CH675077A5

CH675077A5 -

Info

Publication number: CH675077A5
Application number: CH4900/86A
Authority: CH
Inventors: Frantisek Dr Rypacek; Jan Dr Uher; Jaroslav Dr Drobnik
Original assignee: Ceskoslovenska Akademie Ved
Priority date: 1985-12-11
Filing date: 1986-12-09
Publication date: 1990-08-31
Also published as: DE3642390A1; CS907885A1; CS255758B1; DE3642390C2; GB8628294D0; IT1199724B; GB2184015B; GB2184015A; IT8622618A0; US4808399A

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Präparat für die Diagnostik der Transportfunktion der Eileiter sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung gemäss dem Oberbegriff der Ansprüche 1 und 7.

Die Unfähigkeit der Eileiter (Salpinx), das Ovum resp. das Blastocyst aus der Gegend des Ovarium in das Lumen der Gebärmutter (Uterus) zu transportieren, ist ein häufiger Grund der weiblichen Unfruchtbarkeit, weshalb auf 1/3 aller unfruchtbaren Ehen abgeschätzt wird. Die Gründe können anatomische sein, z.B. die totale Undurchlässigkeit der Eileiter, oder funktionelle, bei welchen die Eileiter zwar durchgängig sind, aber der Transport trotzdem nicht zustandekommt. Diese funktionelle tubare Sterilität (FIS) wird meistens zu den sogenannten nicht erklärlichen Sterilitäten, deren Frequenz auf 15% der weiblichen Sterilität abgeschätzt wird, eingereiht werden. Sie kann die verschiedensten Ursachen haben, wie die angeborene Hypoplasie, Störung der Muskelaktivität, Störung der Eiabnahme (Ovum pick-up), aber die häufigste Ursache ist wahrscheinlich der persistierende Spasmus des isthmischen Sfincter, welcher den Lumen dieses Abschnittes auf 150 um herabsetzt, während die Blastocyste einen Durchmesser von 380 bis 400 um hat.

Während anatomische Defekte eine chirurgische Behandlung indizieren, sind Störungen des Transportes durch konservative Verfahren reparierbar. Daraus geht die Notwendigkeit von verlässlichen differentialen Diagnostiken hervor.

Die bekannten diagnostischen Verfahren sind entweder ascendent oder descendent. Bei den ascen-denten Verfahren wird der Eileiter durch die Applikation einer Flüssigkeit oder eines Gases (CO2) in den uterotubaren Trakt gefüllt. Beobachtet wird dann (bei der Laparoskopie) der Durchgang der Flüssigkeit (geeignet gefärbt) und/oder wird der Widerstand des eingeführten Mediums registriert. Es wurde auch ein Verfahren beschrieben, das den aktiven Transport von radioaktiven Mikrosphären (aus menschlichem Albumin 0 10 az 35 mm, markiert 99 m Te; S.C. Stone et al., Fertik. Steril. 43,757 (1985) ) eingeführt in den vaginalen Fornix und in den Eingang des cervikalen Kanals (Cervix uteri) verwendet.

Durch Scintigraphie wurden während 60 Minuten Hysterosalpingogramme hergestellt. Der Nachteil liegt darin, dass das angewendete Medium auch in den Bereich des Spasmus eindringen kann, der den Transport der Blastocyste verhindert, weshalb das Resultat fälschlicherweise positiv wird. Bei der Füllung unter Druck kann durch die Änderung des Druckes (Widerstand) des Spasmus festgestellt werden (kimoinsuflace), kann jedoch dabei in Folge der Reizung induziert werden, so dass die Ergebnisse fälschlicherweise negativ sind.

Bei descendenten Verfahren wird das diagnostische Medium von partikularem Charakter in die Gegend des Ovarium oder in den Dougias-Raum appliziert und es wird sein Durchgang in das Gebärmutter-Lumen (Lumen Uteri) beobachtet. Es wird zum Beispiel Tusche angewendet (D. v. Ott, 1925; Ztbl. Gynek. Nr. 10, 546) oder Stärkekörner (A. Decker und H. Decker 1954; Obstet. Gynecol. 4, 35) oder kolloides radioaktives Gold (198Au) (A. Stabile und F. E. Leborgane 1958; Int. J. Fertil 3, 139). Bei Versuchen an Tieren Kaninchen) wurden auch als Modelle des Ovum sphärische Teilchen von vernetzten! Dextran (Sephadex), (H.B. Croxatto, C. Vogel, J. Vasquer, J. Reprod Fert. 33, 337, (1973)) oder Polystyrol (M. J. K. Harper et al 1960; J. Reprod Fert. 1, 249) gegebenenfalls radioaktives Jod I125 (C. J. Pauerstein und B. J. Hodgson 1976, Am. J. Obstet. Gynecol. 124. 840) angewendet.

Der Nachteil der beschriebenen Verfahren in der klinischen Anwendung ist darin, dass die Partikeln (Tusche, kolloides Gold, Stärkekörner zu klein sind, so dass sie durch die isthmische Zone auch im Falle eines persistischen Spasmus durchdringen können. Die bei den Versuchen an Tieren verwendeten Modelleier (Ovum) unterscheiden sich einerseits durch ihre physikalischen Eigenschaften und den Oberflächencharakter von den natürlichen Transportobjekten, anderseits rufen sie Einwände von Standpunkt der Sicherheit für den Patienten (Polystyrol) hervor.

Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, biokompatibile, sphärische Teilchen, die durch ihre Grösse, Form, mechanische und teilweise auch biochemische Eigenschaften den Eigenschaften der menschlichen Blastocyste entsprechen, auf so eine Weise herzustellen, dass sie diese Eigenschaften im Ute-rotubaren-Trakt mindestens 80 Stunden beibehalten und dann dem biologischen Abbau auf lösliche, nichttoxische Produkte unterliegen. Weiter wurde gefunden, dass diese Teilchen, geeignet appliziert, aktiv durch den Eileiter (Salpinx) in die Gebärmutter (Uterus) transportiert werden, im Falle, dass die Transportfunktion nicht beschädigt ist. Diese Tatsache kann für die Diagnostik der Transportfunktion des menschlichen Eileiters (Salpinx) verwendet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die erwähnten Nachteile der bisherigen Ausführungen zu beheben.

Diese Aufgabe ist erfindungsgemäss durch die Merkmale im Kennzeichnungsteil der Ansprüche 1 und 7 gelöst.

Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen umschrieben.

Als Polysaccharide eignen sich vorteilhafterweise Polysaccharide mit überwiegend durch 1-4 giykosi-dische Bindungen gebundener Glukose wie Stärke, Glykogen, Amylose, Amylopektin und ihre biokompatiblen Derivate, wie Hydroxyethylstärke.

Als Polyaminsäuren eignen sich vorteilhaft Polymere abgeleitet von der Glutaminsäure und der Aspa-

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raginsäure wie Poiy(N-hydroxyethyl)-L-Asparagin, Poly(N-hydroxyethyl)-L-Glutamin und deren Copoly-mere mit anderen Aminosäuren wie L-Lysin, L-Alanin, L-Valin.

Als Polypeptide eignen sich vorteilhaft lösliche Derivate des Kolagens und Elastins wie Gelatine.

Als Vernetzungsmittel eignen sich insbesondere Halogenepoxide wie 2,3-Epoxy-1-chloropan oder 2,3-epoxy-brompropan, Diisocyanate wie Hexan-1,6-diisocyanat oder Dialdehyde wie das Glutaraldehyd.

Die sphärischen Teilchen können Stoffe enthalten, welche die Identifikation im biologischen Material erleichtern. Solche Stoffe sind chromophore und/oder fluorphore Stoffe durch kovalente Bindungen an das, die Teilchen bildende polymere Material gebunden, mit Vorteil azylierte Derivate des Fluoreszein, Rhodamin, Akridin und oder Mikropartikeln inerter Pigmente wie Tusche oder magnetische Materiale wie Eisenoxyde.

Die sphärischen Teilchen können noch Stoffe enthalten, die ihre biologischen Eigenschaften beinflus-sen. Diese Stoffe können mit dem, die Teilchen bildenden, Polymer durch kovalente oder nichtkovalente Bindungen gebunden sein und können im Milieu des Organismus freigemacht werden. Solche Verbindungen sind mit Vorteil Polyaminosäuren, Polypeptide, wie choriogonadotrope Hormone und/oder Verbindungen die aus der folikularen Flüssigkeit isoliert werden.

Als nichtpolare Lösungsmittel, im erfindungsgemässen Verfahren als kontinuale Phase der Dispersion, eignen sich Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogenkohlenwasserstoffen wie Dichlormethan, Dichlorethan, Chloroform, cyklische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol und ihre Gemische.

Die gewonnenen sphärischen Teilchen werden mit einer alkalischen wässrigen Lösung z.B. einer Lösung die 1 bis 10 Masse-% Natriumhydroxid enthält, gewaschen, wobei die Verseifung der a-Alkylester der Glutaminsäure verläuft und die Zersetzung der möglichen nichtreagierten reaktiven Gruppen der bifunktionellen Vemetzungsmittel und der Produkte ihrer Reaktion zustande kommt, und die gewaschenen Teilchen werden erfindungsgemäss in einer geeigneten Lösung für parenterale Applikation wie die isotonische Lösung von Natriumchlorid, Ringersche isotonische Lösung, die Infusionslösung von Dextran usw. dispergiert und durch Wärme sterilisiert.

Die gewonnenen sphärischen Teilchen können chemisch aktiviert werden für die Bindung von biologisch aktiven Peptiden wie Hormone, durch Verfahren gebräuchlich im Bereich der Immobilisation von Peptiden und Eiweissstoffen auf polymeren Trägern.

Die sphärischen Teilchen sind dadurch charakterisiert, dass es durch die Einwirkung der Enzyme, die in der peritonealen Höhle (Cavity) und im uterotubaren Trakt anwesend sind, zur Spaltung der Bindungen des gebildeten Polymeren kommt, wodurch es zur fortlaufenden Auflösung der Gelmikrosphären kommt. So kann die Wirkung der Enzyme der 1,4-GIykosidasen und insbesondere der a-Amylase, deren Anwesenheit in der tubaren Flüssigkeit allgemein bekannt ist, zur Spaltung der 1,4-Glykolsidischen Bindungen des, das gelbildenden Polysacchariden, unter der Bildung von löslichen Produkten wie die Glukose, Oligomere der Glukose und ihre Derivate führen, die metabolisiert oder ausgeschieden sein können.

Durch das beschriebene Verfahren kann die Geschwindigkeit des Abbaus der Teilchen durch die a-Amylase mit den Stufen der Konversion der Vernetzungsreaktion reguliert werden, d.h. durch die Stufe der chemischen Modifikation und den Vernetzungsgrad des Ausgangspolymeren. Der Vernetzungsgrad ist abhängig von dem Konzentrationsverhältnis der reagierenden Komponenten, der Temperatur und der Reaktionszeit. Die Erhöhung der Konzentration der bifunktionellen Verbindung und/oder die Verlängerung der Reaktionsdauer führen zur Erhöhung des Vernetzungsgrades und zur Erhöhung des Widerstandes der Teilchen gegen den biologischen Abbau. Dadurch ist es möglich, in einem genügend breiten Bereich die Zeit, in welcher die Teilchen ihre Form und Grösse beibehalten, wie auch die Dauer ihres Verbleibens im Organismus, zu regulieren. Analog ist durch die Stufe der Konversion der Vernetzungsreaktion der Polyaminosäuren und Polypeptide, zum Beispiel, das Konzentrationsverhältnis der bi-funktionellen Verbindungen wie Hexan-1,6-diisocyanat und der Gelatine die Geschwindigkeit des Abbaus des entstandenen Gels durch proteolytische Enzyme wie Katepsine, Elastase, Plasmin, Pepsin und andere, deren Fähigkeit, die Hydrolyse der angeführten Polyaminosäuren und Polypeptide zu katalysieren bekannt ist, reguliert.

Der Vorteil des beschriebenen Präparates liegt darin, dass es einen descendenten diagnostischen Vorgang mit Teilchen ermöglicht, die durch ihre Form, mechanische und biologischen Eigenschaften, am meisten dem menschlichen Ovum (Ei) ähnlich sind, ermöglicht. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass die Teilchen, die im Körper aufgehalten werden, in einer relativ kurzen Zeit auf nichtschädliche Produkte abgebaut werden, wobei die Geschwindigkeit des Abbaus in einem breiten Bereich durch den Vernetzungsgrad des Polymères beeinflusst werden kann. Ein Vorteil ist es ferner, dass die Teilchen in der Gebärmutterspülung gefunden und identifiziert werden können, so dass die Wahrscheinlichkeit falscher negativer oder positiver Befunde nur klein ist, und die Methode erfordert keine speziellen Apparate. Schliesslich besteht ein Vorteil des Präparates darin, dass es leicht sterilisier und haltbar ist, wobei biologisch aktive Komponente, welche den Transport des Eis im Eileiter beeinflussen, enthalten können.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Durch Vermischen von 7 g löslicher Stärke (M, 25000-35000), 12,0 ml destilliertem Wasser und 1,2 g

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Natriumhydroxid (NaOH) wurde eins Lösung gewonnen, weiche über eine Fritte gefiltert und unter Vakuum entlüftet wurde. 15 ml dieser Lösung wurde in 35 ml 1,2-Dichlorethan mit dem Gehalt von 0,070 g Poly-gama-benzyl-L-glutamat in einem zylindrischen mit Rührer und Mantel versehenen Reaktionsgefäss, dispergiert. Die Temperatur wurde auf 40°C gehalten, und die Umdrehungen des Rührers wurden so eingestellt, dass die mittlere Grösse der Teilchen 120 bis 150 um betrug. Es wurden 4,0 g 1-Chlor-2,3-epoxypropan (Epichlorhydrin) hinzugefügt, und die Emulsion wurde 11 Stunden bei konstantem Rühren bei 40°C reagieren gelassen. Die Suspension der Teilchen wurde durch Dekantation mit 300 ml eines Gemisches von Dichlorethan (1:1) und mit 300 ml Dioxan gewaschen und nachher in Dioxan durch Sieben auf einem Sieb mit der Maschengrösse von 40 um, 120 um und 240 um in vier Fraktionen aufgeteilt:

a) Teilchen kleiner als 40 um,

b) Teilchen von 40 bis 120 jim,

c) Teilchen von 120 bis 240 um,

d) Teilchen grösser als 240 um.

Die Teilchen der einzelnen Fraktionen wurden sedimentiert, das Sediment in einer 2% Natriumhydroxidlösung verteilt und unter zeitweiligem Schütteln 16 Stunden bei Raumtemperatur gelassen, nachher mit Wasser und physiologischer Lösung von Natriumchlorid (0,154 M NaCI) durchgewaschen. Die mittlere Grösse der Teilchen suspendiert in der isotonischen Lösung von Natriumchlorid wurde im optischen Mikroskop bestimmt. Die Werte 38 ± 12 um 84 ± 16 um, 205 ± 34 jim und 340 ± 62 um wurden für die einzelnen Fraktionen in der Reihenfolge a, b, c, und d gefunden. Der Gehalt der Teilchen in den einzelnen Fraktionen nach dem Trocknen, ausgedrückt in Prozenten der Ganzen Menge betrug a) 3%, b) 20%, c) 65%, d) 12%.

Beispiel 2

3,47 g 6-Aminoflurescein wurden in 120 ml Azetonitril in einem dreihalsigen Reaktionskolben mit Rührer versehen, aufgelöst. Das Gemisch wurde in einem Bad auf-10°C abgekühlt und sukzessive wurden 3,78 g 3-chlorpropionylchlorid gleichaufend mit 4,04 g Triethylamin in Verlauf von 30 Minuten hinzugefügt. Die Reaktion wurde 2 Stunden bei -10°C geführt und nachher wurde das Gemisch bei Raumtemperatur bis zu dem nächsten Tag stehengelassen. Nachher wurde das Azetonitril abgedampft und der Abdampfrückstand in 300 ml Methanol mit dem Gehalt von 17 g Ammoniak gelöst. Die Lösung im Ammoniak wurde 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Das überflüssige Ammoniak wurde nachher mit dem Methanol abdestilliert, der Rest wurde mit 200 ml Wasser versetzt, das anwesende Ammoniumchlorid (NH4CI) wurde mit Natriumhydroxid (NaOH) zersetzt und das entstandene Ammoniak wieder abdestiliert. Durch Neutralisierung auf einen pH-Wert von pH 6 wurde das Produkt als Präzipitat gewonnen, welches wiederholt aus einer Wasserlösung rekristallisiert wurde. Es wurden 2,75 g (60%) des 6-(3-Amino-propionamido)fluoreszein gewonnen. Analyse: berechnet für C23H18O6N2 2H2O; C 60,79%; H, 4,84%; N 6,16%. Gefunden 60,34% C, 4,62% H und 6,09% N.

20 mg des gewonnenen 6-(3-Aminopropinamido)fluoreszein und 7,0 g löslicher Stärke wurden in 12 ml Wasser und 1,2 g Natriumhydroxid gelöst. 15 ml dieser Lösung, gefiltert und entlüftet, wurden in 35 ml 1,2-Dichlormethan mit dem Gehalt von 70 mg Poly-gama-benzyl-L-Glutamat dispergiert. Die Reaktion mit 4,0 g 1-Chlor-2,3-Epoxypropan (Epichlorhydrin) wurde 11 Stunden bei 40°C auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 geführt und die gewonnenen Teilchen wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durch das Sieben in Dioxan in Fraktionen aufgeteilt. Die Fraktion, welche durch das Sieb mit einer Maschengrösse von 240 um durchging und auf dem Sieb mit Maschengrösse von 120 um zurückblieb, wurde in einer 2% Natriumhydroxidlösung für 16 Stunden suspendiert, wobei es zur Zersetzung der restlichen reaktiven Gruppen kam, nachher mit Wasser und isotonischer NaCI-Lösung gewaschen und dann mit isotonischer Natriumchloridlösung bei pH 7 in der Dauer von 40 Minuten bei 120°C im Autoklaven extrahiert. Nachher wurden die Teilchen mit steriler isotonischer Lösung gewaschen und aseptisch in sterile Serumampullen gefüllt und nochmals 40 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisiert. Die Ampullen wurden wie sterile Suspensionen in isotonischer Lösung gelagert.

Die Teilchen haben eine regelmässige sphärische Form und einen Grössenbereich von 140 bis 280 um, mittlerer Wert 195 ± 36 (im. Bei Exzitation in blauem Licht ( X = 430 nm) weisen sie eine brillante Fluoreszenz in Bereich von 515 bis 530 nm (gelblichgrün) auf. Die fluoreszente Markierung ist dauerhaft und wäscht sich nicht aus, solange es nicht zum Abbau des Gels kommt.

Beispiel 3

Die fluoreszent markierten Mikrosphären, die sich von einander durch die Länge der Reaktionsdauer mit 1-Chlor-2,3-Epoxypropan unterschieden, wurden bei dem gleichen Konzentrationsverhältnis und den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 2 hergestellt nur mit dem Unterschied, dass die Reaktion mit 1-Chlor-2,3-Epoxypropan (Epichlorhydrin) bei den einzelnen Proben durch das Verdünnen der Suspension mit dem kalten Gemisch von Dioxan und 1,2-Dichlorethan (1:1 ) nach 7,9,11,13 und 18 Stunden der Reaktion bei 40°C beendet wurde. Die Proben der Teilchen in einer Menge entsprechend 10 mg des

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Trockengewichts wurden in 2 ml physiologischer Lösung von pH 7 mit dem Gehalt von 115 E./ml pankreati-scher a-Amylase suspendiert und unter schwachem Schütteln bei 37°C inkubiert. Mit Hilfe eines Fluor-eszenzmikroskopes wurde die Zeit notwendig für das vollständige Auflösen der Teilchen verfolgt. Die Stabilität der Teilchen wächst, im die a-Amylase enthaltenden Milieu, mit der wachsenden Zeit der Reaktion mit Epichlorhydrin, siehe Tabelle 1.

Tabelle 1

Probe Reaktionsdauer Zeit notwendig für das (h) vollständige Auflösen

1 7 3-6 Min.

2 9 12-18 Min.

3 11 40-70 Min.

4 13 3-4h

5 18 mehr als 24 h

Beispiel 4

Proben der fluoreszent markierten Mikrosphären unterschiedlich in der Dauer der Reaktion mit 1-Chlor-2,3-Epoxypropan wurden wie in Beispiel 3 hergestellt. 0,4 ml der entsprechenden sterilen Suspension der Mikrosphären mit einem Gehalt von 40 mg des Trockengewichts des Gels wurden Ratten mit einem Lebendgewicht im Bereich von 180 bis 200 g durch die oberflächlich desinfizierte Bauchwand in die peritoneale Höhle appliziert. Die Ratten wurden in den geeigneten Intervallen getötet (3 Ratten für jedes Zeitintervall und jede Mikrosphärenprobe), die Bauchhöhle mit physiologischer Lösung ausgespült und das Sediment der Ausspülungen wie auch die Oberflächen der Bauchhöhle wurden auf die Gegenwart von fluoreszenten Mikrosphären untersucht. Die Tabelle 2 gibt eine Übersicht über den zeitlichen Verlauf des Abbaus der Mikrosphären in der Bauchhöhle von Ratten in vivo.

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Tabelle 2. Wertung des Abbauverlaufs der Mikrosphären in der Bauchhöhle

Probe

Dauer der Reaktion mit1-Chlor-2,3-

epoxypropan

Mittlerer Wert des Teilchendurchmessers

Beschreibung des Befundes

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240 um

Binnen 6 Stunden nach der Applikation verschwin

den der kompakten (ganzen) Teilchen aus der peritonealen Höhle. Lösliche fluoreszente Materiale im Harn und in der Harnblase

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210 um

Nach 24 Stunden anwesend nur vereinzelte ganze

Teilchen in der Ausspülung der peritonealen Höhle zusammen mit dem löslichen fluoreszenten Material aus dem Harn und der Harnblase

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162p.m

72 Stunden nach der Applikation ist der Mehrteil der Teilchen in der Ausspülung ohne offensichtliche Änderungen der Grösse und der Form.

Manche Teilchen mit dem Anzeichen des Abbaus. 6 Tage nach der Applikation die Teilchen gefunden in vorgeschrittenem Stadium des Abbaus, anwesend reichlich Makrophage, die dasfagocytierte fluoreszente Material in der Cytoplasma enthalten. Das lösliche fluoreszente Material ausgeschieden im Ham. 21. Tag nach der Applikation: das gänzliche Verschwinden der Teilchen aus der peritonealen Höhle; Verschwinden des fluoreszenten Materials aus dem Cytoplasma der Leukocyten der peritonealen Ausspülung.

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180 jim

21 Tage nach der Applikation: die Mehrzahl der Teilchen im Sediment der Ausspülung ohne Anzeichen des Abbaus. Einzelne Teilchen mit gestörter Oberfläche - aufgelöste Ränder. 40. Tag nach der Applikation: die Teilchen anwesend in der Ausspülung mit fortgeschrittenen Anzeichen des Abbaus.

Beispiel 5

Die Mikrosphären wurden wie in Beispiel 2 hergestellt. 5 ml einer Suspension mit dem Gehalt von 200 mg Gel in Wasser, wurde mit 43 mg Natriumperojodat(Nal04)versetzt, die Suspension durch Schütteln bei 22°C im Dunkeln 2 Stunden gemischt. Die Mikrosphären wurden auf dem Filter mit destilliertem Wasser gewaschen bis zum Entschwinden der Reaktion auf Jod nach der Zugabe von Kaliumjodid, nachher mit steriler physiologischer Lösung gewaschen und in 5 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 5000 I.E. des menschlichen Choriogonadotropins (Sigma), gepuffert mit 0,1 Mol 1~1 Phosphatpuffer mit pH 7,2, resuspendiert. Die Suspension wurde 4 Stunden bei 4°C durch Schütteln gemischt und nachher mit steriler physiologischer Lösung gewaschen. Die gewaschenen Teilchen wurden in drei Fraktionen aufgeteilt und inkubiert a) in Phosphatpuffer pH 7,4,

b) in Phosphatpuffer pH 6,2,

c) in Phosphatpuffer mit pH 6,2 mit der Zugabe von 1,5 E./mol der a-Amylase.

Das freigesetzte Choriogonadotropin wurde in der Lösung durch Radio-lmmunoassay bestimmt. Die Geschwindigkeit der Freisetzung des Gonadotropins in das Medium stieg in der Reihenfolge a), b), c).

Beispiel 6

Zu 10 ml schwarzer Tusche wurden 4 g Gelatine hinzugefügt und über Nacht quellen gelassen. Nachher wurde die Gelatine durch Erwärmen in siedendem Wasserbad aufgelöst und die Lösung wurde unter Rühren hinzugefügt zu 40 ml 1,2-Dichlorethan, dass 80 mg Poly-Gama-methyl-L-Glutamat, bis zu 8 Mol.-% verseift, enthielt, und auf 45°C temperiert war. Die Umdrehungen des Rührers wurden so wie in Bei6

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spiel 1 eingestellt, damit die mittlere Grösse der Teilchen 120 bis 150 um betrug. Nachher wurden in das Reaktionsgefäss langsam 5 ml 1,6-Diisocyanat hinzugefügt. Das Rühren wurde 4 Stunden fortgesetzt und dann bei Raumtemperatur noch weitere 18 Stunden. Die weitere Verarbeitung der Teilchen wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Teilchen wurden mit physiologischer Lösung bis zur Entschwindung der Reaktion auf Amine gewaschen.

Beispiel 7

Die sphärischen Teilchen wurden durch das Verfahren, beschrieben in Beipiel 1 hergestellt, nur mit dem Unterschied, dass in die Stärkelösung 1,5 g Eisen (lll)-oxyd (F2O3) mit einer Teilchengrösse von bis 1 um hinzugegeben und in dieser Lösung gründlich dispergiert wurden.

Beipsiel 8

Die Mikrosphären hergestellt durch das Verfahren nach Beispiel 2 wurden in der isotonischen Natriumchloridlösung suspendiert und im Autoklaven 30 Minuten bei 120°C sterilisiert. 1 ml der sterilisierten Suspension mit dem Gehalt von 12 mg Mikrosphären mit einer Durchmessergrösse im Bereich von 150-250 |im wurde in den retro-uterunen Raum der untersuchten Frauen appliziert. Die durch den Eileiter (Salpinx) transportierten Mikrosphären wurden in den Abnahmen des uterinen und cervikalen Sekrets unter einer binokularen Lupe nach der gelblichgrünen Fluoreszenz bei der Beleuchtung mit einer Quecksilberlampe (HBO Lampe) identifiziert. Der untersuchte Satz umfing 86 Patientinnen mit idiopatischer Sterilität, bei welchen aus therapeutischen Gründen die Untersuchung des tubaren Transportes indiziert wurde. In den Satz wurden Patientinnen eingereiht, bei welchen vorher der Durchgang der Eileiter (Salpinx) entweder mit Hilfe der Chromopertunation oder der Laparoskopie oder der Hysterosalpingo-graphie untersucht wurden und in allen Fälle wurden durch diese Methoden die Eileiter als durchgängig für Flüssigkeiten diagnostiziert. Durch die Anwendung der Mikrosphären wurde in dem gegebenen Satz in 38 Fällen d.i. 44%, die ungestörte Transportfunktion der Eileiter bewiesen. In dieser Gruppe wurden die Mikrosphären eindeutig in den Abnahmen des cervikalen und uterotubaren Sekrets in der Dauer von 38 bis 56 Stunden nach der Applikation ohne Rücksicht auf den Ovuiationszyklus, bewiesen.

Claims

Patentansprüche

1. Präparat für die Diagnostik der Transportfähigkeit der Eileiter, gekennzeichnet durch eine Suspension von biokompatiblen, biodegradierbaren, gegebenenfalls markierten Teilchen in einem für parenterale Applikationen in der Medizin geeigneten Vehikulum und wobei die Teilchen sphärische Form mit einem Durchmesser im Bereich von 10 bis 600 um haben und aus weichen hydrophilen Gelen auf der Basis von vernetzten, wasserlöslichen, nichttoxischen, inerten, biodegradierbaren Polymeren aus der Gruppe bestehend aus physiologisch inerten, biodegradierbaren Polysacchariden, Polyaminsäuren und Polypeptiden und ihren substituierten, biokompatiblen Derivaten, die gegebenenfalls physiologisch aktive Stoffe enthalten, bestehen und die ihre Form und Grösse in der Bauchhöhle, Cavum peritonae, und im uterotubaren Trakt mindestens 80 Stunden beibehalten, während der darauffolgende Abbau auf nichttoxische Produkte innert 5 bis 60 Tagen erfolgt.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen aus weichen, hydrophilen Gelen, auf der Basis von vernetzten, wasserlöslichen, nichttoxischen und biologisch abbaubaren Polymeren aus der Gruppe der physiologisch inerten Polysaccharide, wie z.B. der Polysaccharide mit durch 1-4 glykosidischen Bindungen gebundener Glukose, wie Stärke, Amylase, Amylopektin, Glykogen und ihrer biokompatiblen Derivate, wie Hydroxyethylstärke, bestehen.

3. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen aus weichen hydrophilen Gelen auf der Basis von vernetzten, nichttoxischen, biologisch abbaubaren Polymeren aus der Gruppe der physiologisch inerten, wasserlöslichen und biodegradierbaren Polyaminosäuren und Polypeptiden und ihren biokompatiblen Derivaten wie Poly(N-Hydroxyalkyl)-L-Asparaginen, Poly(N-Hydroxyäthyl)-L-Glutaminen und der von diesen abgeleiteten Copolymeren mit weiteren Aminosäuren wie L-Lysin, L-Ala-nin, L-Valin, löslichen Derivaten von Kollagen und Elastin wie Gelatine, bestehen.

4. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die sphärischen Teilchen chromophore oder fluorophore Stoffe enthalten, die an das Polymer, das das Material der Teilchen bildet, kovalent gebunden sind, beispielsweise acyliertes Fluoreszein, Rhodamin oder Akridin sowie gegebenenfalls Mikroteilchen von Pigmenten, wie Tusche oder magnetische Materiale wie Eisenoxyde,

5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die sphärischen Teilchen Polyaminosäuren und/oder Hormone wie choriogonadotrope Hormone gebunden enthalten.

6. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die biologisch abbaubaren, sphärischen Teilchen in einem in der parenteralen Medizin anwendbaren Vehikulum suspendiert sind, das noch chromophore oder schattengebende Stoffe, wie Stoffe für die Chromopertubationsunter-suchung, für eine Laparoskopie oder für die Hysterosalpingographie enthält, beispielsweise Methylenblau oder Konjugate mit Dextran.

7. Verfahren zur Herstellung eines Präparates nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn7

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zeichnet, dass eine wässrige Lösung eines physiologisch inerten, biologisch abbaubaren, wasserlöslichen, nichttoxischen Polymers aus der Gruppe, bestehend aus Polysacchariden, Polyaminosäuren, Polypeptiden oder ihren substituierten, biokompatiblen Derivaten, mit einem nichtpolaren, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, enthaltend 1 bis 10 Masse-% eines Polymers mit einem Polymerisationsgrad von 50 bis 500 und einem Gehalt von 80 bis 100% Einheiten des a-Alkyl-L-Glutamates und 20% bis 0% Mol.-Einheiten der L-Glutaminsäure, zusammengegeben wird, unter Bildung von polymeren sphärischen Teilchen mit einem Durchmesser im Bereich von 10 bis 600 um, welche Teilchen nachher durch die Einwirkung von bifunktionellen Vernetzungsmitteln in das Gel überführt und mit alkalischen wässrigen Lösungen gewaschen und in einer Lösung für parenterale Anwendung dispergiert werden und die gewonnene Suspension durch Wärme sterilisiert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als nichtpolare, mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel solche aus der Gruppe, bestehend aus Halogenkohlenwasserstoffen wie Di-chlormethan, Dichlorethan, Chloroform und cyklischen Kohlenwasserstoffen, wie Benzol, Toluol und ihre Gemische verwendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die gewonnenen, sphärischen Teilchen für die Bindung von biologisch aktiven Peptiden, wie Hormone, chemisch aktiviert werden.

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