JP3359821B2 - 迅速な物質の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の分析対象
物質を、化学反応に基づいて色素等の検出可能な物質を
生成する反応系を用い、前記検出可能な物質を測定する
ことにより定量する方法に関する。詳しくは、本発明
は、検出可能な物質を生成する反応の反応速度を高めた
迅速な測定方法に関するものであり、生体成分や環境試
料の分析に用いることができる。

【０００２】

【従来の技術】試料中の分析対象物質、例えば体液中の
尿や血液等の生体成分、食品、医薬、自然環境に存在す
る微量物質、産業化学物質、廃棄物中の微量物質等を検
出・定量する方法として、分析対象物質が関与する反応
系を用い、それによって定量的に生成する色素等の検出
可能な物質の量を測定する方法がある。

【０００３】このような方法としては、例えば分析対象
物の化学反応によって生成される過酸化水素を、ペルオ
キシダーゼの共存下にある被酸化性発色剤（色素前駆
体）と酸化還元反応を行わせ、生成する色素化合物を比
色定量する方法などがあり、その簡便性から臨床検査等
において多く用いられている。また電子伝達物質（メデ
ィエーター）と分析対象物質の間に酵素などによって酸
化／還元反応を起こさせ、生じた電子伝達物質の酸化体
／還元体を電極で還元／酸化するときの電気化学応答か
ら分析対象物質の量を求める方法もある。

【０００４】しかしながら、これまでの化学反応を利用
した物質の測定方法では、反応に時間がかかるため測定
に長時間を要する、あるいは検出反応が終点に達するま
でに時間がかかるため反応速度から定量を行うレート法
では定量精度が悪くなる、といった問題点があった。

【０００５】これまでは反応速度を高めるために、反応
系を加温する、あるいは反応に与る試薬の濃度を高め
る、などの方法がとられていた。しかし、反応系を加温
する方法では、加温のために熱源が必要であるので分析
が複雑になっていた。また、生成物質が熱に不安定であ
る場合は検出に困難を生じるのでこの手段を用いること
ができなかった。一方、試薬の濃度を高める方法は、検
出のバックグラウンドの上昇や分析コストの増加につな
がるので実用的ではなかった。また、反応速度を高める
ために触媒を添加するなどの方法があるが、好ましい触
媒が知られていない検出反応が多く、これも実用的では
ない。以上のように、これまでの方法はまだ不十分なと
ころが多いため、より簡単に反応速度を高め迅速な測定
を可能にする新規な方法が熱望されていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、分析対象物
質の化学反応に基づいて量的相関関係を伴って生成する
色素等の検出可能な物質を定量する方法において、前記
化学反応の反応速度を高め迅速な測定を可能にする新規
な方法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、検出可能
な物質の生成反応を層状無機化合物の存在下に行うとい
う全く新規な方法により上記課題を解決できることを見
出し、本発明を完成したものである。

【０００８】すなわち、本発明は、試料中の分析対象物
質の化学反応に基づいて検出可能な物質を生成する反応
を含む反応系を用いて前記検出可能な物質の量を測定す
ることにより前記分析対象物質を測定する方法におい
て、前記検出可能な物質の生成反応を層状無機化合物の
存在下に行うことにより反応速度を高めることを特徴と
する物質の測定方法に関する。

【０００９】本発明においては、検出可能な物質の生成
反応を層状無機化合物の存在下に行うことにより、前記
生成反応の反応速度が上昇し、迅速な測定が可能となっ
て測定時間が大幅に短縮されるだけでなく、検出反応が
終点に達するまでに要する時間が短縮される結果、反応
速度から定量を行うレート法での定量精度を向上させる
ことができる。検出可能な物質の生成反応速度が上昇す
る理由は必ずしも明確ではないが、前記生成反応の反応
出発物質又は反応中間体が層状無機化合物の表面に吸着
し、表面上で濃縮されることにより反応速度が上昇する
ものと考えられる。

【００１０】本発明が適用される測定方法は、試料中の
分析対象物質の化学反応に基づいて前記分析対象物質と
量的相関関係を伴って検出可能な物質を生成する反応を
含む反応系を利用して、前記検出可能な物質を定量する
ことによって前記分析対象物質を定量測定する方法であ
れば、特に限定されるものではない。検出可能な物質が
分析対象物質自身であってもよい。また、例えば、前記
分析対象物質の化学反応によって検出可能な物質が直接
生成される反応系を利用する場合に限らず、前記分析対
象物質の化学反応と検出可能な物質の生成反応とが別の
化学反応を介して間接的に結びついている場合も含まれ
る。そのうち、本発明の方法は、検出可能な物質が酸化
還元反応によって生成する色素や電子伝達物質である反
応系を用いる測定方法、検出可能な物質がアゾ色素など
の色素やイオノフォアと分析対象物質との錯体などであ
る反応系を用いる測定方法等に好ましく適用される。

【００１１】本発明の測定方法は、好ましくは体液中の
尿や血液等の生体成分、食品、医薬、自然環境に存在す
る微量物質、産業化学物質、廃棄物中の微量物質等を検
出・定量する方法に利用される。

【００１２】特に、検出可能な物質の生成反応の反応出
発物質又は反応中間体がカチオン性化合物である場合、
反応系にカチオン交換能を有する層状無機化合物を添加
することにより、層状無機化合物の表面に前記反応出発
物質又は反応中間体を吸着させ、濃縮させることにより
前記生成反応速度を向上させることができ、迅速な測定
が可能となる。勿論、本発明の方法はこの例に限定され
るものではない。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を詳細
に説明する。本発明の測定方法は、具体的には以下に述
べるような検出可能な物質を生成する反応系を利用した
測定方法に適用するのが好ましい。

【００１４】検出可能な物質としては、具体的にはアミ
ン、ポリアミン等のアミン類；イミン、ポリイミン等の
イミン類；ポリエン類；アニリン誘導体、ベンゾキノン
誘導体、芳香族縮合環化合物等の芳香族化合物；キサン
テン、アジン、チアジン等の複素環化合物；イオンとク
ラウンエーテルやバリノマイシンなどの環状配位子との
錯体；などであって、分子内に４級窒素原子、フェノー
ル性水酸基、スルホン酸基、カルボキシル基を含んでい
てもよく、光学的方法、電気化学的方法によって検出で
きる物質が挙げられる。

【００１５】このうち、光学的方法によって検出できる
物質としては、色素が挙げられる。ここで、色素には蛍
光色素、発光物質等も含まれ、また、色素を生成する反
応とは、光学的に検知しうるものが生成する反応であれ
ばよく、例えば発色のみならず、変色、蛍光、発光等を
もたらすものでもよい。

【００１６】色素としては、好ましくは、色素前駆体か
ら酸化還元反応、酸塩基反応、縮合反応などにより生成
される色素化合物が挙げられる。酸化還元反応に関連し
て生成する色素としては、４−アミノ−１，２−ジヒド
ロ−１，５−ジメチル−２−フェニル−３Ｈ−ピラゾー
ル−３−オン（４−アミノアンチピリン：以下、４−Ａ
Ａと略す。）に代表されるカプラーと、水素供与体（Ｎ
−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメ
チルアニリンなどのトリンダー試薬類等）が酸化縮合す
ることによって生成する色素；オルトトリジン、ベンジ
ジン類（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
など）の酸化発色体色素；２，６−ジクロロ−４−
［（４−ヒドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シク
ロヘキサジエン−１−オンなどロイコ体が酸化されて生
成する色素；４−ヒドロキシフェニル酢酸などが酸化さ
れて生成する蛍光物質；化学発光物質など発光物質およ
びその励起体；テトラゾリウム塩の還元色素であるホル
マザン；１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジリウ
ム塩などが還元されて生成する色素；などが挙げられ
る。

【００１７】酸塩基反応で生成する色素としては、ブロ
モクレゾールグリーンなどｐＨの変化によって発色また
は変色する化合物が挙げられる。その他に、呈色反応等
として公知である種々の反応で生成する色素として、２
−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニウム塩な
どジアゾニウム塩のカップリングによって生成するアゾ
系色素；アルデヒドと２，３−ジメチル−２，３−ビス
（ヒドロキシアミノ）ブタンの反応など種々の公知の呈
色反応によって生成する色素；ヒスタミンとオルトフタ
ルアルデヒドとの反応など種々の公知の反応によって生
成する蛍光物質；４−メチルウンベリフェリルリン酸塩
などの酵素基質が酵素によって反応し生成する色素や蛍
光物質が挙げられる。

【００１８】また、配位結合、イオン結合で生成する色
素として、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５
−［Ｎ−プロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミ
ノ］アニリン塩と金属イオンから生成した錯体である色
素が挙げられる。

【００１９】ここで、前記した水素供与体とは、過酸化
水素の共存下、ペルオキシダーゼ作用で、４−アミノ−
１，２−ジヒドロ−１，５−ジメチル−２−フェニル−
３Ｈ−ピラゾール−３−オン（４−ＡＡ）や３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと縮合してキノン
系色素を生成するフェノール等の化合物であり、具体的
にはジクロロフェノール、オルトメトキシフェノール、
１，２，３−トリヒドロキシベンゼン、ジメチルアニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルメタアニシジン、
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシア
ニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−
３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプ
ロピルメタトルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）メタアニシジン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニ
リン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキ
シアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）メ
タトルイジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン等
が挙げられる。

【００２０】例えば前記４−ＡＡと水素供与体とが過酸
化水素の存在下で反応してキノン系色素を生成する反応
系を利用する方法では、生成するキノン系色素を吸光光
度計などで測定して間接的に過酸化水素を定量すること
によって分析対象物質を定量する。

【００２１】またオルトトリジン、ベンジジン類として
は、オルトトリジン、ジアニシジン、３，３’−ジアミ
ノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラメチルベン
ジジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，３’，５，
５’−テトラメチルベンジジン等が挙げられる。

【００２２】ロイコ体は酸化されて色素となり発色する
無色の色素前駆体である。ロイコ体が酸化された色素と
しては、２，６−ジクロロ−４−［（４−ヒドロキシフ
ェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−
オン、２，６−ジクロロ−４−［（３−クロロ−４−ヒ
ドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジ
エン−１−オン、７−（ジエチルアミノ）−３−イミノ
−８−メチル−３Ｈ−フェノキサジン塩、３−（ジエチ
ルアミノ）−７−アミノ−５−フェニルフェナジニウム
塩、３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−
５−イウム塩、１−ヒドロキシ−５−メチルフェナジニ
ウム塩、７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−
オン−１０−オキシドが挙げられ、ロイコ体としては、
４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホ
プロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタ
ン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，
５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−
ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、
４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩等が挙げ
られる。

【００２３】また、４−ヒドロキシフェニル酢酸などが
酸化されて蛍光物質を生成するが、蛍光物質としては、
４−ヒドロキシフェニル酢酸、（４−ヒドロキシ−３−
メトキシフェニル）酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニ
ル）プロピオン酸、４−ヒドロキシ−（２−アミノエチ
ル）フェノール、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメ
チルベンゼンメタミニウム、アルファアミノパラヒドロ
キシヒドロケイ皮酸、４−ヒドロキシフェネチルアミ
ン、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアニリド、
２，７−ジクロロフルオレッセインジアセテート等が、
酸化されて生成した蛍光物質が挙げられる。

【００２４】化学発光物質など発光物質としては、ホタ
ルルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、エクオリ
ン、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体、アクリジニ
ウムエステル、過シュウ酸エステル等が挙げられる。

【００２５】例えば前記ベンジジン類やロイコ体が過酸
化水素の存在下で酸化反応して発色する反応系を利用す
る方法では、生成する色素を吸光光度計などで測定して
間接的に過酸化水素を定量することによって分析対象物
質を定量する。

【００２６】前記蛍光物質や発光物質が生成する反応系
を利用する方法では、蛍光光度計や発光光度計などで測
定して間接的に過酸化水素を定量することによって分析
対象物質を定量する。

【００２７】このような色素を生成する酸化反応におい
て、酸化反応に与る酸化剤は過酸化水素に限定されるも
のではなく、種々の公知の酸化剤を利用してもよい。ペ
ルオキシダーゼなどの酸化酵素を添加してもよい。また
色素が生成する酸化反応に先立って、前記酸化剤が生成
する反応が生じていてもよい。

【００２８】テトラゾリウム塩としては、２，３，５−
トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−
３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，
３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレ
ン）−ビス［２−（パラニトロフェニル）−５−フェニ
ル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−（３，３’
−ジメトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４，４’−
ジイル）−ビス［２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾ
リウム］塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−
ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウ
ム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロ
フェニル）−５−［２，４−ジスルホフェニル］−２Ｈ
−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３
−（２，４−ジニトロフェニル）−５−［２，４−ジス
ルホフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−
［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）−ビス
［２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３
−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジ
フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。

【００２９】還元されて生成する色素としては、１，
１’−ジメチル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，
１’−ジベンジル−４，４’−ビピリジリウム塩等の還
元体が挙げられる。また７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノ
キサジン−３−オン−１０−オキシドなどが還元されて
蛍光物質を生成するが、蛍光物質としては、７−ヒドロ
キシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン−１０−オキシ
ド、５−シアノ−２，３−ビス（４−メチルフェニル）
−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，３−ビス（４−シアノ
フェニル）−５−シアノ−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が
還元されて生成する蛍光物質等が挙げられる。

【００３０】例えば前記テトラゾリウム塩やロイコ体が
還元剤の存在下で還元反応して発色する反応系を利用す
る方法では、生成する色素を吸光光度計又は蛍光光度計
などで測定して間接的に還元剤を定量することによって
分析対象物質を定量するのである。また色素が生成する
還元反応に先立って還元剤が生成する反応が生じていて
もよい。

【００３１】このような色素を生成する還元反応におい
て、還元反応に与る還元剤としてニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドもしくはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドホスフェートが好ましく用いられる。しかし
もちろんこれに限定されるものではなく、種々の公知の
還元剤を利用していてもよい。

【００３２】またｐＨの変化によって発色または変色す
る化合物としては、ブロモクレゾールグリーン、ブロモ
フェノールブルー、フェノールレッド、ブロモピロガロ
ールレッド、ピロガロールレッドなどのスルホンフタレ
イン系色素、マラカイトグリーン、ロゾリックアシドな
どのトリフェニルメタン系色素、キナルジンレッド、Ｎ
−（パラヒドロキシフェニル）−２，６−ジクロロパラ
ベンゾキノンイミンなどのキノリン系色素、７−ヒドロ
キシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン １０−オキシ
ドなどのオキサゾン系色素、６，７−ジヒドロキシ−４
−メチルクマリンなどのクマリン系色素、アニリンオリ
ゴマーなどの導電性高分子化合物が挙げられる。

【００３３】例えばｐＨの変化によって発色または変色
する化合物が酸または塩基によって発色または変色する
反応系を利用する方法では、生成する色素を吸光光度計
などで測定して間接的に酸または塩基を定量することに
よって分析対象物質を定量する。

【００３４】また、例えばｐＨの変化によって発色また
は変色する化合物が水素イオンによって発色または変色
する反応系を利用する方法では、生成する色素を吸光光
度計などで測定して水素イオン濃度を定量することによ
って分析対象物質を定量する。

【００３５】またジアゾニウム塩のカップリングによっ
て生成するアゾ系色素としては、インドキシルと２−メ
トキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニウム塩のカッ
プリングによって生成するアゾ系色素、ウロビリノーゲ
ンと３，３’−ジメトキシビフェニル−４，４’−ジア
ゾニウム塩のカップリングによって生成するアゾ系色
素、亜硝酸塩の存在下に４−アミノベンゼンアルソン酸
とＮ−１−ナフチルエチレンジアミンが反応して生成す
るアゾ系色素、同じく亜硝酸塩の存在下に２，４−ジク
ロロアニリンとＮ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’−１−ナフチル
ナフチルエチレンジアミンシュウ酸塩（津田試薬）とが
反応して生成するアゾ系色素などが挙げられる。

【００３６】前記アゾ系色素が生成する反応系を利用す
る方法では、生成する色素を吸光光度計などで測定して
反応の出発物質である分析対象物質（前記の例ではイン
ドキシル、ウロビリノーゲン、亜硝酸塩である）を定量
する。アゾ系色素が生成する反応は前記の例に限定され
るものではなく、種々の公知のアゾ系色素生成反応が好
ましく適用される。

【００３７】また種々の公知の呈色反応によって生成す
る色素としては、次に述べる公知の呈色反応において生
成する色素が挙げられるが、もちろんこれに限定される
ものではない。呈色反応としては、アルデヒドを検出す
るときの過酸化水素と１，４−ジアミノベンゼンの反
応、アルデヒドを検出するときの２，３−ジメチル−
２，３−ビス（ヒドロキシアミノ）ブタンの反応、アル
デヒドを検出するときの３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾンと酸化剤の反応、二級アミンを検出す
るときの１０Ｈ−フェノチアジンと臭素の反応、チオー
ルを検出するときの２，２’−ジチオジピリジンの反応
などが挙げられる。

【００３８】前記公知の呈色反応を利用する方法では、
生成する色素を吸光光度計などで測定して反応の出発物
質である分析対象物質（前記の例ではアルデヒド、二級
アミン、チオールである）を定量する。利用できる公知
の呈色反応は前記の例に限定されるものではない。

【００３９】また種々の公知の反応によって生成する蛍
光物質としては、次に述べる試薬を用いて実施される公
知の検出反応において生成する蛍光物質が挙げられる
が、もちろんこれに限定されるものではない。蛍光物質
を生成する検出反応に用いられる試薬としては、グアニ
ジノ化合物を検出するときの２−ヒドロキシ−１，２−
ジフェニルエタノン、ヒスタミンを検出するときのオル
トフタルアルデヒド、スペルミジンを検出するときのオ
ルトフタルアルデヒド、アルファケト酸を検出するとき
の１，２−ジアミノ−４，５−ジメトキシベンゼンなど
が挙げられる。

【００４０】前記公知の検出反応を利用する方法では、
生成する蛍光物質を蛍光光度計などで測定して反応の出
発物質である分析対象物質（前記の例ではグアニジノ化
合物、ヒスタミン、スペルミジン、アルファケト酸であ
る）を定量するのである。利用できる公知の検出反応
は、もちろん前記の例に限定されるものではない。

【００４１】また酵素によって反応し色素や蛍光物質を
生成する酵素基質としては、キモトリプシンの基質であ
るＮ−トシル−Ｌ−フェニルアラニン−２−アミドアク
リドン、アミノペプチターゼの基質であるＬ−アラニン
−２−アミドアクリドン、エステラーゼを測定するとき
の７−アセトキシ−Ｎ−メチルキノリニウム塩、エステ
ラーゼの基質である７−アセトキシ−３Ｈ−フェノキサ
ジン−３−オン、ホスファターゼの基質である４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸塩などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。

【００４２】例えば前記酵素基質が酵素によって分解さ
れる反応を利用する方法では、生成する色素や蛍光物質
を吸光光度計や蛍光光度計などで測定して間接的に酵素
を定量することによって分析対象物質を定量する。酵素
や酵素基質は例えば抗体やその断片に化学的に結合して
いてもよい。

【００４３】また、錯体である色素とは、金属イオンや
アニオンと、配位子などの化合物とが、配位結合やイオ
ン結合で錯体を形成して生成した色素あるいは蛍光物質
である。金属イオンと錯体を形成し発色・変色する化合
物としては、金属指示薬やクロモイオノフォアとして知
られている化合物のほか、有色の遷移金属イオンと錯体
を形成して着色する化合物が含まれるが、具体的にはエ
チレンジアミン四酢酸、２，２−ビピリジン、１−ヒド
ロキシ−２−（２−ヒドロキシフェニルアゾ）ベンゼ
ン、ジベンゾ−１８−クラウン−６、ジシクロヘキシル
−１８−クラウン−６、環状ポリアミン類、カリックス
［４］アレーン、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチ
ル）アミノメチル］−１，２−ジヒドロキシアンスラキ
ノン、５’，５”−ジブロモピロガロールスルホンフタ
レイン、２−ヒドロキシ−１−（１−ヒドロキシ−２−
ナフチルアゾ）−６−ニトロ−４−ナフタレンスルホン
酸塩、２，６−ジクロロ−４’−ヒドロキシ−３’，
３”−ジメチルフクソン−５’，５”−二カルボン酸
塩、３，３’−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチ
ル）アミノメチル］フルオレッセイン、８−［Ｎ，Ｎ−
ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］−４−メチル
ウンベリフェロン、２，７−ビス（２−アルソノフェニ
ルアゾ）−１，８−ジヒドロキシ−３，６−ナフタレン
ジスルホン酸、５−クロロ−２−ヒドロキシ−３−
（２，４−ジヒドロキシフェニルアゾ）ベンゼンスルホ
ン酸、５−［（ヘキサヒドロ−２，４，６−トリオキソ
−５−ピリミジニル）イミノ］−２，４，６（１Ｈ，３
Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン塩、２−（５−ブロモ
−２−ピリジルアゾ）−５−［Ｎ−プロピル−Ｎ−（３
−スルホプロピル）アミノ］アニリン塩、１，８−ジヒ
ドロキシ−２−（２−ピリジルアゾ）−３，６−ナフタ
レンジスルホン酸塩、２−ニトロソ−５−［Ｎ−プロピ
ル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミノ］フェノール等
が挙げられる。

【００４４】また特に一価のカチオンと有色錯体を生成
する化合物としては、テトラキス［３，５−ビス（トリ
フルオロメチル）フェニル］ボレート塩、テトラフェニ
ルホスホニウム塩等が挙げられる。

【００４５】また特にカルシウムイオンなどと蛍光錯体
を生成する化合物としては、１−［２−アミノ−５−
（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９
−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５
−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四
酢酸塩、１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−
６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェ
ノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）
エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸−ペンタアセトキ
シメチルエステル、１−［６−アミノ−２−（５−カル
ボキシ−２−オギザゾイル）−５−ベンゾフラニロキ
シ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタ
ン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸塩、１−［６−アミノ
−２−（５−カルボキシ−２−オギザゾイル）−５−ベ
ンゾフラニロキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフ
ェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸 ペン
タアセトキシメチルエステル、１−［２−アミノ−５−
（６−カルボキシ−２−インドリル）フェノキシ］−２
−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸塩、１−［２−アミノ−５−
（６−カルボキシ−２−インドリル）フェノキシ］−２
−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸 ペンタアセトキシメチルエス
テル、８−アミノ−２−［（２−アミノ−５−メチルフ
ェノキシ）メチル］−６−メトキシキノリン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−四酢酸塩、８−アミノ−２−［（２−アミ
ノ−５−メチルフェノキシ）メチル］−６−メトキシキ
ノリン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸−ペンタアセトキ
シメチルエステル、３，３’−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カ
ルボキシメチル）アミノメチル］フルオレッセイン、８
−［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］
−４−メチルウンベリフェロンなどが挙げられる。

【００４６】またアニオンと有色錯体を形成するテトラ
フェニルアルソニウム塩、塩化物イオンと錯体を形成す
ると蛍光強度が減少する臭化Ｎ−エトキシカルボニルメ
チル−６−メトキシキノリニウム、ホウ素と錯体を形成
する８−ヒドロキシ−１−（サリシリデンアミノ）−
３，６−ナフタレンジスルホン酸塩などが挙げられる。

【００４７】前記錯体が形成される反応を利用する方法
では、イオンと配位子などが生成する色素や蛍光物質を
吸光光度計や蛍光光度計などで測定して色素や蛍光物質
の量を定量することによって分析対象物質（多くの場
合、イオンである）を定量する。

【００４８】今まで光学的に検出可能な物質について述
べてきたが、次に電気化学的に検出可能な物質について
説明する。電気化学的方法によって検出できる物質とし
ては、電子伝達物質（メディエーター）やイオノフォア
とイオンとの錯体などが挙げられる。

【００４９】電子伝達物質とは、分析対象物質を酵素な
どによって酸化／還元し、その際分析対象物質から／に
直接的に電子を受容／供与する化学物質であって、電子
伝達物質の還元体／酸化体を電極で酸化／還元するとき
の電気化学応答から分析対象物質を定量するのである。
また電子伝達物質と分析対象物質が直接的に電子を授受
していなくても良く、電子伝達物質は、分析対象物質を
酵素などによって酸化／還元し、その際分析対象物質か
らまたは分析対象物質に、間接的に電子を受容／供与す
る化学物質であっても良い。分析対象物質と定量的関係
にある電子伝達物質の酸化体／還元体を電極で還元／酸
化するときの電気化学応答から分析対象物質を定量する
のである。

【００５０】具体的には電子伝達物質として、１，１’
−ジメチル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，１’−
ジベンジル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，４−ジ
アミノベンゼン、２−メチル−１，４−ナフトキノン、
Ｎ−メチルフェナジニウム塩、１−ヒドロキシ−５−メ
チルフェナジニウム塩、１−メトキシ−５−メチルフェ
ナジニウム塩、９−ジメチルアミノベンゾアルファフェ
ノキサジン−７−イウム塩、フェロセン誘導体、ヘキサ
シアノ鉄（ＩＩ）塩、７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキ
サジン−３−オン １０−オキシド、３，７−ジアミノ
−５−フェニルフェナジニウム塩、３−（ジエチルアミ
ノ）−７−アミノ−５−フェニルフェナジニウム塩、
１，４-ベンゼンジオール、１，４−ジヒドロキシ−
２，３，５−トリメチルベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチル−１，４−ベンゼンジアミン、Δ２，
２’−ビ−１，３−ジチオール、２，６−ジメチルベン
ゾキノン、２，５−ジメチルベンゾキノン、２，３，
５，６−テトラメチル−２，５−シクロヘキサジエン−
１，４−ジオン、２，６−ジクロロ−４−［（４−ヒド
ロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエ
ン−１−オン、２，６−ジクロロ−４−［（３−クロロ
−４−ヒドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロ
ヘキサジエン−１−オン、７−（ジエチルアミノ）−３
−イミノ−８−メチル−３Ｈ−フェノキサジン塩、３，
７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−５−イウ
ム塩等が挙げられる。

【００５１】この例において検出可能な物質とは電子伝
達物質の酸化体／還元体であり、検出可能な物質を生成
する反応とは電子伝達物質の酸化／還元反応である。前
述のように分析対象物質と定量的関係をもって存在する
電子伝達物質の酸化体／還元体を電極で還元／酸化する
ときの酸化還元電流などの電気化学応答を測定し、分析
対象物質を定量するのである。例えば、アスコルビン酸
や過酸化水素のように、電子供与／受容物質として電極
上で酸化／還元されるときの電気化学的応答を測定し、
その応答結果から分析対象物質を間接的に定量すること
ができる。

【００５２】イオノフォアとは、分析対象物質である特
定のイオンと選択的に配位結合またはイオン結合を生
じ、錯体となる配位子などの化合物であって、液膜電極
で用いられていることは特に良く知られている。

【００５３】具体的には、カチオンと錯体をつくるイオ
ノフォアとして、テトラキス［３，５−ビス（トリフル
オロメチル）フェニル］ボレート塩、テトラフェニルホ
スホニウム塩、バリノマイシン、シクロ（Ｎ’，Ｎ’−
ジオクチル−Ｄ−アスパラギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−
アラニル）₂、ビス（ベンゾ−１５−クラウン−５）、
ビス［（ベンゾ−１５−クラウン−５）−４−メチル］
ピメレート、ビス（１２−クラウン−４）、ビス［（１
２−クラウン−４）メチル］−２−ドデシル−２−メチ
ルマロネート、１４−クラウン−４、ドデシル−メチル
−１４−クラウン−４、６，６−ジベンジル−１，４，
８，１１−テトラオキサシクロテトラデカン、ジベンゾ
−１８−クラウン−６、ジシクロヘキシル−１８−クラ
ウン−６、４，１６−ジ−Ｎ−オクタデシルカルバモイ
ル−３−オキサブチリル−１，７，１０，１３，１９−
ペンタオキサ−４，１６−ジアザシクロヘンイコサン等
が挙げられる。

【００５４】またアニオンと錯体をつくるイオノフォア
として、テトラフェニルアルソニウム塩、６−メトキシ
−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム塩などが挙
げられる。

【００５５】液膜電極とは、電極の表面に多孔質の高分
子層などを設け、高分子層にイオノフォアを染み込ま
せ、試料液中の特定のイオンのみと結合させて高分子層
内を移動させることによって、ある特定のイオンのみを
選択分離させ、その際に生じる膜電位を測定し分析対象
物質である特定のイオンを定量する方法である。もちろ
ん電気化学的検出方法にイオノフォアが用いられるの
は、この液膜電極の例に限られるわけではない。

【００５６】バルク液中でイオノフォアとある特定のイ
オンを結合させ、結合していないイオンが移動できず、
結合して生成した錯体のみが移動できる高分子層を設け
た電極において該イオンの選択分離を行い、その際に生
じる膜電位を測定し分析対象物質である該イオンを定量
することができる。

【００５７】この例において検出可能な物質とはイオノ
フォアと特定のイオンとの錯体であり、検出可能な物質
を生成する反応とは配位結合またはイオン結合によるイ
オノフォアと特定のイオンとの錯体形成反応である。前
述のように分析対象物質である特定のイオンの濃度に応
じて発生する膜電位を電気化学的に測定することによ
り、分析対象物質を定量するのである。

【００５８】本発明の測定方法は、このような検出可能
な物質を生成する反応系を利用する以下のような方法に
好ましく適用される。

【００５９】(a)過酸化水素の生成反応または過酸化水
素を酸化剤とする酸化反応を含む反応系を利用する方法
であり、具体的には、例えば分析対象物質から酸化酵素
反応系を介して過酸化水素を生成させ、これをペルオキ
シダーゼの共存下、被酸化性発色体（色素前駆体）と酸
化還元反応を行わせて、この反応により生成する色素化
合物の量を測定する方法。

【００６０】(b)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）を生成する反応、
または、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを還元剤として使
用する反応を含む反応系を利用する方法であって、具体
的には、例えば、分析対象物質から、脱水素酵素反応系
を介してＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成させ、これを
電子伝達系存在下に色素前駆体に作用させて還元し、こ
れにより生成する色素化合物の量を測定する方法。

【００６１】(c)酸性下で芳香性第１アミンに亜硝酸を
反応させてジアゾニウム塩を生成させ、生成したジアゾ
ニウム塩と被カップリング試薬とを反応させ、次いで生
成したアゾ色素を定量することにより亜硝酸塩、ジアゾ
ニウム塩、カップリング化合物の量を測定する方法。

【００６２】(d)リン酸エステルを有する４−メチルウ
ンベリフェロンなどの蛍光酵素基質が、アルカリホスフ
ァターゼの作用によってリン酸塩を遊離して蛍光物質を
生成し、生成した蛍光物質に励起光を照射し発する蛍光
を測定する、蛍光酵素基質で標識された物質やアルカリ
ホスファターゼの量を測定する方法。

【００６３】(e)酸化還元酵素などによって１，４−ジ
アミノベンゼンなどのメディエーターを酸化／還元し、
生成したメディエーターの酸化体／還元体が電極反応で
還元／酸化されるときの電流応答を測定する、酸化還元
酵素や酸化還元酵素で標識された物質の量の測定方法。

【００６４】(f)還元剤とテトラゾリウム塩とを反応さ
せてテトラゾリウム塩をホルマザン化合物とし、ホルマ
ザン化合物の生成量を測定することにより還元剤等の定
量を行う方法。

【００６５】これらのうち、好ましくは、前記検出可能
な物質の生成反応の反応出発物質又は反応中間体又は反
応生成物が層状無機化合物に吸着可能な化合物である測
定方法が挙げられる。層状無機化合物に吸着可能な化合
物は、例えば、H.Van Olphen著の成書「An Introductio
n to Clay Colloid Chemistry, Second Edition」（Kri
eger Publishment, Malabar）の１１章「Interaction o
f Clays and OrganicCompounds」などに詳述されてい
る。また、加藤忠義、特公昭50-8462（USP3,950,180）
などには、多数の吸着可能な化合物が紹介されている。

【００６６】特に好ましくは、前記検出可能な物質の生
成反応の反応出発物質又は反応中間体等の反応生成物が
層状無機化合物に吸着可能なカチオン性化合物である測
定方法が挙げられる。具体的には、前記反応出発物質又
は反応中間体がジアゾニウム塩である場合、又は前記反
応出発物質又は反応中間体がテトラゾリウム塩である場
合が挙げられる。

【００６７】もちろん、検出可能な物質とは分析対象物
質自身であってもよく、その例としては、水に溶解した
グルコースが電極表面で酸化される際の電気化学的応答
を測定し、分析対象物質を定量するものがある。

【００６８】このような反応系で測定可能な分析対象物
質としては、体液中の尿や血液等の生体成分、食品、医
薬、自然環境に存在する微量物質、産業化学物質、廃棄
物中の微量物質等を挙げることができる。

【００６９】次に、本発明の層状無機化合物について説
明する。本発明の層状無機化合物は、Ｓｉ四面体、Ａｌ
八面体等の多面体が平面状に連なったシート構造が層状
に重なった結晶構造を有する無機化合物であり、層状粘
土鉱物及びハイドロタルサイトが含まれる。

【００７０】粘土鉱物とは、粘土（細かい土状の無機粒
状物で、水で湿った状態で可塑性のあるもの）の大半を
占めるアルミニウムケイ酸塩鉱物をいい、通常は、Ｓｉ
が４つのＯ（酸素原子）に囲まれたＳｉ四面体とＡｌ又
はＭｇが６つのＯＨ基あるいはＯに囲まれたＡｌ（又は
Ｍｇ）八面体を最小構成単位としている。層状粘土鉱物
の構造は、Ｓｉ四面体が１つの面を共有し、残る頂点の
Ｏを同方向に向けて六角網状のシートを形成し（四面体
シート）、一方Ａｌ（又はＭｇ）八面体が稜角を共有し
てシートを形成し（八面体シート）、これらが層状に重
なったものである。四面体シートと八面体シートが一枚
づつ重なってできた１：１層が何枚も積み重なってでき
た鉱物を１：１型鉱物、一枚の八面体シートを２枚の四
面体シートで挟んだ２：１層が何枚も積み重なってでき
た鉱物を２：１型鉱物、２：１型の層間にもう一枚八面
体シートが挟まったものを２：１：１型鉱物という。ま
た、八面体シートがＭｇ（ＯＨ）₂ですべての八面体位
置に金属イオンが存在するものを３八面体型（Trioctah
edral）、八面体シートがＡｌ（ＯＨ）₃で１／３が空孔
になっているものを２八面体型（Dioctahedral）とい
う。本発明で用いる層状無機化合物としては、２：１型
鉱物が好ましい。

【００７１】本発明の層状無機化合物を構成する元素
は、好ましくは、リチウム、ナトリウム、カリウム、マ
グネシウム、アルミニウム、ケイ素、酸素、水素、フッ
素、及び炭素から選ばれる少なくとも一つ以上から構成
され、具体的には以下に示す式１〜９のいずれか一つで
表される化合物が挙げられる。尚、これらの式に結晶水
が含まれたものでもよい。もちろん、これらの式は鉱物
学的又は化学的に純粋な化合物としての式であって、現
実の層状無機化合物では、ケイ酸ナトリウムなどの不純
物を含む場合があるため、元素分析などによって化学式
を定めたものとしても、これらの式と必ずしも一致しな
い場合があることは、例えば、文献（D. W, Thompson,
J. T. Butterworth, J. Colloid Interf. Sci., 151, 2
36-243(1992)）においても記述されていることである。

【００７２】

【化１】 Ｍ_xＳｉ₄（Ａｌ_2-xＭｇ_x）Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（１） （式１においてＭはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのうちいずれか
ひとつであって、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、x
は２未満の正数である。）

【００７３】

【化２】 Ｍ_x（Ｓｉ_4-xＡｌ_x）Ａｌ₂Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（２） （式２においてＭはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのうちいずれか
ひとつであって、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、x
は４未満の正数である。）

【００７４】

【化３】 Ｍ_xＳｉ₄（Ｍｇ_3-xＬｉ_x）Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（３） （式３においてＭはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのうちいずれか
ひとつであって、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、x
は３未満の正数である。）

【００７５】

【化４】 Ｍ_x（Ｓｉ_4-xＡｌ_x）Ｍｇ₃Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（４） （式４においてＭはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのうちいずれか
ひとつであって、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、x
は４未満の正数である。）

【００７６】

【化５】ＭＳｉ₄Ｍｇ_2.5Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（５） （式５においてＭはＬｉ、Ｎａのうちいずれかであっ
て、好ましくはＮａである。ＸはＯＨ、Ｆのいずれかで
あって、好ましくはＦである。）

【００７７】

【化６】Ｍ₂Ｓｉ₄Ｍｇ₂Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（６） （式６においてＭはＬｉ、Ｎａのうちいずれかであっ
て、好ましくはＬｉである。ＸはＯＨ、Ｆのいずれかで
あって、好ましくはＦである。）

【００７８】

【化７】Ｍｇ₆Ａｌ₂（ＯＨ）₁₆Ｘ_x ・・・（７） （式７においてＸはハロゲン、Ｎ０₃、ＳＯ₄、ＣＯ₃、
ＯＨのいずれかもしくは有機酸のアニオン形であって、
好ましくはＣＯ₃である。xはＸがハロゲン、ＯＨ、ＮＯ
₃、一価の有機酸のとき２であって、ＸがＳＯ₄、Ｃ
Ｏ₃、二価の有機酸のとき１である。）

【００７９】

【化８】 Ｎａ_0.33Ｓｉ₄（Ｍｇ_2.67Ｌｉ_0.33）Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（８） （式８において、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、好
ましくはＯＨである。）

【００８０】

【化９】 Ｎａ_a-b（Ｓｉ_4-aＡｌ_a）（Ｍｇ_3-bＡｌ_b）Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（９） （式９において、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、好
ましくはＯＨである。ａは４未満の正数であって、ｂは
３未満の正数であって、ａ−ｂ＞０である。）

【００８１】本発明の層状無機化合物の具体例として
は、カオリナイト、ハロイサイト、蛇紋石等の１：１型
粘土鉱物；タルク、パイロフィライト、スメクタイト、
バーミキュライト（上記式中、式２で表されるもの、以
下同様）、フッ素四ケイ素雲母（式５）やテニオナイト
（式６）を含む雲母等の２：１型粘土鉱物；クロライト
等の２：１：１型粘土鉱物；２：１〜２：１：１型の中
間鉱物；イモゴライト等の準晶質粘土鉱物；アロフェン
等の非晶質粘土鉱物；ハイドロタルサイト（式７）；等
が挙げられる。

【００８２】また、スメクタイトには、同型置換された
四面体、八面体格子中のイオン種によってモンモリロナ
イト（式１）、モンモリロナイトが４０〜８０％含まれ
る天然物であるベントナイト、バイデライト（式２）等
の２八面体型；ヘクトライト（式３、好ましくは式
８）、サポナイト（式４、好ましくは式９）、ノントロ
ナイト等の３八面体型；等が含まれる。

【００８３】尚、ハイドロタルサイトは、上記式中の式
７、具体的にはＭｇ₆Ａｌ₂（ＯＨ） ₁₆ＣＯ₃・４Ｈ₂Ｏで
表される層状鉱物であり、Ｍｇ（ＯＨ）₂（ブルーサイ
ト：中心にＭｇ²⁺を持つ酸素八面体の層が積み重なった
構造を持つ）のＭｇ²⁺の一部がＡｌ³⁺に同型置換したも
のであって正電荷を有するが、層間のＣＯ₃ ^2-によって
電気的中性を保っており、陰イオン交換能をもつもので
ある。ケイ酸塩鉱物ではないが、しばしば粘土鉱物とし
て取り扱われる。

【００８４】上述した本発明の層状無機化合物のうちい
くつかの組成を下記表１に示す。

【００８５】

【表１】 ＜表１＞ ──────────────────────────────────── 鉱物名 組成^* ──────────────────────────────────── カオリナイト（Kaolinite） Si₂Al₂O₅(OH)₄ ハロイサイト Si₂Al₂O₅(OH)₄・2H₂O 蛇紋石 Si₂(Mg²⁺,Fe²⁺)₃O₅(OH)₄ タルク（Talc） Si₄Mg₃(OH)₂O₁₀ パイロフィライト（Pyrophyllite） Si₄Al₂(OH)₂O₁₀ モンモリロナイト（Montmorillonite） MI_xSi₄(Al_2-xMg_x)O₁₀(OH)₂・nH₂O バイデライト（Beidellite） MI_x(Si_4-xAl_x)Al₂O₁₀(OH)₂・nH₂O ヘクトライト（Hectorite） MI_xSi₄(Mg_3-xLi_x)O₁₀(OH,F)₂・nH₂O サポナイト（Saponite） MI_x(Si_4-xAl_x)Mg₃O₁₀(0H)₂・nH₂O ノントロナイト（Nontronite） MI_x(Si_4-xAl_x)Fe₂O₁₀(OH)₂・nH₂O バーミキュライト（Vermiculite） MI_x(Si_4-xAl_x)Al₂O₁₀(OH)₂・nH₂O ハイドロタルサイト（Hydrotalcite） Mg₆Al₂(OH)₁₆CO₃・4H₂O ──────────────────────────────────── * : MI は１価陽イオンで代表させた交換性陽イオン

【００８６】本発明の層状無機化合物の平均粒径は、均
一な分散が行える程度に小さな粒径であれば特に限定は
されない。また、層状無機化合物は一般に板状の粒子で
あり且つ複数個の粒子が凝集と劈開を繰り返す動的平衡
にあるので、平均粒径の定義を行うこと自体が困難であ
るから、好ましい平均粒径の範囲を明示することは容易
ではないが、強いて言及すれば、光散乱法や電子顕微鏡
での観察などの手段によって測定された値が水中に分散
させた状態で、１ｎｍ以上２０μｍ以下であるのが好ま
しい。さらには１０ｎｍ以上２μｍ以下のものが好まし
い。又、これらはイオン交換能を有することによって、
色素等の電荷や極性に応じて吸着を行うものと考えら
れ、イオン交換能は、層を構成する金属イオンの置換に
よって生じた層電荷に由来する。そこで、層電荷の絶対
値は、表１に示した式の組成の原子団について０．２〜
１程度の値を有することが好ましい。

【００８７】また、鉄等の遷移金属イオンを置換イオン
として構造中に、又は不純物として含むものは、それに
よって着色を生じ、また酸化還元特性等を示して副反応
を生じる結果、透明性等に劣ることとなるため、遷移金
属イオンによる置換がない方が好ましいが、これに限定
されるものではない。

【００８８】これら粘土鉱物等の層状無機化合物には４
級アンモニウム塩などのピラーを立てて層間距離や層間
の電荷や極性をあらかじめ調整することもできる。本発
明の上述した層状無機化合物のうち、より好ましいもの
は２：１型粘土鉱物であり、特に好ましいものはイオン
交換能を有する膨潤性粘土鉱物である。

【００８９】膨潤作用は交換性のカチオンまたはアニオ
ンを持つことに由来し、層間あるいはカードハウス構造
と呼ばれる粘土鉱物等の表面に反応出発物質又は反応中
間体を迅速に吸着できる。粘土鉱物はアニオン性物質、
カチオン性物質、非イオン性の極性有機化合物を、ハイ
ドロタルサイトはアニオン性化合物を吸着する。層状無
機化合物に吸着可能な化合物は、例えばH.Van Olphen著
の成書「An Introduction to Clay Colloid Chemistry,
Second Edition」（Krieger Publishment, Malabar）
の１１章「Interaction of Clays and Organic Compoun
ds」などに詳述されている。本発明においては好ましく
はカチオン交換能を有するものを用いる。

【００９０】膨潤性粘土鉱物のうち、更に好ましいもの
はベントナイト、スメクタイト、バーミキュライトまた
は合成フッ素雲母であり、特に好ましくは合成ヘクトラ
イトもしくは合成サポナイト等の合成スメクタイト、ま
たは合成フッ素雲母で代表される膨潤性合成雲母（又は
Ｎａ型雲母）等の合成雲母（天然の雲母は通常非膨潤性
の粘土鉱物である）である。本発明においてはこれらを
単独で、または２種以上を併用してよい。

【００９１】本発明の上述した層状無機化合物は、合成
物、天然物に限らず使用できるが、好ましくは合成物が
用いられる。合成物は、天然物とは異なり、化学的に均
一で吸着した検出可能な物質を定量的に取り扱うことが
可能であり、更に層間に鉄等の有色の金属を含まず透明
度が高いため、定量的、光学的取り扱いが可能だからで
ある。合成物としては、例えば水熱合成法又は溶融法に
よって製造されたものが挙げられる。天然物を精製して
得られる膨潤性粘土鉱物も好ましく用いられる。

【００９２】このような層状無機化合物はいくつか市販
されており、たとえばコープケミカル（株）製の商品名
ルーセンタイトＳＷＮもしくはルーセンタイトＳＷＦ
（合成ヘクトライト）またはＭＥ（フッ素雲母）、クニ
ミネ工業（株）製の商品名スメクトンＳＡ（合成サポナ
イト）、協和化学工業（株）製の商品名チキソピーＷ
（合成ヘクトライト）または商品名キョーワード５００
（合成ハイドロタルサイト）、ラポー社製の商品名ラポ
ナイト（合成ヘクトライト）、（株）ナカライテスク社
販売の天然ベントナイト、（株）豊順鉱業社製の商品名
マルチゲル（ベントナイト）等が挙げられる。

【００９３】上述した層状無機化合物は、アミン、ポリ
エン、各種色素など有機化合物を吸着することが知られ
ており、従来、油、色素などを吸着する水処理剤、ワイ
ンやみりん等の製造時の蛋白除去剤、不純物吸着除去に
よる脱色精製剤等として用いられてきた。また、これら
層状無機化合物は、メタクロマジーと呼ばれる現象を生
じるなど、特定の反応場を与える素材として知られてお
り、更に、最近では天然色素の光安定性を向上させるこ
とも知られている。

【００９４】しかしながら、本発明においては、分析を
目的として検出可能な物質の生成反応をこの層状化合物
の存在下に進行させ、その機構は必ずしも明確ではない
が、この層状無機化合物に検出可能な物質の反応前駆体
を吸着させて層状無機化合物の表面で濃縮させることな
どにより、検出可能な物質の生成反応速度を向上させ、
測定の迅速化が可能となることを見出したものである。
かかる層状無機化合物の使用例は未だ見い出されていな
い。

【００９５】尚、反応系にあらかじめ前記層状無機化合
物を添加しても、検出反応は妨害されなかった。本発明
の方法において層状無機化合物を添加する方法は、利用
する反応系にもよるが、溶媒に溶解または分散させて溶
液または分散液の形で、反応系中に添加するのが好まし
い。溶媒としては特に限定されず、従来公知のものを任
意に使用することができるが、例えば蒸留水などの水、
エタノールなどのアルコール、アセトンなどのケトン
類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、酢酸エチルな
どのエステル類、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水
素類、ベンゼンやトルエンなどの芳香族炭化水素類など
から、分析対象物質やその検出反応系に適したものを選
ぶことができる。好ましくは後述する緩衝剤を用い、緩
衝剤に溶解または分散させた緩衝溶液として添加するの
がよい。

【００９６】層状無機化合物の添加量は、利用する反応
系に応じて決定され、用いる層状無機化合物にもよる
が、検出可能な物質に対して吸着サイトが少な過ぎて検
出可能な物質が吸着されずに溶液中等に残ったり、吸着
サイトが多すぎて検出可能な物質の吸着に濃度の偏りが
生じたりすることのない量が望ましい。

【００９７】尚、反応系に添加する層状無機化合物の好
ましい量は以下のように決定する。即ち、層状無機化合
物は、主として上述の層電荷の程度に応じた量の色素等
を吸着するので、各種の層状無機化合物について色素等
に対する全吸着サイト数を求めることができる。検出反
応系において試薬の濃度が定まれば、生成する色素等の
おおよその最大量が算出でき、層状無機化合物の全吸着
サイト量を生成しうる色素等の最大量が越えないように
層状無機化合物を添加することができる。

【００９８】層状無機化合物の添加時期については、検
出可能な物質の生成反応中に層状無機化合物が存在して
おれば特に制限はないが、検出可能な物質の生成反応前
に反応系にあらかじめ添加し、反応系中に分散させてお
くのが好ましい。ここで、反応系中に分散させておくの
は、この層状無機化合物と、検出可能な物質の生成反応
に与る反応出発物質、反応中間体、反応生成物質との吸
着などの相互作用を生じやすくするためである。また、
均一に分散した濃度のバラツキのない状態は検出に適し
ているためでもある。したがってここで分散という場合
は、前述の相互作用が生じやすく、また検出に適した状
態であればよく、例えば液体中へ層状無機化合物が分散
した状態でもよく、またゾル、ゲルなどの状態であって
もよい。

【００９９】吸着の度合いは緩衝剤の組成（ｐＨ、イオ
ン強度、錯体を形成する成分等）に影響される。例え
ば、純水に分散させたスメクタイトは食用色素青色一号
（ブリリアントブルー ＦＣＦ）を吸着しにくいが、ｐ
Ｈ６．５のビス−トリス緩衝液［ビス（２−ヒドロキシ
エチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタンと塩
酸から調製されたもの］中に分散させたスメクタイトは
この色素を迅速に吸着する。

【０１００】本発明の方法に用いる緩衝剤、緩衝溶液の
種類は、例えば上述したビス−トリス緩衝液の他、Ｎ−
（２−アセトアミド）イミノ二酢酸緩衝液等が挙げられ
るが、これらに限定されるものではなく、用いる反応系
に応じて適宜選択するのが好ましい。また、緩衝剤のｐ
Ｈ、濃度等については、用いる反応系に適した条件を選
択することが好ましい。

【０１０１】緩衝剤の添加時期は特に限定されず、層状
無機化合物の添加前であっても添加後であっても差し支
えないが、層状無機化合物を溶解もしくは分散させた緩
衝溶液として、層状無機化合物と共に反応系に添加する
のが好ましい。

【０１０２】また、測定にあたっては、反応系に種々の
界面活性剤を添加することもできる。界面活性剤の添加
により、難溶性物質を含む検体の均一な分散、検体の濡
れ性の向上による浸透の均一化と迅速化が可能となる。
ただし、界面活性剤は、界面に吸着する、物質を分散・
溶解する等の作用があるため、生成した検出可能な物質
の層状無機化合物への吸着と競合し、あるいは生成した
検出可能な物質の溶解をもたらすことによって、測定の
精度を損なわしめるおそれがある。したがって、本発明
において層状無機化合物と組み合わせて用いる界面活性
剤としては、生成した検出可能な物質と層状無機化合物
との吸着を妨害しないものを選択するのが好ましい。ま
た、界面活性剤の使用量についても、このような妨害が
生じない程度の少量を用いるのが好ましい。

【０１０３】吸着を妨害しない界面活性剤の種類として
は、界面活性剤の分子量が生成する色素に比べて極端に
大きくないものであり、且つ界面活性剤の有機性値と無
機性値が下記式を満足するものが好ましい。

【０１０４】

【数１】（無機性値）＝（2.37±0.23）×（有機性値）
−186.2±117.1

【０１０５】上記式は、既知の構造の種々の界面活性剤
について吸着阻害効果と無機性値及び有機性値との関係
を検討して得られたものである。すなわち、炭素一個の
有機性値を２０、水酸基の無機性値を１００、ポリエチ
レンオキシドの有機性値を３０、その無機性値を６０、
ニトロ基の有機性値を７０、その無機性値を７０、など
のように官能基や原子ごとにポイントを割り振り、化合
物を構成する官能基、原子についてこれらのポイントを
合計して無機性値の総和及び有機性値の総和をとり、こ
の無機性値と有機性値とを直交座標にプロットすると、
似た性質の化合物は直交座標の同じ領域に位置づけられ
るので、化合物の構造によらない共通の性質が現れるこ
とが有機概念図として知られている（甲田善生、「有機
概念図−基礎と応用−」第１１頁、三共出版(1984)）。
本発明者らは、既知の構造を有する多くの界面活性剤に
ついて吸着阻害効果と無機性値及び有機性値との関係を
検討し、吸着を阻害しない界面活性剤の種類が有機概念
図において上記式を満足することを見出したものであ
る。なお、無機性値、有機性値の算出には前述の有機概
念図に関する成書中の換算データを用いることができる
が、前述の数式は、本間善夫作製のプログラム「パソコ
ン有機概念図」（化学ソフトウェア学会等）中の換算デ
ータを用いて得たものである。

【０１０６】吸着を妨害しない界面活性剤の種類と添加
量の選択は、例えば次の（イ）〜（ニ）のように実施す
ることができる。

【０１０７】（イ）所定量のスメクタイト、４−ＡＡ、
及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−３，５−ジメトキシアニリンを含む反応液に
過酸化水素を加え発色させる。 （ロ）（イ）と同じ組成の反応液に更に所定の濃度とな
るように界面活性剤を加え、同様に過酸化水素を加え発
色させる。 （ハ）スメクタイトを自然沈降、遠心分離、ろ別などの
適当な手段で分離し、上澄み液またはろ液の色調を分光
光度計等で測定して、（イ）、（ロ）のそれぞれにおけ
るスメクタイトへの生成色素の吸着量を比較する。ある
いは、吸着による凝集が観察される場合には、凝集沈殿
の程度をもって評価する。 （ニ）界面活性剤を添加しないときと添加したときでほ
とんど差が見られない界面活性剤の種類と添加量を選択
する。

【０１０８】このような方法で選択された好ましい界面
活性剤の種類としては、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドなどの糖アルキルエーテル類、ｎ−オクチル
−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−
Ｄ−チオグルコピラノシドなどの糖アルキルチオエーテ
ル類、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−
ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミドなどの糖アミド類、
β−Ｄ−フラクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ドモノデカノエート、β−Ｄ−フラクトピラノシル−α
−Ｄ−グルコピラノシドモノデカノエートなどの糖エス
テル、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコナミドプロピル）
デオキシコラミドなどが挙げられる。

【０１０９】また、添加量としては特に限定されず、層
状無機化合物全量に対する添加の割合も特に限定される
わけではなく、界面活性剤の種類と層状無機化合物の種
類と反応系に適した量を選べばよいが、界面活性剤とし
ての効果を発揮するに充分な量、例えば水系溶液におい
て用いる界面活性剤の臨界ミセル濃度を大きく越えない
程度が好ましい。例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオ
グルコピラノシドの０．３％水溶液、β−Ｄ−フラクト
ピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノデカノエー
トの０．３％水溶液、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコナ
ミドプロピル）デオキシコラミドの０．３％水溶液を好
ましく用いることができる。

【０１１０】検出可能な物質の測定方法としては、吸光
測定方法、蛍光測定、発光測定、電気化学的測定方法、
散乱光測定方法、反射率測定方法等が挙げられる。好ま
しくは吸光光度計等を用いた光吸収分析に代表される比
色定量等の光学的な測定方法が挙げられる。本発明で用
いる層状無機化合物は、可視〜近赤外領域にほとんど吸
収を持たないので、コロイド状の分散液又は溶液のまま
でも、あるいはゲル状でも光学的な測定を行うことがで
きるのである。尚、溶液のまま測定するときには系はも
ちろんオパールグラス法などの手段を選ぶことができ
る。

【０１１１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

【０１１２】

【実施例１】テトラゾリウム塩として３，３’−（３，
３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）−ビス
［２−（パラニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−
テトラゾリウム］クロライド（以下、「テトラゾリウム
塩」と略す）、緩衝剤としてリン酸バッファー（リン酸
水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムとを混合し
てｐＨ８．５に調整したもの）、Ｌ−アスコルビン酸、
及びスメクタイト（商品名ルーセンタイトＳＷＮ：コー
プケミカル社製、合成スメクタイト）を、終濃度が表２
の通りになるようにディスポセル（ポリメチルメタクリ
レート製）にとり、３０℃で１８０秒間インキュベート
した。その後、Ｌ−アスコルビン酸を加えて反応を開始
し、添加１０秒後より３００秒間、１秒毎に吸光度を測
定して経時変化を観察した。測定波長は５３５ｎｍ、反
応温度は３０℃である。

【０１１３】また、比較のため、スメクタイトを添加し
ない他は上記と同様に終濃度が表２の通りになるように
テトラゾリウム塩及びリン酸バッファーをディスポセル
（ポリメチルメタクリレート製）にとり、３０℃で１８
０秒間インキュベートした。その後、Ｌ−アスコルビン
酸を加え反応を開始し、添加１０秒後より３００秒間、
１秒毎に吸光度を測定し、経時変化を観察した。測定波
長は６３３ｎｍ、反応温度は３０℃である。

【０１１４】尚、吸光度の測定は日本分光社製分光光度
計（ＪａｓｃｏＶ−５５０）を用い、セルにはセル長１
ｃｍのディスポセル（ポリメチルメタクリレート製）を
使用した。また、測定波長はどちらも吸収極大波長付近
の波長である。

【０１１５】図１に測定結果を経過時間に対する吸光度
のグラフとして示す。スメクタイト添加系では測定開始
後約５０秒で反応が安定化するのに対して、スメクタイ
ト無添加系では反応が安定化するのに測定開始後約３０
０秒要している。このことから、スメクタイトを添加す
ることによって反応速度が上昇したことがわかる。

【０１１６】

【表２】 ＜表２＞ ─────────────────────────── 試 薬 終濃度 ─────────────────────────── テトラゾリウム塩 ８００μｍｏｌ／ｌ リン酸バッファー(pH8.5) １００ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ(+)−アスコルビン酸 ８３．３μｍｏｌ／ｌ スメクタイト ０．１％、又は０％ （全量３ｍｌ） ───────────────────────────

【０１１７】

【実施例２】塩酸、スメクタイト（コープケミカル社
製、商品名ルーセンタイトＳＷＮ）、２，４−ジクロロ
アニリン、及び亜硝酸ナトリウムを、終濃度が表３の通
りになるようにディスポセル（ポリメチルメタクリレー
ト製）にとり、３０℃で１８０秒間インキュベートし
た。ここで、亜硝酸ナトリウムの濃度は０〜５０μｍｏ
ｌ／ｌの範囲で、１．６、６．３、１２．５、２５．
０、及び５０．０μｍｏｌ／ｌの５種類の濃度を採用し
た。

【０１１８】インキュベート後、津田試薬（Ｎ，Ｎ−ジ
エチル−Ｎ’−１−ナフチルナフチルエチレンジアミン
シュウ酸塩）を加え、添加１０秒後より６００秒間、１
秒毎に吸光度を測定し、経時変化を観察した。測定波長
は５５５ｎｍ、反応温度は３０℃である。

【０１１９】また、比較のため、スメクタイトを添加し
ない他は上記と同様に終濃度が表３の通りになるよう
に、塩酸、２，４−ジクロロアニリン、及び亜硝酸ナト
リウムをディスポセル（ポリメチルメタクリレート製）
にとり、３０℃で１８０秒間インキュベートした。その
後、津田試薬を加え、添加１０秒後より６００秒間、１
秒毎に吸光度を測定し、経時変化を観察した。測定波長
は５４０ｎｍ、反応温度は３０℃である。

【０１２０】尚、吸光度の測定は日本分光社製分光光度
計（ＪａｓｃｏＶ−５５０）を用い、セルにはセル長１
ｃｍのディスポセル（ポリメチルメタクリレート製）を
使用した。また、測定波長はどちらも吸収極大波長付近
の波長である。

【０１２１】図２〜図４に測定結果を経過時間に対する
吸光度のグラフとして示す。このうち図２はスメクタイ
ト無添加系におけるグラフ、図３はスメクタイト添加系
におけるグラフ、図４は亜硝酸ナトリウム濃度２５．０
μｍｏｌ／ｌの場合のスメクタイト添加系及び無添加系
におけるグラフである。これらによれば、スメクタイト
無添加系では測定開始後約３００秒で反応が終点に達す
るのに対し、スメクタイト添加系では測定開始後約３０
秒で反応が終点に達している。このことから、スメクタ
イトを添加することによって反応速度が上昇したことが
わかる。

【０１２２】

【表３】

【０１２３】

【発明の効果】本発明によれば、検出可能な物質の生成
反応系に粘土鉱物等の層状無機化合物を添加することに
よって、前記生成反応の反応速度を高め、迅速な測定を
可能にすることができる。本発明の測定方法は、体液中
の尿や血液等の生体成分、食品、医薬、自然環境に存在
する微量物質、産業化学物質、廃棄物中の微量物質等の
検出、定量等に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で測定した吸光度の経時変化を示す
図である。

【図２】 実施例２で測定したスメクタイト無添加系に
おける吸光度の経時変化を示す図である。

【図３】 実施例２で測定したスメクタイト添加系にお
ける吸光度の経時変化を示す図である。

【図４】 実施例２で測定した亜硝酸ナトリウム濃度２
５．０μｍｏｌ／ｌの場合のスメクタイト添加系及び無
添加系における吸光度の経時変化を示す図である。

【符号の説明】

１・・・スメクタイトを添加した場合 ２・・・スメクタイトを添加しなかった場合 ３・・・亜硝酸ナトリウム濃度５０．０μｍｏｌ／ｌの
場合 ４・・・亜硝酸ナトリウム濃度２５．０μｍｏｌ／ｌの
場合 ５・・・亜硝酸ナトリウム濃度１２．５μｍｏｌ／ｌの
場合 ６・・・亜硝酸ナトリウム濃度６．３μｍｏｌ／ｌの場
合 ７・・・亜硝酸ナトリウム濃度１．６μｍｏｌ／ｌの場
合

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−15399（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−222061（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−99927（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−35753（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 31/00 G01N 21/75 G01N 33/48 - 33/98

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の分析対象物質の化学反応に基づ
   いて検出可能な物質を生成する反応を含む水性反応系を
   用いて前記検出可能な物質の量を測定することにより前
   記分析対象物質を測定する方法において、前記検出可能
   な物質の生成反応を前記水性反応系に分散させた層状無
   機化合物の存在下に行うことにより前記生成反応速度を
   高めることを特徴とする、物質の測定方法。
2. 【請求項２】 層状無機化合物が２：１型粘土鉱物であ
   る、請求項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】 ２：１型粘土鉱物が膨潤性層状粘土鉱物
   である、請求項２記載の測定方法。
4. 【請求項４】 膨潤性層状粘土鉱物がベントナイト、ス
   メクタイト、バーミキュライト及び合成フッ素雲母から
   なる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項３記
   載の測定方法。
5. 【請求項５】 スメクタイトが合成スメクタイトであ
   る、請求項４記載の測定方法。
6. 【請求項６】 合成スメクタイトが、ヘクトライト及び
   サポナイトからなる群から選ばれる少なくとも一種であ
   る、請求項５記載の測定方法。
7. 【請求項７】 前記検出可能な物質が、光学的方法によ
   って検出可能な色素である、請求項１記載の測定方法。
8. 【請求項８】 前記検出可能な物質が、アミン、イミ
   ン、ポリエン類、芳香族化合物、複素環化合物、及びイ
   オンと環状配位子との錯体からなる群から選ばれる化合
   物である、請求項１記載の測定方法。
9. 【請求項９】 前記検出可能な物質の生成反応が酸化還
   元反応である、請求項１記載の測定方法。
10. 【請求項１０】 前記検出可能な物質の生成反応の反応
    出発物質又は反応中間体が、層状無機化合物に吸着可能
    なカチオン性化合物である、請求項１記載の測定方法。
11. 【請求項１１】 前記反応出発物質又は反応中間体がジ
    アゾニウム塩である、請求項１０記載の測定方法。
12. 【請求項１２】 前記反応出発物質又は反応中間体がテ
    トラゾリウム塩である、請求項１０記載の測定方法。
13. 【請求項１３】 前記反応系に緩衝剤またはその乾燥物
    が含まれる、請求項１〜１２のいずれかに記載の測定方
    法。
14. 【請求項１４】 前記反応系中の層状無機化合物が、前
    記層状無機化合物の溶液または分散液として前記反応系
    中に添加されたものである、請求項１〜１３のいずれか
    に記載の測定方法。