JP5070549B2 - 腫瘍選択的蛍光染色剤 - Google Patents
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Description
本発明は、腫瘍選択的蛍光染色剤に関する。より詳しくは、腫瘍細胞や腫瘍組織を選択的に蛍光染色することができ、内視鏡を用いたがんの診断などにおいて腫瘍細胞や腫瘍組織を選択的に造影するための染色剤に関する。
光診断は表層に近い病変部位を高感度に検出する強力な手法として近年大きな注目を集めているが、その一例として蛍光内視鏡によるがん診断が挙げられる。現在、内視鏡診断において腫瘍組織の染色には5-アミノレブリン酸(5-ALA)やポルフィリンが用いられている。しかしながら、これらの染色剤を用いた方法は染色剤が腫瘍組織に蓄積するまでに時間を要することなどの問題点があることから、特に内視鏡診断などにおいて、がんの発見のために腫瘍組織を正常細胞と区別して選択的に染色する手段の提供が求められている。
一方、フルオレセイン誘導体であるFDA（フルオレセインジアセテート）などのフルオレセインエステル誘導体が知られている（例えば非特許文献１などを参照のこと）。これらのエステル誘導体はエステルが加水分解されると強蛍光性のフルオレセインを生成する。また、FDAなどのエステル誘導体はエステル基が存在することから脂溶性であり、細胞膜を容易に透過する性質を有しているが、一方、細胞内のエステラーゼにより加水分解を受けて細胞内で生成するフルオレセインは親水性物質であり、細胞膜を通過しにくく細胞内に滞留する性質を有している。
これらの性質を利用して、FDAを細胞内に取り込ませて、細胞内のエステラーゼにより加水分解を受けて生成するフルオレセインから放出される蛍光を測定することにより、細胞内エステラーゼを測定する技術（FDAをエステラーゼプローブとして利用する技術）、又は細胞を蛍光染色する技術が開発されている（非特許文献２）。しかしながら、上記のようにFDAはエステラーゼプローブとして、又は組織を一様に染色するための染色剤として用いられているものの、腫瘍細胞などの特定の細胞を正常細胞と区別して選択的に染色するために用いられた例は知られていない。また、FDAを内視鏡診断における造影剤として使用した例も知られていない。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 134-141, 1966 The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 29, pp.503-510, 1981
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本発明の課題は、腫瘍細胞や腫瘍組織を選択的に蛍光染色することができる染色剤を提供することにある。より具体的には、上記の特徴を有し、内視鏡を用いた診断などにおいて腫瘍組織を選択的に蛍光染色するための内視鏡用蛍光造影剤として有用な染色剤を提供することが本発明の課題である。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、従来、エステラーゼプローブなどに利用されていたFDAなどのフルオレセインエステル誘導体を用いると腫瘍細胞や腫瘍組織を選択的に蛍光染色することができ、さらにこれらのエステル誘導体が内視鏡用の造影剤として極めて優れた性質を有していることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
（式中、R1及びR2はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1〜C4アルキル基、置換基を有していてもよいC2〜C4アルケニル基、置換基を有していてもよいC2〜C4アルキニル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示す）で表される化合物を含む腫瘍細胞又は腫瘍組織選択的な蛍光染色剤が提供される。
上記発明の好ましい態様によれば、R1及びR2がそれぞれ独立にC1〜C4アルキル基、C2〜C4アルケニル基、アリール基、又はヘテロアリール基である上記の蛍光染色剤；R1及びR2がそれぞれ独立にC1〜C4アルキル基又はC2〜C4アルケニル基である上記の蛍光染色剤；R1及びR2がそれぞれ独立にC1〜C3アルキル基又はC2〜C3アルケニル基である上記の蛍光染色剤；並びにR1及びR2が-CH=CH2である上記の蛍光染色剤が提供される。
別の観点からは、上記の蛍光染色剤を有効成分として含む診断薬、及び上記の蛍光染色剤を有効成分として含む腫瘍組織選択的な造影剤が提供される。上記の造影剤は内視鏡を用いたがん診断、特に内視鏡光源としてフルオレセインに対する至適励起波長を有する励起光（例えば488 nm程度の励起光）を照射可能な蛍光内視鏡を用いたがん診断に有用である。
さらに別の観点からは、本発明により、上記蛍光染色剤、上記診断薬、又は上記造影剤の製造のための上記一般式(I)で表される化合物の使用；腫瘍細胞又は腫瘍組織の染色方法であって、上記一般式(I)で表される化合物を腫瘍細胞又は腫瘍組織と接触させる工程を含む方法；腫瘍細胞又は腫瘍組織の検出方法であって、上記一般式(I)で表される化合物を腫瘍細胞又は腫瘍組織と接触させた後、フルオレセインに対する励起光を照射し、フルオレセインから生じる蛍光を測定する工程を含む方法；並びに、腫瘍組織の造影方法であって、上記一般式(I)で表される化合物を腫瘍細胞又は腫瘍組織と接触させ後、フルオレセインに対する励起光を照射し、フルオレセインから生じる蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。
また、本発明により、がん診断方法であって、診断部位に上記一般式(I)で表される化合物を接触させ後、フルオレセインに対する励起光を該診断部位に照射し、フルオレセインから生じる蛍光を測定して腫瘍組織の有無を判定する工程を含む方法；内視鏡を用いたがん診断方法であって、診断部位に上記一般式(I)で表される化合物を接触させ後、内視鏡光源によりフルオレセインに対する励起光を該診断部位に照射し、フルオレセインから生じる蛍光を内視鏡により検出して腫瘍組織の有無を判定する工程を含む方法が提供される。
さらに、上記の診断薬、上記の造影剤、及び上記の診断方法において、上記一般式(I)で表される化合物とともに、又は上記一般式(I)で表される化合物に替えて、シアニン系化合物を用いてもよく、このような診断薬、造影剤、及び診断方法も本発明により提供される。
さらに、上記の診断薬、上記の造影剤、及び上記の診断方法において、上記一般式(I)で表される化合物とともに、又は上記一般式(I)で表される化合物に替えて、シアニン系化合物を用いてもよく、このような診断薬、造影剤、及び診断方法も本発明により提供される。
一般式(I)において、C1〜C4アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、シクロプロピルメチル基などを挙げることができる。これらのうち、C1〜C3アルキル基が好ましい。C2〜C4アルケニル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、1個又は2個の二重結合を含むことができる。アルケニル基としては、例えば、ビニル基、n-プロペニル基、イソプロペニル基、n-ブテニル基などを挙げることができる。C2〜C4アルキニル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、1個又は2個の三重結合を含むことができ、1個の三重結合と1個の二重結合を含んでいてもよい。アルキニル基としては、例えば、エチニル基、n-プロピニル基、n-ブチニル基などを挙げることができる。
一般式(I)において、アリール基としては単環性又は縮合多環性の芳香族炭化水素基を用いることができ、例えば、フェニル基、ナフチル基などが挙げられる。ヘテロアリール基としては、環構成原子として1個又は2個以上のヘテロ原子を含む単環性又は縮合多環性の芳香族基を用いることができる。ヘテロ原子としては、例えば、窒素原子、酸素原子、又はイオウ原子などが挙げられ、2個以上のヘテロ原子を含む場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。より具体的には、フリル基、チエニル基、ピロール基、ピリジル基、イミダゾリル基、ピリミジル基などを挙げることができる。
本明細書においてある官能基について「置換基を有していてもよい」という場合には、置換基の種類、個数、及び置換位置は特に限定されない。置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、アルコキシカルボニル基、又はハロゲン原子（ハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子などが挙げられる）などが挙げられるが、これらに限定されることはない。R1及びR2は同一でも異なっていてもよいが、化合物の合成的観点からはR1及びR2が同一であることが好ましい。
一般式(I)で表される代表的な化合物として、R1及びR2がメチル基である化合物（フルオレセインジアセテート：FDA）、R1及びR2がビニル基である化合物（フルオレセインジアクリレート：FDAcr）、R1及びR2がエチル基である化合物（FDP）、R1及びR2がn-プロピル基である化合物（FDB）、R1及びR2がn-ブチル基である化合物（FDC）、R1及びR2がフェニル基である化合物（FDBz）、及びR1及びR2が2-フリル基である化合物（FDFu）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
一般式(I)で表される化合物の代表的な化合物はいずれも公知化合物であり、例えば、モレキュラープローブス（Molecular Probes）社やアルドリッチ社の試薬カタログに収載されており、当業者は容易に入手可能である。また、公知化合物の製造方法に準じて容易に製造することもできる。例えば、FDAcrをはじめとするフルオレセインジエステル類はRotoman, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 134-141, 1966などに記載されているので、当業者は容易に入手可能である。
本発明の蛍光染色剤は腫瘍細胞又は腫瘍組織に取り込まれてエステラーゼにより加水分解を受け、強蛍光性のフルオレセインを生成する。本発明の蛍光染色剤で染色可能な腫瘍細胞又は腫瘍組織の種類は特に限定されず、例えば、胃癌、食道癌、十二指腸癌、気管支癌、肺癌、大腸癌、皮膚癌などの癌細胞又は癌組織など、任意の悪性腫瘍細胞又は悪性腫瘍組織を挙げることができるが、これらに限定されることはない。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の蛍光染色剤は正常細胞及び腫瘍細胞にほぼ同様に取り込まれるが、細胞内のエステラーゼ活性の違い、あるいはその他の代謝酵素活性などの違いにより、腫瘍細胞内においてより多量のフルオレセインが生成し、及び／又は生成したフルオレセインが腫瘍細胞内においてより長時間滞留し、その結果、腫瘍細胞内はフルオレセインによりより強く蛍光染色される。従って、本発明の蛍光染色剤は腫瘍細胞又は腫瘍組織に対して選択的な染色剤として使用することができる。本発明の蛍光染色剤で染色した腫瘍細胞又は腫瘍組織は、フルオレセインに対する励起光を照射した場合に蛍光を発するので、正常細胞から容易に識別可能である。
フルオレセインに対する励起光の種類は特に限定されないが、通常は、470-500 nm程度の波長の励起光を用いればよい。腫瘍細胞又は腫瘍組織に接触させるべき蛍光染色剤の濃度は特に限定されないが、例えば1×10-4〜1×10-2 mg/ml程度の濃度であり、腫瘍細胞又は腫瘍組織と上記蛍光染色剤とを接触させた後、通常は37℃程度の温度で数分から数時間、好ましくは10分〜2時間程度、さらに好ましくは30分〜2時間程度放置して加水分解を進行させ、その後に励起光を照射すればよい。
本発明の蛍光染色剤を有効成分として含む診断薬は、がん診断、例えば早期がん診断などの目的に好適に使用できる。例えば、腫瘍組織の存在の有無の確認を目的とした診断においては、診断の対象となる部位（例えば皮膚、口腔内、食道、胃、十二指腸、大腸、気管支、肺など）に上記診断薬を塗布、嚥下、噴霧、又は注射などの手段で接触させた後、数分から数時間、好ましくは10分〜2時間程度、さらに好ましくは30分〜2時間程度の時間をおいて該部位に励起光を照射して、蛍光染色された組織の有無を肉眼的又は顕微鏡的に確認すればよい。
より好ましい態様では、本発明の蛍光染色剤を蛍光造影剤として用いて内視鏡によるがん診断を行うことができる。例えば、診断の対象となる部位（食道、胃、十二指腸、大腸、気管支、肺など）に本発明の蛍光染色剤を嚥下、噴霧、又は注射などの手段で接触させた後、数分から数時間、好ましくは10分〜2時間程度、さらに好ましくは30分〜2時間程度の時間をおいて内視鏡光源により励起光を該部位に照射し、蛍光染色された組織の有無を内視鏡的に確認すればよい。内視鏡によりフイルムカメラやデジタルカメラ、CCDビデオカメラなどに画像や映像を記録して診断を行うこともできる。内視鏡の種類は特に限定されないが、内視鏡光源としてフルオレセインのための励起光を照射できる蛍光内視鏡が好ましい。
また、上記の診断薬、上記の造影剤、及び上記の診断方法において、上記の蛍光染色剤とともに、又は上記染色剤にに替えて、シアニン系化合物を用いてもよい。シアニン系化合物の種類は特に限定されず、当業者に利用可能なシアニン系化合物であれば任意のものを利用できる。例えば、市販されているCy-3、Cy-7などのシアニン系化合物（いずれもAmersham Biosciencesより市販品を入手可能である）を好適に用いることができる。特にシアニン系化合物のための励起光を内視鏡光源として照射可能な蛍光内視鏡を用い、蛍光造影剤としてCy-3又はCy-7、好ましくはCy-7を用いてがん診断を行う方法は本発明の好ましい態様である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：候補化合物の選出
培養細胞系にて候補化合物の選別をおこなった。培養細胞としては、ラット正常胃粘膜上皮由来細胞RGM1、及びそのトランスフォーム細胞であるRGK1を正常細胞及びがん細胞のモデル細胞として使用した。RGM1及び RGK1の培養にはDMEM/HAM F12＝1:1培地（10％FBS, 0.1％ penicillin streptomycinを用いた。それぞれの細胞に下記に示した化合物（濃度0.1M）を10分間ロードした後、培地を化合物非含有培地に交換し、一定時間後にFlow Cytometryから平均蛍光強度を求めた。各化合物の有効性はRGM1に対するRGK1の平均蛍光強度比により評価した。この結果、フルオレセインのエステル誘導体であるFDA（フルオレセインジアセテート）の蛍光強度比が最も高くなり、またその強度比は時間に依存して変化することが明らかとなった（図１）。
例１：候補化合物の選出
培養細胞系にて候補化合物の選別をおこなった。培養細胞としては、ラット正常胃粘膜上皮由来細胞RGM1、及びそのトランスフォーム細胞であるRGK1を正常細胞及びがん細胞のモデル細胞として使用した。RGM1及び RGK1の培養にはDMEM/HAM F12＝1:1培地（10％FBS, 0.1％ penicillin streptomycinを用いた。それぞれの細胞に下記に示した化合物（濃度0.1M）を10分間ロードした後、培地を化合物非含有培地に交換し、一定時間後にFlow Cytometryから平均蛍光強度を求めた。各化合物の有効性はRGM1に対するRGK1の平均蛍光強度比により評価した。この結果、フルオレセインのエステル誘導体であるFDA（フルオレセインジアセテート）の蛍光強度比が最も高くなり、またその強度比は時間に依存して変化することが明らかとなった（図１）。
例２
FDAはエステラーゼ感受性蛍光プローブであり、拡散で細胞に入った後に細胞内のエステラーゼで加水分解されて蛍光性のフルオレセインを生成し、徐々に細胞外へと漏出する。フルオレセインの細胞外漏出はフルオレセインがFDAに比べて親水性であることからFDAの細胞内取り込みに比べて非常にゆっくりと起きる。この過程を正常細胞及びがん細胞で比較した。2種類の細胞溶解液の加水分解酵素活性を比較したところ、RGK1がFDAに対して約2倍高い加水分解活性を有していた。また、フルオレセインの漏出速度を比較すると、RGM1に比べてRGK1の方が遅いことが分かった。これらの結果から、がん細胞における高い加水分解酵素活性と低い漏出速度の2つの要因によって、FDAでは正常細胞に対してがん細胞において高い蛍光強度比を与えたものと考えられた。
FDAはエステラーゼ感受性蛍光プローブであり、拡散で細胞に入った後に細胞内のエステラーゼで加水分解されて蛍光性のフルオレセインを生成し、徐々に細胞外へと漏出する。フルオレセインの細胞外漏出はフルオレセインがFDAに比べて親水性であることからFDAの細胞内取り込みに比べて非常にゆっくりと起きる。この過程を正常細胞及びがん細胞で比較した。2種類の細胞溶解液の加水分解酵素活性を比較したところ、RGK1がFDAに対して約2倍高い加水分解活性を有していた。また、フルオレセインの漏出速度を比較すると、RGM1に比べてRGK1の方が遅いことが分かった。これらの結果から、がん細胞における高い加水分解酵素活性と低い漏出速度の2つの要因によって、FDAでは正常細胞に対してがん細胞において高い蛍光強度比を与えたものと考えられた。
例３
FDAのアセチルエステルを各種のエステルに変換した下記表１の各誘導体について例１と同様にしてフローサイトメトリーにより比較した結果を図２に示す。その結果、フルオレセインジアクリレート(FDAcr)が正常細胞とがん細胞との識別性能に極めて優れていることが明らかになった。
FDAのアセチルエステルを各種のエステルに変換した下記表１の各誘導体について例１と同様にしてフローサイトメトリーにより比較した結果を図２に示す。その結果、フルオレセインジアクリレート(FDAcr)が正常細胞とがん細胞との識別性能に極めて優れていることが明らかになった。
例４
FDAcrを用いて蛍光顕微鏡下でのイメージングを行った。蛍光顕微鏡下（オリンパス社製IX71、励起波長470-490 nm、フィルター500 nm）で観察したところ、例３の結果と同様に、がん細胞において強い蛍光が認められ、がん細胞と正常細胞とを明確に区別できることが確認された。
FDAcrを用いて蛍光顕微鏡下でのイメージングを行った。蛍光顕微鏡下（オリンパス社製IX71、励起波長470-490 nm、フィルター500 nm）で観察したところ、例３の結果と同様に、がん細胞において強い蛍光が認められ、がん細胞と正常細胞とを明確に区別できることが確認された。
例５
FDAcrを用いて食道癌モデルであるNMBAラットのイメージングを行なった。ラット（オス、10週齢）にNMBA 1 mgを皮下注射し、第1〜5週は週5回投与し、第6〜15週は週1回投与し、第16週以降に実験に使用した。ラットをネンブタール腹腔内投与（1 mL/kg体重）により麻酔し、仰向けにして台に固定して気道を確保した。内視鏡を食道に挿入して観察を行った。実験系を図３に示し、結果を図４に示す。食道癌病変部の蛍光強度が周囲の正常組織に比べて高いことが観察された。この結果から、内視鏡下でFDAcrを用いることにより癌病変部と正常組織を区別できることが示された。
FDAcrを用いて食道癌モデルであるNMBAラットのイメージングを行なった。ラット（オス、10週齢）にNMBA 1 mgを皮下注射し、第1〜5週は週5回投与し、第6〜15週は週1回投与し、第16週以降に実験に使用した。ラットをネンブタール腹腔内投与（1 mL/kg体重）により麻酔し、仰向けにして台に固定して気道を確保した。内視鏡を食道に挿入して観察を行った。実験系を図３に示し、結果を図４に示す。食道癌病変部の蛍光強度が周囲の正常組織に比べて高いことが観察された。この結果から、内視鏡下でFDAcrを用いることにより癌病変部と正常組織を区別できることが示された。
例６
例５と同様にしてシアニン系の近赤外蛍光色素であるCy-7を用いて蛍光内視鏡像を得た。Cy-7では非病変部と思われる部分からも蛍光が観察されたが、主として食道内に突出している瘤状の病変部からCy-7由来の蛍光が観察され、病変部が蛍光染色されていることが示された。
例５と同様にしてシアニン系の近赤外蛍光色素であるCy-7を用いて蛍光内視鏡像を得た。Cy-7では非病変部と思われる部分からも蛍光が観察されたが、主として食道内に突出している瘤状の病変部からCy-7由来の蛍光が観察され、病変部が蛍光染色されていることが示された。
例７
FDAcrを用いて大腸癌モデルラットのイメージングを行なった。大腸癌モデルラットをエーテル麻酔し、大腸内を0.6%酢酸水溶液で洗浄した。37℃に保ったPBSで大腸内を2〜3回洗浄し、100μM FDAcr（PBS溶液）15 mlを肛門より注腸し、肛門を塞いで3分間静置した。3分後に37℃に保ったPBSで2〜3回大腸内を洗浄した。大腸内にファイバースコープ（BF-3C40）を挿入して病変部を観察した。糞が観察の邪魔になる場合には適宜大腸内を洗浄した。結果を図５に示す。大腸癌部位（左側面、右下面）に強い蛍光が認められ、容易に癌診断が可能であった。
FDAcrを用いて大腸癌モデルラットのイメージングを行なった。大腸癌モデルラットをエーテル麻酔し、大腸内を0.6%酢酸水溶液で洗浄した。37℃に保ったPBSで大腸内を2〜3回洗浄し、100μM FDAcr（PBS溶液）15 mlを肛門より注腸し、肛門を塞いで3分間静置した。3分後に37℃に保ったPBSで2〜3回大腸内を洗浄した。大腸内にファイバースコープ（BF-3C40）を挿入して病変部を観察した。糞が観察の邪魔になる場合には適宜大腸内を洗浄した。結果を図５に示す。大腸癌部位（左側面、右下面）に強い蛍光が認められ、容易に癌診断が可能であった。
本発明の蛍光染色剤は腫瘍細胞又は腫瘍組織を正常細胞又は正常組織と区別して蛍光染色するための染色剤として有用であり、例えば、内視鏡診断において腫瘍組織選択的な造影剤として使用することができる。
Claims (4)
- 内視鏡を用いた固形がんの診断に用いるための造影剤であって、下記の一般式(I)：
- R1及びR2が-CH=CH2である請求項１に記載の造影剤。
- 胃癌、食道癌、十二指腸癌、気管支癌、肺癌、又は大腸癌の診断に用いるための請求項１又は２に記載の造影剤。
- 食道癌又は大腸癌の診断に用いるための請求項１又は２に記載の造影剤。
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