JP2007182425A - 内視鏡用組織染色剤組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ベニコウジ由来の色素から選ばれる1種又は2種以上を含有する内視鏡用組織染色剤組成物。
【選択図】なし
Description
Gastroenterology 2004, Vol.127, No.3, p.706-713
従って、本発明の目的は、可視光波長領域における消化管内腔表面等の形状を鮮明化すると同時に、特定の波長の光により励起され蛍光を発する機能を有し、さらに生物学的に安全な内視鏡観察に適した染色剤を提供することにある。
各種の天然物色素について吸光スペクトル測定、蛍光励起スペクトル測定を行い、蛍光を発する物質を検証した。測定した色素のうち、ベニコウジ色素(黄)を除く各色素は、和光純薬より購入した。測定は、以下の手順により実施した。各色素を濃度1〜0.1mg/mLとなるように水に溶解した溶液を調製した。色素の吸収極大波長は、分光光度計(島津製作所製、BioSpec-1600)により波長200nm〜600nmまでの吸光度を連続的に測定し、吸収極大となる波長を決定した。各色素に対して吸収極大波長の光を励起光として照射し、その励起光の光軸に対して垂直方向に検出される散乱光の波長を分光蛍光光度計(島津製作所製、RF-1500)により測定、蛍光極大波長とした。
表1に示すようにベニコウジ色素(黄)及びベニコウジ色素(赤)は蛍光(散乱光)波長の励起波長よりも長波長側へのシフト(ストークスシフト)が観察された。ベニコウジ色素以外の色素ではストークスシフトが観察されなかった。また、図1にベニコウジ色素(赤)の吸収及び蛍光スペクトルを示す。ここでベニコウジ色素(赤)は和光純薬(株)製モナスカス色素を用いた。また、ベニコウジ色素(黄)は、キリヤ化学(株)製モナスコイエローを用いた。
ホルマリン溶液で固定してあるラット大腸を5mm角の大きさに切断し、リン酸緩衝生理的食塩水(137mmol/l NaCl、8.1mmol/l Na2HPO4、2.7mmol/l KCl、1.5mmol/l KH2PO4、以下 PBS(−)と略す)で洗った。ベニコウジ色素(赤)(和光純薬(株)製モナスカス色素)水溶液(10mg/mL)に組織を入れて1分間静置し、PBS(−)内で10秒間洗った。その後、ホルマリン溶液で固定し、共焦点顕微鏡(ライカ社製 TCS SP2、本件の実施例で使用する共焦点顕微鏡は全てこの顕微鏡を用いた。)で観察した。488nmArレーザーにより励起、500〜535nmの波長で蛍光観察した。図2に共焦点顕微鏡像を示す。図は同一断面を表層側から内部方向(深部)へと約6μm毎に撮影した画像である。図2に示すように、大腸が染色され、組織内部まで染色されている蛍光染色像を得ることが分かった。
蛍光を発しなかった天然色素(アナトー、ブドウ果皮、ビートレッド、コチニール)を用いて、実施例2と同様に共焦点顕微鏡観察したところ、蛍光染色像は得られなかった。
実施例2で染色した大腸より薄切切片試料を作製した。試料は共焦点顕微鏡により、488nmArレーザーにより励起し、500〜535nmの波長で蛍光観察した。その結果、図3に示すように内腔側から筋膜側まで一様(粘膜下層を除く)に染色されている像を得ることが分かった。また、図からベニコウジ色素の染色深度は500〜1000μm以上であることが分かった。
ホルマリン溶液で固定してあるラット小腸を10mm角の大きさに切断し、ベニコウジ色素(赤)(和光純薬(株)製モナスカス色素)水溶液(10mg/mL)を塗布し、可視光内視鏡により観察した。その結果、図4に示すように小腸は赤色に染色されており、未染色観察像では判別が困難であった絨毛の形状などの情報を、より鮮明に得ることが可能となった。
ベニコウジ色素(黄)(キリヤ化学製モナスコイエローS)水溶液(6mg/mL)及びベニコウジ色素(赤)(キリヤ化学製モナスコレッド9000P)水溶液(10mg/mL)を用いたラットの大腸染色試験を行った。試料はホルマリン固定ラットの大腸を用い各色素溶液に1分間浸し、共焦点顕微鏡観察を行った。その結果、図5及び図6に示すように、モナスコレッド、モナスコイエロー共に組織内部にまで染色液が浸透しており、強い蛍光を呈した。観察の結果、細胞の核は染色されず、細胞質のみが鮮明に染色されていることがわかった。
生体内を染色する際にpHによる染色性の違いは非常に重要な要素である。そこでモナスコイエローS(キリヤ化学製)の蛍光特性へのpHの影響についての試験を行った。結果を図7に示す。pH4.65、5.00、6.00、6.80、7.00、7.40、8.00、9.30の緩衝液での測定を行ったが、蛍光強度に大きな変化は無かった。モナスカス黄色素に関しての蛍光性はpHにより大きな影響を受けないことがわかった。
ベニコウジ色素に代えてフルオレセインをpH9に調製したものを用いて実施例2及び5と同様にしてラット大腸を共焦点顕微鏡観察した。その結果、図8に示すように、フルオレセインによる蛍光強度は、組織を染色していたが、バックグラウンドまで高くなってしまい、観察がしづらかった。
生体消化器内腔へのベニコウジ色素(黄)撒布による染色効果を下記方法により検証した。
マウス(8週齢、オス)の肛門よりモナスコイエロー(キリヤ化学製)(0.1mg/mL, 500μl)を注入、1分後に大腸を取り出し、染色状態を共焦点顕微鏡(ライカ社製)により観察した。
生体マウス大腸は色素撒布により大腸表面の粘膜組織が良好に染色された(図9)。大腸粘膜に存在する細胞は特に表層部に関して円柱上皮細胞、杯細胞のほかに粘膜固有層内に繊維芽細胞や白血球細胞などがある。モナスコイエローによりこれらの細胞の細胞質成分は染色されたが、杯細胞の粘液成分及び全ての細胞の核は染色性が低かった。
これらの結果は大腸組織を摘出後、試験管内にて染色することにより得られた顕微鏡像(図10)と同様であった。
実施例7と同様の方法により生体マウス大腸をモナスコイエロー(キリヤ化学製)により染色後10分間及び60分間飼育した後、染色性の経時変化を観察した。観察は実施例7と同様の方法より行った。モナスコイエローの好染部位は投与後の飼育時間に対して変化しないが、組織の蛍光輝度は60分飼育後には低下していた(図11及び12)。
さらにその結果を総合的に判断して大腸粘膜の好染部位を表2にまとめた。
蛍光度の差異
共焦点顕微鏡(ライカ社製)では受光部感度を調節することにより同程度の蛍光輝度を表示することができる。即ち、この機能を用いることで輝度の異なる試料の蛍光強度を相対的に見積もることが出来る。
同程度の蛍光輝度を与える受光感度の値をもとに計算した試料の蛍光輝度はベニコウジ色素(黄)に対してフルオレセインナトリウムでは10分経過時0.74倍、60分経過時0.85倍であった。
したがって同じ濃度の蛍光色素溶液で染色した場合、大腸組織の蛍光輝度はベニコウジ色素(黄)の方が高いといえる。
ベニコウジ色素(黄)(1mg/mL,2mL)をマウスの心臓から灌流させて染色試験を行った。染色の結果、大腸組織は良好に染色された。染色の浸透性は摘出組織染色(実施例2)や肛門注入染色(実施例7)に比べて高かった。内腔側からの共焦点顕微鏡による観察では、粘膜を構成する細胞のほとんどの細胞質は好染されたが、杯細胞の粘液成分及び細胞核の染色性は低かった(図13)。即ち、好染部位に関しては実施例7、8と同様であった。
同様にフルオレセインナトリウム(1mg/mL)についても実施例9と同様の方法で試験を行った。
実施例9と同様の染色像を与えるものであり、これにより粘膜組織を構成する細胞の多くは好染されたが、杯細胞の粘液部分は染色されなかった。細胞核に関しては染色の状態を判定できなかった(図14)。
これらの結果は撒布法による染色の結果得られた像と同様であったが、灌流染色法では染色範囲、濃度等の結果において、より良好な結果を得られた。
細胞の状態、核の形状を観察する目的においてはベニコウジ色素(黄)での観察はフルオレセインナトリウムと比較してより有用なデータを与えるといえる。
ベニコウジ黄色素を高速液体クロマトグラフ(島津製作所製 SCL10A)にかけてその主成分であるキサントモナシンA及びキサントモナシンBを抽出し、精製を行った。
ベニコウジ黄色素をODSカラム(Wakosil25C18)に注入し、移動相20%アセトニトリル/水により分離を行った。得られたクロマトグラムから各ピークの成分を回収しエバポレーターにより濃縮し、再度同条件によりクロマトグラフィーを行った。各分画はLC−MS(Waters 製 AcquityUPLC-ZQ)により純度と質量数の分析を行い、それぞれ得られたクロマトグラムのピークが単一で、且つ質量数がキサントモナシンA及びBの質量数と一致する分画のみを濃縮し、精製キサントモナシンA、Bとした。
実施例10で精製したキサントモナシンAを用いて、マウスの大腸染色試験を行った。
マウス(ddY、9週齢、オス)に麻酔をかけ、注射針を用いてキサントモナシンA(遠心乾燥サンプル、10mg/mL Saline)100μLを大腸内腔に注入し、染色を行った。
5分後にマウスの大腸を摘出し、共焦点顕微鏡(TCS SP2)による共焦点撮像観察を行った。
図15に20倍レンズで撮影した画像を示す。図16には63倍油浸レンズで撮影したものを示す。増幅率を表すゲイン値が348.2V、339.7Vであり、キサントモナシンAにより非常に鮮明な断面画像が得られた。
実施例10で精製したキサントモナシンAを用いて、マウスの大腸染色試験及び凍結切片の観察を行った。
マウス(ddY、11週齢、オス)に麻酔をかけ、注射針を用いてキサントモナシンA(遠心乾燥サンプル、10mg/mL Saline)100μLを大腸内腔に注入し、染色を行った。
5分後にマウスの大腸を摘出し、OCTコンパウンドによって凍結包埋し、凍結切片は6μmに薄切した。薄切切片はヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)による観察と、キサントモナシンAの染色による蛍光観察を行った。
図17に40倍レンズで撮影したHE染色画像を、図18に63倍レンズで撮影したキサントモナシンA染色蛍光画像を示す。
二つの染色像より、キサントモナシンAによる染色によっては上皮細胞が比較的良好に染色されていたし、筋板も良好に染色されていた。また、増幅率を表すゲイン値が300〜500Vの範囲にあり、染色性は良好だといえる。
マウス(ddY、9週齢、オス)に麻酔をかけ、注射針を用いてキサントモナシンA(遠心乾燥サンプル、1mg/mL Saline)100μLを大腸の内腔に注入し、染色を行った。
1分後と10分後にそれぞれマウスの大腸を摘出し、共焦点顕微鏡(TCS SP2)による共焦点撮像観察を行った。
図19に染色1分後に大腸を摘出したものの共焦点画像を示し、図20に染色10分後に大腸を摘出したものの共焦点撮影画像を示す。時間の変化により染色性及び染色剤の浸透性が異なるが、染色部位は同様である。10分間染色を行った方の大腸がより視認性が向上するといえる。
Claims (7)
- ベニコウジ由来の色素から選ばれる1種又は2種以上を含有する内視鏡用組織染色剤組成物。
- ベニコウジ由来の色素が、次式(1)〜(5)
から選ばれる化合物の1種又は2種以上を含むものである請求項1記載の染色剤組成物。 - ベニコウジ由来の色素が、アンカフラビン、モナスシン、モナスコルブリン、ルブロパンクタチン、モナスコルブラミン、ルブロパンクタチン、ルブロパンクタリジン及びキサントモナシン類から選ばれる1種又は2種以上である請求項1又は2記載の染色剤組成物。
- 内視鏡が、医療用内視鏡である請求項1〜3のいずれか1項記載の染色剤組成物。
- 内視鏡が、可視光内視鏡、蛍光内視鏡又は共焦点内視鏡である請求項1〜4のいずれか1項記載の染色剤組成物。
- 経口投与、消化管内直接投与又は粘膜下投与するものである請求項1〜5のいずれか1項記載の染色剤組成物。
- 消化管内腔表面及び/又は消化管内腔細胞内を染色するものである請求項1〜6のいずれか1項記載の染色剤組成物。
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