JP4505651B2 - 酵素活性の測定方法および測定用試薬キット - Google Patents
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Description
しかしながら、唾液中のアミラーゼ活性値は、正常値が数万IU/Lとなるため、従来のアミラーゼ測定法では直接測定することは不可能であった。そのため、試料を希釈するなどの余分な操作が必要となるうえ、数百倍の希釈が必要なため測定精度の低下を招くという問題点が存在する。つまり,必要とされる分析範囲や,リニアリティの良好な検量線を実現するのが困難であった。
医用電子と生体工学 39(3), p234-239(2001)、山口昌樹 他
2.競合阻害剤と生成阻害剤の添加によって、アミラーゼ活性の測定範囲もしくはリニアリティーが改善される前項1に記載の方法。
3.競合阻害剤の基質に対するモル比が1/10〜1/2である前項1または2に記載の方法。
4.生成阻害剤の基質に対するモル比が1/5〜1/2である前項1〜3の何れか一に記載の方法。
5.基質を1 〜 100 mM、競合阻害剤を0.25 〜 25 mM、生成阻害剤を0.4 〜 40 mMの比率で含有する前項1〜4の何れか一に記載の方法。
6.基質である修飾オリゴ糖が、G2〜7から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されている前項1〜5の何れか一に記載の方法。
7.色原体が、4−ニトロフェノール(PNP)、2−クロロ−4−ニトロフェノール(CNP)、2,4−ジクロロフェノール(Cl2P)から選ばれる前項6に記載の方法。
8.修飾オリゴ糖が、以下から選ばれる前項1〜7の何れか一に記載の方法;
2−クロロ−4−ニトロフェノール−4-O-β-D-ガラクトピラノシルマルトサイド(以
下 GAL−G2−CNP)、GAL−G4−CNP、GAL−G5−CNP、G5−C
NP、G6−CNP、G7−CNP、G5−PNP、G7−PNP。
9.競合阻害剤であるオリゴ糖が、三糖以上である前項1〜8の何れか一に記載の方法。
10.競合阻害剤であるオリゴ糖がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースから選ばれる前項9に記載の方法。
11.生成阻害剤が、2種類以上添加される前項1〜10の何れか一に記載の方法。
12.生成阻害剤が、グルコース、マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラオースから選ばれる少なくとも一である前項1〜11の何れか一に記載の方法。
13.修飾オリゴ糖がGAL−G2−CNP、競合阻害剤がマルトペンタオース、生成阻害剤がマルトースである前項1〜12の何れか一に記載の方法。
14.唾液を希釈することなく直接測定する前項1〜13の何れか一に記載の方法。
15.前項1〜14の方法に使用する基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が少なくとも含まれるアミラーゼ活性測定用試薬キット。
も sAMYの反応速度の緩和に顕著な効果があることが確認された。この2つの阻害効果を併用すれば、酵素活性分析における分析範囲の拡大と低コスト化を両立できる。
生体サンプルの測定法に関する限り全て本発明の技術思想に包含される。
(式1)
sAMY
Gal-G2-CNP → Gal-G2 + CNP
酵素が基質として認識する化学物質を添加すると、主要基質の化学反応スピードが低下する(competitive inhibition)。この系を積極的に用いるため、主要基質(Gal-G2-CNP) の競合阻害剤としてmaltopentaose (C30H52O26, G5, nacalai tesque, INC. Japan) を加えた。添加量は、20 mM Gal-G2-CNP に2, 5, 10 mM の G5 を添加した試験紙を作成した。健常な成人 (3人の男性及び2人の女性) から採取した唾液を等張塩化カリウム溶液で 0, 20, 50, 100, 150 kU/l に希釈した。この唾液を用いて、試験紙の吸光度を測定した (n = 25)。
酵素反応によって基質が分解されて生成される化学物質(生産物)を、予め基質に加えておくと、化学反応スピードが低下する (product inhibition)。この product inhibitionを積極的に用いるため、主要基質(Gal-G2-CNP)の生産物阻害剤として maltose (C12H22O11, G2, nacalai tesque, INC. Japan)を試験紙に加え、その吸光度を測定した (n = 25)。
基質、競合阻害剤及び生産物阻害剤の系による効果を確認のために、20 mM Gal-G2-CNP に 5 mM G5 と 8 mM G2 を加えた試験紙を調製した。
(式2)
sAMY
Gal-G2-CNP + G5 + G2 → Gal-G2 + CNP + G2 +G3
上記式2でG3はmaltotrioseを意味する。
2 試験試
3 スプリング
4 スリーブ
5 レバー
6 光学機器
Claims (15)
- 基質である修飾オリゴ糖、この基質と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤であるオリゴ糖、及びアミラーゼによって産生される反応生成物の生成阻害剤である単糖もしくはオリゴ糖を少なくとも反応系に含み、競合阻害剤の基質に対するモル比が1/10〜1、生成阻害剤の基質に対するモル比が1/5〜1で支持体に担持されていることを特徴とする唾液中のアミラーゼ活性測定方法。
- 競合阻害剤と生成阻害剤の添加によって、アミラーゼ活性の測定範囲もしくはリニアリティーが改善される請求項1に記載の方法。
- 競合阻害剤の基質に対するモル比が1/10〜1/2である請求項1または2に記載の方法。
- 生成阻害剤の基質に対するモル比が1/5〜1/2である請求項1〜3の何れか一に記載の方法。
- 基質を1 〜 100 mM、競合阻害剤を0.25 〜 25 mM、生成阻害剤を0.4 〜 40 mMの比率で含有する請求項1〜4の何れか一に記載の方法。
- 基質である修飾オリゴ糖が、G2〜7から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されている請求項1〜5の何れか一に記載の方法。
- 色原体が、4−ニトロフェノール(PNP)、2−クロロ−4−ニトロフェノール(CNP)、2,4−ジクロロフェノール(Cl2P)から選ばれる請求項6に記載の方法。
- 修飾オリゴ糖が、以下から選ばれる請求項1〜7の何れか一に記載の方法;
2−クロロ−4−ニトロフェノール−4-O-β-D-ガラクトピラノシルマルトサイド(以
下 GAL−G2−CNP)、GAL−G4−CNP、GAL−G5−CNP、G5−C
NP、G6−CNP、G7−CNP、G5−PNP、G7−PNP。 - 競合阻害剤であるオリゴ糖が、三糖以上である請求項1〜8の何れか一に記載の方法。
- 競合阻害剤であるオリゴ糖がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオー
スから選ばれる請求項9に記載の方法。 - 生成阻害剤が、2種類以上添加される請求項1〜10の何れか一に記載の方法。
- 生成阻害剤が、グルコース、マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラオースから選ばれる少なくとも一である請求項1〜11の何れか一に記載の方法。
- 修飾オリゴ糖がGAL−G2−CNP、競合阻害剤がマルトペンタオース、生成阻害剤がマルトースである請求項1〜12の何れか一に記載の方法。
- 唾液を希釈することなく直接測定する請求項1〜13の何れか一に記載の方法。
- 請求項1〜14の方法に使用する基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が少なくとも含まれる
アミラーゼ活性測定用試薬キット。
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