JP2007197350A - 組織の蛍光染色方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】フルオレセイン又はその塩を含有する溶液で、組織を処理した後、当該処理部分をpH7未満の酸性条件下で蛍光観察する組織の蛍光染色方法。
【選択図】なし
Description
共焦点撮像システムの開発及び共焦点レーザー顕微鏡の普及により、細胞や結合組織が複雑に多層化した生物試料の断面の観察において、細胞や組織を非侵襲的に観察することが可能となった。さらに現在では、共焦点撮像システムを内蔵した医療用内視鏡が開発されている。
遊離の色素は、染色後の組織試料を適切な緩衝液や溶液で複数回洗浄することにより、除去することが可能である。しかし、観察しようとする試料は表面が非常に繊細であり、洗浄する際には試料の変形や破損、組織の変性に注意せねばならず、洗浄操作は丁寧かつ注意深く行わなくてはならない。また、過剰な洗浄は染色を行った組織から色素を脱離(脱色)させる原因ともなる。
一方、摘出した組織試料を化学固定せずに染色し共焦点顕微鏡で観察する際には、洗浄操作の過程で組織の自己消化、細胞やタンパク質の変性などが起こってしまい、試料が生体内部での状態とは異なってしまうことが問題となる。
Gastroenterology, 127(3), 706-713, 2004
また、本発明は、フルオレセイン又はその塩を含有する溶液であって、組織を処理した後、当該処理部分をpH7未満の酸性条件下で蛍光観察するための組織用蛍光染色剤を提供するものである。
フルオレセインのpH依存性蛍光発光
フルオレセインナトリウムの水溶液(1mg/mL)を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液を用いてpHを調整し、励起波長490nm/蛍光波長530nmにて測定した。
蛍光測定にはマイクロプレートリーダー(コロナ製、MTP−800AFC)を使用した。
その結果、図1に示すように、フルオレセインの蛍光強度はpHが高くなるほど強くなることがわかった。
フルオレセインナトリウムのラット大腸染色試験
ラット(8週齢、オス)の大腸をホルマリン固定したものを用いてpHに対する染色性の違いを観察した。大腸をリン酸緩衝生理的食塩水(137mmol/L NaCl,8.1mmol/L Na2HPO4,2.7mmol/L KCl,1.57mmol/L KH2PO4,以下PBS(−)とする)で10秒間洗浄した後、フルオレセインナトリウム(Sigma製,F6377,以下F−Naとする)を調整後、酸、アルカリ、中性の緩衝液で1mg/mLに希釈した溶液に浸漬する。緩衝液はそれぞれ0.1M・リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.1)、0.4M NaH2PO4緩衝液(pH4.65)を用いた。さらにPBS(−)で10秒間洗浄した後、10%ホルマリンリン酸緩衝液で固定したものを共焦点顕微鏡(ライカマイクロシステムズ製,TCS−SP2)で観察した。
溶媒のpH変化による色素の浸潤および蛍光性の違い
ラット(8週齢、オス)の大腸を摘出し染色試験を行った。
F−Na(Sigma製,F6377)を1mg/mLで調整し、0.1M・リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.1)、0.4M NaH2PO4緩衝液(pH4.65)でそれぞれ0.1mg/mLに希釈した溶液をつくり、組織を1分間浸漬した。さらにPBS(−)で10秒間洗浄した後、共焦点顕微鏡(ライカマイクロシステムズ製,TCS−SP2)にて観察を行った。結果を表1に示す。
F−Na(Sigma製,F6377)の等張条件下、pH4〜7の範囲での組織染色観察を行った。
ラット(8週齢、オス)の大腸を摘出し、リン酸緩衝生理食塩水(137mmol/L NaCl,8.1mmol/L Na2HPO4,2.7mmol/L KCl,1.5mmol/L KH2PO4,4.4mol/L CaCl2・2H2O,1.6mmol/L MgCl2・6H2O,以下PBS(+)とする)にて洗浄した後、各pHに調整したF−Na(0.1mg/mL)に1分間浸漬し、染色したものを共焦点顕微鏡(ライカマイクロシステムズ製,TCS−SP2)にて観察を行った。
ここで生理食塩水を用いての対照試験を同時に行った。静脈注射などで用いられるF−Naの溶媒として生理食塩水が用いられるためである。
共焦点顕微鏡の撮影条件は共焦点ピンホール径を1.00airy、レンズは×20倍及び×63倍油浸レンズの2種類を用いる。Gain値を自動で補正するように設定し、最適な輝度にて観察を行った。
5mg/mLフルオレセインNa/D.W.を調整し、各pHのクエン酸リン酸緩衝液と生理食塩水を用いて希釈し0.1mg/mLとする。調整染色液に浸した後はPBS(+)で洗浄し、観察した。結果を表2に示す。
実施例4で用いた大腸切片を薄切したものを観察し、染色液の浸透度を観察した。
実施例4同様pH(4.0,5.0,6.0,7.0)及び生理食塩水を用いて希釈し0.1mg/mLに調整した。
蛍光顕微鏡(ZEISS社製、LSM510)を使用し、撮影条件はピンホール径1.0及びMaxとして撮影し、レンズは×20倍、×40倍のものを用いた。
切片を観察することで上皮細胞の50μm程度がよく染色されており該部分に蛍光が強くみられることが確認できた。
pHの異なる染色液を用いて観察を行ったが、組織の浸透度に大きな違いは見られなかった。
pHを6.0に固定し、異なる濃度で観察を行った。
F−Na(Sigma製,F6377)の濃度は各10,1.0,0.1,0.01,0.001mg/mLとし、クエン酸リン酸緩衝液(pH6.0)で調整後、共焦点顕微鏡(ライカマイクロシステムズ製,TCS−SP2)で観察を行った。
共焦点顕微鏡の撮影条件は共焦点ピンホール径を1.00airy、レンズは×20倍及び×63倍油浸レンズの2種類を用いる。Gain値を自動で補正するように設定し最適な輝度にて観察を行った。
低濃度の0.01及び0.001mg/mLでは染色像を確認することが出来たが、輝度が低いため、鮮明な画像を得ることができなかった。
結果として、0.1〜10mg/mLの範囲では組織浸透性のある鮮明な画像が得られた。
実施例6で用いた大腸切片を薄切したものを観察し、染色液の浸透度を観察した。
実施例6同様、濃度は各100,10,1.0,0.1,0.01,0.001mg/mLとし、クエン酸リン酸緩衝液(pH6.0)で調整後、共焦点顕微鏡(ZEISS社製,LSM510)の撮影条件は共焦点ピンホール径1.0及びMaxにて撮影し、レンズは×20倍、×40倍を使用した。
その結果、濃度の違いによる観察においては高濃度のものほど粘膜固有層が濃く染色されていた。
フルオレセインナトリウムの染色性の蛍光顕微鏡による観察
フルオレセインナトリウム(以下、F−Na)を染色後、蛍光顕微鏡(ライカ社製,DM IRB)にて観察を行った。
試料としてホルマリン固定されたウサギの小腸を用い、pH4.0及び9.0の条件下で観察した。
F−Naを生理食塩水で1mg/mlに調整したものを各pHの0.1Mリン酸緩衝液で希釈し、0.01mg/mlに再調整した。
ホルマリン固定のウサギ小腸に洗浄操作を行わずにそれぞれのpHで調整した染色液を塗布し、過剰な染色液をろ紙で吸着除去した後の状態で蛍光顕微鏡観察行った。対物レンズは40倍のものを用いた。
その結果、pH4.0のものは染色後の洗浄操作を行わなくともウサギ小腸絨毛が染色され、明瞭な蛍光像が得られた。しかしpH9.0のものは染色後にそのまま観察を行った場合、絨毛よりも組織外の液体から蛍光が発せられ不鮮明であった。希釈で用いた0.1Mリン酸緩衝液(pH9.0)で周辺の蛍光溶液を除去するための洗浄操作が必要であった。
フルオレセインナトリウムの注腸染色
生体内においては、消化器は常に粘液を分泌したり、あるいは逆に体内に取り込まれ消化される。内視鏡での使用時と同様の環境下で本発明の効果を検証するために、生体大腸での染色性を観察した。
酸性領域とアルカリ領域の二つのpHでの生体大腸の染色性と共焦点顕微鏡(ライカ社製 TCS SP2)観察を行った。
マウス(9週齢,オス)に麻酔をかけた状態で大腸上部からシリンジ(テルモ27G,0.4mm)を用いてF−Na(pH4,1mg/mL)を500μL注入した。10分後に大腸を摘出し、腸内をPBS(+)で洗浄した。
大腸の摘出部位は盲腸側から5.5〜6.5cmを切除して行った。
図2(ゲイン値480V,上皮から約0μm)から、pH4.0では組織の構造を明瞭に観察することが出来、杯細胞が不染であった。
さらにF−NaのpH9.0(1mg/mL,500μL)の染色液を用いて観察を行った。pH9.0の染色液では以前のpH差による観察同様、染色部位と遊離のF−Naのある液溜まりとの間で蛍光輝度の差がほとんどなく、組織像は不明瞭であった(図3)。
フルオレセインナトリウム染色における洗浄液のpHによる染色性の違い
フルオレセインナトリウム(以下、F−Na)は、pH7以上の水溶液中で蛍光を強く出す。pH7以上のF−Na水溶液で組織表面を染色すると組織内部及び組織表面の液溜まりが存在するF−Na分子のいずれもが蛍光性を示すため、染色された組織の観察が困難になる。
液溜まりに存在するF−Naは組織表面を洗浄することで除去可能である。しかし洗浄操作により、組織内部のF−Naも溶出するため、染色効果が低下する。
そこでpH7以上のF−Na水溶液で組織を染色後、pH7以下の酸性溶液を少量塗布(撒布)して染色に関与しない遊離のF−Naの蛍光性を消失させ、染色後の観察を行った。結果を表4に示す。
Claims (12)
- フルオレセイン又はその塩を含有する溶液で、組織を処理した後、当該処理部分をpH7未満の酸性条件下で蛍光観察することを特徴とする組織の蛍光染色方法。
- フルオレセイン又はその塩を含有する溶液が、pH7未満の酸性溶液である請求項1記載の組織の蛍光染色方法。
- フルオレセイン又はその塩を含有する溶液が、pH7以上の塩基性溶液であり、当該処理部分をpH7未満の酸性溶液で洗浄後に蛍光観察するものである請求項1記載の組織の蛍光染色方法。
- 組織が、生体組織又は生体由来組織である請求項1〜3のいずれか1項記載の組織の蛍光染色方法。
- フルオレセイン又はその塩を含有する溶液による組織の処理が、組織への当該溶液の塗布又は当該溶液への組織の浸漬である請求項1〜4のいずれか1項記載の組織の蛍光染色方法。
- 蛍光観察が、蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡又は共焦点撮像システムによる観察である請求項1〜5のいずれか1項記載の組織の蛍光染色方法。
- フルオレセイン又はその塩を含有する溶液であって、組織を処理した後、当該処理部分をpH7未満の酸性条件下で蛍光観察するための組織用蛍光染色剤。
- フルオレセイン又はその塩を含有する溶液が、pH7未満の酸性溶液である請求項7記載の組織用蛍光染色剤。
- フルオレセイン又はその塩を含有する溶液が、pH7以上の塩基性溶液であり、当該処理部分をpH7未満の酸性溶液で洗浄後に蛍光観察するものである請求項7記載の組織用蛍光染色剤。
- 組織が、生体組織又は生体由来組織である請求項7〜9のいずれか1項記載の組織用蛍光染色剤。
- フルオレセイン又はその塩を含有する溶液による組織の処理が、組織への当該溶液の塗布又は当該溶液への組織の浸漬である請求項7〜10のいずれか1項記載の組織用蛍光染色剤。
- 蛍光観察が、蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡又は共焦点撮像システムによる観察である請求項7〜11のいずれか1項記載の組織用蛍光染色剤。
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