FR2897940A1 - Procede de coloration d'un tissu par fluorescence. - Google Patents
Procede de coloration d'un tissu par fluorescence. Download PDFInfo
- Publication number
- FR2897940A1 FR2897940A1 FR0752876A FR0752876A FR2897940A1 FR 2897940 A1 FR2897940 A1 FR 2897940A1 FR 0752876 A FR0752876 A FR 0752876A FR 0752876 A FR0752876 A FR 0752876A FR 2897940 A1 FR2897940 A1 FR 2897940A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- tissue
- solution
- fluorescence
- fluorescein
- salt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000004040 coloring Methods 0.000 title description 15
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 84
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 85
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 19
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 7
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 abstract description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 89
- 229960002143 fluorescein Drugs 0.000 description 57
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 26
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 10
- 229940020947 fluorescein sodium Drugs 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 5
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(3-oxido-6-oxoxanthen-9-yl)benzoate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=O)C=C2OC2=CC([O-])=CC=C21 NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 2
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKMDIIJZOFXHFU-UHFFFAOYSA-N [bis(hydroxymethyl)-$l^{3}-chloranyl]methanol Chemical compound OCCl(CO)CO DKMDIIJZOFXHFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960005337 lysine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004798 organs belonging to the digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229960003975 potassium Drugs 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001834 xanthenyl group Chemical group C1=CC=CC=2OC3=CC=CC=C3C(C12)* 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
- A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Endoscopes (AREA)
Abstract
L'invention concerne un procédé pour colorer par fluorescence un tissu de manière précise et nette avec un agent colorant fluorescent.Elle concerne également une solution d'agent colorant fluorescent, comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels, le tissu étant traité avec la solution et la partie est ensuite observée par fluorescence dans des conditions acides à un pH inférieur à 7.Domaine d'application : coloration nette par fluorescence de tissus de corps vivants ou dérivés de corps vivants.
Description
La présente invention concerne un procédé pour la coloration par
fluorescence d'un tissu corporel vivant ou d'un tissu dérivé d'un corps vivant de manière corrraode et nette, ainsi qu'un agent de coloration utilisé dans ce procédé.
L'obtention d'images en coupe transversale de tissus d'un corps vivant a une extrême importance dans le domaine de la biologie médicale. Des images en coupe transversale de tissus extraits de corps vivants ont pu être obtenues auparavant par fixation chimique, déshydratation, débitage en coupes et coloration. L'élaboration d'un système d'imagerie confocale et la prévalence d'un microscope à balayage laser confocal ont permis l'observation non invasive de cellules et de tissus lors de l'observation de coupes d'échantillons biologiques avec des cellules en couches multiples enchevêtrées et des tissus conjonctifs. Des endoscopes médicaux équipés d'un système d'imagerie confocale incorporé ont été récemment élaborés. L'observation d'images fluorescentes dans un système optique confocal fait intervenir des modes opératoires pour la coloration d'un tissu d'un corps vivant et d'un échantillon qui en est dérivé avec un colorant fluorescent. Lorsqu'un tissu de corps vivant est observé avec un microscope à balayage confocal et un endoscope médical équipé de ce microscope, un réactif pour coloration doit être biologiquement sûr. La fluorescéine a été utilisée classiquement comme agent de contraste fluorescent qui est sûr pour les corps vivants en fondoscopie et procédés similaires, dans lesquels une solution aqueuse de cet agent est injectée par voie intraveineuse (document non-brevet 1). En variante, un tissu peut être coloré en saupoudrant directement un réactif pour coloration sur la surface du tissu, sans passage par des vaisseaux sanguins tels que les veines. Le procédé comprenant l'aspersion directe de la surface d'un tissu avec une solution colorante est un moyen efficace pour colorer des organes extraits. Dans la coloration d'un tissu in vivo également, ce procédé, par comparaison avec le procédé de coloration impliquant une injection intraveineuse et une perfusion, a pour avantage de permettre de réduire l'influence d'une solution colorante sur les corps vivants car le procédé nécessite seulement une petite quantité de la solution colorante et ne comporte aucune perfusion du colorant à un site qui ne nécessite pas de perfusion dans les corps vivants. La solution de fluorescéine répandue sur la surface d'un tissu d'un corps vivant pénètre la région interne du tissu, et une partie de la solution persiste sous forme d'un volume de liquide sur la surface du tissu. Si le tissu est irradié avec de la lumière d'excitation dans cet état, la molécule de fluorescéine ayant pénétré et la molécule de fluorescéine restant sur la surface du tissu émettent une fluorescence, ce qui brouille la distinction entre les sites colorés et non colorés. En conséquence, dans le procédé comprenant l'étape consistant à répandre l'agent colorant sur la surface du tissu, une molécule de fluorescéine libre restant sur le site non coloré a dû être éliminée par lavage. Le colorant libre peut être éliminé par lavage de l'échantillon de tissu coloré plusieurs fois avec un tampon ou une solution approprié. Cependant, l'échantillon à observer présente une surface très délicate et doit être lavé avec précaution pour éviter la déformation ou l'altération de l'échantillon et la dénaturation du tissu. Ainsi, les modes opératoires de lavage doivent être effectués doucement et soigneusement. En outre, un lavage excessif provoque également le détachement du tissu coloré (décoloration). D'autre part, lorsqu'un échantillon de tissu extrait est coloré sans effectuer de fixation chimique et est observé avec un microscope à balayage confocal, l'autolyse du tissu ainsi qu'une dénaturation des cellules ou des protéines se produisent au cours des modes opératoires de lavage, ce qui pose le problème de l'obtention d'un échantillon ayant un état différent de celui de l'échantillon dans le corps vivant. [Document non-brevet 1] Gaestroenterology, 127 (3), 706-713, 2004 Un objectif de la présente invention consiste à proposer un procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu de manière précise et nette par des modes opératoires commodes, et un agent colorant utilisé dans ce procédé.
Ainsi, le présent inventeur a focalisé son attention sur la fluorescéine et a effectué diverses études. De la fluorescéine dissoute en solution aqueuse présente une fluorescence à un pH alcalin et ne présente presque pas de fluorescence dans une solution acide. Ainsi, la fluorescéine a été utilisée classiquement sous forme d'une solution alcaline et l'observation de la fluorescence a été effectuée dans des conditions alcalines. Cependant, le présent inventeur a trouvé d'après diverses études que, de manière totalement inattendue, la fluorescéine liée à un tissu présente une fluorescence nette dans des conditions acides malgré le fait que la fluorescéine ne présente presque pas de fluorescence dans une solution acide. En conséquence, si un tissu traité avec de la fluorescéine est placé dans des conditions acides au cours de l'observation de fluorescence, seule la fluorescéine liée au tissu est capable sélectivement d'effectuer une coloration par fluorescence, tandis que la fluorescéine non liée au tissu ne présente presque pas de fluorescence. En conséquence, le présent inventeur à trouvé qu'une image colorée par fluorescence nette et précise d'un tissu pouvait être obtenue sans effectuer de procédures complexes de lavage. D'après ces découvertes, la présente invention a été menée à bonne fin. Plus précisément, la présente invention propose un procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu, comprenant le traitement d'un tissu avec une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels, puis par l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7. La présente invention propose également un agent de coloration fluorescent pour un tissu, comprenant une solution qui comprend de la fluorescéine ou un de ses sels, pour le traitement d'un tissu, suivi de l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7. La présente invention propose en outre l'utilisation d'une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels pour la production d'un agent colorant fluorescent pour un tissu, pour le traitement d'un tissu, suivi de l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7.
Suivant le procédé de coloration de la présente invention, une image colorée nette et précise peut être obtenue car seule la fluorescéine liée à un tissu est capable sélectivement de provoquer une coloration par fluorescence. A ce propos, la fluorescéine est généralement hautement dépendante du pH et sa propriété de fluorescence tend à s'amplifier encore à des valeurs de pH plus élevées. Seule une molécule de fluorescéine qui a pénétré dans la région interne d'un tissu d'un corps vivant et qui s'est liée au tissu émet une fluorescence intense par coloration du tissu du corps vivant dans des conditions préalablement inenvisageables, les conditions d'observation de fluorescence choisies étant des conditions acides. Dans ces conditions, une molécule de fluorescéine libre n'émet pas de fluorescence. En conséquence, une image colorée par fluorescence du tissu d'un corps vivant peut être observée sans effectuer de procédures complexes et invasives telles qu'un lavage après coloration et une perfusion. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée qui suit, en regard des dessins 35 annexés sur lesquels : la figure 1 est un diagramme représentant la dépendance de l'émission de fluorescence de la fluorescéine vis-à-vis du pH ; la figure 2 est un diagramme représentant une image colorée par fluorescence du gros intestin traité avec une solution de fluorescéine à pH 4,0, puis l'observation par fluorescence ; et la figure 3 est un diagramme représentant une image colorée par fluorescence du gros intestin traité avec une solution de fluorescéine à pH 9,0, puis l'observation par fluorescence. DESCRIPTION DETAILLEE DES FORMES DE REALISATION PREFEREES Dans un procédé de la présente invention, un tissu est traité avec une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels. Dans ce contexte, le tissu comprend un tissu d'un corps vivant et un tissu dérivé d'un corps vivant (tissu extrait). Le tissu d'un corps vivant comprend le tissu de l'oesophage, de l'estomac, du duodénum, de l'intestin grêle, du gros intestin, du rectum, de la cavité buccale ou le tissu de la lumière d'organes internes. Le tissu dérivé d'un corps vivant comprend un tissu dérivé de ces tissus d'un corps vivant et comprend en outre un tissu dérivé de divers organes et tissus musculaires. La fluorescéine ou son sel utilisé dans la présente invention comprend la fluorescéine, la fluorescéine sodique et la fluorescéine potassique, la fluorescéine et les sels de sodium de fluorescéine étant particulièrement préférables. Parmi ces agents, la fluorescéine et un sel disodique de fluorescéine (uranine) sont particulièrement préférables. La fluorescéine présente une fluorescence verte (excitation à 490 nm) à environ 520 nm et est donc excitée convenablement avec la lumière d'un laser à Ar (488 nm, 514 nm). Une solution aqueuse d'uranine est une solution d'un colorant acide ayant au niveau intramoléculaire un squelette xanthène qui, bien qu'étant présent en petites quantités, émet de la fluorescence verte par exposition à la lumière. Le maximum d'absorption du colorant uranine est de 450 à 490 nm, bien qu'il diffère en fonction des solvants. De préférence, le moyen pour le traitement du tissu de la présente invention est l'application de la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels au tissu ou bien l'immersion du tissu dans la solution. Dans ce contexte, l'application est préférable dans le cas où un tissu d'un corps vivant est utilisé comme tissu à traiter.
Le moyen d'application comprend la pulvérisation, l'aspersion et les moyens similaires. Lorsqu'un tissu dérivé d'un corps vivant est utilisé comme tissu, l'application ou immersion est utilisée. La quantité de solution à appliquer peut être une quantité qui permet d'étaler la solution sur la totalité du tissu à traiter. La partie traitée doit seulement être placée dans des conditions acides à pH inférieur à 7 au cours de l'observation de fluorescence et, ainsi, la solution utilisée peut être une solution basique à pH non inférieur à 7 ou une solution acide à pH inférieur à 7. Lorsqu'une solution basique à pH non inférieur à 7 comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est utilisée, le tissu est traité avec la solution, et la partie traitée peut être ensuite observée par fluorescence après lavage avec une solution acide à pH inférieur à 7. En variante, lorsqu'une solution acide à pH inférieur à 7 comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est utilisée, le tissu est traité avec la solution et peut être observé directement par fluorescence.
La solution à pH non inférieur à 7 comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est préparée en ajoutant une substance basique, par exemple l'hydroxyde de sodium, l'acétate de sodium, le phosphate acide de sodium ou la glycine, qui ajuste le pH de la solution aqueuse à une valeur non inférieure à 7, à une solution aqueuse comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels. De préférence, le pH est de 7 à 10, de manière particulièrement préférable de 7 à 8. De préférence, le pH est ajusté avec un tampon, plus avantageusement avec, par exemple, du phosphate de sodium, du chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, du chlorhydrate de lysine ou du chlorhydrate d'arginine. La solution à pH inférieur à 7 comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est préparée en ajoutant une substance acide, par exemple l'acide phosphorique, l'acide chlorhydrique, l'acide carbonique, un acide inorganique ou un acide organique non toxique (par exemple l'acide acétique ou l'acide citrique) qui ajuste le pH de la solution aqueuse à une valeur inférieure à 7, à une solution aqueuse comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels. Le pH préférable est de 4 à 6,5, de manière particulièrement appréciée de 6 à moins de 7. De préférence, le pH est ajusté avec un tampon, plus avantageusement avec, par exemple, une solution tampon acide non toxique comme une solution de phosphate de sodium, d'acétate de sodium, de citrate de sodium ou de carbonate de sodium. La concentration en fluorescéine de la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est avantageusement de 0,001 mg/ml à 50 mg/ml, plus avantageusement de 0,1 à 10 mg/ml. La fluorescéine à concentration non inférieure à 10 mg/ml est présente sous forme d'une solution qui est aisément déposée à un pH non inférieur à 5. La fluorescéine à concentration non supérieure à 0,001 mg/ml a une faible propriété de coloration. Comme décrit ci-dessus, la partie traitée du tissu à colorer est placée dans des conditions acides à pH inférieur à 7 par lavage avec une solution acide ou traitement avec une solution acide à pH inférieur à 7, comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels. En conséquence, la fluorescéine libre n'émet pas de fluorescence, tandis que seule la fluorescéine liée au tissu émet de la fluorescence.
L'observation de la fluorescence peut être mesurée par irradiation avec une lumière d'excitation. De préférence, l'image colorée par fluorescence est observée avec un microscope à fluorescence, un endoscope à fluorescence ou un système d'imagerie confocale. Le système d'imagerie confocale comprend un microscope à balayage confocal et un endoscope avec un système d'imagerie confocale. Un agent colorant fluorescent de la présente invention comprend seulement une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels lorsque la solution est une solution acide à pH inférieur à 7. D'autre part, l'agent colorant fluorescent comprend une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels en association avec une solution acide à pH inférieur à 7 (pour le lavage) lorsque la solution est une solution basique à pH non inférieur à 7. Exemples La présente invention est décrite ensuite plus spécifiquement par référence à des exemples. Exemple 1 Emission de fluorescence, dépendant du pH, de la fluorescéine Le pH d'une solution aqueuse de fluorescéine sodique (1 mg/ml) a été ajusté avec une solution tampon au phosphate de sodium 0,1 M, avec ensuite la mesure à une longueur d'onde d'excitation de 490 nm et une longueur d'onde de fluorescence de 530 nm. Un lecteur de microplaques (produit par Corona, MTP-800AFC) a été utilisé lors de la mesure de fluorescence. Comme le montrent les résultats représentés sur la figure 1, l'intensité de fluorescence de la fluorescéine devient plus forte à des valeurs de pH plus élevées. Exemple 2 Test de coloration au moyen de fluorescéine sodique sur du gros intestin de rat Les gros intestins de rats (âgés de 8 semaines, mâles), fixés avec une solution de formaldéhyde ont été utilisés pour observer une différence de propriété de coloration en fonction du pH. Les gros intestins ont été lavés pendant 10 secondes avec du sérum physiologique tamponné avec un phosphate (137 mol/1 de NaCl, 8,1 mmol/l de Na2HPO4, 2,7 mmol/l de KC1, 1,57 mol/1 de KH2PO4, appelé ci-après STP (-)) et ont été ensuite immergés dans des solutions de fluorescéine sodique (produite par Sigma, F6377, appelée ci-après F-Na) ajustées et diluées à 1 mg/ml avec des solutions tampons acide, alcaline et neutre. Les solutions tampons neutre et alcaline et la solution tampon acide utilisées étaient une solution tampon au phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,0), une solution tampon au borate 0,1 M (pH 9,1) et une solution tampon au NaH2PO4 0,4 M (pH 4,65), respectivement. Après un lavage supplémentaire pendant 10 secondes avec du STP (-), les gros intestins résultants ont été fixés avec une solution tampon acide à 10 % de formaldéhyde et ont été observés avec un microscope à balayage confocal (produit par Leica Microsystems, TCS-SP2). Bien que tous les échantillons de tissus aient été convenablement colorés, la F-Na diluée avec les solutions tampons à pH 7,0 et 9,0 ont présenté un fond plus intense et étaient donc impropres à l'observation des cellules. Exemple 3 Différence de perméation et de propriété de fluorescence du colorant en fonction des variations du pH du solvant Les gros intestins de rats (âgés de 8 semaines, mâles) ont été extraits et soumis à un test de coloration. De la F-Na (produite par Sigma, F6377) a été ajustée à 1 mg/ml et diluée avec une solution tampon au phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,0), une solution tampon au borate 0,1 M (pH 9,1) et une solution tampon au NaH2PO4 0,4 M (pH 4,65) pour préparer leurs solutions respectives à 0,1 mg/ml, dans lesquelles les tissus ont été ensuite immergés pendant 1 minute. Après un lavage supplémentaire pendant 10 secondes avec du STP (-), les tissus résultants ont été observés avec un microscope à balayage confocal (produit par Leica, 5 10 15 20 25 30 35 Microsystems, TCS-SP2). Les résultats sont présentés sur le tableau 1. [Tableau 1] Solvant pH Intensité de fluorescence examinée Etat de l'image observée (netteté de l'image fluorescente) -visuellement (indiquée dans cinq rangées) Fluorescéine libre Fluorescéine dans dans le volume de la région interne liquide du tissu Solution de 4,65 1 3 Nette NaH2PO4 0,4 M Solution 7,0 5 3 Pas nette mais le tampon au tissu est phosphate de identifiable Na 0,1 M Solution 9,1 4 3 Le -volume de liquide tampon au présente une borate de Na fluorescence plus 0,1 M intense Exemple 4 L'observation de la coloration des tissus a été effectuée dans la plage de pH de 4 à 7 dans des conditions isotoniques de F-Na (produite par Sigma, F6377). Les gros intestins de rats (âgés de 8 semaines, mâles) ont été extraits. Ils ont été lavés avec du sérum physiologique tamponné avec un phosphate (137 mol/1 de NaCl, 8,1 mol/1 de Na2HPO4, 2,7 mol/1 de KC1, 1,5 mol/1 de KH2PO4, 4,4 mol/1 de CaC12.2H20, 1,6 mol/1 de MgC12.6H20, appelé ci-après STP (+), et ils ont été ensuite colorés par immersion pendant 1 minute dans une solution de F-Na (à 0,1 mg/ml) ajustée à chaque pH. Les gros intestins colorés ont été observés avec un microscope à balayage confocal (produit par Leica, Microsystems, TCS-SP2). Ici, un test témoin utilisant du sérum physiologique a été effectué en même temps. Cela est dû au fait que du sérum physiologique a été utilisé comme solvant pour la F-Na utilisée dans l'injection intraveineuse et des opérations similaires.
Les conditions d'imagerie pour le microscope à balayage confocal comprenaient un diamètre d'ouverture confocale de 1,00 airy, et deux types de lentille consistant en des lentilles à immersion dans l'huile 20x et 63x ont été utilisés. Le microscope a été programmé pour corriger automatiquement une valeur de gain et l'observation a été effectuée à la luminance optimale. La solution de fluorescéine Na/eau désionisée a été ajustée à 5 mg/ml et diluée à 0,1 mg/ml avec une solution tampon à l'acide citrique-acide phosphorique à chaque pH et du sérum physiologique. Les gros intestins ont été immergés dans les solutions colorantes ajustées, puis ont été lavés avec du STP (+) et observés. Les résultats sont présentés sur le tableau 2. [Tableau 2] pH de la solution Intensité de fluorescence examinée Etat de l'image tampon à l'acide observée citrique-acide (netteté de phosphorique l'image fluorescente) visuellement (indiquée dans cinq rangées) Fluorescéine libre Fluorescéine dans la dans le volume de région interne du liquide tissu 4,0 1 3 Nette 5,0 1 4 Nette 6,0 2 4 Nette 7,0 3 4 Pas nette, mais le tissu est identifiable Sérum 3 4 Le volume de physiologique liquide présente une fluorescence plus intense Exemple 5 Des coupes des gros intestins utilisés dans l'exemple 4 ont été observées et le degré de perméation d'une solution colorante a été observé. La fluorescéine sodique a été ajustée à 0,1 mg/ml de la même manière que dans l'exemple 4, par dilution avec des solutions à des pH de 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 et du sérum physiologique. 25 30 35 L'imagerie a été effectuée avec un microscope à fluorescence (produit par ZEISS, LSM510) dans des conditions d'imagerie comprenant un diamètre d'ouverture de 1,0 et Max, et des lentilles 20x et 40x ont été utilisées.
L'observation des coupes a montré qu'une partie de l'ordre de 50 pm dans la cellule épithéliale est colorée convenablement et une fluorescence intense est observée dans cette partie. Lors de l'observation utilisant les solutions colorantes avec des valeurs de pH variables, aucune différence significative n'a été observée quant au degré de perméation dans les tissus. Comme le montrent les exemples 1 à 5, la fluorescéine sous forme libre et la fluorescéine sous forme liée à un tissu émettent toutes deux une fluorescence dans des conditions alcalines, tandis que seule la forme liée à un tissu émet de la fluorescence dans des conditions acides. Exemple 6 L'observation a été effectuée à une concentration 20 variable à un pH constant fixé à 6,0. La concentration de F-Na (produite par Sigma, F6377) a été fixée à 10, 1,0, 0,1, 0,01 ou 0,001 mg/ml. Après ajustement à chaque concentration avec une solution tampon à l'acide citrique-acide phosphorique (pH 6,0), 25 l'observation a été effectuée avec un microscope à balayage confocal (produit par Leica Microsystems, TCS-SP2). Les conditions d'imagerie pour les microscopes à balayage confocal comprenaient un diamètre d'ouverture confocale de 1,00 airy, et deux types de lentille, 30 consistant en des lentilles à immersion dans l'huile 20x et 63x, ont été utilisés. Le microscope a été programmé pour corriger automatiquement une valeur de gain et l'observation a été effectuée à la luminance optimale. Bien que l'image colorée ait été confirmée avec les 35 faibles concentrations en F-Na, à savoir de 0,01 à 0,001 mg/ml, une image nette n'a pu être obtenue en raison d'une faible luminance. En résultat, une image nette mettant en évidence la perméabilité du tissu a été obtenue dans l'intervalle de 5 0,1 à 10 mg/ml. Exemple 7 Des coupes des gros intestins utilisés dans l'exemple 6 ont été observées et le degré de perméation d'une solution colorante a été observé. 10 La concentration de fluorescéine sodique a été fixée à 100, 10, 1,0, 0,1, 0,01 ou 0,001 mg/ml, comme dans l'exemple 6. Après ajustement à chaque concentration avec une solution tampon à l'acide citrique-acide phosphorique (pH 6,0), l'imagerie a été effectuée avec un microscope à 15 balayage confocal (produit par ZEISS, LSM510) dans des conditions d'imagerie comprenant un diamètre d'ouverture confocale de 1,0 et Max, et des lentilles de 20x et 40x ont été utilisées. En résultat, lors de l'observation avec des 20 concentrations variables de fluorescéine sodique, les solutions colorantes de plus fortes concentrations ont donné une concentration plus foncée du chorion de la membrane muqueuse. [Tableau 3] 25 Concentration Chorion de la Cellule Noyau Gobelet (mg/ml) membrane muqueuse épithéliale 10 +++ +++ 1,0 ++ +++ 0,1 ++ +++ 0,01 + +++ 0,001 + +++ - - + : Plus le nombre de signes + augmente, plus le tissu est coloré avantageusement - : Non coloré 30 35 Exemple 8 Observation de la propriété de coloration de la fluorescéine sodique avec un microscope à fluorescence Après coloration avec de la fluorescéine sodique (appelée ci-après F-Na), l'observation a été effectuée avec un microscope à fluorescence (produit par Leica Microsystems, DM IRB). Des intestins grêles de lapin, fixés avec une solution de formaldéhyde, ont été utilisés comme échantillons et observés dans des conditions de pH de 4,0 à 9,0. 10 La F-Na a été ajustée à 1 mg/ml avec du sérum physiologique et a été réajustée à 0,01 mg/ml par dilution avec un tampon à l'acide phosphorique 0,1 M à chaque pH. La solution colorante ajustée à chaque pH a été appliquée aux intestins grêles de lapin fixés au formaldéhyde, sans 15 effectuer de procédures de lavage. L'excès de solution colorante a été éliminé par adsorption avec du papier-filtre, puis l'observation a été effectuée avec un microscope à fluorescence. L'objectif utilisé avait un grossissement de 40x. En résultat, la solution colorante à pH 4,0 a coloré 20 les villosités d'intestin grêle de lapin, même sans effectuer de procédures de lavage après coloration, et à donné une image colorée nette. Cependant, lorsque l'observation a été effectuée directement après coloration avec la solution colorante à pH 9,0, de la fluorescence a 25 été émise par un liquide à l'extérieur du tissu plutôt qu'à partir des villosités, et une image non nette a été obtenue. La solution tampon à l'acide phosphorique 0,1 M (pH 9,0) utilisée dans la dilution a nécessité des modes opératoires de lavage pour l'élimination de la solution fluorescente voisine. 30 Exemple 9 Coloration par perfusion intestinale de fluorescéine sodique Dans des corps vivants, les organes digestifs sécrètent constamment du mucus, le mucus sécrété étant absorbé dans les organismes et digéré. Pour vérifier les 35 avantages de la présente invention dans un environnement similaire à l'utilisation dans un endoscope, la propriété de coloration de la fluorescéine sodique pour le gros intestin d'un corps vivant a été observée. La coloration du gros intestin des corps vivants à deux valeurs de pH dans les régions acide et alcaline et également l'observation avec un microscope à balayage confocal (produit par I.eicaMicrosystems, TCS-SP2) ont été effectuées. Une souris (âgée de 9 semaines, mâle) a été soumise à l'injection, sous anesthésie, de 500 .il de F-Na (pH 4, 1 mg/ml) par la partie supérieure du gros intestin en utilisant une seringue (Terumo de câlibre 27, 0,4 mm). Au bout de 10 minutes, le gros intestin a été extrait et l'intérieur de l'intestin a été lavé avec du STP (+). Le site extrait du gros intestin a été obtenu en prélevant de 5,5 à 6,5 cm à partir du caecum.
Comme le montre la figure 2 (valeur de gain de 480 V, approximativement 0,1 pm à partir de l'épithélium), la structure du tissu a été observée nettement en utilisant de la F-Na à pH 4,0, et la cellule en gobelet était non colorée. En outre, une solution colorante de F-Na à pH 9,0 (1 mg/ml, 500 pl) a été utilisée pour effectuer l'observation. La solution colorante à pH 9,0 a provoqué une faible différence de luminance de fluorescence entre le site coloré et un volume de liquide contenant de la F-Na libre et a donné une image non nette du tissu, comme dans l'observation précédente effectuée avec différentes valeurs de pH (figure 3). Exemple 10 Différence de propriété de coloration en fonction du pH de la solution de lavage lors de la coloration avec de la fluorescéine sodique De la fluorescéine sodique (appelée ci-après F-Na) émet une fluorescence intense en solution aqueuse à pH non inférieur à 7. Lors de la coloration de la surface d'un tissu avec une solution aqueuse de F-Na à pH non inférieur à 7, la molécule de F-Na présente dans la région interne du tissu et la molécule de F-Na présente dans un volume de liquide sur la surface du tissu présentent toutes deux une propriété de fluorescence et rendent donc difficile l'observation du tissu coloré. La F-Na présente dans le volume de liquide peut être éliminée par lavage de la surface du tissu. Cependant, la F-Na présente dans la région interne du tissu est égalementéluée en raison de modes opératoires de lavage, donnant un effet de coloration réduit. Ainsi, après la coloration d'un tissu avec une solution aqueuse de F-Na à pH non inférieur à 7, une petite quantité d'une solution acide à pH inférieur à 7 a été appliquée (par aspersion) au tissu pour supprimer ainsi la propriété de fluorescence de la F-Na libre qui n'a pas participé à la coloration. Puis l'observation après coloration a été effectuée. Les résultats sont présentés sur le tableau 4. [Tableau 4] pH de la solution pH 9,0 -> pH 7,0 -~ pH 4,0 - de coloration -3 pH pH 4,0 pH 4,0 pH 7,0 de la solution de lavage Région interne du Colorée et Colorée et Colorée et tissu apparition d'une apparition d'une apparition d'une fluorescence fluorescence fluorescence Partie constituée Aucune fluorescence Aucune fluorescence Aucune fluorescence du volune de liquide Chorion de la Colorée et Colorée et Colorée mais image membrane muqueuse apparition d'une apparition d'une nonnette fluorescence fluorescence Visibilité de la Les contours des Les contours des Ta forme d's forme des cellules cellules dans le cellules dans le cellules est tissu épithélial tissu épithélial identifiable mais peuvent être peuvent être le contraste est identifiés identifiés faible Visibilité de la La crypte est La crypte est La crypte ne peut forme des cryptes observée nettement observée nettement être identifiée en en raison du fort en raison du fort raison de la contraste entre le contraste entre le fluorescence émise volume de liquide volume de liquide par le volume de et la région et la région liquide interne du tissu interne du tissu Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans 35 sortir de son cadre. 25 30
Claims (18)
1. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu, caractérisé en ce qu'il comprend le traitement d'un tissu avec une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels, et ensuite l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7.
2. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution acide à un pH inférieur à 7.
3. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution basique à un pH non inférieur à 7, et la partie traitée est observée par fluorescence après lavage avec une solution acide à un pH inférieur à 7.
4. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le tissu est un tissu d'un corps vivant ou un tissu dérivé d'un corps vivant.
5. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le traitement du tissu avec la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est l'application de la solution au tissu ou l'immersion du tissu dans la solution.
6. Procédé pour la coloration par fluorescence d'un tissu suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'observation par fluorescence est l'observation avec un microscope à fluorescence, un endoscope à fluorescence ou un système d'imagerie confocale.
7. Agent colorant fluorescent pour un tissu 35 comprenant une solution qui comprend de la fluorescéine ou un de ses sels, caractérisé en ce qu'il est destiné autraitement d'un tissu et ensuite à l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7.
8. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution acide à un pH inférieur à 7.
9. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution basique à un pH non inférieur à 7, et la partie traitée est observée par fluorescence après lavage avec une solution acide à pH inférieur à 7.
10. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que en ce que le tissu est un tissu d'un corps vivant ou un tissu dérivé d'un corps vivant.
11. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que le traitement du tissu avec la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est l'application de la solution au tissu ou l'immersion du tissu dans la solution.
12. Agent colorant fluorescent pour un tissu suivant l'une quelconque des revendications 7 à 11, dans lequel l'observation par fluorescence est l'observation avec un microscope à fluorescence, un endoscope à fluorescence ou un système d'imagerie confocale.
13. Utilisation d'une solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la production d'un agent colorant fluorescent pour un tissu destiné au traitement d'un tissu et ensuite à l'observation par fluorescence de la partie traitée dans des conditions acides à un pH inférieur à 7.
14. Utilisation suivant la revendication 13, caractérisée en ce que la solution comprenant de lafluorescéine ou un de ses sels est une solution acide à un pH inférieur à 7.
15. Utilisation suivant la revendication 13, caractérisée en ce que la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est une solution basique à un pH non inférieur à 7, et la partie traitée est observée par fluorescence après lavage avec une solution à un pH inférieur à 7.
16. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que le tissu est un tissu d'un corps vivant ou un tissu dérivé d'un corps vivant.
17. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que le traitement du tissu avec la solution comprenant de la fluorescéine ou un de ses sels est l'application de la solution au tissu ou l'immersion du tissu dans la solution.
18. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que l'observation par fluorescence est l'observation avec un microscope à fluorescence, un endoscope à fluorescence ou un système d'imagerie confocale.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006016678A JP4555232B2 (ja) | 2006-01-25 | 2006-01-25 | 組織の蛍光染色方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2897940A1 true FR2897940A1 (fr) | 2007-08-31 |
| FR2897940B1 FR2897940B1 (fr) | 2015-06-05 |
Family
ID=37872837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0752876A Active FR2897940B1 (fr) | 2006-01-25 | 2007-01-25 | Procede de coloration d'un tissu par fluorescence. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070172912A1 (fr) |
| JP (1) | JP4555232B2 (fr) |
| DE (1) | DE102007003873B4 (fr) |
| FR (1) | FR2897940B1 (fr) |
| GB (1) | GB2434446B (fr) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007332073A (ja) * | 2006-06-15 | 2007-12-27 | Pentax Corp | 消化管内腔蛍光染色像のコントラスト増強剤 |
| JP2008069107A (ja) * | 2006-09-14 | 2008-03-27 | Pentax Corp | 内視鏡用組織蛍光染色剤 |
| JP5396004B2 (ja) * | 2007-01-31 | 2014-01-22 | オリンパス株式会社 | 蛍光観察装置および蛍光観察装置の作動方法 |
| US7951075B2 (en) * | 2007-04-23 | 2011-05-31 | Olympus Medical Systems Corp. | Inspection method with endoscope |
| JP2012524904A (ja) * | 2009-04-21 | 2012-10-18 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | 手術時イメージングまたはセンチネルリンパ節バイオプシー用の発光ダイ |
| JP6583011B2 (ja) * | 2016-01-20 | 2019-10-02 | コニカミノルタ株式会社 | 酸性水溶液を用いた免疫染色スライドの洗浄方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US77202A (en) * | 1868-04-28 | Paul marcelin and joseph saunders | ||
| GB1113760A (en) * | 1966-12-16 | 1968-05-15 | Barnes Hind Lab Inc | Ophthalmic composition |
| IT1229075B (it) * | 1985-04-05 | 1991-07-17 | Fidia Farmaceutici | Medicamenti per uso topico, ottenuti tramite l'impiego dell'acido ialuronico |
| US4945239A (en) * | 1989-03-29 | 1990-07-31 | Center For Innovative Technology | Early detection of breast cancer using transillumination |
| JP2680713B2 (ja) * | 1990-02-21 | 1997-11-19 | 三菱重工業株式会社 | 微生物生細胞の計数方法 |
| JPH10179191A (ja) * | 1996-12-25 | 1998-07-07 | Mitsubishi Chem Corp | 生細胞の検出方法 |
| JP2002168870A (ja) * | 2000-12-01 | 2002-06-14 | Kirin Brewery Co Ltd | フローサイトメーターによる低ｐＨ領域の微生物細胞内ｐＨ測定法 |
-
2006
- 2006-01-25 JP JP2006016678A patent/JP4555232B2/ja active Active
-
2007
- 2007-01-23 US US11/656,373 patent/US20070172912A1/en not_active Abandoned
- 2007-01-25 GB GB0701514A patent/GB2434446B/en active Active
- 2007-01-25 DE DE102007003873.0A patent/DE102007003873B4/de active Active
- 2007-01-25 FR FR0752876A patent/FR2897940B1/fr active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE102007003873B4 (de) | 2015-08-06 |
| FR2897940B1 (fr) | 2015-06-05 |
| GB2434446B (en) | 2010-09-01 |
| JP2007197350A (ja) | 2007-08-09 |
| JP4555232B2 (ja) | 2010-09-29 |
| GB2434446A (en) | 2007-07-25 |
| US20070172912A1 (en) | 2007-07-26 |
| GB0701514D0 (en) | 2007-03-07 |
| DE102007003873A1 (de) | 2007-08-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10883903B2 (en) | Method for rendering biological material transparent and processing kit for rendering biological material transparent | |
| FR2897940A1 (fr) | Procede de coloration d'un tissu par fluorescence. | |
| JP6687949B2 (ja) | 生物材料用透明化試薬、システム及びその利用 | |
| KR101781261B1 (ko) | 플루오로퀴놀론계 항생제의 용도 | |
| WO2017031249A1 (fr) | Stabilisation de tissu de tout le corps et extractions sélectives par le biais d'hybrides hydrogel-tissu pour un phénotypage et un appariement de circuit intact à haute résolution | |
| EP3550029A2 (fr) | Composition pour l'élimination de tissu biologique et procédé d'élimination de tissu biologique l'utilisant | |
| CN102203604B (zh) | 用于防止组织样品中伪像的方法和组合物 | |
| US20070077202A1 (en) | Histostain composition for endoscope | |
| US20060106304A1 (en) | System and method for enhancing microscope images of tissue using citric acid and agents of the like | |
| CN113189071B (zh) | 用于完整器官血管三维网络精准成像的试剂盒及成像方法 | |
| US20080045796A1 (en) | Histofluorescent stain composition for endoscopy | |
| EP3167272B1 (fr) | Solution aqueuse pour l'éclaircissement d'un tissu, et ses utilisations | |
| FR2905869A1 (fr) | Composition de colorant histofluorescente pour endoscopie | |
| JP4953761B2 (ja) | 内視鏡用組織染色剤組成物 | |
| KR101872163B1 (ko) | 플루오로퀴놀론계 항생제의 용도 | |
| WO2018157367A1 (fr) | Procédés de quantification d'ions dans un biofilm dentaire | |
| JP2686398B2 (ja) | 透過型電子顕微鏡観察用試料の作成方法 | |
| JP2007223966A (ja) | 細胞表面又は組織表面染色剤組成物及びこれを用いた染色方法 | |
| US8298514B2 (en) | Agent for enhancing contrast of image of fluorescent staining of lumen of digestive tract | |
| KR20230074088A (ko) | 생물학적 이미징을 위한 새로운 수성 굴절률 동기화 및 조직 투명화 용액 | |
| JP2020034297A (ja) | 生体試料の透明化方法及び生体試料透明化剤 | |
| Wood | Microscopy and Biophotonics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 10 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 11 |
|
| CA | Change of address |
Effective date: 20170302 |
|
| TP | Transmission of property |
Owner name: HOYA CORPORATION, JP Effective date: 20170302 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 12 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 14 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 15 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 16 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 17 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 18 |