JPH10179191A - 生細胞の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検出効率の優れた生細胞の検出方法の提供。 【解決手段】 生細胞内でｐＨ依存性の蛍光性物質に変
化し得る蛍光性酵素基質、例えば５−カルボキシフルオ
レセインジアセテートアセトキシメチルエステルを媒体
に添加し、媒体中に存在する細胞内からの蛍光を測定す
る生細胞の検出方法であって、媒体のｐＨを６以下の酸
性に下げた状態で蛍光を測定することを特徴とする方
法。 【効果】 本発明の方法によれば、任意の媒体中におけ
る生細胞の数を、感度良く、簡便に検出することができ
る。特に、洗い操作ができないかまたは好ましくない自
然界の試料の場合に、この方法は非常に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は生細胞の検出方法に
関し、更に詳しくは、特定の条件を用いることにより、
微生物の生死を効率的に検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】媒体中における生細胞の検出は、滅菌状
態の確認や、細胞の生存状態の異常を検出する上で重要
な技術である。例えば工業用水、飲料水、嗜好飲料、ア
ルコール飲料などに存在する生菌を検出することは、工
業製品の歩留りや飲料の安全性、衛生性、品質保証の面
で重要な業務であり、ＬＳＩを生産する電子工業におい
ては、その中間製品である半導体ウエハーの洗浄にあた
り、その歩留りを向上させるために、洗浄水の水質管理
は極めて重要な業務となっている。また、近年のバイオ
テクノロジーの急速な進展に伴い、医薬品等の有用な物
質が微生物、昆虫細胞、哺乳動物由来の細胞等の宿主細
胞を培養して生産されているが、生産性を管理する上で
これら宿主細胞の生存を確認することは必要不可欠であ
る。従来、このような生細胞を検出するための手段とし
て、生体染色といわれる方法や、フルオレセインジアセ
テート等の蛍光性酵素基質を媒体に添加し、細胞内から
の蛍光を測定することによる検出方法が知られている。

【０００３】しかし、生細胞内でのみ発光すべき蛍光性
酵素基質が自然分解し、細胞外部で発光することによっ
て測定が妨害され、生細胞のみを効率的に検出すること
は困難であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、蛍光性酵素
基質を媒体に添加する方法における欠点、細胞内部と細
胞外部の蛍光強度の差（コントラスト）が弱いこと等が
解決された検出効率の優れた生細胞の検出方法を提供し
ようとするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の課題
を解決するため、媒体中に存在する細胞内からの蛍光の
測定条件を種々検討した。その結果、生細胞内部は細胞
外のｐＨに独立してほぼｐＨ７に保たれており、細胞内
でｐＨ依存性の蛍光性物質を生成し得る蛍光性酵素基質
を用いて生細胞を染色し、細胞外部のｐＨを酸性にして
ｐＨ依存性の励起波長で励起すれば、生細胞に特異的に
強い蛍光が発することを見いだした。本発明は、上記の
知見に基づいて完成されたものである。

【０００６】即ち本発明によれば、蛍光性酵素基質を媒
体に添加し、媒体中に存在する細胞内からの蛍光を測定
する生細胞の検出方法であって、媒体のｐＨを酸性に下
げた状態で蛍光を測定することを特徴とする方法が提供
される。

【０００７】この発明の好ましい態様によれば、蛍光性
酵素基質が、生細胞内でｐＨ依存性の蛍光性物質を生成
し得る化合物である上記方法；蛍光性酵素基質が、５−
カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチ
ルエステル、５−（６−）−カルボキシフルオレセイン
ジアセテート及び２’，７’−ビス−（２−カルボキシ
エチル）−５−（６−）−カルボキシフルオレセインア
セトキシメチルエステルよりなる群から選ばれる化合物
である上記方法；媒体のｐＨが、ｐＨ６以下である上記
方法；蛍光測定を、ｐＨ依存性の励起波長で行う上記方
法；及び蛍光生酵素基質が５−カルボキシフルオレセイ
ンジアセテートアセトキシメチルエステルであり、蛍光
測定の励起波長がＡｒ⁺レーザーである上記方法が提供
される。

【０００８】また、本発明の別の態様によれば、少なく
とも、蛍光性酵素基質を含有する染色液よりなり、蛍光
性酵素基質を媒体に添加し、媒体中に存在する細胞内か
らの蛍光を測定する生細胞の検出に使用するための試薬
キットであって、媒体のｐＨを酸性に下げた状態で蛍光
を測定することを特徴とする方法に使用するための試薬
キットが提供される。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。本発明における蛍光性酵素基質としては、単独では
蛍光を発しないが、生細胞内でエステラーゼ等の生体内
酵素の作用により蛍光を発する物質（蛍光性物質）に変
化し得る化合物であって、かつ、生成する蛍光性物質が
ｐＨによってその蛍光強度に差の有るもの、即ちｐＨ依
存性の蛍光性物質であれば、いかなるものでも使用する
ことができる。

【００１０】具体的には、例えば、５−カルボキシフル
オレセインジアセテートアセトキシメチルエステル（５
−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅ
ｔａｔｅ ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ／
以下、「ＣＦＤＡ−ＡＭ」と略す）、５−（６−）−カ
ルボキシフルオレセインジアセテート（５−（ａｎｄ−
６）−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａ
ｃｅｔａｔｅ／以下、「ＣＦＤＡ」と略す）、２’，
７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（６−）
−カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル
（２’，７’−ｂｉｓ−（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙ
ｌ）−５−（ａｎｄ−６）−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｉｎ ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅ
ｒ／以下、「ＢＣＥＣＦ−ＡＭ：１」と略す）等の化合
物を蛍光性基質として使用することができる。これらの
化合物はいずれも既知の化合物であり、市販されてい
る。これらのうち、ＣＦＤＡ−ＡＭが特に好ましい。

【００１１】ＣＦＤＡ−ＡＭはＣＦＤＡのカルボキシル
基をアセトキシメチル基によってブロックしたもので、
親水基がまったく無くなっている（この状態では非蛍光
性である）。従って、この誘導体であるＣＦＤＡに比べ
て親油性が強いので細胞膜を通過し易く、結果的に細胞
を効率よく染色することができる。ＢＣＥＣＦ−ＡＭ：
１も同様であるが、この化合物は合成が難しくかつ、保
存中に自然分解してしまうことが多いので使用に際して
注意が必要である。

【００１２】本発明の方法で検出しようとする生細胞と
しては、バクテリア、酵母、放線菌、カビ類等の微生
物、カイコのＳｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ
ＯＳ細胞等の哺乳動物由来の細胞等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではなく、いずれの細胞でもよ
い。細胞が死滅すると、細胞膜がもれ易くなり、細胞内
に蓄積された蛍光色素が外へもれだし、蛍光強度が大き
く減少し、かつ細胞内のｐＨが細胞外ｐＨと等しくな
る。これらの点を利用して生細胞と、死細胞との区別を
することができる。

【００１３】生細胞を検出しようとする媒体としては、
水、酒、培養液等の液体の媒体、土、砂等の固体の媒
体、寒天、ゲル等の半固体やそれらの混合物等が挙げら
れる。本発明で使用する蛍光性酵素基質を媒体に添加す
る方法は、媒体に応じて適宜行えばよい。蛍光性酵素基
質はそれぞれを単独で使用することもできるが、複数の
蛍光性酵素基質を併用してもよい。

【００１４】蛍光性酵素基質は一般に水に難溶性である
ので、媒体が水性である場合には、蛍光性酵素基質を溶
媒に溶解した後、媒体に加えることにより行えばよい。
固体の媒体の場合にも、同様に溶媒に蛍光性酵素基質を
溶解し、媒体に加えることにより行えばよい。蛍光性酵
素基質を溶解する溶媒としては、通常水に溶解しやすい
こと、検出しようとする生細胞中の酵素を失活させにく
いものを用いる。また、必要に応じて非イオン性界面活
性剤を用いて溶解してもよい。

【００１５】土壌中の生細胞を検出しようとする場合に
は、土壌中に染色液を加えるだけで良い。土質によって
は、蛍光性酵素基質が土の触媒作用により非生物的に分
解して背景蛍光が上がる場合があるが、この場合は、１
〜２回洗いを加える必要がある。液体媒体中の生細胞を
検出しようとする場合には、蛍光性酵素基質を添加した
後、フイルター濾過したり、ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎ
ｅコート基盤へ固定化したり、寒天若しくはゼラチン等
で非流動体化して蛍光を測定するのが好ましい。

【００１６】蛍光測定は、媒体のｐＨを酸性にした状態
で行われる。媒体のｐＨは、通常ｐＨ６以下でｐＨが低
ければ低いほど良いが、水素イオン濃度の細胞への影響
を考慮すると、ｐＨ３〜６がより好ましい。媒体のｐＨ
は如何なる方法で酸性状態に下げてもよいが、通常、ｐ
Ｈが酸性の水性溶媒を予め調製し、それに蛍光性酵素基
質を溶解又は分散させ、媒体に加えて生細胞を染色すれ
ばよい。

【００１７】本発明の生細胞の検出方法における操作手
順に特に制限はないが、通常、以下の手順によって行わ
れるのが好ましい。 １）蛍光性酵素基質を、ｐＨを酸性に調整した溶媒に溶
かし、染色液を作成する。 ２）該染色液と媒体（細胞や土壌等）を混ぜ、混合液を
作成する。 ３）該混合液をスライドガラスとカバーガラスに挟む。 ４）水蒸気で飽和したインキュベーター中に放置する。 ５）顕微鏡観察し、蛍光を測定して生細胞を検出する。

【００１８】蛍光性酵素基質を溶解又は分散させる溶媒
としては、通常、ｐＨが酸性の水性溶媒が用いられ、好
ましくは適当な酸性緩衝液、例えば、ナトリウムリン酸
緩衝液、クエン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム
−ホウ酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム−クエン
酸ナトリウム緩衝液等が用いられる。蛍光性酵素基質が
ＣＦＤＡ−ＡＭである場合、溶媒としては、ｐＨを酸
性、例えばｐＨ３〜６に調整したナトリウムリン酸緩衝
液にｐｌｕｒｏｎｉｃ^TMＦ１２７（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎ
ｄｏｔｔｅ社製界面活性剤；分子量１２５００）を少量
（０．０２５〜０．０５％）添加したものを用いるのが
特に好ましい。用いる緩衝剤の濃度に特に制限はない。

【００１９】蛍光性基質の添加量は、特に制限はされな
いが、通常媒体中における最終濃度が１〜３０μＭ、よ
り好ましくは１〜１０μＭとなるように調製するのが適
当である。色素濃度が低すぎると、蛍光の絶対強度が低
くなってしまう。色素濃度が高すぎると色素が不溶化し
て沈殿したり、細胞外部の蛍光性物質による背景光が強
く細胞からの蛍光が隠されるために検出効率が下がる傾
向がある。また、染色液と媒体との混合比も、特に制限
はされない。

【００２０】上記においては、スライドガラスとカバー
ガラスに挟むか、又はホールスライドガラスに入れてカ
バーグラスで密閉した後、インキュベートする例を挙げ
たが、細胞外に存在する酵素や土壌の触媒作用によって
蛍光性酵素基質が分解され背景光が高くなってしまう場
合は、遠心チューブ中で染色液、細胞、土壌を混ぜイン
キュベート（約３０分程度）し、そのまま遠心によって
一回洗い、その沈澱を溶媒に懸濁したあと、コートされ
たスライドガラスとカバーガラスに挟んでもよい。

【００２１】蛍光性酵素基質を用いる測定では反応時間
と共に細胞ばかりでなく背景の蛍光強度が増していくの
で、測定は染色後７０分以内に行うことが好ましい。色
素濃度が１０μＭを越えている場合には、４０分以内に
測定を終えることが必要である。また、染色後、反応を
進行させるために、測定までには通常２０分以上の時間
を置くことが好ましい。

【００２２】検出しようとする細胞が、メラニン色素等
で着色している場合には、そのまま蛍光性酵素基質で染
色しても、蛍光が色素で妨害されて観察しにくいので、
蛍光性酵素基質で染色する前に、予め過酸化水素等で細
胞を脱色しておくことが望ましい。

【００２３】蛍光の検出手段は特に制限されないが、例
えば蛍光性酵素基質を添加した媒体をスライドガラス上
にのせて蛍光顕微鏡で観察する方法や、ＣＣＤカメラと
パソコンとを組み合わせた画像解析装置を用いて観察す
る方法などが挙げられる。

【００２４】本発明において用いられる励起光源として
は、蛍光顕微鏡の光源として一般的に知られているもの
を用いることができる。例えば、超高圧水銀灯やＡｒ⁺
レーザ−等を挙げることができるが、蛍光性酵素基質に
ＣＦＤＡ−ＡＭを用い、生成するカルボキシフルオレセ
インを励起する場合は、特にＡｒ⁺レーザーを用いるこ
とが好ましい。

【００２５】以下に本発明の原理を説明する。生きてい
る細胞においては細胞内部のｐＨは細胞外部のｐＨに独
立にほぼ７を保つ。一方、蛍光性酵素基質、例えばＣＦ
ＤＡ−ＡＭから生細胞内で変化して生成する６−カルボ
キシフルオレセイン（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｉｎ／以下、「ＣＦ」と略す）の吸収スペクトル
は図１に示すようにｐＨに依存して大きく変化し、蛍光
もｐＨに依存して大きく変化する。図１からも明らかな
ように、ＣＦは４３５ｎｍと４９０ｎｍとの二つの波長
で光吸収する。その結果ＣＦは励起されて蛍光を発する
が、各々の波長で励起された場合の蛍光強度をＩｅｘ４
３５とＩｅｘ４９０とすると、アルカリ側ではＩｅｘ４
９０が大きくなり、酸性側ではＩｅｘ４３５が大きくな
る。

【００２６】上記ｐＨ依存性の励起波長を用いて、生細
胞内と媒体間にｐＨ勾配をつけた状態で蛍光強度を測定
すれば、生きた細胞を効率よく検出可能であることを見
出したのが本発明である。すなわち測定の際に細胞外の
ｐＨを酸性にして、測定の際の励起波長を吸収極大４９
０ｎｍ付近にすると、細胞外部にあるＣＦ（自然分解し
たり、細胞の表層や外に存在するエステラーゼによって
分解されたもの）はあまり蛍光を発せず、細胞内部に留
まったＣＦは強い蛍光を発する。従って、細胞が効率よ
く検出できる。一方図１から解るように、外部のｐＨを
低くしてもＣＦを励起する波長が適当でないとその効果
は低くなる。図１の中で横軸の下にある破線は一般的に
用いられる励起用フィルターであり、超高圧水銀ランプ
の輝線を使えるように設計されているがこの波長域は細
胞の選択的検出には余り適当ではない。効率を挙げるた
めには特別の干渉フィルターを用いて４９０ｎｍに近い
励起光を用いるとよい。また図１の短い縦線はＡｒ⁺レ
ーザーの発振線（４８８ｎｍ）であるがこの波長は細胞
の選択的検出には非常に適していることが解る。

【００２７】本発明において、ＣＦの蛍光を測定する場
合には、励起光として４９０ｎｍに近い波長の光を用い
ることが理想であるが、蛍光顕微鏡の光源として一般的
に用いられる超高圧水銀灯の場合は波長的に連続である
ため励起波長を４９０ｎｍまで長い方にすると、励起光
が蛍光側に漏れ出てしまう。従って高々４８５ｎｍにと
どめることが必要である。この点を克服するにはＡｒ⁺
レーザーを用いるのが有効である。Ａｒ⁺レーザーは４
８８ｎｍに強い光を発するのでＣＦの励起には最適であ
ることと、レーザーは発光波長がはっきりと決まってお
り励起光が蛍光側に漏れることが少ないので背景が暗く
なるためである。

【００２８】本発明の試薬キットは、上記した生細胞の
検出方法に基づいて、それ自体既知の通常用いられる材
料及び手法で調製することができる。

【００２９】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。この実施例において、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）はａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉ
ｕｍ３培地（バクト牛エクストラクト０．１５％、バク
トイーストエクストラクト０．１５％、バクトペプトン
０．５％、バクトデキストローズ０．１％、ＮａＣｌ
０．３５％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．３６８％、ＫＨ₂ＰＯ₄
０．３２％）中、３０℃で培養し、対数増殖期の中期か
ら後期の細胞を集めて使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）はＬＢ培地（トリプトン１％、イーストエクストラ
クト０．５％、ＮａＣｌ ０．５％）中、３７℃で培養
し、対数増殖期の中期から後期の細胞を集めて使用し
た。

【００３０】細胞が動き回るのを抑えるためスライドガ
ラスをあらかじめｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ（０．１
ｍｇ／ｍｌ Ｈ₂Ｏ）でコートしておいた。コートは次
のように行った。ピペットでｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎ
ｅ（０．２μｌ程度）をスライドガラスに滴下して滴状
にする。この滴を１０個程度作る。そのまま室温に放置
して乾かす。

【００３１】ＣＦＤＡ−ＡＭの溶媒としては、ｐＨ５．
９（実施例１）とｐＨ７．１（比較例１）に、それぞれ
ｐＨを調製したナトリウムリン酸緩衝液２０ｍＭ中にｐ
ｌｕｒｏｎｉｃ^TMＦ１２７（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔ
ｔｅ社製）を０．０２５％の割合で溶解させたものを用
いた（以下、この緩衝液をＮａ−Ｐ−Ｐと呼ぶ）。Ｎａ
−Ｐ−ＰにＣＦＤＡ−ＡＭを３μＭ溶解し、Ｎａ−Ｐ−
Ｐ液を調製した。

【００３２】Ｎａ−Ｐ−Ｐ液１００μｌに培養した上記
細菌（１〜１０μｌ）、またはそれにさらに土壌（１〜
１０μｌ）を混合し、直ちにコートされたスライドガラ
スとカバーガラスではさみ水蒸気で飽和したインキュベ
ーター中で３０分放置し反応を進ませた。このようにし
て得られた試料を顕微鏡で観察した。測定は以下のよう
な条件で行った。

【００３３】用いた顕微鏡は冷却ＣＣＤ付き蛍光顕微鏡
および共焦点レーザー顕微鏡である。まず、視野内の細
胞の数を知るために微分干渉像を観察記録した。次に蛍
光像を記録した。用いた蛍光フィルターはＢ励起フィル
ター（励起バンドパスフィルター：４７７ｎｍ（半値幅
１０ｎｍ）、ダイクロイックミラー：５３０ｎｍ、蛍光
バンドパスフィルター：５１０〜５５０ｎｍ）である。
共焦点レーザー顕微鏡を用いた場合は４８８ｎｍの励起
光を用いた。

【００３４】記録は冷却ＣＣＤで行い、得られたデジタ
ル画像は光磁気ディスクに記録された。解析は以下の順
で行った。まず一連の画像から蛍光画像を抽出し、顕微
鏡の光ムラ補正、電気雑音除去を行った。この補正後の
蛍光画像の中で明るさが特定レベル（通常は背景光の平
均的明るさ＋背景光の明るさのゆらぎの標準偏差）以上
の物体を細胞と見なし、その個数Ａを計測した。一方、
微分干渉画像から視野中の細胞数Ｂを計測し、Ａ／Ｂ×
１００によって検出効率αを求めた。

【００３５】蛍光性酵素基質を用いる測定では反応時間
と共に細胞ばかりでなく背景の蛍光強度が増して行くの
で、測定は染色後２０分から７０分の間に行った。色素
濃度が１０μＭ以上の場合は４０分以内に測定を終える
ことが必要である。

【００３６】この測定結果を図２に示す。図２は枯草
菌、大腸菌をＣＦＤＡ−ＡＭで染色したものの検出効率
αの色素濃度依存性を示している。図２によると励起光
として４７７ｎｍを用いると、通常の測定条件であるｐ
Ｈ７（比較例１）では細胞の検出効率はたかだか６０％
程度に留まったが、ｐＨ５．９（実施例１）では８０％
以上と大きな違いが出た。色素濃度が高い条件（３０μ
Ｍ）では検出効率が下がっているがこれは細胞外部のＣ
Ｆによる背景光が強くて細胞からの蛍光が隠されるため
である。

【００３７】

【発明の効果】本発明の方法によれば、任意の媒体中に
おける生細胞の数を、感度良く、簡便に検出することが
できる。特に、洗い操作ができないかまたは好ましくな
い自然界の試料の場合に、この方法は非常に有効であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＦＤＡ−ＡＭの分解物ＣＦ（６−ｃａｒｂｏ
ｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）の吸収スペクトルを示す
図である。ＣＦの吸収はｐＨに大きく依存する。ｐＨが
高いと４９０ｎｍの吸収が増し、ｐＨが低いと４３５ｎ
ｍの吸収が増す。通常の蛍光顕微鏡では励起用フィルタ
ーとして４４０〜４８０ｎｍの範囲を透過するものを用
いる（横軸下の破線）。この場合、二つの吸収帯の両方
とも選択してしまう。４７５ｎｍより長い波長を用いる
と４９０ｎｍの吸収帯のみを選択することになる。Ａｒ
⁺レーザーは４８８ｎｍで発光するため（横軸下の縦
線）、４９０ｎｍの吸収帯の選択には最適である。

【図２】ＣＦＤＡ−ＡＭによる細菌の検出効率のｐＨと
色素濃度依存性を示す図であり、横軸はＣＦＤＡ−ＡＭ
濃度を示し、縦軸は検出効率を示す。Ｂ．ｓｕｂ（枯草
菌）、Ｅ．Ｃｏｌｉ（大腸菌）を所定濃度のＣＦＤＡ−
ＡＭで染色後、４７７ｎｍで励起して蛍光像を撮影し、
対応する微分干渉像と比較して検出効率を求めた。どち
らの細胞においてもｐＨ５．９の場合の方が検出効率が
高い。３０μＭで検出効率が下がっているのは背景光の
明るさが増したからである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蛍光性酵素基質を媒体に添加し、媒体中
   に存在する細胞内からの蛍光を測定する生細胞の検出方
   法であって、媒体のｐＨを酸性に下げた状態で蛍光を測
   定することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 蛍光性酵素基質が、ｐＨ依存性の蛍光性
   物質に生細胞内で変化し得る化合物である請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】 蛍光性酵素基質が、５−カルボキシフル
   オレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５
   −（６−）−カルボキシフルオレセインジアセテート及
   び２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−
   （６−）−カルボキシフルオレセインアセトキシメチル
   エステルよりなる群から選ばれる化合物である請求項１
   に記載の方法。
4. 【請求項４】 媒体のｐＨが、ｐＨ６以下である請求項
   １〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 蛍光測定を、ｐＨ依存性の励起波長を用
   いて行う請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】 蛍光性酵素基質が５−カルボキシフルオ
   レセインジアセテートアセトキシメチルエステルであ
   り、蛍光測定の励起波長がＡｒ⁺レーザーである請求項
   １に記載の方法
7. 【請求項７】 少なくとも、蛍光性酵素基質を含有する
   染色液よりなり、蛍光性酵素基質を媒体に添加し、媒体
   中に存在する細胞内からの蛍光を測定する生細胞の検出
   方法に使用するための試薬キットであって、媒体のｐＨ
   を酸性に下げた状態で蛍光を測定することを特徴とする
   方法に使用するための試薬キット。