DE102007003873B4

DE102007003873B4 - Verfahren zur Fluoreszenzfärbung und zur Untersuchung von Gewebe

Info

Publication number: DE102007003873B4
Application number: DE102007003873.0A
Authority: DE
Inventors: Akira Yamamoto; Yusuke Iimori; Mizue Saze; Mariko Ishiguro
Original assignee: Hoya Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2006-01-25
Filing date: 2007-01-25
Publication date: 2015-08-06
Anticipated expiration: 2027-01-26
Also published as: JP2007197350A; GB2434446B; JP4555232B2; US20070172912A1; FR2897940B1; GB2434446A; GB0701514D0; FR2897940A1; DE102007003873A1

Abstract

Verfahren zum Fluoreszenzfärben eines Gewebes, gekennzeichnet durch Behandeln eines Gewebes mit einer Lösung von Fluorescein oder einem seiner Salze und anschließendes Beobachten der Fluoreszenz des behandelten Teils unter sauren Bedingungen bei einem pH-Wert von 4 bis 6,5, wobei das Gewebe ein Gewebe des Dünndarms oder des Dickdarms ist, bei dem die Behandlung des Gewebes mit der das Fluorescein oder eines seiner Salze enthaltenden Lösung in dem Aufbringen der Lösung auf das Gewebe oder in dem Eintauchen des Gewebes in die Lösung besteht, und bei dem die das Fluorescein oder eines seiner Salze enthaltende Lösung eine saure Lösung mit einem pH-Wert von 4 bis 6,5 ist.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum einfachen und klaren Fluoreszenzfärben eines lebenden Körpergewebes oder eines aus dem lebenden Körper entnommenen Gewebes.
Beschreibung des Standes der Technik
Das Erzeugen von Querschnittsbildern lebender Körpergewebe ist auf dem medicobiologischen Gebiet extrem wichtig. Querschnittsbilder aus lebenden Körpern entnommener Gewebe konnten bisher nur durch chemische Fixation, Dehydrierung, Schichtbildung und Färbung erhalten werden.
Die Entwicklung eines konfokalen Abbildungssystems und die Existenz eines konfokalen Laser-Abtastmikroskops ermöglichte die nicht-invasive Beobachtung von Zellen und Geweben bei dem Betrachten von Schnitten biologischer Proben mit kompliziert mehrfach geschichteten Zellen und verbindenden Geweben. Medizinische Endoskope mit einem konfokalen Abbildungssystem wurden in jüngerer Zeit entwickelt.
Das Betrachten fluoreszierender Bilder mit einem konfokalen optischen System erfordert Verfahren zum Färben eines lebenden Körpergewebes sowie einer daraus abgeleiteten Probe mit einem fluoreszierenden Farbstoff. Wird ein lebendes Gewebe mit einem konfokalen Abtastmikroskop und einem damit ausgerüsteten medizinischen Endoskop betrachtet, so ist zur biologischen Sicherheit ein Färbungsmittel erforderlich.
Fluorescein wurde bisher als fluoreszierendes, für lebende Körper sicheres Kontrastmittel bei der Augenspiegelung usw. verwendet, wobei es in wässriger Lösung intravenös injiziert wurde (Kiesslich et al., Gastroenterology, 127 (3), 706–713, 2004). Alternativ kann ein Gewebe durch direktes Aufsprühen eines Färbungsmittels auf die Gewebeoberfläche gefärbt werden, ohne es durch Blutgefäße wie Venen zuzuführen. Das direkte Aufsprühen einer Färbungslösung auf die Gewebeoberfläche ist ein wirksames Mittel zum Färben extrahierter Organe. Bei dem in-vivo-Einfärben hat dieses Verfahren, verglichen mit dem intravenösen Injizieren und Durchströmen den Vorteil, dass der Einfluss einer Färbungslösung auf lebende Körper reduziert wird, denn es ist nur eine geringe Menge der Färbungslösung erforderlich. Ferner wird kein Farbstoff an eine Stelle des lebenden Körpers geleitet, an der er nicht benötigt wird.
Die auf das lebende Gewebe aufgesprühte Fluoresceinlösung wandert in das Gewebe hinein, und ein Teil der Lösung bleibt als Flüssigkeitsansammlung auf der Gewebeoberfläche zurück. Wird das Gewebe in diesem Zustand mit Anregungslicht bestrahlt, fluoreszieren die eingewanderten Fluoresceinmoleküle und die auf der Gewebeoberfläche verbleibenden Fluoresceinmoleküle, so dass das Unterscheiden der gefärbten und der nichtgefärbten Bereiche ungenau wird. Deshalb musste man bisher nach dem Aufsprühen des Färbungsmittels auf die Gewebeoberfläche die in den nichtgefärbten Bereichen verbleibenden freien Fluoresceinmoleküle durch Waschen entfernen.
Der freie Farbstoff kann durch mehrmaliges Waschen des gefärbten Gewebes mit einem geeigneten Puffer oder einer Lösung entfernt werden. Die zu betrachtende Probe hat aber eine ziemlich empfindliche Oberfläche und muss sorgfältig gewaschen werden, um eine Deformation oder einen Schaden der Probe und ein Denaturieren des Gewebes zu vermeiden. Somit müssen die Waschprozeduren sanft und sorgfältig durchgeführt werden. Ferner verursacht ein übermäßiges Waschen das Ablösen des Farbstoffs (Entfärbung) von dem eingefärbten Gewebe.
Wird andererseits eine extrahierte Gewebeprobe ohne eine chemische Fixation eingefärbt und mit einem konfokalen Abtastmikroskop betrachtet, so tritt während der Waschprozeduren die Autolyse des Gewebes sowie ein Denaturieren der Zellen oder des Proteins auf, wodurch das Problem entsteht, dass die Probe einen anderen Zustand als im lebenden Körper hat (Kiesslich et al., Gastroenterology, 127 (3), 706–713, 2004).
Das Dokument GB 1 113 760 A offenbart eine ophthalmische Zusammensetzung mit einer Fluorescein-Verbindung. Für die ophthalmische Zusammensetzung wird eine nichttoxische Säure verwendet, um den pH-Wert der Zusammensetzung auf 4,5 bis 5,5 zu bringen.
Das Dokument JP H10-179 191 A offenbart die Beobachtung von lebenden Zellen.
Das Dokument JP 2002-168 870 A offenbart ein Verfahren zur Messung des pH-Werts in Zellen wie von Hefe und Bakterien.
Das Dokument JP H03-244 395 A offenbart ein Verfahren zur Zählung von lebenden Zellen, insbesondere von Mikroorganismen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum genauen und klaren Fluoreszenzfärben eines Gewebes mit einfachen Prozeduren sowie ein dabei einzusetzendes Färbungsmittel anzugeben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Erfinder hat seine Aufmerksamkeit auf Fluorescein gerichtet und verschiedene Studien durchgeführt. Fluorescein in wässriger Lösung zeigt eine Fluoreszenz bei alkalischen pH-Werten, jedoch kaum in saurer Lösung. Somit wurde Fluorescein bisher in alkalischer Lösung verwendet, und die Fluoreszenzbeobachtung erfolgte unter alkalischen Bedingungen. Der Erfinder hat aber im Laufe seiner verschiedenen Studien völlig unerwartet festgestellt, dass mit einem Gewebe verbundenes Fluorescein in einer sauren Umgebung klare Fluoreszenz zeigt, obwohl es in saurer Lösung kaum Fluoreszenz zeigt. Wird ein mit Fluorescein behandeltes Gewebe während der Fluoreszenz in eine saure Umgebung gebracht, so kann daher nur mit dem Gewebe verbundenes Fluorescein wahlweise fluoreszierend gefärbt werden, während nicht mit dem Gewebe verbundenes Fluorescein kaum eine Fluoreszenz zeigt. Somit hat der Erfinder herausgefunden, dass ein klares und genaues Fluoreszenzbild eines Gewebes ohne komplizierte Waschprozeduren erhalten werden kann. Auf dieser Grundlage wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
Speziell führt die vorliegende Erfindung zu einem Verfahren zum Fluoreszenzfärben eines Gewebes, bei dem das Gewebe mit einer Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthaltenden Lösung behandelt und dann unter sauren Bedingungen mit einem pH-Wert unter 7 die Fluoreszenz betrachtet wird.
Die vorliegende Erfindung verwendet ein Fluoreszenzfärbungsmittel für ein Gewebe in Form einer Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthaltender Lösung, mit der ein Gewebe zu behandeln und danach seine Fluoreszenz unter sauren Bedingungen mit einem pH-Wert unter 7 zu betrachten ist.
Bei dem Färbungsverfahren nach der vorliegenden Erfindung kann ein klares und genaues Färbungsbild erhalten werden, da nur mit einem Gewebe verbundenes Fluorescein wahlweise fluoreszierend gefärbt werden kann. Fluorescein ist nämlich allgemein stark abhängig von dem pH-Wert, und seine Fluoreszenz kann bei höheren pH-Werten weiter verbessert werden. Nur ein in das Innere eines lebenden Gewebes eingedrungenes und mit diesem verbundenes Fluoresceinmolekül fluoresziert stark, wenn das lebende Gewebe in einem zuvor nicht abbildbaren Zustand eingefärbt wird, wobei zur Fluoreszenzbeobachtung saure Bedingungen einzustellen sind. Unter dieser Voraussetzung gibt ein freies Fluoresceinmolekül keine Fluoreszenz ab. Daher kann ein fluoreszenzgefärbtes Bild des lebenden Gewebes ohne komplizierte und invasive Prozeduren wie Waschen nach dem Einfärben und Durchwandern betrachtet werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Diagramm der Abhängigkeit des pH-Wertes von der Fluoreszenz des Fluoresceins;
2 zeigt ein Diagramm des fluoreszenzgefärbten Bildes des Dickdarms, behandelt mit einer Fluoresceinlösung mit pH 4,0 bei nachfolgender Fluoreszenzbeobachtung; und
3 zeigt ein Diagramm eines fluoreszenzgefärbten Bildes des Dickdarms, behandelt mit einer Fluoresceinlösung mit pH 9,0 bei nachfolgender Fluoreszenzbetrachtung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER VORZUGSWEISEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bei dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wird ein Gewebe mit einer Lösung behandelt, die Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthält. In diesem Zusammenhang ist unter Gewebe ein lebendes Gewebe und ein dem lebenden Körper entnommenes Gewebe (extrahiertes Gewebe) zu verstehen. Zu dem lebenden Gewebe gehören der Dünndarm und der Dickdarm. Die Gewebe sind den vorstehenden lebenden Organen entnommen.
Das Fluorescein oder dessen Salz sind bei der vorliegenden Erfindung Fluorescein, Fluorescein-Natrium und Fluorescein-Kalium, und Fluorescein sowie Fluorescein-Natriumsalze sind vorzugsweise anzuwenden. Darunter sind insbesondere Fluorescein und ein Fluorescein-Dinatriumsalz (Uranin) anzuwenden. Das Fluorescein hat eine grüne Fluoreszenz (angeregt bei 490 nm) im Bereich von 520 nm und kann daher mit einem Ar-Laserlicht (488 nm, 514 nm) gut angeregt werden. Eine wässrige Lösung von Uranin ist ein Säurefarbstoff, der einen inneren molekularen Aufbau in Form eines Xanthenskeletts hat, das, auch in kleinen Mengen, bei Bestrahlung mit Licht eine grüne Fluoreszenz zeigt. Das Absorptionsmaximum des Uraninfarbstoffs liegt bei 450 bis 490 nm, jedoch treten abhängig von den Lösungsmitteln auch Unterschiede auf.
Zur Behandlung des Gewebes wird die das Fluorescein oder ein entsprechendes Salz enthaltende Lösung auf das Gewebe aufgebracht oder dieses in die Lösung eingetaucht. Aufgebracht wird es vorzugsweise dann, wenn ein lebendes Gewebe zu behandeln ist. Aufbringen bedeutet Sprühen, Träufeln usw.. Ist das Gewebe ein dem lebenden Körper entnommenes Gewebe, so wird es in die Lösung eingetaucht. Die Menge der aufgebrachten Lösung sollte so bemessen sein, dass die Lösung auf das gesamte Gewebe aufgebracht werden kann.
Der so behandelte Teil muss in eine saure Umgebung mit einem pH-Wert unter 7 gebracht werden, wenn die Fluoreszenz beobachtet wird. Die verwendete Lösung ist eine saure Lösung mit einem pH-Wertunter 7. Bei Verwendung einer sauren Lösung mit pH-Wert unter 7, die Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthält, kann das Gewebe direkt fluoreszierend beobachtet werden, nachdem es mit der Lösung behandelt wurde.
Die Lösung mit einem pH-Wert unter 7, die Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthält, wird durch Zugabe einer sauren Substanz zu einer wässrigen Lösung gebildet, die Fluorescein oder das Salz enthält. Solche Substanzen sind z. B. Phosphorsäure, Salzsäure, Kohlensäure, eine anorganische Säure oder eine nichttoxische organische Säure (z. B. Essigsäure oder Zitronensäure). Der pH-Wert liegt bei 4 bis 6,5. Vorzugsweise wird der pH-Wert mit einem Puffer eingestellt, insbesondere z. B. mit einer nichttoxischen, sauren Pufferlösung wie Natriumphosphat, Natriumacetat, Natriumcitrat oder Natriumcarbonat.
Die Fluoresceinkonzentration in der das Fluorescein oder ein entsprechendes Salz enthaltenden Lösung ist vorzugsweise 0,001 mg/ml bis 50 mg/ml, insbesondere 0,1 bis 10 mg/ml. Fluorescein mit einer Konzentration nicht unter 10 mg/ml ist eine Lösungsform, die leicht bei einem pH-Wert nicht über 5 aufgebracht werden kann. Fluorescein mit einer Konzentration nicht über 0,001 mg/ml hat nur schwache Färbungseigenschaften.
Wie oben beschrieben, wird der behandelte Teil des zu färbenden Gewebes in eine saure Umgebung mit einem pH-Wert unter 7 gebracht, indem er mit einer sauren Lösung behandelt wird, deren pH-Wert unter 7 liegt und die Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthält. Daher fluoresziert freies Fluorescein nicht, während nur das an dem Gewebe gebundene Fluorescein fluoresziert.
Die Fluoreszenz kann durch Bestrahlen mit Anregungslicht gemessen werden. Vorzugsweise wird das fluoreszenzgefärbte Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop, einem Fluoreszenzendoskop oder einem konfokalen Abbildungssystem betrachtet. Das konfokale Abbildungssystem enthält ein konfokales Abtastmikroskop und ein Endoskop mit einem konfokalen Abbildungssystem.
Ein Fluoreszenzfärbungsmittel zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren enthält nur eine Lösung von Fluorescein oder einem Salz von Fluorescein mit einem pH-Wert unter 7.
Beispiele
Die Erfindung wird nun ausführlicher unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
pH-Wert-abhängige Fluoreszenz von Fluorescein
Der pH-Wert einer wässrigen Lösung von Fluorescein-Natrium (1 mg/ml) wurde mit einer Pufferlösung von 0,1 Mol Natriumphosphat eingestellt und dann eine Messung bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 530 nm durchgeführt.
Ein Mikroplattenleser (hergestellt von Corona, MTP-800AFC) wurde bei der Fluoreszenzmessung verwendet.
Wie das in 1 dargestellte Ergebnis zeigt, steigt die Intensität der Fluoreszenz von Fluorescein mit zunehmenden pH-Werten.
Beispiel 2
Fluorescein-Natrium-Färbungstest mit Rattendickdarm
Der mit Formalin konservierte Dickdarm von Ratten (8 Wochen alt, männlich) wurde zum Beobachten eines Unterschieds der Färbungseigenschaft abhängig von dem pH-Wert verwendet. Die Dickdärme wurden für zehn Sekunden mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (137 mMol/l NaCl, 8,1 mMol/l Na₂HPO₄, 2,7 mMol/l KCl, 1,57 mMol/l KH₂PO₄, im Folgenden als PBS (–) bezeichnet) für zehn Sekunden gewaschen und dann in Lösungen von Fluorescein-Natrium (hergestellt von Sigma, F6377, im Folgenden als F-Na bezeichnet) eingetaucht, die auf 1 mg/ml mit sauren, alkalischen und neutralen Pufferlösungen eingestellt und verdünnt waren. Die neutralen, alkalischen und sauren Pufferlösungen waren 0,1 M Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0), 0,1 M Borat-Pufferlösung (pH 9,1) und 0,4 M NaH₂PO₄-Pufferlösung (pH 4,65). Nach weiterem Waschen für zehn Sekunden mit PBS (–) wurden die Dickdärme mit einer sauren 10%-Formalinpufferlösung konserviert und mit einem konfokalen Abtastmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems, TCS-SP2) betrachtet.
Obwohl alle Gewebeproben gut gefärbt waren, führte F-Na, gelöst mit Pufferlösungen mit pH 7,0 und 9,0 zu einem verstärkten Hintergrund und war daher zur Zellenbetrachtung nicht geeignet.
Beispiel 3
Unterschied der Durchdringung und der Fluoreszenz des Farbstoffs abhängig von pH-Änderungen im Lösungsmittel
Die Dickdärme von Ratten (8 Wochen alt, männlich) wurden extrahiert und einem Färbungstest unterzogen.

F-Na (hergestellt von Sigma, F6377) wurde auf 1 mg/ml eingestellt und mit 0,1 M Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0), 0,1 M Borat-Pufferlösung (pH 9,1) und 0,4 M NaH₂PO₄-Pufferlösung (pH 4,65) verdünnt, um die jeweilige 0,1 mg/ml Lösung zu erhalten, in die die Gewebe dann für eine Minute eingetaucht wurden. Nach weiterem Waschen für zehn Sekunden mit PBS (–) wurden die erhaltenen Gewebe mit einem konfokalen Abtastmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems, TCS-SP2) betrachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. [Tabelle 1]

Lösungsmittel	pH	Fluoreszenzintensität visuell geprüft (angezeigt in 5 Stufen)		Zustand des betrachteten Bildes (Klarheit des Fluoreszenzbildes)
Lösungsmittel	pH	Freie Fluoresceinflüssigkeit	Fluorescein im Gewebe
0,4 M NaH₂PO₄ Lösung	4,65	1	3	Klar
0,1 M Na Phosphat-Pufferlösung	7,0	5	3	Nicht klar, aber Gewebe erkennbar
0,1 M Na Borat-Pufferlösung	9,1	4	3	Flüssigkeit fluoresziert stärker

Beispiel 4
Die Gewebefärbung wurde im pH-Bereich 4 bis 7 unter isotonischen Bedingungen von F-Na (hergestellt von Sigma, F6377) beobachtet.
Die Dickdärme von Ratten (8 Wochen alt, männlich) wurden extrahiert. Sie wurden mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (137 mMol/l NaCl, 8,1 mMol/l Na₂HPO₄, 2,7 mMol/l KCl, 1,5 mMol/l KH₂PO₄, 4,4 mMol/l CaCl₂·2H₂O, 1,6 mMol/l MgCl2·6H₂O, im Folgenden als PBS (+) bezeichnet) gewaschen und dann durch Eintauchen für eine Minute in F-Na (0,1 mg/ml) auf jeden pH-Wert eingestellt. Die gefärbten Dickdärme wurden mit einem konfokalen Abtastmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems, TCS-SP2) betrachtet.
Hier wurde gleichzeitig eine Kontrollprüfung mit einer Salzlösung durchgeführt, weil eine Salzlösung als Lösungsmittel für F-Na bei der intravenösen Injektion usw. verwendet wird.
Die Abbildungsbedingungen für das konfokale Abtastmikroskop waren ein konfokaler Öffnungsdurchmesser von 1,00 in Luft, und es wurden zwei Arten von Linsen, 20× und 63× Öl-Immersionslinsen, verwendet. Das Mikroskop wurde zum automatischen Korrigieren eines Verstärkungswertes programmiert, und die Beobachtung erfolgte bei optimaler Leuchtdichte.

Fluorescein Na/D.W. wurde auf 5 mg/ml eingestellt und mit einer Zitronensäure-Phosphorsäure-Pufferlösung mit jedem pH-Wert und einer Salzlösung auf 0,1 mg/ml verdünnt. Die Dickdärme wurden in die eingestellten Färbungslösungen eingetaucht, dann mit PBS (+) gewaschen und beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. [Tabelle 2]

pH-Wert der Zitronensäure-Phosphorsäure-Pufferlösung	Fluoreszenz-Intensität visuell geprüft (angezeigt in 5 Stufen)		Zustand des betrachteten Bildes (Klarheit des Fluoreszenzbildes)
pH-Wert der Zitronensäure-Phosphorsäure-Pufferlösung	Freie Fluoresceinflüssigkeit	Fluoreszenz im Gewebe
4,0	1	3	Klar
5,0	1	4	Klar
6,0	2	4	Klar
7,0	3	4	Nicht klar, aber Gewebe erkennbar
Salzlösung	3	4	Flüssigkeit fluoresziert stärker

Beispiel 5
Scheiben der in Beispiel 4 verwendeten Dickdärme wurden beobachtet, und es wurde der Eindringgrad einer Färbungslösung beobachtet. Fluorescein-Natrium wurde auf 0,1 mg/ml wie in Beispiel 4 durch Verdünnen mit Lösungen mit pH 4,0, 5,0, 6,0 und 7,0 und einer Salzlösung eingestellt.
Die Abbildung erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop (hergestellt von ZEISS, LSM510) bei einem Öffnungsdurchmesser von 1,0 und Max, und es wurden 20× und 40×-Linsen verwendet.
Die Beobachtung der Scheiben zeigte, dass ein Teil in der Größenordnung von 50 μm in der Epithelzelle gut gefärbt war, und dass in diesem Teil eine starke Fluoreszenz auftrat.
Bei der Beobachtung mit Färbungslösungen mit veränderlichen pH-Werten ergab sich kein merklicher Unterschied der Eindringtiefe in die Gewebe.
Wie die Beispiele 1 bis 5 ergeben, zeigt Fluorescein in freier und in gewebegebundener Form bei alkalischen Bedingungen eine Fluoreszenz, während nur die gewebegebundene Form unter sauren Bedingungen eine Fluoreszenz zeigt.
Beispiel 6
Die Beobachtung wurde bei verschiedenen Konzentrationen und einem konstanten pH-Wert von 6,0 durchgeführt.
Die Konzentration von F-Na (hergestellt von Sigma, F6377) wurde auf 10, 1,0, 0,1, 0,01 oder 0,001 mg/ml eingestellt. Nach dem Einstellen auf die jeweilige Konzentration mit einer Zitronensäure-Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 6,0) erfolgte die Beobachtung mit einem konfokalen Abtastmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems, TCS-SP2).
Die Abbildungsbedingungen für das konfokale Abtastmikroskop waren ein konfokaler Öffnungsdurchmesser von 1,00 in Luft und zwei Öl-Immersionslinsen 20× und 63×. Das Mikroskop wurde zur automatischen Korrektur eines Verstärkungswertes programmiert, und es wurde bei optimaler Leuchtdichte beobachtet.
Obwohl das gefärbte Bild mit den geringen F-Na-Konzentrationen 0,01 und 0,001 mg/ml bestätigt wurde, konnte ein klares Bild infolge geringer Leuchtdichte nicht erzielt werden.
Als Ergebnis wurde eine zu einem klaren Bild führende Gewebedurchlässigkeit im Bereich von 0,1 bis 10 mg/ml erzielt.
Beispiel 7
Scheiben der Dickdärme aus Beispiel 6 wurden betrachtet, und es wurde der Durchdringungsgrad einer Färbungslösung beobachtet.
Die Konzentration des Fluorescein-Natriums wurde auf 100, 10, 1,0, 0,1, 0,01 und 0,001 mg/ml wie in Beispiel 6 beschrieben eingestellt. Nach dem Einstellen auf die jeweilige Konzentration mit einer Zitronensäure-Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 6,0) wurde die Abbildung mit einem konfokalen Abtastmikroskop (hergestellt von ZEISS, LSM510) erzeugt, wobei die Abbildungsbedingungen ein konfokaler Öffnungsdurchmesser von 1,0 und Max sowie 20×- und 40×-Linsen waren.
Als Ergebnis der Beobachtung mit unterschiedlichen Fluorescein-Natriumkonzentrationen färbten die Färbungslösungen mit höheren Konzentrationen die Schleimhäute dunkler. [Tabelle 3]

Konzentration (mg/ml) Schleimhäute Epithelzelle Kern Becher

10 +++ +++ – –

1,0 ++ +++ – –

0,1 ++ +++ – –

0,01 + +++ – –

0,001 + +++ – –

+: je größer die Zahl der +, desto besser die Färbung des Gewebes
–: nicht gefärbt
Beispiel 8
Beobachtung der Färbungseigenschaft von Fluorescein-Natrium mit dem Fluoreszenzmikroskop
Nach dem Färben mit Fluorescein-Natrium (auch als F-Na bezeichnet) erfolgte die Beobachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems, DM IRB).
Mit Formalin konservierte Dünndärme von Kaninchen wurden als Proben verwendet und bei pH 4,0 und 9,0 beobachtet.
F-Na wurde auf 1 mg/ml mit einer Salzlösung eingestellt und durch Verdünnen mit 0,1 M Phosphorsäure-Puffer auf 0,01 mg/ml auf jeden pH-Wert eingestellt.
Die auf jeden pH-Wert eingestellte Färbungslösung wurde auf die in Formalin konservierten Dünndärme der Kaninchen ohne Waschen aufgebracht. Die überschüssige Färbungslösung wurde durch Adsorption mit einem Filterpapier entfernt und dann eine Beobachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop vorgenommen. Die verwendete Objektivlinse hatte eine Vergrößerung von 40 mal.
Als Ergebnis färbte die Färbungslösung mit pH = 4,0 die Dünndarmzotten auch ohne Waschprozedur nach dem Färben und ergab ein klares Färbungsbild. Wurde die Beobachtung aber direkt nach dem Färben mit der Färbungslösung mit pH 9,0 durchgeführt, so wurde eine Fluoreszenz aus einer Flüssigkeit außerhalb des Gewebes und nicht von den Dünndarmzotten abgegeben und es ergab sich ein unklares Bild. Die 0,1 M-Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 9,0) in der Verdünnung erforderte ein Waschen zum Entfernen der benachbarten fluoreszenten Lösung.
Beispiel 9
Färben durch Infusion von Fluorescein-Natrium in den Darm
In lebenden Körpern sondern die Verdauungsorgane dauernd Schleim ab, der vom Körper aufgenommen und verdaut wird. Zum Bestätigen der Vorteile der vorliegenden Erfindung in einer Umgebung ähnlich dem Einsatz eines Endoskops wurden die Färbungseigenschaften von Fluorescein-Natrium im Dickdarm eines lebenden Körpers beobachtet.
Es wurde der Dickdarm eines lebenden Körpers bei zwei pH-Werten im sauren und im alkalischen Bereich gefärbt und mit einem konfokalen Abtastmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems, TCS-SP2) beobachtet.
Einer Maus (9 Wochen alt, männlich) wurde unter Narkose mit einer Spritze (Terumo 27G, 0,4 mm) im oberen Teil des Dickdarms 500 μl F-Na (pH 4; 1 mg/ml) injiziert. Nach zehn Minuten wurde der Dickdarm extrahiert, und das Innere wurde mit PBS (+) gewaschen.
Der extrahierte Teil des Dickdarms ergab sich durch Ausschneiden von 5,5 bis 6,5 cm aus dem Blinddarm.
Wie 2 zeigt (Verstärkungswert 480 V, etwa 0 μm Abstand zu dem Epithel), wurde die Gewebestruktur bei Verwendung von F-Na mit pH 4,0 klar beobachtet, und die Becherzelle war nicht gefärbt.
Ferner wurde zur Beobachtung eine Färbungslösung von F-Na mit pH 9,0 (1 mg/ml, 500 μl) verwendet. Die Färbungslösung mit pH 9,0 ergab einen geringen Unterschied der Fluoreszenz-Leuchtdichte zwischen dem gefärbten Bereich und einer Flüssigkeitsansammlung, die freies F-Na enthielt, und ergab ein unklares Gewebebild (3) im Vergleich zu der vorherigen Beobachtung.

Claims

Verfahren zum Fluoreszenzfärben eines Gewebes, gekennzeichnet durch Behandeln eines Gewebes mit einer Lösung von Fluorescein oder einem seiner Salze und anschließendes Beobachten der Fluoreszenz des behandelten Teils unter sauren Bedingungen bei einem pH-Wert von 4 bis 6,5, wobei das Gewebe ein Gewebe des Dünndarms oder des Dickdarms ist, bei dem die Behandlung des Gewebes mit der das Fluorescein oder eines seiner Salze enthaltenden Lösung in dem Aufbringen der Lösung auf das Gewebe oder in dem Eintauchen des Gewebes in die Lösung besteht, und bei dem die das Fluorescein oder eines seiner Salze enthaltende Lösung eine saure Lösung mit einem pH-Wert von 4 bis 6,5 ist.
Verfahren zum Untersuchen von einem Gewebe des Dünndarms oder des Dickdarms mit einem Fluoreszenzmikroskop, einem Fluoreszenzendoskop oder einem konfokalen Abbildungssystem, wobei das Gewebe des Dünndarms oder des Dickdarms nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 gefärbt wurde.