-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum einfachen und klaren
Fluoreszenzfärben
eines lebenden Körpergewebes
oder eines aus dem lebenden Körper
entnommenen Gewebes sowie ein dabei zu verwendendes Färbungsmittel.
-
Beschreibung des Standes
der Technik
-
Das
Erzeugen von Querschnittsbildern lebender Körpergewebe ist auf dem medicobiologischen
Gebiet extrem wichtig. Querschnittsbilder aus lebenden Körpern entnommener
Gewebe konnten bisher nur durch chemische Fixation, Dehydrierung,
Schichtbildung und Färbung
erhalten werden.
-
Die
Entwicklung eines konfokalen Abbildungssystems und die Existenz
eines konfokalen Laser-Abtastmikroskops ermöglichte die nicht-invasive
Beobachtung von Zellen und Geweben bei dem Betrachten von Schnitten
biologischer Proben mit kompliziert mehrfach geschichteten Zellen
und verbindenden Geweben. Medizinische Endoskope mit einem konfokalen
Abbildungssystem wurden in jüngerer
Zeit entwickelt.
-
Das
Betrachten fluoreszierender Bilder mit einem konfokalen optischen
System erfordert Verfahren zum Färben
eines lebenden Körpergewebes
sowie einer daraus abgeleiteten Probe mit einem fluoreszierenden
Farbstoff. Wird ein lebendes Gewebe mit einem konfokalen Abtastmikroskop
und einem damit ausgerüsteten
medizinischen Endoskop betrachtet, so ist zur biologischen Sicherheit
ein Färbungsmittel
erforderlich.
-
Fluorescein
wurde bisher als fluoreszierendes, für lebende Körper sicheres Kontrastmittel
bei der Augenspiegelung usw. verwendet, wobei es in wässriger
Lösung
intravenös
injiziert wurde (Nicht-Patentdokument 1). Alternativ kann ein Gewebe
durch direktes Aufsprühen
eines Färbungsmittels
auf die Gewebeoberfläche
gefärbt
werden, ohne es durch Blutgefäße wie Venen
zuzuführen.
Das direkte Aufsprühen
einer Färbungslösung auf
die Gewebeoberfläche
ist ein wirksames Mittel zum Färben
extrahierter Organe. Bei dem in-vivo-Einfärben hat dieses Verfahren,
verglichen mit dem intravenösen
Injizieren und Durchströmen den
Vorteil, dass der Einfluss einer Färbungslösung auf lebende Körper reduziert
wird, denn es ist nur eine geringe Menge der Färbungslösung erforderlich. Ferner wird
kein Farbstoff an eine Stelle des lebenden Körpers geleitet, an der er nicht
benötigt
wird.
-
Die
auf das lebende Gewebe aufgesprühte
Fluoresceinlösung
wandert in das Gewebe hinein, und ein Teil der Lösung bleibt als Flüssigkeitsansammlung
auf der Gewebeoberfläche
zurück.
Wird das Gewebe in diesem Zustand mit Anregungslicht bestrahlt,
fluoreszieren die eingewanderten Fluoresceinmoleküle und die
auf der Gewebeoberfläche
verbleibenden Fluoresceinmoleküle,
so dass das Unterscheiden der gefärbten und der nichtgefärbten Bereiche
ungenau wird. Deshalb musste man bisher nach dem Aufsprühen des
Färbungsmittels
auf die Gewebeoberfläche
die in den nichtgefärbten
Bereichen verbleibenden freien Fluoresceinmoleküle durch Waschen entfernen.
-
Der
freie Farbstoff kann durch mehrmaliges Waschen des gefärbten Gewebes
mit einem geeigneten Puffer oder einer Lösung entfernt werden. Die zu
betrachtende Probe hat aber eine ziemlich empfindliche Oberfläche und
muss sorgfältig
gewaschen werden, um eine Deformation oder einen Schaden der Probe
und ein Denaturieren des Gewebes zu vermeiden.
-
Somit
müssen
die Waschprozeduren sanft und sorgfältig durchgeführt werden.
Ferner verursacht ein übermäßiges Waschen
das Ablösen
des Farbstoffs (Entfärbung)
von dem eingefärbten
Gewebe.
-
Wird
andererseits eine extrahierte Gewebeprobe ohne eine chemische Fixation
eingefärbt
und mit einem konfokalen Abtastmikroskop betrachtet, so tritt während der
Waschprozeduren die Autolyse des Gewebes sowie ein Denaturieren
der Zellen oder des Proteins auf, wodurch das Problem entsteht,
dass die Probe einen anderen Zustand als im lebenden Körper hat.
[Nicht-Patentdokument 1] Gastroenterology, 127 (3), 706–713, 2004.
-
Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zum genauen und klaren Fluoreszenzfärben eines Gewebes mit einfachen
Prozeduren sowie ein dabei einzusetzendes Färbungsmittel anzugeben.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Der
Erfinder hat seine Aufmerksamkeit auf Fluorescein gerichtet und
verschiedene Studien durchgeführt.
Fluorescein in wässriger
Lösung
zeigt eine Fluoreszenz bei alkalischen pH-Werten, jedoch kaum in
saurer Lösung.
Somit wurde Fluorescein bisher in alkalischer Lösung verwendet, und die Fluoreszenzbeobachtung
erfolgte unter alkalischen Bedingungen. Der Erfinder hat aber im
Laufe seiner verschiedenen Studien völlig unerwartet festgestellt,
dass mit einem Gewebe verbundenes Fluorescein in einer sauren Umgebung
klare Fluoreszenz zeigt, obwohl es in saurer Lösung kaum Fluoreszenz zeigt.
Wird ein mit Fluorescein behandeltes Gewebe während der Fluoreszenz in eine
saure Umgebung gebracht, so kann daher nur mit dem Gewebe verbundenes
Fluorescein wahlweise fluoreszierend gefärbt werden, während nicht
mit dem Gewebe verbundenes Fluorescein kaum eine Fluoreszenz zeigt.
Somit hat der Erfinder herausgefunden, dass ein klares und genaues
Fluoreszenzbild eines Gewebes ohne komplizierte Waschprozeduren
erhalten werden kann. Auf dieser Grundlage wurde die vorliegende
Erfindung gemacht.
-
Speziell
führt die
vorliegende Erfindung zu einem Verfahren zum Fluoreszenzfärben eines
Gewebes, bei dem das Gewebe mit einer Fluorescein oder ein Salz
von Fluorescein enthaltenden Lösung
behandelt und dann unter sauren Bedingungen mit einem pH-Wert unter
7 die Fluoreszenz betrachtet wird.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Fluoreszenzfärbungsmittel
für ein
Gewebe in Form einer Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthaltenden
Lösung,
mit der ein Gewebe zu behandeln und danach seine Fluoreszenz unter
sauren Bedingungen mit einem pH-Wert unter 7 zu betrachten ist.
-
Die
vorliegende Erfindung besteht ferner in der Verwendung einer Fluorescein
oder ein Salz von Fluorescein enthaltenden Lösung zum Herstellen eines Fluoreszenzfärbungsmittels
für ein
Gewebe, mit dem das Gewebe zu behandeln und dann im behandelten
Bereich unter sauren Bedingungen mit einem pH-Wert unter 7 die Fluoreszenz
zu betrachten ist.
-
Bei
dem Färbungsverfahren
nach der vorliegenden Erfindung kann ein klares und genaues Färbungsbild
erhalten werden, da nur mit einem Gewebe verbundenes Fluorescein
wahlweise fluoreszierend gefärbt werden
kann. Fluorescein ist nämlich
allgemein stark abhängig
von dem pH-Wert, und seine Fluoreszenz kann bei höheren pH-Werten
weiter verbessert werden. Nur ein in das Innere eines lebenden Gewebes
eingedrungenes und mit diesem verbundenes Fluoresceinmolekül fluoresziert
stark, wenn das lebende Gewebe in einem zuvor nicht abbildbaren
Zustand eingefärbt
wird, wobei zur Fluoreszenzbeobachtung saure Bedingungen einzustellen
sind. Unter dieser Voraussetzung gibt ein freies Fluoresceinmolekül keine
Fluoreszenz ab. Daher kann ein fluoreszenzgefärbtes Bild des lebenden Gewebes
ohne komplizierte und invasive Prozeduren wie Waschen nach dem Einfärben und
Durchwandern betrachtet werden.
-
KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt
ein Diagramm der Abhängigkeit
des pH-Wertes von der Fluoreszenz des Fluoresceins;
-
2 zeigt
ein Diagramm des fluoreszenzgefärbten
Bildes des Dickdarms, behandelt mit einer Fluoresceinlösung mit
pH 4,0 bei nachfolgender Fluoreszenzbeobachtung; und
-
3 zeigt
ein Diagramm eines fluoreszenzgefärbten Bildes des Dickdarms,
behandelt mit einer Fluoresceinlösung
mit pH 9,0 bei nachfolgender Fluoreszenzbetrachtung.
-
AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER VORZUGSWEISEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Bei
einem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wird ein Gewebe
mit einer Lösung
behandelt, die Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthält. In diesem
Zusammenhang ist unter Gewebe ein lebendes Gewebe und ein dem lebenden
Körper
entnommenes Gewebe (extrahiertes Gewebe) zu verstehen. Zu dem lebenden
Gewebe gehören
die Speiseröhre,
der Magen, der Zwölffingerdarm,
der Dünndarm,
der Dickdarm, der After, die Mundhöhle und die Innenwände der
Harnorgane. Die entnommenen Gewebe sind den vorstehenden lebenden
Organen entnommene sowie von verschiedensten weiteren Organen entnommene
Gewebe und muskuläre
Gewebe.
-
Das
Fluorescein oder dessen Salz sind bei der vorliegenden Erfindung
Fluorescein, Fluorescein-Natrium und Fluorescein-Kalium, und Fluorescein
sowie Fluorescein-Natriumsalze sind vorzugsweise anzuwenden. Darunter
sind insbesondere Fluorescein und ein Fluorescein-Dinatriumsalz (Uranin)
anzuwenden. Das Fluorescein hat eine grüne Fluoreszenz (angeregt bei
490 nm) im Bereich von 520 nm und kann daher mit einem Ar-Laserlicht
(488 nm, 514 nm) gut angeregt werden. Eine wässrige Lösung von Uranin ist ein Säurefarbstoff,
der einen inneren molekularen Aufbau in Form eines Xanthenskeletts
hat, das, auch in kleinen Mengen, bei Bestrahlung mit Licht eine
grüne Fluoreszenz
zeigt. Das Absorptionsmaximum des Uraninfarbstoffs liegt bei 450
bis 490 nm, jedoch treten abhängig
von den Lösungsmitteln
auch Unterschiede auf.
-
Vorzugsweise
wird zur Behandlung des Gewebes bei der vorliegenden Erfindung die
das Fluorescein oder ein entsprechendes Salz enthaltende Lösung auf
das Gewebe aufgebracht oder dieses in die Lösung eingetaucht. Aufgebracht
wird es vorzugsweise dann, wenn ein lebendes Gewebe zu behandeln
ist. Aufbringen bedeutet Sprühen,
Träufeln
usw.. Ist das Gewebe ein dem lebenden Körper entnommenes Gewebe, so
wird es in die Lösung
eingetaucht. Die Menge der aufgebrachten Lösung sollte so bemessen sein,
dass die Lösung auf
das gesamte Gewebe aufgebracht werden kann.
-
Der
so behandelte Teil muss nur in eine saure Umgebung mit einem pH-Wert unter 7 gebracht
werden, wenn die Fluoreszenz beobachtet wird, und somit kann die
verwendete Lösung
eine basische Lösung
mit einem pH-Wert über 7 oder
eine saure Lösung
mit einem pH-Wert unter 7 sein. Wird eine basische Lösung mit einem
pH-Wert über
7 verwendet, die Fluorescein oder ein entsprechendes Salz enthält, so wird
das Gewebe mit der Lösung
behandelt, und die Fluoreszenz des behandelten Teils kann dann beobachtet
werden, nachdem er mit einer sauren Lösung mit pH unter 7 gewaschen
wurde. Alternativ kann bei Verwendung einer sauren Lösung mit
pH-Wert unter 7, die Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthält, das
Gewebe direkt fluoreszierend beobachtet werden, nachdem es mit der
Lösung
behandelt wurde.
-
Die
Lösung
mit einem pH-Wert nicht unter 7, die Fluorescein oder ein Salz von
Fluorescein enthält, wird
durch Beigabe einer basischen Substanz, z. B. Natriumhydroxid, Natriumacetat,
Natriumwasserstoffphosphat oder Glycin gebildet, wodurch der pH-Wert
nicht unter 7 erreicht wird. Diese Substanz wird einer wässrigen
Lösung
beigegeben, die Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein enthält. Vorzugsweise
beträgt
der pH-Wert 7 bis 10, besonders vorzugsweise 7 bis 8. Vorzugsweise
wird der pH-Wert mit einem Puffer eingestellt, insbesondere z. B.
mit Natriumphosphat, Tris-hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid,
Lysinhydrochlorid oder Argininhydrochlorid.
-
Die
Lösung
mit einem pH-Wert unter 7, die Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein
enthält,
wird durch Zugabe einer sauren Substanz zu einer wässrigen
Lösung
gebildet, die Fluorescein oder das Salz enthält. Solche Substanzen sind
z. B. Phosphorsäure,
Salzsäure,
Kohlensäure,
eine anorganische Säure
oder eine nichttoxische organische Säure (z. B. Essigsäure oder
Zitronensäure).
Vorzugsweise liegt der pH-Wert bei 4 bis 6,5, insbesondere bei 6
bis unter 7. Vorzugsweise wird der pH-Wert mit einem Puffer eingestellt,
insbesondere z. B. mit einer nichttoxischen, sauren Pufferlösung wie
Natriumphosphat, Natriumacetat, Natriumcitrat oder Natriumcarbonat.
-
Die
Fluoresceinkonzentration in der das Fluorescein oder ein entsprechendes
Salz enthaltenden Lösung
ist vorzugsweise 0,001 mg/ml bis 50 mg/ml, insbesondere 0,1 bis
10 mg/ml. Fluorescein mit einer Konzentration nicht unter 10 mg/ml
ist eine Lösungsform,
die leicht bei einem pH-Wert nicht über 5 aufgebracht werden kann.
Fluorescein mit einer Konzentration nicht über 0,001 mg/ml hat nur schwache
Färbungseigenschaften.
-
Wie
oben beschrieben, wird der behandelte Teil des zu färbenden
Gewebes in eine saure Umgebung mit einem pH-Wert unter 7 gebracht,
indem er mit einer sauren Lösung
gewaschen oder mit einer sauren Lösung behandelt wird, deren
pH-Wert unter 7 liegt und die Fluorescein oder ein Salz von Fluorescein
enthält. Daher
fluoresziert freies Fluorescein nicht, während nur das an dem Gewebe
gebundene Fluorescein fluoresziert.
-
Die
Fluoreszenz kann durch Bestrahlen mit Anregungslicht gemessen werden.
Vorzugsweise wird das fluoreszenzgefärbte Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop,
einem Fluoreszenzendoskop oder einem konfokalen Abbildungssystem
betrachtet. Das konfokale Abbildungssystem enthält ein konfokales Abtastmikroskop und
ein Endoskop mit einem konfokalen Abbildungssystem.
-
Ein
Fluoreszenzfärbungsmittel
nach der vorliegenden Erfindung enthält nur eine Lösung von
Fluorescein oder einem Salz von Fluorescein mit einem pH-Wert unter
7. Andererseits enthält
das Fluoreszenzfärbungsmittel
eine Lösung
von Fluorescein oder einem Salz von Fluorescein in Kombination mit
einer sauren Lösung
mit einem pH-Wert unter 7 (zum Waschen), wenn die Lösung eine
basische Lösung
ist, deren pH-Wert nicht kleiner als 7 ist.
-
Beispiele
-
Die
Erfindung wird nun ausführlicher
unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben.
-
Beispiel 1
-
pH-Wert-abhängige Fluoreszenz
von Fluorescein
-
Der
pH-Wert einer wässrigen
Lösung
von Fluorescein-Natrium (1 mg/ml) wurde mit einer Pufferlösung von
0,1 Mol Natriumphosphat eingestellt und dann eine Messung bei einer
Anregungswellenlänge
von 490 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 530 nm durchgeführt.
-
Ein
Mikroplattenleser (hergestellt von Corona, MTP-800AFC) wurde bei
der Fluoreszenzmessung verwendet.
-
Wie
das in 1 dargestellte Ergebnis zeigt, steigt die Intensität der Fluoreszenz
von Fluorescein mit zunehmenden pH-Werten.
-
Beispiel 2
-
Fluorescein-Natrium-Färbungstest
mit Rattendickdarm
-
Der
mit Formalin konservierte Dickdarm von Ratten (8 Wochen alt, männlich)
wurde zum Beobachten eines Unterschieds der Färbungseigenschaft abhängig von
dem pH-Wert verwendet. Die Dickdärme
wurden für
zehn Sekunden mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (137
mMol/l NaCl, 8,1 mMol/l Na2HPO4,
2,7 mMol/l KCl, 1,57 mMol/l KH2PO4, im Folgenden als PBS (-) bezeichnet) für zehn Sekunden
gewaschen und dann in Lösungen
von Fluorescein-Natrium (hergestellt von Sigma, F6377, im Folgenden
als F-Na bezeichnet) eingetaucht, die auf 1 mg/ml mit sauren, alkalischen
und neutralen Pufferlösungen
eingestellt und verdünnt
waren. Die neutralen, alkalischen und sauren Pufferlösungen waren
0,1 M Natriumphosphat-Pufferlösung
(pH 7,0), 0,1 M Borat-Pufferlösung
(pH 9,1) und 0,4 M NaH2PO4-Pufferlösung (pH
4,65). Nach weiterem Waschen für
zehn Sekunden mit PBS (-) wurden die Dickdärme mit einer sauren 10%-Formalinpufferlösung konserviert und mit
einem konfokalen Abtastmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems,
TCS-SP2) betrachtet.
-
Obwohl
alle Gewebeproben gut gefärbt
waren, führte
F-Na, gelöst
mit Pufferlösungen
mit pH 7,0 und 9,0 zu einem verstärkten Hintergrund und war daher
zur Zellenbetrachtung nicht geeignet.
-
Beispiel 3
-
Unterschied
der Durchdringung und der Fluoreszenz des Farbstoffs abhängig von
pH-Änderungen
im Lösungsmittel
Die Dickdärme
von Ratten (8 Wochen alt, männlich)
wurden extrahiert und einem Färbungstest unterzogen.
-
F-Na
(hergestellt von Sigma, F6377) wurde auf 1 mg/ml eingestellt und
mit 0,1 M Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0), 0,1 M Borat-Pufferlösung (pH
9,1) und 0,4 M NaH2PO4-Pufferlösung (pH
4,65) verdünnt,
um die jeweilige 0,1 mg/ml Lösung
zu erhalten, in die die Gewebe dann für eine Minute eingetaucht wurden.
Nach weiterem Waschen für
zehn Sekunden mit PBS (-) wurden die erhaltenen Gewebe mit einem
konfokalen Abtastmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems,
TCS-SP2) betrachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
-
-
Beispiel 4
-
Die
Gewebefärbung
wurde im pH-Bereich 4 bis 7 unter isotonischen Bedingungen von F-Na
(hergestellt von Sigma, F6377) beobachtet.
-
Die
Dickdärme
von Ratten (8 Wochen alt, männlich)
wurden extrahiert. Sie wurden mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (137
mMol/l NaCl, 8,1 mMol/l Na2HPO4,
2,7 mMol/l KCl, 1,5 mMol/l KH2PO4, 4,4 mMol/l CaCl2·2H2O, 1,6 mMol/l MgCl2·6H2O,
im Folgenden als PBS (+) bezeichnet) gewaschen und dann durch Eintauchen
für eine
Minute in F- Na (0,1
mg/ml) auf jeden pH-Wert eingestellt. Die gefärbten Dickdärme wurden mit einem konfokalen
Abtastmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems, TCS-SP2) betrachtet.
-
Hier
wurde gleichzeitig eine Kontrollprüfung mit einer Salzlösung durchgeführt, weil
eine Salzlösung als
Lösungsmittel
für F-Na
bei der intravenösen
Injektion usw. verwendet wird.
-
Die
Abbildungsbedingungen für
das konfokale Abtastmikroskop waren ein konfokaler Öffnungsdurchmesser
von 1,00 in Luft, und es wurden zwei Arten von Linsen, 20x und 63x Öl-Immersionslinsen,
verwendet. Das Mikroskop wurde zum automatischen Korrigieren eines
Verstärkungswertes
programmiert, und die Beobachtung erfolgte bei optimaler Leuchtdichte.
-
Fluorescein
Na/D.W. wurde auf 5 mg/ml eingestellt und mit einer Zitronensäure-Phosphorsäure-Pufferlösung mit
jedem pH-Wert und einer Salzlösung
auf 0,1 mg/ml verdünnt.
Die Dickdärme
wurden in die eingestellten Färbungslösungen eingetaucht,
dann mit PBS (+) gewaschen und beobachtet. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 2 aufgeführt.
-
-
Beispiel 5
-
Scheiben
der in Beispiel 4 verwendeten Dickdärme wurden beobachtet, und
es wurde der Eindringgrad einer Färbungslösung beobachtet. Fluorescein-Natrium
wurde auf 0,1 mg/ml wie in Beispiel 4 durch Verdünnen mit Lösungen mit pH 4,0, 5,0, 6,0
und 7,0 und einer Salzlösung
eingestellt.
-
Die
Abbildung erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop (hergestellt von
ZEISS, LSM510) bei einem Öffnungsdurchmesser
von 1,0 und Max, und es wurden 20x und 40x-Linsen verwendet.
-
Die
Beobachtung der Scheiben zeigte, dass ein Teil in der Größenordnung
von 50 μm
in der Epithelzelle gut gefärbt
war, und dass in diesem Teil eine starke Fluoreszenz auftrat.
-
Bei
der Beobachtung mit Färbungslösungen mit
veränderlichen
pH-Werten ergab
sich kein merklicher Unterschied der Eindringtiefe in die Gewebe.
-
Wie
die Beispiele 1 bis 5 ergeben, zeigt Fluorescein in freier und in
gewebegebundener Form bei alkalischen Bedingungen eine Fluoreszenz,
während
nur die gewebegebundene Form unter sauren Bedingungen eine Fluoreszenz
zeigt.
-
Beispiel 6
-
Die
Beobachtung wurde bei verschiedenen Konzentrationen und einem konstanten
pH-Wert von 6,0 durchgeführt.
-
Die
Konzentration von F-Na (hergestellt von Sigma, F6377) wurde auf
10, 1,0, 0,1, 0,01 oder 0,001 mg/ml eingestellt. Nach dem Einstellen
auf die jeweilige Konzentration mit einer Zitronensäure-Phosphorsäure- Pufferlösung (pH
6,0) erfolgte die Beobachtung mit einem konfokalen Abtastmikroskop
(hergestellt von Leica Microsystems, TCS-SP2).
-
Die
Abbildungsbedingungen für
das konfokale Abtastmikroskop waren ein konfokaler Öffnungsdurchmesser
von 1,00 in Luft und zwei Öl-Immersionslinsen
20x und 63x. Die Mikroskop wurde zur automatischen Korrektur eines
Verstärkungswertes
programmiert, und es wurde bei optimaler Leuchtdichte beobachtet.
-
Obwohl
das gefärbte
Bild mit: den geringen F-Na-Konzentrationen 0,01 und 0,001 mg/ml
bestätigt wurde,
konnte ein klares Bild infolge geringer Leuchtdichte nicht erzielt
werden.
-
Als
Ergebnis wurde eine zu einem klaren Bild führende Gewebedurchlässigkeit
im Bereich von 0,1 bis 10 mg/ml erzielt.
-
Beispiel 7
-
Scheiben
der Dickdärme
aus Beispiel 6 wurden betrachtet, und es wurde der Durchdringungsgrad
einer Färbungslösung beobachtet.
-
Die
Konzentration des Fluorescein-Natriums wurde auf 100, 10, 1,0, 0,1,
0,01 und 0,001 mg/ml wie in Beispiel 6 beschrieben eingestellt.
Nach dem Einstellen auf die jeweilige Konzentration mit einer Zitronensäure-Phosphorsäure-Pufferlösung; (pH
6,0) wurde die Abbildung mit einem konfokalen Abtastmikroskop (hergestellt
von ZEISS, LSM510) erzeugt, wobei die Abbildungsbedingungen ein
konfokaler Öffnungsdurchmesser von
1,0 und Max sowie 20x- und 40x-Linsen waren.
-
Als
Ergebnis der Beobachtung mit unterschiedlichen Fluorescein-Natriumkonzentrationen
färbten
die Färbungslösungen mit
höheren
Konzentrationen die Schleimhäute
dunkler. [Tabelle
3]
- +: je größer die Zahl der +, desto besser
die Färbung
des Gewebes
- -: nicht gefärbt
-
Beispiel 8
-
Beobachtung der Färbungseigenschaft
von Fluorescein-Natrium mit dem Fluoreszenzmikroskop
-
Nach
dem Färben
mit Fluorescein-Natrium (auch als F-Na bezeichnet) erfolgte die
Beobachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop (hergestellt von Leica
Microsystems, DM IRB).
-
Mit
Formalin konservierte Dünndärme von
Kaninchen wurden als Proben verwendet und bei pH 4,0 und 9,0 beobachtet.
-
F-Na
wurde auf 1 mg/ml mit einer Salzlösung eingestellt und durch
Verdünnen
mit 0,1 M Phosphorsäure-Puffer
auf 0,01 mg/ml auf jeden pH-Wert
eingestellt.
-
Die
auf jeden pH-Wert eingestellte Färbungslösung wurde
auf die in Formalin konservierten Dünndärme der Kaninchen ohne Waschen
aufgebracht. Die überschüssige Färbungslösung wurde
durch Adsorption mit einem Filterpapier entfernt und dann eine Beobachtung
mit einem Fluoreszenzmikroskop vorgenommen. Die verwendete Objektivlinse
hatte eine Vergrößerung von
40 mal.
-
Als
Ergebnis färbte
die Färbungslösung mit
pH = 4,0 die Dünndarmzotten
auch ohne Waschprozedur nach dem Färben und ergab ein klares Färbungsbild.
Wurde die Beobachtung aber direkt nach dem Färben mit der Färbungslösung mit
pH 9,0 durchgeführt,
so wurde eine Fluoreszenz aus einer Flüssigkeit außerhalb des Gewebes und nicht
von den Dünndarmzotten
abgegeben und es ergab sich ein unklares Bild. Die 0,1 M-Phosphorsäure-Pufferlösung (pH
9,0) in der Verdünnung
erforderte ein Waschen zum Entfernen der benachbarten fluoreszenten
Lösung.
-
Beispiel 9
-
Färben durch
Infusion von Fluorescein-Natrium in den Darm
-
In
lebenden Körpern
sondern die Verdauungsorgane dauernd Schleim ab, der vom Körper aufgenommen
und verdaut wird. Zum Bestätigen
der Vorteile der vorliegenden Erfindung in einer Umgebung ähnlich dem Einsatz
eines Endoskops wurden die Färbungseigenschaften
von Fluorescein-Natrium im Dickdarm eines lebenden Körpers beobachtet.
-
Es
wurde der Dickdarm eines lebenden Körpers bei zwei pH-Werten im
sauren und im alkalischen Bereich gefärbt und mit einem konfokalen
Abtastmikroskop (hergestellt von Leica Microsystems, TCS-SP2) beobachtet.
-
Einer
Maus (9 Wochen alt, männlich)
wurde unter Narkose mit einer Spritze (Terumo 27G, 0,4 mm) im oberen
Teil des Dickdarms 500 μl
F-Na (pH 4; 1 mg/ml) injiziert. Nach zehn Minuten wurde der Dickdarm
extrahiert, und das Innere wurde mit PBS (+) gewaschen.
-
Der
extrahierte Teil des Dickdarms ergab sich durch Ausschneiden von
5,5 bis 6,5 cm aus dem Blinddarm.
-
Wie 2 zeigt
(Verstärkungswert
480 V, etwa 0 μm
Abstand zu dem Epithel), wurde die Gewebestruktur bei Verwendung
von F-Na mit pH 4,0 klar beobachtet, und die Becherzelle war nicht
gefärbt.
-
Ferner
wurde zur Beobachtung eine Färbungslösung von
F-Na mit pH 9,0 (1 mg/ml, 500 μl)
verwendet. Die Färbungslösung mit
pH 9,0 ergab einen geringen Unterschied der Fluoreszenz-Leuchtdichte
zwischen dem gefärbten
Bereich und einer Flüssigkeitsansammlung,
die freies F-Na enthielt, und ergab ein unklares Gewebebild wie
bei der vorherigen Beobachtung bei unterschiedlichen pH-Werten (3).
-
Beispiel 10
-
Unterschied
der Färbungseigenschaften
abhängig
von dem pH-Wert der Waschlösung
bei Fluorescein-Natrium-Färbung
-
Fluorescein-Natrium
(auch als F-Na bezeichnet) zeigt eine starke Fluoreszenz in wässriger
Lösung
bei einem pH-Wert nicht unter 7. Beim Färben der Gewebeoberfläche mit
einer wässrigen
Lösung
von F-Na bei einem pH-Wert nicht unter 7 zeigen F-Na-Moleküle im inneren
Bereich des Gewebes und in einer Flüssigkeitsansammlung auf der
Gewebeoberfläche
eine Fluoreszenz und machen daher eine Beobachtung des gefärbten Gewebes
schwierig.
-
Das
in der Flüssigkeit
vorhandene F-Na kann durch Waschen der Gewebeoberfläche entfernt
werden. Das in dem inneren Bereich des Gewebes vorhandene F-Na wird
durch die Waschprozeduren aber auch ausgespült, wodurch sich ein reduzierter
Färbungseffekt
ergibt.
-
Deshalb
wurde nach dem Färben
eines Gewebes mit einer wässrigen
Lösung
von F-Na mit einem pH-Wert nicht unter 7 eine geringe Menge einer
sauren Lösung
mit einem pH-Wert kleiner als 7 auf das Gewebe aufgebracht (getröpfelt),
um dadurch die Fluoreszenzeigenschaft des freien F-Na zu beseitigen,
das nicht an der Färbung
beteiligt war. Dann wurde nach dem Färben beobachtet. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 4 aufgeführt.
-