JP4847795B2 - 内視鏡用組織蛍光染色剤組成物 - Google Patents

Description

本発明は、内視鏡による診断に用いる組織蛍光染色剤組成物に関する。

内視鏡を用いた診断技術は、上部消化管及び下部消化管における消化管内視鏡検査を中心に、特に癌、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎等の疾患の診断に広く応用されている。これら内視鏡検査における組織の異常（病変部）の検出は、染色剤を用いることなく１０〜５００倍程度の可視光内視鏡によるのが一般的である。他方、組織表面に色素を含む溶液を撒布した状態で内視鏡観察する色素内視鏡法と呼ばれる方法がある。この色素内視鏡法は消化器内腔表面の形状を明確に観察することができるため、色調の変化によって微細な病変部であっても容易に発見することができる。これら色素内視鏡法に用いられる内視鏡としては可視光内視鏡及び蛍光内視鏡がある。

これらの色素内視鏡法に用いられる色素としては、例えば可視光下での消化管内腔の染色にはインジゴカルミン（非特許文献１）、蛍光染色にはアクリフラビン及びフルオレセイン（非特許文献２）などが主に用いられている。

一方、診断においては、生体の組織表面だけでなく、生体組織内部の観察も重要である。生体組織内部を観察する方法としては、バイオプシーなどで採取した組織の微小部を実験室で薄切し染色の後観察する方法が一般的である。また、生体組織の内部をその場で観察する方法では、例えば、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＣＴ、軟Ｘ線法などが全身の観察のために適用されている。消化管内視鏡に関しては、生体組織の自家蛍光反応を応用した内視鏡が商業化されている。生体組織に特定波長の光を照射することで組織の内因性蛍光物質により自家蛍光が発生するので、その強度差及びスペクトラムにより正常部位と病変部位を視覚的に観察することができる。

しかし、通常の内視鏡観察では、病変部を経験的に判断し、組織片を切り取って、別途実験室内で組織染色等の手法により診断せざるを得ない。一方、最近開発された共焦点内視鏡によれば、組織を切り取ることなく、組織内部を観察することができる。すなわち、共焦点システムとは、検出器の前にピンホールを置くことにより、組織内の焦点面のみの反射光を検出し、明確な画像を得ることができる技術である。通常、共焦点光学システムは蛍光物質により染色された試料にレーザー光を走査してその蛍光像を観察する。そのため蛍光染色剤が必要となる。この共焦点システムを採用した共焦点内視鏡は、通常観察光学系と共焦点観察光学系の両者を有しているため、病変部のスクリーニングと、細胞を切り取らずに光学的な組織薄切による細胞の観察が低侵襲かつその場で可能となる点で有用である。

共焦点内視鏡による組織内観察を目的として用いられた蛍光色素としては、フルオレセイン及びアクリフラビンが知られている（非特許文献２）。この非特許文献２においては、多量のフルオレセインを静脈内投与し、消化管組織にフルオレセインが到達した時点で、共焦点内視鏡による組織内観察を行っている。また、アクリフラビンは消化管に局所的に撒布して組織内観察を行っているが、色素残留の可能性や変異原性などが憂慮されている。この二種の色素に関しては染色性は異なるが、組織観察において大差はないとされている（非特許文献３）。
多田正大、磯 彰格 他（臨床内科、vol.7、no.2、1992） Gastroenterology 2004, vol. 127, No.3, p.706-713 Gastrointestinal Endoscopy Clin of N Am, 2005, vol.12, p.715-731

色素内視鏡、蛍光内視鏡、共焦点内視鏡では短時間でも細胞及び組織の染色が可能であり、さらに可視光観察及び蛍光励起光のいずれの光源に対しても組織表面の形状を鮮明にすることができる色素が求められており、さらに組織内部の染色も可能な色素が求められている。
従って、本発明の課題は、可視光波長領域における消化管内腔表面等の形状を鮮明化すると同時に、特定の波長の光により励起され蛍光を発する機能を有し、さらに組織表面及び内部が鮮明に蛍光染色でき、生物学的に内視鏡観察に適した蛍光染色剤を提供することにある。

本発明者は、安全性、可視光及び蛍光における染色性の点から天然色素に着目して種々検討した結果、スピルリナ青色素が通常の内視鏡における染色剤としても有用であり、さらに共焦点内視鏡における組織内染色用蛍光染色剤としても有用であり、かつそれらの染色像が鮮明であり早期の病変の検出に有用であることを見出した。

すなわち、本発明はスピルリナ青色素を含有する内視鏡用組織蛍光染色剤組成物を提供するものである。

本発明の蛍光組織染色剤を用いれば、可視光及び蛍光、共焦点内視鏡観察下において、すなわち組織を採取することなく、病変部の表面及び組織内部の可視化を同時に行うことができ、染色像が鮮明であることから、消化管疾患等の診断に有用である。

本発明の内視鏡には、消化管内視鏡、呼吸器内視鏡、血管内視鏡、腹腔内視鏡、胸腔内視鏡などの医療用内視鏡が挙げられる。このうち消化管内視鏡が特に好ましい。本発明について、可視光内視鏡には、可視光で観察する内視鏡が全て含まれ、通常の内視鏡、拡大内視鏡、及び可視光を観察する色素内視鏡が含まれる。一方、蛍光内視鏡には、励起光を照射して生じる蛍光を測定する内視鏡が含まれ、これには拡大蛍光内視鏡が含まれる。また、共焦点内視鏡は、共焦点撮像システムを搭載した内視鏡をいう。なお、共焦点内視鏡は通常観察光学系と共焦点観察光学系の両者を有している。

本発明の組織蛍光染色剤組成物は、スピルリナ青色素を含有する。スピルリナ青色素はユレモ科スピルリナ（Spirulina platensis(NORD.)GEITLER）の全藻より、室温時水で抽出して得られる。主色素はフィコシアニン（Phycocyanin）である。

このスピルリナ青色素の市販品としては、例えばキリヤ化学のキリヤスブルーＡＮ、キリヤスブルーＡＮ−Ｌ、フナコシ株式会社のＣ−フィコシアニン、大日本インキのリナブルーＡ等が挙げられる。
またスピルリナ青色素は、化粧品や医薬品の着色剤として広く使用されている。従って、これらの成分の安全性は確立されている。しかし、これらの化合物が蛍光を発することは知られていたが、組織に適用した場合に組織内部において鮮明な蛍光像を呈することは全く知られていない。

本発明の組織蛍光染色剤組成物中のスピルリナ青色素の含有量は、染色性及び染色像の鮮明さの点から、０．０１〜７０質量％、さらに０．０１〜５０質量％、特に０．０１〜２０質量％が好ましい。

本発明の組織蛍光染色剤組成物は、液体、顆粒、錠剤等の形態で使用することができる。消化管内で撒布する場合又は粘膜下投与する場合は液体が好ましく、経口投与する場合は液体、顆粒、錠剤等が好ましい。

本発明の組織蛍光染色剤組成物には、その形態（剤型）に応じて種々の成分を配合できる。例えば、粘稠剤、増粘剤、界面活性剤、甘味剤、防腐剤、香料、pH調整剤、水等を配合できる。

pH調整剤としては、pHを５〜９にするもの、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸及びこれらの塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ピロリン酸四ナトリウムなどが挙げられる。

また溶剤としてエタノール、水などを配合し得る。錠剤の場合は、結合剤、崩壊剤などの公知の錠剤用成分を用いることができる。

本発明の組織蛍光染色剤は、組織を青色系に染色することができるので、通常の可視光内視鏡観察時における組織内部染色剤として有用である。ここで用いられる内視鏡は通常の内視鏡及び拡大内視鏡であり、１０〜５００倍の倍率を有する可視光下での内視鏡観察に有用である。

スピルリナ青色素は白色光源下で青色を呈し、橙色の光源により励起されて赤紫色の蛍光を示す。励起波長は６２４nm近辺であり、６３９nm近辺に蛍光を発する。従って、共焦点観察する場合は、Ｈｅ−Ｎｅレーザーの光源を用いて６３３nmの励起光を照射すれば、蛍光像を得ることができる。

後述の実施例で示すように、スピルリナ青色素は、他の食用色素に比べて、蛍光を発光するという特性を有するだけでなく、組織内部の蛍光染色像が鮮明であるという特性を有する。従って、本発明の染色剤は、内視鏡用組織蛍光染色剤として有用である。共焦点内視鏡としては、例えば観察深度は２５０μm（観察範囲は５００μm×５００μmで拡大率５００倍）のものが実用化されている。従って、本発明の組織染色剤組成物を撒布又は経口投与後に、この共焦点内視鏡を用いれば、組織内部（例えば、２５０μmまで）の蛍光染色断層像が、容易に得られる。

なお、共焦点光学システムを採用した内視鏡が、通常観察光学系と共焦点観察光学系との両者を有しているものであれば、通常光下での観察により病変部を肉眼観察し、次いで疑問になった病変部について、共焦点内視鏡により組織内部（例えば、２５０μｍまで）の蛍光染色断層像を観察することにより、病変部組織を切り取ることなく消化管の組織表面及び組織内部の診断が可能となる。すなわち、生体組織の細胞や核の形状を生きた状態で観察することができる。この結果、前癌状態、癌、潰瘍、潰瘍性大腸炎等の消化管の疾患の診断が安全、迅速、低侵襲で可能となり、かつ精度が飛躍的に向上する。

これらの内視鏡観察においては、本発明の組織染色剤組成物は、消化管内腔に直接撒布又は粘膜下投与してもよく、経口的に投与してもよい。

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制限されるものではない。

実施例１
各種の天然物色素について吸光スペクトル測定、蛍光励起スペクトル測定を行い、蛍光を発する物質を検証した。測定した色素は、和光純薬より購入した。
測定は、以下の手順により実施した。各色素を濃度１〜０．１mg/mLとなるように水に溶解した溶液を調製した。色素の吸収極大波長は、分光光度計(島津製作所製、BioSpec-1600)により波長２００nm〜６００nmまでの吸光度を連続的に測定し、吸収極大となる波長を決定した。各色素に対しては吸収極大波長の光を励起光として照射し、その励起光の光軸に対して垂直方向に検出される散乱光の波長を分光光度計(島津製作所製、RF-1500)により限定、蛍光極大波長とした。
表１に示すようにスピルリナ青色素(フィコシアニン)は蛍光（散乱光）波長の励起波長よりも長波長側へのシフト（ストークスシフト）が観察された。スピルリナ青色素以外の色素ではストークスシフトが観察されなかった。また、図１にスピルリナ青色素の吸収及び蛍光スペクトルを示す。

実施例２
スピルリナ青色素について吸光スペクトル及び蛍光励起スペクトル測定を行った。スピルリナ青色素(フィコシアニン、和光純薬製)を０．０１mg/mLに調整し、分光光度計(島津製作所製、BioSpec−1600)により波長２００nm〜７５０nmまでの吸光度を連続的に測定し、吸収極大となる波長を決定した。得られた吸収極大波長が６２１nmであったため、これを励起波長として照射し、その励起光の光軸に対して垂直方向に検出される散乱光の波長を分光蛍光光度計(島津製作所製、RF−1500)により測定、蛍光極大波長を得た。（図１）

実施例３
スピルリナ青色素(和光純薬製)を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を用いて２．０mg/mLに希釈調整し、共焦点顕微鏡(ライカ社製、TCS SP2)を使用し、共焦点画像の観察を行った。ホルマリン固定されたマウスの大腸片のサンプルを染色剤に浸漬し、He−Neレーザーの６３３nmの励起波長を照射し、６４８〜７４８nmの波長範囲で蛍光画像を検出した。共焦点顕微鏡の観察条件は、ピンホール径１．００airy、２０倍レンズを使用した。図２に共焦点顕微鏡画像を示す。
組織内部断層像の観察も良好に行うことができた。

比較例１
グレープスキンは、励起極大波長５００nm、蛍光極大波長５２７nmでストークスシフトが２７であり、蛍光を有する染色剤組成物である。
図３に示すのは共焦点顕微鏡により撮影した画像であり、内腔観察が出来るくらい十分に染色されてはいない。
同様にアシッドレッドの励起極大波長は４９２nm、蛍光極大波長は５３１nmでストークスシフトは３９である。しかし図４に示すように染色性が良いとはいえないため、共焦点顕微鏡による蛍光観察が十分に行われなかった。

以下にグレープスキン、アシッドレッド及びスピルリナ青色素の特性を比較した。

実施例４
スピルリナ青色素を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７）を用いて１０mg/mLに調製した。
これをマウス（ddY、６週齢、オス）の心臓から１５００μｌ灌流させて染色した。
このマウスの大腸を摘出し、大腸内腔側を共焦点顕微鏡（ライカ社製、TCS SP2）により観察した。共焦点顕微鏡の観察条件は、ピンホール径１．００airy、２０倍レンズを使用した。図５に共焦点顕微鏡画像を示す。図５の観察位置は、表層より３０μm付近である。

スピルリナ青色素の吸収及び蛍光スペクトルを示す図である。 スピルリナ青色素で蛍光染色したマウス大腸の観察結果を示す図である。 グレープスキン色素で蛍光染色したマウス大腸の観察結果を示す図である。 アシッドレッド色素で蛍光染色したマウス大腸の観察結果を示す図である。 スピルリナ青色素で蛍光染色（心臓灌流）したマウス大腸の観察結果を示す図である。

Claims (4)

1. スピルリナ青色素を含有する内視鏡用組織蛍光染色剤組成物。
2. 内視鏡が、共焦点内視鏡である請求項１記載の染色剤組成物。
3. 経口投与、消化管内直接投与又は粘膜下投与するものである請求項１又は２項記載の染色剤組成物。
4. 消化管内腔表面及び／又は消化管内腔細胞内を蛍光染色するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の染色剤組成物。