JP2007267680A - 酵素活性の測定方法および測定用試薬キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】修飾基質を用いた酵素法において、基質と競合する基質と分子構造が類似した競合阻害剤及び生成物の生成を阻害する生成物と分子構造が類似した生成阻害剤を添加することにより、高活性値の酵素試料の酵素活性を希釈することなく直接測定する。
【選択図】なし
Description
しかしながら、唾液中のアミラーゼ活性値は、正常値が数万IU/Lとなるため、従来のアミラーゼ測定法では直接測定することは不可能であった。そのため、試料を希釈するなどの余分な操作が必要となるうえ、数百倍の希釈が必要なため測定精度の低下を招くという問題点が存在する。つまり,必要とされる分析範囲や,リニアリティの良好な検量線を実現するのが困難であった。
医用電子と生体工学 39(3), p234-239(2001)、山口昌樹 他
1.基質に対する酵素作用によって産生される反応生成物の生成阻害剤を少なくとも反応系に含むことを特徴とする酵素法による酵素活性測定方法。
2.修飾基質、この基質と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤、及び基質に対する酵素作用によって産生される反応生成物の生成阻害剤を少なくとも反応系に含むことを特徴とする酵素法による酵素活性測定方法。
3.生成阻害剤の添加もしくは競合阻害剤と生成阻害剤の添加によって、酵素活性の測定範囲もしくはリニアリティーが改善される前項1又は2の方法。
4.酵素が、アミラーゼ、リゾチーム、ペルオキシダーゼ,炭酸脱水素酵素,インベルターゼ,カタラーゼから選択される前項1〜3の何れか一に記載の方法。
5.競合阻害剤の分子構造が、基質の分子構造と類似している前項1〜4の何れか一に記載の方法。
6.生成阻害剤の分子構造が、生成物の分子構造と類似している前項1〜5の何れか一に記載の方法。
7.生成阻害剤を基質の1/5〜1/2量添加する前項1〜6のいずれか一に記載の方法。
8.基質を1 〜 100 mM、競合阻害剤を0.25 〜 25 mM、生成阻害剤を0.4 〜 40 mMの比率で含有する前項1〜7何れか一に記載の方法。
9.基質として修飾オリゴ糖を使い、該修飾オリゴ糖と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤及び該修飾オリゴ糖に対するアミラーゼの酵素作用によって産生される反応生成物の生成阻害剤を少なくとも使用することを特徴とする酵素法によるアミラーゼの測定方法である前項1〜8何れか一に記載の方法。
10.基質である修飾オリゴ糖が、G2〜7から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されている前項9に記載の方法。
11.色原体が、4−ニトロフェノール(PNP)、2−クロロ−4−ニトロフェノール(CNP)、2,4−ジクロロフェノール(Cl2P)から選ばれる前項10に記載の方法。
12.修飾オリゴ糖が、以下から選ばれる前項9〜11の何れか一に記載の方法;
2−クロロ−4−ニトロフェノール−4-O-β-D-ガラクトピラノシルマルトサイド(以下 GAL−G2−CNP)、GAL−G4−CNP、GAL−G5−CNP、G5−CNP、G6−CNP、G7−CNP、G5−PNP、G7−PNP。
13.競合阻害剤が、オリゴ糖又はでんぷんである前項9〜12の何れか一に記載の方法。
14.競合阻害剤であるオリゴ糖が、三糖以上である前項13に記載の方法。
15.競合阻害剤であるオリゴ糖がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースから選ばれる前項14に記載の方法。
16.生成阻害剤が、一糖以上である前項9〜15の何れか一に記載の方法。
17.生成阻害剤が、2種類以上添加される前項16に記載の方法。
18.生成阻害剤が、マルトースである前項15又は16に記載の方法。
19.修飾基質がGAL−G2−CNP、競合糖がマルトペンタオース、生成阻害糖がマルトースである前項9〜18の何れか一に記載の方法。
20.基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が、液状である前項1〜19の何れか一に記載の方法。
21.基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が、支持体に担持されている状態である前項20に記載方法。
22.酵素活性の測定検体が、生物学的試料である前項1〜21の何れか一に記載の方法。
23.生物学的試料が、人唾液、血液、尿、体液又はそれらの由来物である前項22に記載の方法。
24.酵素を含有する生物学的試料を希釈することなく直接測定する前項23に記載の方法。
25.前項1〜24の方法に使用する基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が少なくとも含まれる酵素活性測定用試薬キット。
も sAMYの反応速度の緩和に顕著な効果があることが確認された。この2つの阻害効果を併用すれば、酵素活性分析における分析範囲の拡大と低コスト化を両立できる。
生体サンプルの測定法に関する限り全て本発明の技術思想に包含される。
(式1)
sAMY
Gal-G2-CNP → Gal-G2 + CNP
酵素が基質として認識する化学物質を添加すると、主要基質の化学反応スピードが低下する(competitive inhibition)。この系を積極的に用いるため、主要基質(Gal-G2-CNP) の競合阻害剤としてmaltopentaose (C30H52O26, G5, nacalai tesque, INC. Japan) を加えた。添加量は、20 mM Gal-G2-CNP に2, 5, 10 mM の G5 を添加した試験紙を作成した。健常な成人 (3人の男性及び2人の女性) から採取した唾液を等張塩化カリウム溶液で 0, 20, 50, 100, 150 kU/l に希釈した。この唾液を用いて、試験紙の吸光度を測定した (n = 25)。
酵素反応によって基質が分解されて生成される化学物質(生産物)を、予め基質に加えておくと、化学反応スピードが低下する (product inhibition)。この product inhibitionを積極的に用いるため、主要基質(Gal-G2-CNP)の生産物阻害剤として maltose (C12H22O11, G2, nacalai tesque, INC. Japan)を試験紙に加え、その吸光度を測定した (n = 25)。
基質、競合阻害剤及び生産物阻害剤の系による効果を確認のために、20 mM Gal-G2-CNP に 5 mM G5 と 8 mM G2 を加えた試験紙を調製した。
(式2)
sAMY
Gal-G2-CNP + G5 + G2 → Gal-G2 + CNP + G2 +G3
上記式2でG3はmaltotrioseを意味する。
2 試験試
3 スプリング
4 スリーブ
5 レバー
6 光学機器
Claims (25)
- 基質に対する酵素作用によって産生される反応生成物の生成阻害剤を少なくとも反応系に含むことを特徴とする酵素法による酵素活性測定方法。
- 修飾基質、この基質と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤、及び基質に対する酵素作用によって産生される反応生成物の生成阻害剤を少なくとも反応系に含むことを特徴とする酵素法による酵素活性測定方法。
- 生成阻害剤の添加もしくは競合阻害剤と生成阻害剤の添加によって、酵素活性の測定範囲もしくはリニアリティーが改善される請求項1又は2の方法。
- 酵素が、アミラーゼ、リゾチーム、ペルオキシダーゼ,炭酸脱水素酵素,インベルターゼ,カタラーゼから選択される請求項1〜3の何れか一に記載の方法。
- 競合阻害剤の分子構造が、基質の分子構造と類似している請求項1〜4の何れか一に記載の方法。
- 生成阻害剤の分子構造が、生成物の分子構造と類似している請求項1〜5の何れか一に記載の方法。
- 生成阻害剤を基質の1/5〜1/2量添加する請求項1〜6のいずれか一に記載の方法。
- 基質を1 〜 100 mM、競合阻害剤を0.25 〜 25 mM、生成阻害剤を0.4 〜 40 mMの比率で含有する請求項1〜7何れか一に記載の方法。
- 基質として修飾オリゴ糖を使い、該修飾オリゴ糖と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤及び該修飾オリゴ糖に対するアミラーゼの酵素作用によって産生される反応生成物の生成阻害剤を少なくとも使用することを特徴とする酵素法によるアミラーゼの測定方法である請求項1〜8何れか一に記載の方法。
- 基質である修飾オリゴ糖が、G2〜7から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されている請求項9に記載の方法。
- 色原体が、4−ニトロフェノール(PNP)、2−クロロ−4−ニトロフェノール(CNP)、2,4−ジクロロフェノール(Cl2P)から選ばれる請求項10に記載の方法。
- 修飾オリゴ糖が、以下から選ばれる請求項9〜11の何れか一に記載の方法;
2−クロロ−4−ニトロフェノール−4-O-β-D-ガラクトピラノシルマルトサイド(以下 GAL−G2−CNP)、GAL−G4−CNP、GAL−G5−CNP、G5−CNP、G6−CNP、G7−CNP、G5−PNP、G7−PNP。 - 競合阻害剤が、オリゴ糖又はでんぷんである請求項9〜12の何れか一に記載の方法。
- 競合阻害剤であるオリゴ糖が、三糖以上である請求項13に記載の方法。
- 競合阻害剤であるオリゴ糖がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースから選ばれる請求項14に記載の方法。
- 生成阻害剤が、一糖以上である請求項9〜15の何れか一に記載の方法。
- 生成阻害剤が、2種類以上添加される請求項16に記載の方法。
- 生成阻害剤が、マルトースである請求項15又は16に記載の方法。
- 修飾基質がGAL−G2−CNP、競合糖がマルトペンタオース、生成阻害糖がマルトースである請求項9〜18の何れか一に記載の方法。
- 基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が、液状である請求項1〜19の何れか一に記載の方法。
- 基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が、支持体に担持されている状態である請求項20に記載方法。
- 酵素活性の測定検体が、生物学的試料である請求項1〜21の何れか一に記載の方法。
- 生物学的試料が、人唾液、血液、尿、体液又はそれらの由来物である請求項22に記載の方法。
- 酵素を含有する生物学的試料を希釈することなく直接測定する請求項23に記載の方法。
- 請求項1〜24の方法に使用する基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が少なくとも含まれる酵素活性測定用試薬キット。
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