DE69635717T2

DE69635717T2 - Verfahren zum Bestimmen eines Analyten und Vorrichtung dafür

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Publication number: DE69635717T2
Application number: DE69635717T
Authority: DE
Inventors: c/o Kyoto Daiichi Kagaku Co. Takao Kyoto-shi FUKUOKA; c/o Kyoto Daiichi Kagaku Co. A. Kyoto-shi KATAYAMA; c/o Kyoto Daiichi Kagaku Co. K. Kyoto-shi YAMAMOTO; c/o Kyoto Daiichi Kagaku Co. S. Kyoto-shi YONEHARA
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1995-10-30
Filing date: 1996-10-30
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2016-10-31
Also published as: EP0860695A1; US7189576B2; US7098038B2; CN1103919C; WO1997016720A1; CN1207173A; EP0860695B1; US20030175985A1; EP0860695A9; DE69635717D1; US20030175984A1; US7153696B2; US20030166295A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen eines Analyten wie beispielsweise einer biologischen Komponente oder Umweltsubstanz, indem ein Reaktionssystem verwendet wird, das eine nachweisbare Substanz bildet, wie beispielsweise einen Farbstoff, der auf einer chemischen Reaktion des Analyten beruht, der in einer Probe enthalten ist, und Bestimmen der nachweisbaren Substanz, und sie betrifft ein Teststück zur Verwendung in dem Verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen eines Analyten, der in einer Probe enthalten ist, beispielsweise einer Biokomponente in einer Körperflüssigkeit wie Urin und Blut, einer Spurenmenge einer Substanz, die in Nahrung, Medizin oder Umwelt vorliegt, einer industriellen chemischen Substanz, einer Spurenmenge einer Substanz, die in Abfall enthalten ist, oder dergleichen umfassen solche zum Bestimmen einer nachweisbaren Substanz wie beispielsweise eines Farbstoffs, der durch ein Reaktionssystem gebildet wird, an welchem der Analyt beteiligt ist.
Eines der Verfahren ist beispielsweise ein Verfahren, das umfasst, dass man durch die chemische Reaktion des Analyten gebildetes Wasserstoffperoxid und einen reaktiven Farbkuppler (Farbstoffvorstufe) einer Oxidations-Reduktions-Reaktion in Gegenwart von Peroxidase (POD) unterzieht und die gebildete Farbstoffverbindung mittels Kolorimetrie bestimmt. Dieses Verfahren wird aufgrund seiner Einfachheit häufig in der klinischen Diagnose und dergleichen verwendet. Ein anderes Verfahren ist ein Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, das darauf beruht, dass mit einer Elektrode in einer elektrochemischen Reduktions/Oxidationsreaktion die oxidierte/reduzierte Form eines Elektronenträgers (Mediators) reduziert/oxidiert wird, welcher durch eine Oxidations-Reduktions-Reaktion, die durch ein Enzym oder dergleichen verursacht wird, zwischen dem Elektronenträger und dem Analyten gebildet wird.
Mit den vorstehenden herkömmlichen Verfahren kann jedoch keine hochpräzise Messung erfolgen, da die Messempfindlichkeit nicht ausreichend hoch ist, wenn die Menge an dem Analyten sehr gering ist. Es war daher die Entwicklung eines hochpräzisen Messverfahrens mit verbesserter Messempfindlichkeit erwünscht.
Da die Messung lange dauert, wenn eine Reaktion Zeit braucht, oder eine Nachweisreaktion Zeit braucht, bis sie einen Endpunkt erreicht, ergibt sich bei einem Messverfahren zum Durchführen der quantitativen Bestimmung aus einer Reaktionsgeschwindigkeit das Problem, dass die Genauigkeit der quantitativen Bestimmung gering ist. Um dies zu überwinden, wird, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen, das Reaktionssystem erwärmt oder die Konzentration eines Reaktionspartners für die Reaktion erhöht. In dem Verfahren zum Erwärmen des Reaktionssystems ist jedoch eine Wärmequelle zum Erwärmen erforderlich und dadurch wird die Analyse erschwert. Wenn die gebildete Substanz thermisch instabil ist, ist ein Nachweis schwierig und dieses Mittel kann nicht eingesetzt werden. Das Verfahren zum Erhöhen der Konzentration des Reagenzes ist nicht praktikabel, da es zu einer Erhöhung im Hintergrund des Nachweises und zu einem Anstieg der Kosten der Analyse führt. Es gibt auch ein Verfahren, einen Katalysator zum Erhöhen der Reaktionsgeschwindigkeit zuzugeben. Da es jedoch viele Nachweisreaktionen gibt, für die bevorzugte Katalysatoren bislang noch unbekannt sind, ist dieses Verfahren ebenfalls nicht praktikabel. Wie zuvor beschrieben, sind die meisten herkömmlichen Verfahren immer noch unbefriedigend und ein neues Verfahren, das eine rasche Messung durch einfacheres Erhöhen der Reaktionsgeschwindigkeit ermöglicht, war dringend erwünscht.
Wenn bei einer Reaktion, bei der eine in einem Reaktionssolvens unlösliche Substanz gebildet wird, in dem Reaktionssystem enthalten ist, das eine nachweisbare Substanz bildet, treten die im Folgenden aufgeführten und in Frage gestellten Schwierigkeiten auf.

(1) Bei einer Bestimmung, bei der ein optischer Nachweis unter Verwendung eines flüssigen Reagenzes durchgeführt wird, beispielsweise in einer automatischen biochemischen Testvorrichtung vom Batch-Typ, fällt ein durch eine Reaktion gebildeter Farbstoff, wenn er in einem Solvens unlöslich ist, aus und haftet an der Wand einer Messzelle, wobei einfallendes Licht oder transmittiertes Licht abgeschirmt wird oder die Verschmutzung einer Verteilerdüse verursacht wird und eine Abweichung im Absorpti onskoeffizienten, Diffusion oder Lichtabschirmung durch Agglomeration verursacht wird, wodurch die Messung erschwert wird.
(2) Bei einer Messung, bei der ein optischer Nachweis unter Verwendung eines flüssigen Reagenzes durchgeführt wird, wird ebenfalls, wenn ein unlösliches Nebenprodukt gebildet wird, dieses an der Wand einer Messzelle haften, wobei einfallendes Licht oder transmittiertes Licht abgeschirmt wird oder die Verschmutzung einer Verteilerdüse, und Diffusion oder Lichtabschirmung mittels Agglomeration bewirkt, wodurch eine Messung erschwert wird.
(3) Bei einer Messung, bei der ein mittels einer Reaktion gebildeter Farbstoff durch Tropfen auf oder Infiltrieren einer Probe die in einem Teststück zu messen ist, optisch nachgewiesen wird, schlägt sich der Farbstoff, wenn der gebildete Farbstoff in einem Probenlösungsmittel unlöslich ist, auf dem Substrat des Teststückes ungleichförmig nieder oder es tritt Agglomeration des Farbstoffs ein, wodurch die Messgenauigkeit beeinträchtigt wird.
(4) Bei einer Elektrodenmessung unter Verwendung eines flüssigen Reagenzes, beispielsweise in einer automatischen biochemischen Testvorrichtung vom Batch-Typ, wird, wenn ein unlösliches Nebenprodukt gebildet wird, eine Verunreinigung einer Elektrode verursacht, indem die Oberfläche der Elektrode mit dem unlöslichen Niederschlag bedeckt wird, wodurch die biochemische Antwort verschlechtert und die Messgenauigkeit beeinträchtigt wird.

Der Unterschied zwischen den Wörtern "unlöslich" und "kaum löslich" gibt einen Unterschied im Grad der Löslichkeit in einem Solvens an. In der vorliegenden Erfindung kann in der folgenden Beschreibung das Wort "unlöslich" durch "kaum löslich" ausgetauscht werden.
Insbesondere wenn die gebildete nachweisbare Substanz in einem Reaktionssolvenz unlöslich ist, kann die Reaktionsgeschwindigkeit vermindert sein oder die Messempfindlichkeit kann herabgesetzt sein, da das Reaktionssystem, das die nachweisbare Substanz bildet, nicht gleichförmig ist und die Reaktion bei dem Verfahren des Standes der Technik nicht rasch fortschreitet. Beispielsweise kann in dem Reaktionssystem, bei dem ein Enzym verwendet wird, sich das Reaktionsprodukt nahe dem Enzym niederschlagen oder die Reaktion behindern.
Ein Messverfahren, bei dem eine Reaktion verwendet wird, bei der ein Nebenprodukt gebildet wird, das in einem Reaktionssolvens, in dem die Reaktion durchgeführt wird, unlöslich ist, ist daher selten eingesetzt worden. Demgemäß war es notwendig, eine Reaktion auszuwählen, bei der kein unlösliches Produkt als Nachweissystem gebildet wird oder mittels synthetischer chemischer Mittel ein neues Nachweisreaktionssystem zu entwickeln, so dass das Produkt in einem Reaktionssolvens löslich wird. Diese Umstände haben jedoch das verwendete Reaktionssystem eingeschränkt. In der Zwischenzeit waren viel Zeit und Arbeit für die Erforschung und Entwicklung eines Reaktionssystems erforderlich, das lediglich eine lösliche Substanz bildet. Darüber hinaus war es notwendig, ein Surfactant zum Solubilisieren, Emulgieren oder Dispergieren des Produkts zuzugeben. Die Zugabe eine Surfactants ist jedoch vom Standpunkt der Kosten der Messung von Nachteil und kann eine ungünstige Wirkung wie beispielsweise eine Unterbrechung einer Reaktion hervorrufen. Daher kann es nicht als perfekte Lösung bezeichnet werden. Daher war ein neues Verfahren, welches dieses Problem leicht löst und eine Bestimmung in Gegenwart eines unlöslichen Produkts ermöglicht, dringend erwünscht.
Das Verfahren zum Messen eines Analyten unter Verwendung eines Reaktionssystems, bei dem, wie zuvor beschrieben, Wasserstoffperoxid gebildet wird, ist ein bedeutendes Bestimmungsverfahren, da es viele Reaktionen gibt, die bei Oxidation Wasserstoffperoxid als Substanz bilden. Eine exakte Bestimmung war jedoch in den Verfahren des Standes der Technik aus folgenden Gründen nicht immer einfach. D. h., in diesen Messverfahren muss die Menge oder Konzentration einer nachweisbaren Substanz wie einer Farbstoffverbindung in einigen Fällen eine quantitative Korrelation mit einer speziellen Substanz wie Wasserstoffperoxid aufweisen. Ein Oxidations-Reduktions-System in der Kolorimetrie wird jedoch durch die starke oxidierende Aktivität von überschüssigem Wasserstoffperoxid oder die starke reduzierende Aktivität von Ascorbinsäure oder dergleichen, die in einer biologischen Probe enthalten sind, beeinträchtigt und die obige nachweisbare Substanz wie beispielsweise eine Farbstoffverbindung zersetzt sich, wodurch ein Messfehler hervorgerufen werden kann.
Wenn in diesen Messverfahren beispielsweise mittels einer Oxidase wie Glukoseoxidase aus einem Analyten wie Glukose eine überschüssige Menge an Wasserstoffperoxid temporär gebildet wird, findet zusätzlich zu einer Reaktion zwischen einem Farbstoffvorläufer und Wasserstoffperoxid zwischen dem gebildeten Farbstoff und Wasserstoffperoxid eine Reaktion statt. Folglich wird der gebildete Farbstoff durch Wasserstoffperoxid zersetzt, sobald er gebildet worden ist und verfärbt sich.
Wenn ein Enzym wie Peroxidase zum Erzeugen aktiver Sauerstoffspezies, wie eines Superoxids, das eine hohe Reaktivität aufweist, aus Wasserstoffperoxid oder Übergangsmetallionen und einem Komplex davon, die eine ähnliche Funktion ausüben, in einer Probe vorliegen, reagieren die aktiven Sauerstoffspezies mit dem gebildeten Farbstoff, zersetzen und verfärben ihn. Diese Interferenz hat die Messung nachteilig beeinflusst. Wenn eine Reaktion durchgeführt wird, die eine nachweisbare Substanz wie beispielsweise einen Farbstoff bildet, während er der Luft ausgesetzt ist, kann der gebildete Farbstoff durch den in der Luft enthaltenen Sauerstoff oder in einer Reaktionslösung gelösten Sauerstoff oxidiert, zersetzt und verfärbt werden.
Es sind daher verschiedene Anstrengungen unternommen worden, wie beispielsweise eine Farbstoffvorstufe zu suchen, die eine stabile Substanz bereit stellt, die kaum zersetzt wird, sowie die Zugabe verschiedener Stabilisatoren, aber diese sind noch unbefriedigend.
Reduzierende Substanzen wie Ascorbinsäure, Harnsäure und Bilirubin, die in einer biologischen Probe enthalten sind, weisen auf eine Oxidations-Reduktions-Reaktion großen Einfluss auf. Insbesondere wie ein Analyt in Gegenwart von Ascorbinsäure genau gemessen werden kann, war lange Zeit ein bedeutendes Thema auf dem Gebiet der klinischen Analyse. Verschiedene Mittel zur Unterdrückung der Interferenz wie selektive Zersetzung eines Enzyms, Zersetzung durch Zugabe von Periodsäure, Oxidationszersetzung mit Eisen-Ethylen-Diamin-Tetraacetat-Chelat und selektive Abtrennung mit einer semipermeablen Membran sind zusätzlich zu der Suche nach dem zuvor beschriebenen Farbstoffvorläufer und dergleichen untersucht worden (s. Yoshihide Ohta, Yutaka Ogawa, Rinsho Kensa, 34(4), 502–504 (1990); Japanische Patentveröffentlichung Nr. 1–41223 (1989); Japanische Patentveröffentlichung Nr. 2–4861 (1990); Japanische Patent-Veröffentlichung Nr. 4–18630 (1992); Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 5–95797 (1993) und Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 7–155196 (1995)).
Es gibt weitere Verfahren zum Messen eines spezifischen Analyten durch Bildung eines Farbstoffs (z. B. eines Azofarbstoffs), die eine quantitative Beziehung mit dem spezifischen Analyten aufweisen, durch andere bekannte Reaktionen als die Oxidations-Reduktions-Reaktion (z. B. Kondensationsreaktionen wie eine Säure-Base-Reaktion und die Kopplungsreaktion eines Diazoniumsalzes, eine Komplexbildungsreaktion und dergleichen) und optisches Bestimmen des gebildeten Farbstoffs. Diese Verfahren sind wichtige Messverfahren, die beispielsweise ausführlich beschrieben werden in Bunseki Kagaku Binran (herausgegeben von der Japanischen Gesellschaft für analytische Chemie). Jedoch können einige der derart gebildeten Farbstoffe eine instabile Verbindung sein, die durch Sauerstoff in der Atmosphäre, eine in einer Probe enthaltene oxidierende oder reduzierende Substanz, in der Probe enthaltene Wasserstoffionen oder Basen, Licht oder dergleichen zersetzt werden. Um diese Substanz zu messen, ist beispielsweise ein rasches Arbeiten erforderlich oder der Vorgang muss in einer durch Stickstoff ersetzten Atmosphäre oder in von Licht abgeschirmter Umgebung durchgeführt werden. Sonst kann die Messung fehlerhaft sein.
Verfahren, bei denen ein Elektronenträger (Mediator) verwendet wird, umfassen eines, bei dem ein Analyt mit hoher Empfindlichkeit gemessen wird, indem eine Enzymreaktion für eine vorbestimmte Zeit durchgeführt wird, um den Elektronenträger während dieser Zeit zu oxidieren/reduzieren, wodurch die oxidierte/reduzierte Form des Elektronenträgers akkumuliert wird, und die akkumulierte oxidierte/reduzierte Form des Elektronenträgers nach der vorbestimmten Zeit mit einer Elektrode reduziert/oxidiert wird, wobei eine starke elektrochemische Antwort erzeugt wird. Herkömmlicherweise wurde die akkumulierte oxidierte/reduzierte Form des Elektronenträgers einer Zersetzungsreaktion unterzogen, wie beispielsweise einer Reduktion/Oxidation durch eine reduzierende Substanz oder oxidierende Substanz, die mit der akkumulierten oxidierten/reduzierten Form des Elektronenträgers koexistiert, wodurch die Messung fehlerhaft sein kann.
Wenn die nachweisbare Substanz stabil ist, ohne zersetzt zu werden, ist die quantitative Beziehung zum Zeitpunkt der Messung gewährleistet, und es kann ein besseres S/B-Verhältnis (Verhältnis Signal zu Hintergrund, signal-to-background ratio) durch Zeitintegration durchgeführt werden, wodurch die Genauigkeit der Analyse verbessert werden und die Empfindlichkeit erhöht werden kann. Um ein Reaktionssystem zu entwickeln, das eine nachweisbare Substanz bildet, die stabil ist und auf einfache Weise bestimmt werden kann, sind daher bislang viele Anstrengungen unternommen worden. Verschiedene Reagenzien, die bislang als Reaktionssubstanzen entwickelt worden sind, die eine solche stabile nachweisbare Substanz bilden, sind in vielen Handbüchern, beispielsweise Bunseki Kagaku Binran aufgeführt.
Die Erforschung eines Reaktionssystems, das eine stabile Substanz bildet, erfordert jedoch viel Zeit und Arbeit, und es werden immer noch Anstrengungen unternommen, um nach einem Reaktionssystem zu suchen, das eine nachweisbare Substanz bildet, die immer stabil ist und auf einfache Weise bestimmt werden kann. Selbst bei den derzeit verwendeten Bestimmungsverfahren gibt es viele Fälle, in denen eine instabile Substanz, die durch pH, Feuchtigkeitsgehalt, koexistierende Substanzen wie beispielsweise einer oxidierenden/reduzierenden Substanz, Licht oder dergleichen zersetzt wird, als die nachweisbare Substanz bestimmt werden muss.
Ein analytisches Teststück, das zum Untersuchen und Analysieren einer Komponente, die in einer flüssigen Probe wie beispielsweise Urin enthalten ist, zum Messen eines Analyten verwendet wird, indem eine nachweisbare Substanz wie beispielsweise ein gebildeter Farbstoff gemessen wird, der auf der chemischen Reaktion des in einer Probe enthaltenen Analyten beruht, umfasst im Allgemeinen einen Testbereich, der ein funktioneller Bereich zum Durchführen einer Reihe von analytischen Prozessen ist, wie Absorption, Diffusion, Reaktion, Detektion der flüssigen Probe und dergleichen und einen Auflagebereich, um den Testbereich zu stützen, und weist darüber hinaus je nach Bedarf einen Sensor, eine Vorrichtung zum Ansaugen der Probenlösung und dergleichen auf. Der zuvor genannte Testbereich umfasst Schichten oder Flächen zum Durchführen verschiedener Funktionen. Allgemein gesagt, umfasst der Testbereich einen Probenansaugbereich zum Ansaugen und Einführen der Probe; einen Diffusions- und Infiltrationsbereich, um die Probe in dem Testbereich gleichförmig auszubreiten und eindringen zu lassen; einen Reagenzbereich, der ein Reagenz enthält, das mit dem in der Probe enthaltenen Analyten reagiert; einen Reaktionsbereich, wo eine Reaktion wie beispielsweise eine Nachweisreaktion stattfindet; einen Entwicklungsbereich, um eine in der Probe enthaltene Komponente, einen durch die Nachweisreaktion oder dergleichen durch eine chromatographieartige Funktion wie beispielsweise Ad sorption oder Verteilung gebildeten Farbstoff abzutrennen; einen Zeitkontrollbereich zum Einstellen des Ablaufs einer Reaktion, der eine Zeit nutzt, während der sich die Probe bewegt; einen Haltebereich zum Festhalten oder Entfernen einer in der Probe enthaltenen Komponente, eines gebildeten Farbstoffs oder dergleichen mittels einer Adsorptionsfunktion; einen Nachweisbereich zum Nachweisen eines Farbstoffs oder dergleichen durch Reflexion, Transmission/Absorption oder Fluoreszenz; einen absorbierenden Bereich zum Absorbieren überschüssiger Probenlösung, zugegebener Waschlösung und Entwicklungslösung, um einen Rückfluss und dergleichen zu verhindern.
In einem tatsächlichen Teststück liegen diese Bereiche, die die zuvor beschriebenen Funktionen aufweisen, nicht immer unabhängig voneinander vor. Wie beispielsweise bei Lackmuspapier, bei dem der Nachweisbereich derselbe ist wie der Probenansaugbereich, der Reagenzbereich und der Reaktionsbereich, gibt es Fälle, bei denen ein Bereich multiple Funktionen aufweist.
Beispielsweise gibt es einschichtige und mehrschichtige Teststücke, die eine Diffusionsschichtumfassen, die auch als eine Probenansaugschicht dient, eine Nachweisschicht, die auch als eine Reagenzschicht und Reaktionsschicht dient, oder eine Nachweisschicht unabhängig von einer Reaktionsschicht umfassen, die auch als eine Reagenzschicht dient. Die meisten sind mittels einer adhäsiven Schicht an eine Basis gebunden. Es gibt ein Teststück, das eine Entwicklungsschicht oder eine Halteschicht mit einer Funktion aufweist, um eine störende Komponente zwischen einer Reaktionsschicht und einer Nachweisschicht zu entfernen. Es gibt auch ein Teststück, bei dem eine Diffusionsschicht auch als eine Entwicklungsschicht dient und mit einer Reagenzschicht mittels einer adhäsiven Schicht in Kontakt ist. Wenn ein Nachweis durch Messen der Reflexion durchgeführt wird, kann eine Reflexionsschicht vor oder nach einer Nachweisschicht gebildet werden. Die Probe wird auf die Diffusionsschicht getropft, welche auch als die Probenansaugschicht dient und wird gleichförmig diffundiert, um ein in der Reagenzschicht enthaltenes Reagenz aufzulösen, wodurch eine Reaktion stattfindet. Auf diese Weise wird beispielsweise aus einer Farbstoffvorstufe ein Farbstoff erzeugt. Wenn die Reagenzschicht und die Reaktionsschicht auch als die Nachweisschicht dienen, wird der Farbstoff direkt gemessen. Wenn jedoch eine unabhängige Nachweisschicht bereitgestellt wird, sickert der erzeugte Farbstoff oder dergleichen weiter in die Nachweisschicht ein und dringt weiter vor und wird an diesem Punkt ge messen (s. H. G. Curme et al., Clinical Chemistry, 24(8), 1335–1342 (1978), B. Walter, Analytical Chemistry, 55(4), 498A (1983), Asaji Kondo, Bunseki, 1984 (7), 534, Asaji Kondo, Bunseki, 1986 (6), 387, Bunseki Kagaku Binran, S. 8 (herausgegeben von der Japanischen Gesellschaft für analytische Chemie: vierte überarbeitete Ausgabe, Maruzen (1991) und Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 6–213886 (1994) (Masao Kitajima et al.)).
Es gibt auch ein Teststück, das einen Infiltrationsbereich einer Entwicklungslösung an einem Ende des Teststücks auf einem kleinen Stück Filterpapier umfasst; einen Probenansaugbereich, der dem Infiltrationsbereich benachbart ist; einen Reaktionsbereich, der auch als ein Reagenzbereich dient (der ein daran immobilisiertes Enzym aufweist) und zwar nahe des Zentrums des Teststücks; und einen Nachweisbereich, der auch als ein Reagenzbereich dient (der daran immobilisiert eine Farbstoffvorstufe oder dergleichen aufweist); einen Reaktionsbereich und einen Haltebereich nach dem Reaktionsbereich und die flächige Bewegung der Probe ausnutzt oder dergleichen. In diesem Fall sickert, nachdem die Probe auf den Probenansaugbereich getropft ist, die Entwicklungslösung von dem Ende des Teststücks ein, wobei die Probe durch eine Kapillarwirkung bewegt wird, die Probe mit dem Enzym in dem Reaktionsbereich reagiert, der auch als der erste Reagenzbereich dient (der das daran immobilisierte Enzym aufweist), wobei Wasserstoffperoxid erzeugt wird, das darin durch die Entwicklungslösung wandert, wobei die Farbstoffvorstufe oder dergleichen in dem Nachweisbereich gefärbt wird, der auch als der zweite Reagenzbereich (an den der die Farbstoffvorstufe oder dergleichen immobilisiert ist), der Reaktionsbereich und der Haltebereich dient, und den erzeugten Farbstoff oder dergleichen adsorbiert und hält (nachweisbare Substanz). Da das Wasserstoffperoxid entlang der Bewegung der Entwicklungslösung wandert und entlang der Bewegung eine Färbereaktion stattfindet, wird die Länge der Verfärbung größer, wenn die Menge des Analyten ansteigt, wodurch die Substanz gemessen werden kann (s. M. P. Allen et al., Clinical Chemistry, 36(9), 1591–1597 (1990), D. Noble, Analytical Chemistry, 65(23), 1037A (1993)).
Dieses Teststück wird in einem Urintest, einem biochemischen Test, einem Immunochromatographietest und dergleichen verwendet. In einem Beispiel für ein Teststück für Immunochromatographie ist, wenn ein Ende des Filterpapiers, das einen daran immobilisierten Antikörper aufweist (man kann sagen, dass die gesamte Oberfläche davon als ein Reagenzbereich, ein Reaktionsbereich, ein Entwicklungsbereich, ein Haltebe reich und ein Nachweisbereich dient), in eine Entwicklungslösung eingetaucht wird, die durch Mischen einer Probe hergestellt wird, die ein Antigen (Analyt) und ein enzymverknüpftes Antigen als ein Reagenz enthält, um eine Farbentwicklungslösung zu entwickeln, die ein zweites Reagenz ist (und eine Farbstoffvorstufe enthält), ein Bereich, der das enzymverknüpfte Antigen enthält, das entwickelt und festgehalten worden ist, wie ein Gürtel gefärbt. Die Länge des gefärbten Gürtels ist proportional zur Menge des in der Probe enthaltenen Antigens (s. R. F. Zuk et al., Clinical Chemistry, 31(7), 1144–1150 (1985)).
Als weiteres Beispiel für ein Teststück für die Immunochromatographie gibt es ein Teststück, das einen Reagenzbereich (erster Antikörper-immobilisierter gefärbter Latex), der an einem Ende eines kleinen Stückes eines Membranfilters auch als ein Probenansaugbereich dient, einen Reagenzbereich (zweiter Antikörper, der dasselbe Antigen erkennt wie der erste Antikörper, jedoch ein unterschiedliches Epitop aufweist), der auch als ein Entwicklungsbereich nahe der Mitte dient, einen Entwicklungsbereich und darüber hinaus einen Nachweisbereich, der auch als ein Reagenzbereich dient (anti-first antibody antibody) und einen Haltebereich umfasst. Wenn eine Probe auf den Probenansaugbereich getropft wird, findet eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen einem Antigen (Analyt) und dem ersten Antikörper statt, ein Immunokomplex bewegt sich direkt entlang mit der Bewegung der Probe und eine Sandwichreaktion zwischen dem Immunokomplex und dem zweiten Antikörper findet in dem Reagenzbereich statt, der auch als ein Entwicklungsbereich dient. Ein Überschuss des ersten Antikörpers, der keinen Immunkomplex bildet, tritt jedoch durch den Entwicklungsbereich entlang der Bewegung der Probe hindurch und wird im Nachweisbereich, welcher auch als Reagenzbereich dient (anti-first antibody antibody) und dem Haltebereich festgehalten. Der Analyt kann bestimmt werden, indem die Färbung des gefärbten Latex bestimmt wird (der einen Farbstoff als eine nachweisbare Substanz enthält), an dem der erste Antikörper immobilisiert ist (s. I. W. Davidson, Analytical Proceedings, 29, 459 (1992)).
In den obigen Teststücken weist jedoch ein Farbstoff oder dergleichen, der durch eine Reaktion mit einer zu analysierenden Komponente erzeugt worden ist, in einer Probenlösung, Reaktionslösung oder dergleichen Löslichkeit auf, was in vielen Fällen zu Nachteilen wie der Elution des Farbstoffs oder dergleichen in eine Probenlösung, ein Rückfließen in die Diffusionsschicht und die Adhäsion des Farbstoffs oder dergleichen an den gegenüber liegenden Testbereich in Mehrzwecktestpapieren, die eine Vielzahl von Testbereichen aufweisen, führt. Aufgrund der Bewegung des Farbstoffs oder dergleichen hin zum Ende bzw. der Kante des Testbereichs durch Trocknen entstehen Phänomene wie das, dass die Konzentration eines mittleren Bereichs niedrig wird und diejenige eines peripheren Bereichs hoch wird.
Ein solches störendes Phänomen, das die Messempfindlichkeit, die Präzision und die Genauigkeit verschlechtert, ist insbesondere bei Urintestpapieren oder dergleichen festzustellen, die zur Messung in eine Probenlösung eingetaucht werden, ist jedoch ungeachtet des Probentyps recht häufig.
Inzwischen ist ein Verfahren vorgeschlagen worden, um die Elution eines Reagenzes zu verhindern, indem ein Testbereich abgedeckt wird (Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 2–38861 (1990)), ein Verfahren, um eine flüssige Verbindung zwischen gegenüberliegenden Testbereichen zu verhindern, bei dem die aus einer porösen Struktur zusammengesetzten Testbereiche (beispielsweise eine poröse Schicht oder ein poröser Film), die ein hohes Absorptionsvermögen aufweisen, eine Probe gleichförmig absorbieren (Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 2–6541 (1990)), ein Verfahren zum Auswählen einer Reaktion zur Bildung eines unlöslichen Farbstoffs, ein Verfahren zum Abfangen eines gebildeten Farbstoffs unter Verwendung eines unlöslichen und hydrophoben Bindemittels (Fixiermittel) (Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 7–181174 (1995)), ein Verfahren zum Erhöhen des Abstands zwischen gegenüberliegenden Testbereichen in dem Mehrzwecktestpapier, ein Verfahren zum Kontrollieren und Einstellen der Eintauchzeit, ein Verfahren zum Kontrollieren der Zeit, so dass die Messung vor der Diffusion ausgeführt wird und dergleichen. Das Abdecken eines Testbereiches oder das Herstellen einer porösen Struktur mittels eines Ausfällungs-Verfestigungsverfahrens macht jedoch den Herstellungsprozess des Testpapiers komplizierter. Wenn eine Reaktion zur Bildung eines unlöslichen Farbstoffs ausgewählt wird, findet eine Produktinhibierung der Enzymaktivität statt. Ein Teststück, das unter Verwendung eines hydrophoben Polymers als einem Bindemittel hergestellt wurde, weist den Nachteil auf, dass das Absorptionsvermögen einer wässerigen Probenlösung sich verschlechtert. Ein Mehrzweckteststück weist den Nachteil auf, dass, wenn der Abstand zwischen benachbarten Testbereichen erhöht wird, eine größere Fläche erforderlich ist oder es für die Bewegung des Sensors nachteilig ist, da ein einzelner Sensor sich durch eine Mehrzahl von Testbereichen bewegt, um reflektiertes Licht zu messen. Die anderen Verfahren weisen entsprechende zu lösende Probleme auf. Bei spielsweise ist das Verfahren zum Kontrollieren der Eintauchzeit in einem Urintest mühsam, das Verfahren zum Kontrollieren der Zeit ist aufgrund der Beziehung zwischen Kontrollzeit und Reaktionszeit nicht einfach. Zufriedenstellende Lösungen für diese Probleme müssen noch gefunden werden.
Ein Verfahren zum Bestimmen eines Analyten aus einer elektrochemischen Antwort zur Zeit der Oxidation-Reduktion unter Verwendung des oben genannten Elektronenträgers (Mediators), ein Verfahren zum Bestimmen von Ionen als einem Analyten durch Messen des Potentials einer Membran auf die Bewegung einer Komplexverbindung, die durch Verwenden eines Liganden (Ionophor) gebildet wurde, der an ein spezielles Ion in einer Flüssigfilmelektrode koordinativ gebunden oder ionisch gebunden ist, und dergleichen sind als bedeutende Messverfahren bekannt. Allgemein gesagt, wird in einer Elektrode, die aus einer oxidierten/reduzierten Form eines Elektronenträgers oder einer Komplexverbindung zusammengesetzt ist, die Elution oder Diffusion des Elektronenträgers oder Liganden verhindert, indem der Elektronenträger oder Ligand an ein unlösliches Polymer addiert wird, und der Elektronenträger oder Ligand nahe der Oberfläche der Elektrode gehalten wird, so dass sich Elektronen zur selben Zeit rasch bewegen können. Da die Bewegung einer Substanz in einem Polymer eingeschränkt ist, wird eine Reaktion zwischen einem in der Probe enthaltenen Analyten oder einer von dem Analyten gebildeten Zwischensubstanz und dem Elektronenträger oder Liganden, die in dem unlöslichen Polymer enthalten sind, unterbrochen. Eine zufriedenstellende Lösung für dieses grundlegende Problem muss jedoch ebenfalls noch gefunden werden.
In der EP-A-0337053 ist die Adsorption von Tyronase mit Bentonit zur Isolierung des Enzyms beschrieben.
Beschreibung der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein hochempfindliches Messverfahren zum Messen eines Analyten bereitzustellen, indem eine nachweisbare Substanz wie beispielsweise ein Farbstoff oder dergleichen, der aufgrund der chemischen Reaktion des Analyten gebildet wird, gemessen wird. Der Begriff „Messung" umfasst sowohl quantitative als auch qualitative Messungen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die Messgenauigkeit verbessert und die Messempfindlichkeit erhöht werden kann, indem die nachweisbare Substanz in dem obigen Verfahren zum Messen des Analyten stabilisiert wird.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Verfahren bereitzustellen, das eine rasche Messung ermöglicht, indem die Reaktionsgeschwindigkeit einer chemischen Reaktion in dem zuvor genannten Messverfahren erhöht wird.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, in dem obigen Verfahren unter Verwendung eines Reaktionssystems, das die Bildungsreaktion einer unlöslichen Substanz umfasst, ein hochempfindliches Messverfahren bereitzustellen Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein analytisches Teststück bereitzustellen, das die Diffusion und Elution eines Farbstoffs oder dergleichen unterdrückt, eine akkurate Prüfung und Analyse ermöglicht und einfach anzuwenden ist.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass die zuvor genannten Probleme gelöst werden können, indem die Bildungsreaktion einer nachweisbaren Substanz in Gegenwart einer anorganischen Schichtverbindung durchgeführt wird, die ausgewählt ist aus Schichttonmineralien und Hydrocalcit und indem eine anorganische Schichtverbindung in einem Testbereich eines Teststücks, beispielsweise einem Nachweisbereich zum Nachweis einer nachweisbaren Substanz, enthalten ist. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis der obigen Ergebnisse erreicht.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Bestimmen eines Analyten bereit, das einen Schritt der Messung einer nachweisbaren Substanz umfasst, indem ein Reaktionssystem verwendet wird, das eine Bildungsreaktion einer nachweisbaren Substanz auf Basis einer chemischen Reaktion des in einer Probe enthaltenen Analyten umfasst, wobei eine anorganische Schichtverbindung zu dem Reaktionssystem zugegeben wird, das die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz enthält. Dieses Verfahren wird im Folgenden als „erfindungsgemäßes Messverfahren" bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch das zuvor genannte Verfahren zum Messen der Substanz bereit, das einen Schritt umfasst, bei dem die anorganische Schichtverbin dung zu dem Reaktionssystem zugegeben wird, um es zu ermöglichen, dass die anorganische Schichtverbindung die nachweisbare Substanz adsorbiert. Dieses Verfahren wird im Folgenden als „erstes erfindungsgemäßes Verfahren" bezeichnet.
In dem ersten erfindungsgemäßen Verfahren wird eine hochempfindliche Messung dadurch möglich, dass es ermöglicht wird, dass die anorganische Schichtverbindung die gebildete nachweisbare Substanz adsorbiert. D. h. zum Beispiel, die nachweisbare Substanz wird an die anorganische Schichtverbindung adsorbiert und setzt sich ab, wodurch die Messempfindlichkeit bei einem optischen oder elektrochemischem Nachweis verbessert wird. In diesem Fall kann die nachweisbare Substanz an die anorganische Schichtverbindung adsorbiert sein und setzt sich als ein kolloidales Agglomerat ab. Es muss jedoch nicht immer agglomeriert sein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch das Verfahren zum Messen des Analyten bereit, wobei die anorganische Schichtverbindung in dem Reaktionssystem vorliegt, um die Zersetzung der nachweisbaren Substanz zu unterdrücken. Dieses Verfahren wird im Folgenden als „zweites erfindungsgemäßes Verfahren" bezeichnet.
In dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren wird, indem die anorganische Schichtverbindung in das Reaktionssystem eingebracht wird, das die zu messende nachweisbare Substanz bildet, ein Komplex zwischen der nachweisbaren Substanz und der anorganischen Schichtverbindung nahezu zur gleichen Zeit gebildet, zu der die nachweisbare Substanz gebildet wird oder bevor sie durch eine ebenfalls vorliegende Substanz zersetzt wird, mit dem Ergebnis, dass die Zersetzung der nachweisbaren Substanz durch die Funktion der koexistierenden Substanz in dem Reaktionssystem unterdrückt werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus das Verfahren zum Messen des Analyten bereit, bei dem die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz in Gegenwart der anorganischen Schichtverbindung durchgeführt wird, um eine Reaktionsgeschwindigkeit der Bildungsreaktion zu erhöhen. Dieses Verfahren wird im Folgenden als „drittes erfindungsgemäßes Verfahren" bezeichnet.
In dem dritten erfindungsgemäßen Verfahren wird, indem die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz in Gegenwart der anorganischen Schichtverbindung durch geführt wird, die Reaktionsgeschwindigkeit der Bildungsreaktion erhöht und eine rasche Messung ermöglicht, wodurch die Messzeit und auch die Zeit, die die Nachweisreaktion für ihre Beendigung benötigt stark verkürzt wird, mit dem Ergebnis, dass die Messgenauigkeit eines Rating-Verfahrens zur Quantitätsbestimmung aus einer Reaktionsgeschwindigkeit verbessert werden kann. Der Grund für einen Anstieg der Geschwindigkeit der Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz ist nicht immer klar, es wird jedoch angenommen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit durch die Adsorption einer Reaktionsstartsubstanz oder einer Reaktionszwischenstufe der Bildungsreaktion an die Oberfläche der anorganischen Schichtverbindung und die Konzentration davon an der Oberfläche erhöht wird.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus das Verfahren zum Messen des Analyten bereit, wobei mindestens eine der Reaktionen, die das Reaktionssystem bilden, die Bildungsreaktion einer in einem Reaktionssolvens unlöslichen Substanz ist. Dieses Verfahren wird im Folgenden als das „vierte erfindungsgemäße Verfahren" bezeichnet.
In dem vierten erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, eine Reaktion rasch ablaufen zu lassen wie ein gleichförmiges System, indem eine anorganische Schichtverbindung vorzugsweise in einem dispergierten Zustand in das Reaktionssystem, das die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz enthält, eingebracht wird, selbst wenn die nachweisbare Substanz oder ein Nebenprodukt der Reaktion in einem Reaktionssolvens unlöslich ist. Es wird angenommen, dass der Grund hierfür ist, dass die gebildete unlösliche nachweisbare Substanz oder das unlösliche Nebenprodukt an die anorganische Schichtverbindung adsorbiert wird und in dem Reaktionssystem zusammen mit der anorganischen Schichtverbindung gleichförmig dispergiert wird. In der vorliegenden Erfindung kann verhindert werden, dass sich die nachweisbare Substanz oder das Nebenprodukt in das Reaktionssystem abtrennt und zum Zeitpunkt des Nachweises schwierig handhabbar wird, indem die nachweisbare Substanz oder das Nebenprodukt, die in einem Solvens unlöslich sind, durch die anorganische Schichtverbindung adsorbiert werden kann.
Fälle, in denen verhindert wurde, dass die nachweisbare Substanz oder das Nebenprodukt zum Zeitpunkt des Nachweises schwierig handzuhaben werden, können die folgenden sein.

(1) In einer Messung, bei der ein optischer Nachweis unter Verwendung eines flüssigen Reagenzes durchgeführt wird, beispielsweise in einer automatischen biochemischen Testvorrichtung vom Batch-Typ, ist es möglich, wenn ein durch eine Reaktion gebildeter Farbstoff in einem Solvens unlöslich ist, zu verhindern, dass sich der Farbstoff abtrennt und an der Wand der Messzelle haftet und einfallendes Licht oder transmittierendes Licht abschirmt und eine Verteilerdüse verschmutzt und Abweichungen im Absorptionskoeffizienten, Streuen oder Abschirmen des Lichts verursacht, indem man den Farbstoff durch die anorganische Schichtverbindung adsorbieren lässt. Es ist somit möglich, zu verhindern, dass die Messung schwierig wird.
(2) Bei einer Messung, bei der ein optischer Nachweis unter Verwendung eines flüssigen Reagenzes durchgeführt wird, ist es, wenn ein unlösliches Nebenprodukt gebildet wird, indem man das Nebenprodukt von der anorganischen Schichtverbindung adsorbieren lässt, gleichfalls möglich zu verhindern, dass das Nebenprodukt an der Wand der Messzelle haftet und einfallendes Licht oder transmittiertes Licht abschirmt und die Verschmutzung einer Verteilerdüse und die Streuung oder Abschirmung von Licht durch Agglomeration verursacht. Somit ist es möglich, zu verhindern, dass eine Messung schwierig wird.
(3) Bei einer Messung, bei der eine Reaktion durchgeführt wird, indem eine zu messende Probe auf ein Teststück aufgetropft wird oder in dieses eindringt und der gebildete Farbstoff optisch nachgewiesen wird, ist es möglich, wenn der gebildete Farbstoff in einem Probensolvens unlöslich ist, zu verhindern, dass sich der Farbstoff ungleichmäßig auf dem Reaktionsbereich oder dem Nachweisbereich des Teststücks niederschlägt und agglomeriert wird, indem man den Farbstoff an die anorganische Schichtverbindung adsorbieren lässt, wodurch eine Verschlechterung der Messgenauigkeit vermieden wird.
(4) Bei einer Elektrodenmessung unter Verwendung eines flüssigen Reagenzes, beispielsweise in einer automatischen biochemischen Testvorrichtung vom Batch-Typ, ist es möglich, wenn ein unlösliches Nebenprodukt gebildet wird, indem man das Nebenprodukt durch die anorganische Schichtverbindung adsorbieren lässt, zu verhindern, dass der unlösliche Niederschlag die Oberfläche der Elektrode bedeckt und eine Verschmutzung der Elektrode und eine geringe elektrochemische Antwort verursacht, wodurch eine Verschlechterung der Messgenauigkeit vermieden wird.

Ein Messverfahren, auf das die vorliegende Erfindung angewendet wird, unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wenn es ein Verfahren zum Messen eines Analyten ist, indem eine nachweisbare Substanz unter Verwendung eines Reaktionssystems gemessen wird, das die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz auf der Basis der chemischen Reaktion des in einer Probe enthaltenen Analyten einschließt. Die nachweisbare Substanz kann natürlich der Analyt sein. Darüber hinaus kann das Verfahren ein Verfahren zur quantitativen Messung eines Analyten sein, indem eine nachweisbare Substanz gemessen wird oder ein Verfahren zur quantitativen Messung eines Analyten sein, indem ein Reaktionssystem verwendet wird, das die Bildungsreaktion einer nachweisbaren Substanz enthält, die eine quantitative Korrelation mit dem Analyten aufweist. Darüber hinaus wird nicht nur der Fall eines Reaktionssystems verwendet, das eine nachweisbare Substanz direkt durch die chemische Reaktion eines Analyten bildet, sondern auch der Fall, bei dem die chemische Reaktion des Analyten und die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz durch eine andere chemische Reaktion indirekt miteinander verbunden sind, eingeschlossen. Von diesen Verfahren wird das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise auf ein Messverfahren angewandt, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, in dem die nachweisbare Substanz ein durch eine Oxidations-Reduktions-Reaktion gebildeter Farbstoff oder Elektronenträger ist, ein Messverfahren, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, bei dem die gebildete nachweisbare Substanz ein Farbstoff wie beispielsweise ein Azo-Farbstoff oder ein Komplex zwischen einem Ionophor und einem Anlayten ist, und dergleichen.
Ein Verfahren zur optischen Messung eines Farbstoffs, der durch eine Oxidations-Reduktions-Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid, das von einer biologischen Komponente mittels einer Oxidation-Enzym-Reaktion gebildet wird, und einem reaktiven farberzeugenden Reagenz quantitativ gebildet wird, wird insbesondere bei der quantitativen Bestimmung einer jeden in der Körperflüssigkeit enthaltenen Komponente bei der klinischen Prüfung, Umweltanalysen und dergleichen verwendet. Durch Anwenden des erfindungsgemäßen Messverfahrens in diesen Analyse- und Nachweisverfahren wird eine hochempfindliche Messung ermöglicht.
Insbesondere bei dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren liegen in einem Oxidations-Reduktions-Reaktionssystem, häufig z. B. eine oxidierende Substanz, eine reduzierende Substanz oder eine Peroxidase-ähnliche Substanz in dem Reaktionssystem als eine Reaktionszwischenstufe oder eine Verunreinigung in einer Probe vor und eine nachweisbare Substanz kann durch die Funktion dieser in dem Reaktionssystem vorliegenden Substanzen zersetzt werden. In diesem Fall ist das zweite erfindungsgemäße Verfahren brauchbar.
Gemäß dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren kann in dem vorstehenden Messverfahren, bei dem eine Oxidations-Reduktions-Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid und einem reaktiven farberzeugenden Reagenz verwendet wird, ein derartiges Problem, dass ein Messfehler durch die Zersetzung und Verfärbung eines Farbstoffs oder dergleichen erfolgt, welche durch die Funktion einer oxidierenden Substanz wie überschüssigem Wasserstoffperoxid oder einer reduzierenden Substanz wie Ascorbinsäure, Harnsäure und Bilirubinsäure, die in den Reaktionssystem vorliegen, überwunden werden.
Das dritte erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, eine Reaktionsstartsubstanz oder eine Reaktionszwischenstufe an der Oberfläche einer anorganischen Schichtverbindung zu adsorbieren, indem die anorganische Schichtverbindung, die eine Kationen-austauschfähigkeit aufweist, zu einem Reaktionssystem zugegeben wird, insbesondere wenn die Startsubstanz oder die Zwischenstufe der Bildungsreaktion einer nachweisbaren Substanz eine kationische Verbindung ist, wodurch die Geschwindigkeit der Bildungsreaktion verbessert werden kann und eine rasche Messung ermöglicht wird. Das dritte erfindungsgemäße Verfahren ist daher für ein Messverfahren brauchbar, bei dem das obige Reaktionssystem verwendet wird.
Das vierte erfindungsgemäße Verfahren unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wenn es ein Verfahren ist, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, das die Bildungsreaktion einer in einem Reaktionssolvens unlöslichen nachweisbaren Substanz oder ein unlösliches Nebenprodukt einschließt.
Das erfindungsgemäße Messverfahren wird in einem Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen eines Analyten, vorzugsweise einer biologischen Komponente in einer Körperflüssigkeit wie Urin und Blut, einer Spurenmenge einer in Nahrung, Medizin oder Umwelt vorliegenden Substanz, einer industriellen chemischen Substanz, oder einer Spurenmenge einer in Abfall enthaltenen Substanz aus einer Probe, die diesen enthält, verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein analytisches Teststück zum Messen eines Analyten bereit, in dem eine nachweisbare Substanz gemessen wird, indem ein Reaktionssystem verwendet wird, das eine Bildungsreaktion einer nachweisbaren Substanz auf der Basis einer chemischen Reaktion des in einer Probe enthaltenen Analyten umfasst, wobei das Teststück mindestens einen Testbereich umfasst, der einen Nachweisbereich zum Nachweis der nachweisbaren Substanz aufweist und zumindest in dem Testbereich eine anorganische Schichtverbindung enthält. Das Teststück wird im Folgenden als „erfindungsgemäßes Teststück" bezeichnet.
Das Teststück der vorliegenden Erfindung kann mindestens einen Testbereich umfassen, der zusammengesetzt ist aus zwei oder mehr Schichten einschließlich einer Nachweisschicht zum Nachweis einer nachweisbaren Substanz als dem Nachweisbereich und zumindest in der Nachweisschicht die anorganische Schichtverbindung enthalten. Das erfindungsgemäße Teststück kann eines sein, in welchem der Testbereich darüber hinaus eine Diffusionsschicht zum Diffundieren einer Probe enthält, so dass die Probe durch die zu diffundierende Diffusionsschicht hindurchtritt und die Nachweisschicht erreicht. Das erfindungsgemäße Teststück kann mindestens einen Testbereich umfassen, der eine Nachweisfläche zum Nachweisen der nachweisbaren Substanz als den Nachweisbereich aufweist und zumindest in der Nachweisfläche die anorganische Schichtverbindung enthalten. Das erfindungsgemäße Teststück kann eines sein, in dem der Testbereich eine Diffusionsfläche zum Diffundieren der Probe aufweist, so dass die Probe durch die zu diffundierende Diffusionsfläche hindurchtritt und die Nachweisfläche erreicht. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Teststück eines sein, in welchem die Nachweisfläche aus mindestens zwei Schichten zusammengesetzt ist, einschließlich einer Nachweisschicht zum Nachweisen der nachweisbaren Substanz. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Teststück eines sein, in dem der Testbereich einen Reaktionsbereich aufweist, in dem der in der Probe enthaltene Analyt mit einem Reagenz reagiert und die nachweisbare Substanz in dem Reaktionsbereich gebildet wird. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Teststück eines sein, in welchem der Nachweisbereich an einer Stelle bereitgestellt wird, welche die Probe erreicht, nachdem die Probe diffundiert ist und durch den Reaktionsbereich hindurchtritt. Das erfindungsgemäße Teststück kann auch eines sein, in welchem die nachweisbare Substanz durch eine Reaktion zwischen dem in der Probe enthaltenen Analyten und einem Reagenz in dem Nachweisbereich gebildet wird.
In dem erfindungsgemäßen Teststück wird in Betracht gezogen, dass ein Farbstoff oder dergleichen, der durch eine Reaktion zwischen einem Analyten und einem Reagenz gebildet wird, an eine anorganische Schichtverbindung adsorbiert wird, indem die anorganische Schichtverbindung in den Testbereich inkludiert wird, mit dem Ergebnis, dass die Diffusion oder Elution des Farbstoffs oder dergleichen durch eine Probenlösung oder eine Reaktionslösung unterdrückt werden kann und eine hochempfindliche und hochgenaue Analyse durchgeführt werden kann.
Das erfindungsgemäße Teststück wird angewandt auf ein Verfahren zum Analysieren einer in einer Flüssigkeit enthaltenen Komponente unter Verwendung einer festen Phase, insbesondere zur Analyse von Glucose, Bilirubin oder dergleichen, die in Urin enthalten sind. Bei der Analyse der in der Flüssigkeit enthaltenen Komponente kann ein Farbstoff oder dergleichen, der durch eine Reaktion zwischen einem Analyten und einem Reagenz gebildet wird, sich ohne Weiteres in einer Probe auflösen, diffundieren und eluieren. Daher ist das erfindungsgemäße Teststück wirksam. Das Reagenz unterliegt keiner besonderen Beschränkung, wenn es eine nachweisbare Reaktion mit einem Analyten verursacht. Vorzugsweise ist es ein Reagenz, das in der Lage ist, eine nachweisbare Substanz, wie beispielsweise eine Farbstoffverbindung, eine oxidierte/reduzierte Form eines Elektronenträgers oder eine Komplexverbindung eines Ionophors und eines Ions durch Reagieren mit dem Analyten zu bilden. Die Bildungsreaktion einer Farbstoffverbindung kann jede Reaktion sein, wenn sie eine optisch nachweisbare Substanz bildet. Es kann eine Reaktion sein, die nicht nur eine Farbentwicklung bewirkt, sondern auch Farbänderungen, Fluoreszenz und Emission. Wenn die gebildete Farbstoffverbindung oder dergleichen wasserlöslich ist, wird sie durch eine Probenlösung, eine Reaktionslösung oder dergleichen häufig verbreitet und eluiert. Daher wird das erfindungsgemäße Teststück besonders bevorzugt bei einem Verfahren angewendet, bei dem ein Reagenz zur Bildung einer solchen wasserlöslichen Farbstoffverbindung gebildet wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt in Beispiel 1 gemessene Absorptionsspektren.
2 zeigt die Eichkurven von in den Beispielen 2 und 3 erhaltenem Wasserstoffperoxid.
3 zeigt eine logarithmische Darstellung der Eichkurven von 2 sowohl in der Ordinatenachse als auch in der Abszissenachse.
4 zeigt den Zeitverlauf des Absorptionsvermögens nach Zugabe von Wasserstoffperoxid in Beispiel 4.
5 zeigt in Beispiel 5 gemessene Absorptionsspektren.
6 zeigt die Eichkurven der in Beispiel 6 enthaltenen Konzentration von Ascorbinsäure.
7 zeigt in Beispiel 7 gemessene Absorptionsspektren (System mit zugefügtem Smektit).
8 zeigt in Beispiel 7 gemessene Absorptionsspektren (System ohne zugefügtem Smektit).
9 zeigt in Beispiel 7 gemessene Absorptionsspektren (System mit zugefügtem Smektit und System ohne zugefügtem Smektit) bei einer Natriumnitritkonzentration von 33 μmol/l.
10 zeigt die in Beispiel 8 erhaltenen Eichkurven der Konzentration von Natriumnitrit.
11 zeigt den Zeitverlauf des Absorptionsvermögens in Versuchen, die in einem POD-Farbentwicklungssystem einen Smektit-Zugabe-Effekt zeigen, durchgeführt in Beispiel 9.
12 zeigt den Zeitverlauf des Absorptionsvermögens in Versuchen, die in einem POD-Farbentwicklungssystem einen Smektit-Zugabe-Effekt zeigen, das Ascorbinsäure enthält, durchgeführt in Beispiel 10.
13 ist eine vergrößerte Ansicht eines Abschnitts von 0 bis 60 Sekunden von 12.
14 zeigt den Zeitverlauf des in Beispiel 11 gemessenen Absorptionsvermögens.
15 zeigt den Zeitverlauf des in Beispiel 12 gemessenen Absorptionsvermögens in einem System, dem kein Smektit zugefügt wurde.
16 zeigt den in Beispiel 12 gemessenen Zeitverlauf des Absorptionsvermögens in einem System, dem Smektit zugefügt wurde.
17 zeigt den in Beispiel 12 gemessenen Zeitverlauf des Absorptionsvermögens in einem System mit Smektit-Zugabe und einem System ohne Smektit-Zugabe, wenn die Konzentration von Natriumnitrit 25,0 μmol/l beträgt.
18 zeigt schematisch den Diffusionszustand eines Farbstoffs auf Smektitimprägniertem Filterpapier in Beispiel 13.
19 zeigt schematisch den Diffusionszustand eines Farbstoffs auf unbehandeltem Filterpapier in Beispiel 13.
20 zeigt schematisch eine Reaktionszelle in Beispiel 15.
21 zeigt schematisch ein Teststück in Beispiel 16.
22 zeigt schematisch ein Teststück in Beispiel 17.
In diesen Figuren ist die Bezugsziffer 1 ein Fall, bei dem Smektit zugegeben wurde, 2 ist ein Fall, bei dem Smektit nicht zugegeben wurde und 3 ist ein Fall, bei dem Smektit zugegeben wurde und Wasserstoffperoxid nicht zugegeben wurde. 4 ist ein Fall, bei dem die Konzentration von salpetriger Säure 33 μmol/l beträgt, 5 ist ein Fall, bei dem die Konzentration von salpetriger Säure 16 μmol/l beträgt, 6 ist ein Fall, bei dem die Konzentration von salpetriger Säure 8 μmol/l beträgt, und 7 ist ein Fall, bei dem die Konzentration von salpetriger Säure 0 μmol/l beträgt. 8 ist Probe Nr. 1, 9 ist Probe Nr. 2, 10 ist Probe Nr. 3, 11 ist Probe Nr. 4, und 12 ist Probe Nr. 5. 13 ist ein Fall, bei dem die Konzentration von Natriumnitrit 50 μmol/l beträgt, 14 ist ein Fall, bei dem die Konzentration von Natriumnitrit 25 μmol/l beträgt, 15 ist ein Fall, bei dem die Konzentration von Natriumnitrit 12,5 μmol/l beträgt, und 16 ist ein Fall, bei dem die Konzentration von Natriumnitrit 6,3 μmol/l beträgt, und 17 ist ein Fall, bei dem die Konzentration von Natriumnitrit 1,6 μmol/l beträgt. 18 ist ein Fleck eines Farbstoffs, 19 ist eine Farbentwicklungslösung, aus der ein Farbstoff entfernt wurde, 20 ist Glas, 21 ist ein Beschichtungsfilm und 22 ist PET. 23 ist mit einem Reagenz imprägniertes Filterpapier (Nachweisschicht), 24 ist doppelt beschichtetes Klebeband (adhäsive Schicht), 25 ist Filterpapier, das mit einer Dispersion einer anorganischen Schichtverbindung imprägniert ist, 26 ist mit einem Reagenz imprägniertes Filterpapier und 27 ist Filterpapier. 28 ist eine Probenansaugfläche, 29 ist eine Diffusionsfläche, 30 ist eine Reaktionsfläche, 31 ist eine Fläche zum Kontrollieren der Reaktionszeit, 32 ist eine Haltefläche und 33 ist eine Fläche zum Absorbieren überschüssiger Probe.
Beste Durchführungsform der Erfindung
1. Erfindungsgemäßes Messverfahren
Das erfindungsgemäße Messverfahren ist ein Verfahren zum Messen eines Analyten, indem eine nachweisbare Substanz gemessen wird, indem ein Reaktionssystem verwendet wird, das die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz auf der Basis der chemischen Reaktion des in einer Probe enthaltenen Analyten umfasst.
1. Nachweisbare Substanz
Das erfindungsgemäß verwendete Reaktionssystem umfasst die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz wie im Folgenden gezeigt wird.
Die nachweisbare Substanz unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wenn sie durch die erfindungsgemäße anorganische Schichtverbindung adsorbiert werden kann. Beispiele für die nachweisbare Substanz, die durch die anorganische Schichtverbindung adsorbiert werden kann, umfassen Amine wie Amin und Polyamin; Imine wie Imin und Polyimin; Polyene; aromatische Verbindungen wie Anilinderivate, Benzochinonderivate und aromatische kondensierte Ringverbindungen; heterozyklische Verbindungen wie Xanten, Azin und Thiazin; Komplexe zwischen Ionen und zyklischen Liganden wie Kronenether und Valinomycin; und dergleichen. Diese Substanzen können ein quaternäres Stickstoffatom, eine phenolische Hydroxylgruppe, Sulfonsäuregruppe oder Carboxylgruppe in dem Molekül enthalten.
Die Substanz, die durch die anorganische Schichtverbindung adsorbiert werden kann, ist beispielsweise ausführlich beschrieben in Kapitel XI „Interaction of Clays and Organic Compounds" von „An Introduction to Clay Colloid Chemistry, Second Edition" verfasst von H. Van Olphen (Krieger Publishment; Malabar). Die Japanische Patentveröffentlichung Nr. 50–8462 (1975) (Tadayoshi Kato) stellt viele adsorbierbare Verbindungen vor. Sie schließen Substanzen mit ein, die durch ein optisches Verfahren und ein elektro-chemisches Verfahren nachgewiesen werden können.
(1) Substanzen, die mittels eines optischen Verfahrens nachgewiesen werden können
Substanzen, die durch ein optisches Verfahren nachgewiesen werden können, schließen Farbstoffe mit ein. Die Farbstoffe schließen fluoreszierende Farbstoffe, lumineszierende Substenzen und dergleichen mit ein. Die Bildungsreaktion des Farbstoffs kann die Bildungsreaktion einer optisch nachweisbaren Substanz, z. B. eine Reaktion, die eine Farbentwicklung, Farbänderung, Fluoreszenz, Lichtemission oder dergleichen bewirkt, sein.
Bevorzugte Farbstoffe umfassen Farbstoffverbindungen, fluoreszierende Substanzen und lumineszierende Substanzen, die aus Farbstoffvorstufen durch verschiedene Farbreaktionen wie einer Oxidations-Reduktions-Reaktion, einer Säure-Base-Reaktion und einer Kondensationsreaktion gebildet werden, Farbstoffkomplexe und fluoreszierende Komplexe, die durch Koordinationsbindung oder Ionenbindung gebildet werden und dergleichen.
Bevorzugte Farbstoffe, die durch eine Oxidations-Reduktions-Reaktion gebildet werden, sind Verbindungen, die ein konjugiertes System wie einen aromatischen Ring aufweisen, wie Farbstoffe, die durch die Oxidationskondensation eines Kupplers wie 4-Amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-on(4-Aminoantipyrin: im Folgenden als 4-AA abgekürzt) und eines Wasserstoffdonors (Trinders Reagenz wie N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin) gebildet werden; durch Oxidation farberzeugende Farbstoffe wie o-Tolidin und Benzidine (wie 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin); Farbstoffe, die durch die Oxidation von Leucosubstanzen wie 2,6-Dichloro-4-[(4-hydroxyphenyl)imino]-2,5-cyclohexadien-1-on gebildet werden; fluoreszierende Substanzen, die durch die Oxidation von 4-Hydroxyphenylacetat gebildet werden; lumineszierende Substanzen wie chemilumineszierende Substanzen und deren angeregte Substanzen; Formazane, die Farbstoffe von Tetrazoliumsalzen reduzieren; Farbstoffe, die durch die Reduktion von 1,1'-Dimethyl-4,4'-bipyridiniumsalzen und dergleichen gebildet werden und dergleichen.
Der Wasserstoffdonor ist eine Verbindung wie beispielsweise Phenol, die einen Chinonfarbstoff bildet, wenn sie mit 4-Amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-on (4-AA) oder 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon durch die Funktion von Peroxidase in Gegenwart von Wasserstoffperoxid kondensiert wird. Beispiele für den Wasserstoffdonor umfassen Dichlorophenol, o-Methoxyphenol, 1,2,3-Trihydroxybenzol, Dimethylanilin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidin, N-Ethyl-N-sulfopropylanilin, N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin, N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-anisidin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)anilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin, N-(2-Hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin, N-(3-Sulfopropyl)anilin und dergleichen.
In einem Verfahren, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, das durch eine Reaktion zwischen dem zuvor genannten 4-AA und einem Wasserstoffdonor in Gegenwart von Wasserstoffperoxid einen Chinonfarbstoff bildet, wird ein Analyt gemessen, indem Wasserstoffperoxid indirekt gemessen wird, indem der gebildete Chinonfarbstoff mit einem Absorptiometer gemessen wird.
o-Tolidin und Benzidine umfassen o-Tolidin, Dianisidin, 3,3'-Diaminobenzidin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, N-(3-Sulfopropyl)-3,3',5,5'-tetramethylbenzidin und dergleichen. Die Leucosubstanz ist ein achromatischer Farbstoffvorläufer, der zu einem Farbstoff wird und Farbe entwickelt, wenn er oxidiert wird. Beispiele für den durch Oxidieren der Leucosubstanz erhaltenen Farbstoff umfassen 2,6-Dichloro-4-[(4-hydroxyphenyl)imino]-2,5-cyclohexadien-1-on, 2,6-Dichloro-4-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl)imino]-2,5-cyclohexadien-1-on, 7-(Diethylamino)-3-imino-8-methyl-3H-phenoxazinsalz, 3-(Diethylamino)-7-amino-5-phenylphenaziniumsalz, 3,7-Bis(dimethylamino)-phenothiazin-5-iumsalz, 1-Hydroxy-5-methylphenaziniumsalz und 7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on-10-oxid. Beispiele für die Leucosubstanz umfassen 4,4'-Benzylidenbis(N,N-dimethylanilin), 4,4'-Bis[N-ethyl-N-(3-sulfopropylamino)-2,6-dimethylphenyl]methan, 1-(Ethylaminothiocarbonyl)-2-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4,5-bis(4-diethylaminophenyl)imidazol, 4,4'-Bis(dimethylamino)diphenylamin, N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)-diphenylaminsalz, 10-(Carboxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino)phenothiazinsalz und dergleichen.
Andere Beispiele für den Farbstoffvorläufer, der Farbe entwickelt, wenn er oxidiert wird, umfassen 4-Methoxyphenol, 4-Ethoxyphenol, 2-Ethoxyphenol, 1-(2-Hydroxy-5-methoxyphenyl)ethanon, 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure, 2-Hydroxy-5-methoxybenzaldehyd, 2-Hydroxy-5-methoxymethoxybenzoesäure, 4-Methoxy-2-nitrophenol, 2-Chloro-4-methoxyphenol, 4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyd, 4-Hydroxy-3-methoxybenzoesäure und dergleichen.
3-(4-Hydroxyphenyl)-2-propensäure, 2-Hydroxyphenylessigsäure, 3-Hydroxyphenylessigsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, 3-Hydroxybenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, 2-Aminobenzoesäure, 3-Aminobenzoesäure, 4-Aminobenzoesäure, 3,4-Diaminobenzoesäure, 3,5-Diaminobenzoesäure, 4-Amino-2-chlorobenzoesäure, 4-Amino-3-methylbenzoesäure, 4-Amino-3-methoxybenzoesäure, 4-Aminophthalsäure und dergleichen sind darüber hinaus in obigen Beispielen enthalten.
2,4-Diamino-6-hydroxypyrimidin, 4,5-Diamino-6-hydroxypyrimidin, 4-Amino-2,6-dihydroxypyrimidin, 6-Hydroxy-2,4,5-triaminopyrimidin, 4,5-Diamino-2,6-dihydroxypyrimidin, 4-Amino-6-hydroxy-2-methylpyrimidin, 4-Amino-6-hydroxypyrimidin, 4-Amino-6-hydroxy-2-methoxypyrimidin und dergleichen sind ebenfalls enthalten.
Fluoreszierende Substanzen können durch Oxidation von 4-Hydroxyphenylessigsäure und dergleichen gebildet werden. Beispiele dafür umfassen fluoreszierende Substanzen, die durch Oxidation von 4-Hydroxyphenylessigsäure, (4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)essigsäure, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure, 4-Hydroxy-2(-aminoethyl)phenol, 4-Hydroxy-N,N,N-trimethylbenzolmetaminium, α-Amino-p-hydroxyhydrozimtsäure, 4-Hydroxyphenethylamin, N-(4-Hydroxyphenyl)acetoanilid, 2,7-Dichlorofluoresceindiacetat und dergleichen gebildet werden.
Lumineszierende Substanzen wie beispielsweise chemilumineszierende Substanzen umfassen Leuchtkäfer-Luciferin, Cypridina-Luciferin, Aequorin, Lucigenin-Derivate, Luminolderivate, Acridiniumester, Peroxalsäureester und dergleichen.
Beispielsweise wird in dem obigen Verfahren, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, bei dem die Benzidin- oder Leucosubstanz in Gegenwart von Wasserstoffperoxid oxidiert wird und Farbe entwickelt, ein Analyt gemessen, indem Wasserstoffperoxid indirekt gemessen wird, indem der gebildete Farbstoff mit einem Absorptiometer gemessen wird.
In dem obigen Verfahren, in dem ein Reaktionssystem verwendet wird, in dem eine fluoreszierende Substanz oder eine lumineszierende Substanz gebildet wird, wird ein Analyt gemessen, indem Wasserstoffperoxid indirekt mit einem Fluorophotometer oder einem Luminophotometer gemessen wird.
In der Oxidationsreaktion, die einen Farbstoff bildet, ist ein Oxidationsmittel, das für die Oxidationsreaktion verwendet wird, nicht auf Wasserstoffperoxid beschränkt, sondern es können verschiedene bekannte Oxidationsmittel verwendet werden. Ein Oxidationsenzym wie Peroxidase kann zugegeben werden. Vor der Oxidationsreaktion, die einen Farbstoff bildet, kann eine Reaktion zur Bildung des Oxidationsmittels stattfinden.
Die Tetrazoliumsalze umfassen 2,3,5-Triphenyltetrazoliumsalz, 2,5-Diphenyl-3-(1-naphthyl)-2H-tetrazoliumsalz, 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium]salz, 3,3'-[3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazolium)salz, 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumsalz, 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumsalz, 2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumsalz, 3,3'-(1,1'-Biphenyl-4,4'-diyl)-bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumsalz, 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumsalz und dergleichen.
Die durch Reduktion gebildeten Farbstoffe umfassen reduzierte Formen von 1,1'-Dimethyl-4,4'-bipyridiniumsalz, 1,1'-Dibenzyl-4,4'-bipyridiniumsalz und dergleichen. Fluoreszierende Substanzen können durch Reduktion von 7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on-10-oxid und dergleichen gebildet werden. Beispiele dafür umfassen fluoreszie rende Substanzen, die durch Reduktion von 7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on-10-oxid, 5-Cyano-2,3-bis(4-methylphenyl)-2H-tetrazoliumsalz, 2,3-Bis(4-cyanophenyl)-5-cyano-2H-tetrazoliumsalz und dergleichen gebildet werden.
In dem obigen Verfahren, bei dem ein Reduktionssystem verwendet wird, bei dem ein Tetrazoliumsalz oder die Leucosubstanz in Gegenwart eines Reduktionsmittels reduziert wird und Farbe entwickelt, wird beispielsweise ein Analyt gemessen, indem das Reduktionsmittel indirekt gemessen wird, indem der gebildete Farbstoff mit einem Colorimeter oder Fluorophotometer gemessen wird. Vor der Reduktionsreaktion, die einen Farbstoff bildet, kann eine Reaktion zur Bildung eines Reduktionsmittels stattfinden.
In der obigen Reduktionsreaktion, bei der ein Farbstoff gebildet wird, wird Nicotinamidadenindinucleotid oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat vorzugsweise als das für die Reduktionsreaktion verwendete Reduktionsmittel verwendet. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese beschränkt, sondern es können verschiedene bekannte Reduktionsmittel verwendet werden.
Farbstoffe, die durch eine Säure-Base-Reaktion gebildet werden, umfassen Verbindungen, die Farbe entwickeln oder ihre Farben durch pH-Änderungen ändern, wie beispielsweise Bromocresol Grün. Die Verbindungen umfassen Sulfonphthalein-Farbstoffe wie Bromophenol Blau, Phenol Rot, Bromopyrogallol Rot und Pyrogallol Rot; Triphenylmethan-Farbstoffe wie Malachit Grün und Rosolsäure; Chinolin-Farbstoffe wie Chinaldin Rot, N-(p-Hydroxyphenyl)-2,6-dichloro-p-benzochinonimin; Oxazon-Farbstoffe wie 7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on-10-oxid; Cumarin-Farbstoffe wie 6,7-Dihydroxy-4-methylcumarin; leitende Polymerverbindungen wie Anilinoligomer und dergleichen, zusätzlich zu Bromocresol Grün.
Wird in dem Verfahren, in dem ein Reaktionssystem verwendet wird, in dem eine Verbindung, die Farbe oder Farbänderungen durch pH-Änderungen entwickelt, ihre Farbe oder Farbänderungen durch eine Säure oder eine Base entwickelt, wird beispielsweise ein Analyt gemessen, indem eine Säure oder Base indirekt gemessen wird, indem der gebildete Farbstoff mit einem Absorptiometer gemessen wird. In dem Verfahren, in dem ein Reaktionssystem verwendet wird, in dem eine Verbindung verwendet wird, die Farbe oder Farbänderungen durch pH-Änderungen entwickelt, Farbe oder ihre Farbänderungen durch Wasserstoffionen entwickelt, wird ein Analyt gemessen, indem die Konzentration von Wasserstoffionen gemessen wird, indem der gebildete Farbstoff mit einem Absorptiometer gemessen wird.
Andere Farbstoffe, die durch verschiedene als Färbereaktionen und dergleichen bekannnte Reaktionen gebildet werden, umfassen Azofarbstoffe, die durch die Kupplung eines Diazoniumsalzes wie beispielsweise 2-Methoxy-4-morpholinobenzoldiazoniumsalz gebildet werden; Farbstoffe, die durch verschiedene bekannte Färbereaktionen wie beispielsweise einer Reaktion zwischen Aldehyd und 2,3-Dimethyl-2,3-bis(hydroxyamino)butan gebildet werden; fluoreszierende Substanzen, die durch verschiedene bekannte Reaktionen wie beispielsweise einer Reaktion zwischen Histamin und o-Phthalaldehyd gebildet werden; und Farbstoffe und fluoreszierende Substanzen, die durch die Reaktion eines Enzymsubstrats wie beispielsweise 4-Methylumbelliferylphosphat mittels eines Enzyms gebildet werden.
Die durch die Kupplung eines Diazoniumsalzes gebildeten Azofarbstoffe umfassen Azofarbstoffe, die durch Kupplung zwischen Indoxyl und 2-Methoxy-4-morpholinobenzoldiazoniumsalz gebildet werden, Azofarbstoffe, die durch Kupplung zwischen Urobilinogen und 3,3'-Dimethoxybiphenyl-4,4'-diazoniumsalz gebildet werden, einen Azofarbstoff, der durch eine Reaktion zwischen 4-Aminobenzolarsonsäure und N-1-Naphthylethylendiamin in Gegenwart eines Nitrits gebildet wird, einen Azofarbstoff, der durch eine Reaktion zwischen 2,4-Dichloroanilin und N,N-Diethyl-N'-1-naphthylnaphthylethylendiaminoxalat in Gegenwart eines Nitrits gebildet wird und dergleichen.
In den obigen Verfahren, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, bei dem ein Azofarbstoff gebildet wird, wird ein Analyt (Indoxyl, Urobilinogen und Nitrit in den obigen Beispielen) als Startsubstanz einer Reaktion gemessen, indem der gebildete Farbstoff mit einem Absorptiometer oder dergleichen gemessen wird. Die Bildungsreaktion eines Azofarbstoffs ist nicht auf die obigen Beispiele beschränkt, sondern es sind verschiedene bekannte Bildungsreaktionen von Azofarbstoffen zur Anwendung geeignet.
Farbstoffe, die durch verschiedene bekannte Färbereaktionen gebildet werden, umfassen Farbstoffe, die durch die folgenden bekannten Färbereaktionen gebildet werden, jedoch ist die vorliegende Erfindung selbstverständlich nicht auf diese beschränkt. Die Färbereaktionen umfassen eine Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid und 1,4- Diaminobenzol zum Nachweis von Aldehyd, die Reaktion von 2,3-Dimethyl-2,3-bis(hydroxyamino)butan zum Nachweis von Aldehyd, eine Reaktion zwischen 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon und einem Oxidationsmittel zum Nachweis von Aldehyd, eine Reaktion zwischen 10H-Phenothiazin und Bromin zum Nachweis eines sekundären Amins, die Reaktion von 2,2'-Dithiodipyridin zum Nachweis von Thiol und dergleichen.
In dem obigen Verfahren, bei dem eine bekannte Färbereaktion verwendet wird, wird ein Analyt (Aldehyd, sekundäres Amin und Thiol in den obigen Beispielen) als die Startsubstanz der Reaktion gemessen, indem der gebildete Farbstoff mit einem Absorptiometer oder dergleichen gemessen wird. Die bekannte eingesetzte Färbereaktion ist selbstverständlich nicht auf die obigen Beispiele beschränkt.
Fluoreszierende Substanzen, die durch verschiedene bekannte Reaktionen gebildet werden, umfassen fluoreszierende Substanzen, die durch bekannte Nachweisreaktionen gebildet werden, die unter Verwendung der folgenden Reagenzien durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung ist jedoch selbstverständlich nicht auf diese beschränkt. Die in den Nachweisreaktionen verwendeten Reagenzien, die fluoreszierende Substanzen bilden, umfassen 2-Hydroxy-1,2-diphenylethanon zum Nachweis einer Guanidino-Verbindung, o-Phthalaldehyd zum Nachweis von Histamin, o-Phthalaldehyd zum Nachweis von Spermidin, 1,2-Diamino-4,5-dimethoxybenzol zum Nachweis von α-Ketosäure und dergleichen.
In dem obigen Verfahren, bei dem eine bekannte Nachweisreaktion verwendet wird, wird ein Analyt (Guanidino-Verbindung, Histamin, Spermidin und α-Ketosäure in den obigen Beispielen) als die Startsubstanz einer Reaktion gemessen, indem die gebildeten fluoreszierenden Substanzen mit einem Fluorophotometer oder dergleichen gemessen werden. Die bekannte einsetzbare Nachweisreaktion ist selbstverständlich nicht auf die obigen Beispiele beschränkt.
Enzymsubstrate, die Farbstoffe und fluoreszierende Substanzen bilden, wenn sie in Gegenwart von Enzymen reagieren, umfassen N-Tosyl-L-phenylalanin-2-amidoacridon als das Substrat für Chymotrypsin, L-Alanin-2-amidoacridon als das Substrat für Aminopeptidase, 7-Acetoxy-N-methylchinoliniumsalz zum Bestimmen von Esterase, 7-Acetoxy-3H-phenoxazin-3-on als das Substrat für Esterase, 4-Methylumbelliferylphosphat als das Substrat für Phosphatase, 5,10,15,20-Tetrakis(4-phosphonooxyphenyl)porphin als das Substrat von Phosphatase und dergleichen. Die vorliegende Erfindung ist selbstverständlich nicht auf diese beschränkt.
Wenn beispielsweise in dem obigen Verfahren, bei dem eine Reaktion verwendet wird, bei der ein Enzymsubstrat durch ein Enzym zersetzt wird, wird ein Analyt gemessen, indem ein Enzym indirekt gemessen wird, indem der gebildete Farbstoff oder die fluoreszierende Substanz mit einem Absorptiometer oder einem Fluorophotometer gemessen wird. Das Enzym oder das Enzymsubstrat kann beispielsweise an einen Antikörper oder ein Fragment davon chemisch gebunden sein.
Farbstoffkomplexe und fluoreszierende Komplexe, die durch Koordinationsbindungen und Ionenbindungen gebildet werden, umfassen Verbindungen, die Farbe entwickeln oder ihre Farben ändern, wie beispielsweise Farbstoffe und fluoreszierende Substanzen, die hergestellt werden, indem mittels Ionenbindung oder Koordinationsbindung zwischen einem Metallion oder einem Anion und einer Verbindung wie beispielsweise einem Liganden Komplexe gebildet werden. Die Verbindungen, die Farbe entwickeln oder ihre Farben ändern und mit einem Metallion Komplexe bilden, umfassen Verbindungen, die als Metallindikatoren und Chromoionophoren bekannt sind und Verbindungen, die durch Komplexbildung mit einem farbigen Übergangsmetallion gefärbt werden. Die Verbindungen umfassen insbesondere Ethylendiamintetraessigsäure, 2,2-Bipyridin, 1-Hydroxy-2-(2-hydroxyphenylazo)benzol, Dibenzo-18-krone-6, Dicyclohexyl-18-krone-6, cyclische Polyamine, Calix[4]aren, 3-[N,N-Bis(carboxymethyl)aminomethyl]-1,2-dihydroxyanthrachinon, 5',5''-Dibromopyrogallolsulfonphthalein, 2-Hydroxy-1-(1-hydroxy-2-naphthylazo)-6-nitro-4-naphthalinsulfonat, 2,6-Dichloro-4'-hydroxy-3,3''-dimethylfuchson-5',5''-dicarboxylat, 3,3'-Bis[N,N-bis-(carboxymethyl)aminomethyl]fluoreszein, 8-[N,N-Bis(carboxymethyl)aminomethyl]-4-methylumbelliferon, 2,7-Bis(2-arsonophenylazo)-1,8-dihydroxy-3,6-naphthalindisulfonsäure, 5-Chloro-2-hydroxy-3-(2,4-dihydroxyphenylazo)benzolsulfonsäure, 5-[(Hexahydro-2,4,6-trioxo-5-pyrimidinyl)imino]-2,4,6-(1H,3H,5H)-pyrimidintrionsalz, 2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-[N-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]anilinsalz, 1,8-Dihydroxy-2-(2-pyridylazo)-3,6-naphthalindisulfonat, 2-Nitroso-5-[N-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol und dergleichen.
Verbindungen, die mit einwertigen Kationen farbige Komplexe bilden, umfassen insbesondere Tetrakis[3,5-bis-(trifluoromethyl)phenyl]-boratsalz, Tetraphenylphosphoniumsalz und dergleichen.
Verbindungen, die mit Calciumionen fluoreszierende Komplexe bilden, umfassen insbesondere 1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraacetat, 1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure-pentaacetoxymethylester, 1-[6-Amino-2-(5-carboxy-2-oxazoyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy]ethan-N,N,N',N'-tetraacetat, 1-[6-Amino-2-(5-carboxy-2-oxazoyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure-pentaacetoxymethylester, 1-[2-Amino-5-(6-carboxy-2-indolyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraacetat, 1-[2-Amino-5-(6-carboxy-2-indolyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure-pentaacetoxymethylester, 8-Amino-2-[(2-amino-5-methylphenoxy)methyl]-6-methoxychinolin-N,N,N',N'-tetraacetat, 8-Amino-2-[(2-amino-5-methylphenoxy)methyl]-6-methoxychinolin-N,N,N',N'-tetraessigsäure-pentaacetoxymethylester, 3,3'-Bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluoreszein, 8-[N,N-Bis(carboxymethyl)aminomethyl]-4-methylumbelliferon und dergleichen.
Ein Tetraphenylarsoniumsalz, das mit einem Anion einen farbigen Komplex bildet, ist darüber hinaus N-Ethoxycarbonylmethyl-6-methoxychinoliniumbromid, dessen Fluoreszenzintensität vermindert wird, wenn es mit einem Chloridion einen Komplex bildet, 8-Hydroxy-1-(salicylidenamino)-3,6-naphthalindisulfonat, das mit Bor einen Komplex bildet und dergleichen, sind ebenfalls mit umfasst.
In dem vorstehenden Verfahren, bei dem die Bildungsreaktion eines Komplexes verwendet wird, wird ein Analyt (in meisten Fällen Ionen) gemessen, indem die Menge eines Farbstoffs oder einer fluoreszierenden Substanz, die durch ein Ion und einen Liganden gebildet wird, mit einem Absorptiometer oder einem Fluorophotometer gemessen wird.
(2) Elektrochemisch nachweisbare Substanzen
Im Folgenden werden elektrochemisch nachweisbare Substanzen beschrieben.
Substanzen, die mittels elektrochemischer Verfahren nachgewiesen werden können, umfassen Elektronenträger (Mediatoren) und Komplexe zwischen Ionophoren und Ionen.
Ein Elektronenträger ist eine chemische Substanz, die einen Analyten mit einem Enzym oder dergleichen oxidiert/reduziert und gleichzeitig von dem Analyten Elektronen direkt erhält bzw. an diesen abgibt. Der Analyt kann aus der elektrochemischen Antwort bestimmt werden, wenn die oxidierte/reduzierte Form des Elektronenträgers mittels einer Elektrode oxidiert/reduziert wird. Der Elektronenträger braucht Elektronen nicht direkt von dem Analyten zu erhalten bzw. an diesen abgeben und kann eine chemische Substanz sein, welche den Analyten mit einem Enzym oder dergleichen oxidiert/reduziert und gleichzeitig Elektronen direkt von dem Analyten erhält bzw. an diesen abgibt. Der Analyt wird aus der elektrochemischen Antwort bestimmt, wenn die oxidierte/reduzierte Form des Elektronenträgers, die eine quantitative Beziehung zu dem Analyten aufweist, mittels eine Elektrode reduziert/oxidiert wird.
Der Elektronenträger wird vorzugsweise durch ein Potential oxidiert/reduziert, das in einem Bereich liegt, der durch die verwendete Elektrode gemessen werden kann (im Allgemeinen –1,2 V bis +1,0 V im Fall einer Kohlenstoffelektrode). Beispiele für den Elektronenträger sind 1,1'-Dimethyl-4,4'-bipyridiniumsalz, 1,1'-Dibenzyl-4,4'-bipyridiniumsalz, 1,4-Diaminobenzol, 2-Methyl-1,4-naphthochinon, N-Methylphenaziniumsalz, 1-Hydroxy-5-methylphenaziniumsalz, 1-Methoxy-5-methylphenaziniumsalz, 9-Dimethylaminobenzo-α-phenoxazin-7-iumsalz, Ferrocen-Derivate, Hexacyano-Eisen(II)-Salz, 7-Hydroxy-3N-phenoxazin-3-on-10-oxid, 3,7-Diamino-5-phenylphenaziniumsalz, 3-(Diethylamino)-7-amino-5-phenylphenaziniumsalz, 1,4-Benzoldiol, 1,4-Dihydroxy-2,3,5-trimethylbenzol, N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-benzoldiamin, Δ2,2'-Bi-1,3-dithiol, 2,6-Dimethylbenzochinon, 2,5-Dimethylbenzochinon, 2,3,5,6-Tetramethyl-2,5-cyclohexadien-1,4-dion, 2,6-Dichloro-4-[(4-hydroxyphenyl)imino]-2,5-cyclohexadien-1-on, 2,6-Dichloro-4-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl)imino]-2,5-cyclohexadien-1-on, 7-(Diethylamino)-3-imino-8-methyl-3H-phenoxazinsalz, 3,7-Bis(dimethylamino)-phenothiazin-5-iumsalz und dergleichen.
Nachweisbare Substanzen in diesem Fall sind oxidierte/reduzierte Formen der zuvor genannten Elektronenträger und die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanzen ist die Oxidations-Reduktions-Reaktion der Elektronenträger. Wie zuvor beschrieben wurde, kann ein Analyt gemessen werden, indem die elektrochemische Antwort wie beispielsweise ein Oxidations-/Reduktionsstrom gemessen wird, wenn die oxidierte/reduzierte Form eines vorliegenden Elektronenträgers, die mit dem Analyten eine quantitative Beziehung aufweist, mittels einer Elektrode reduziert/oxidiert wird. Beispielsweise kann der Analyt aus dem Ergebnis der gemessenen elektrochemischen Antwort direkt gemessen werden, wenn der Elektronenträger an einer Elektrode wie einem Elektronendonor/-rezeptor wie Ascorbinsäure oder Wasserstoffperoxid oxidiert/reduziert wird.
Der Ionophor ist eine Verbindung wie beispielsweise ein Ligand, der selektiv an ein spezielles Ion wie einen Analyten unter Bildung eines Komplexes koordinativ gebunden oder ionisch gebunden ist, und es ist insbesondere gut bekannt, dass der Ionophor in einer Flüssigfilmelektrode (liquid film electrode) verwendet wird.
Beispiele für den Ionophoren, der mit einem Kation einen Komplex bildet, umfassen Tetrakis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]boratsalz, Tetraphenylphosphoniumsalz, Valinomycin, Cyclo(N,N'-dioctyl-D-asparaginyl-L-prolyl-L-alanyl)₂, Bis(benzo-15-Krone-5), Bis[(benzo-15-Krone-5)-4-methyl]pimelat, Bis(12-Krone-4), Bis[(12-Krone-4)methyl]-2-dodecyl-2-methylmalonat, 14-Krone-4, Dodecyl-methyl-14-Krone-4, 6,6-dibenzyl-1,4,8,11-tetraoxacyclotetradecan, Dibenzo-18-krone-6, Dicyclohexyl-18-krone-6, 4,16-Di-N-octadecylcarbamoyl-3-oxabutyryl-1,7,10,13,19-pentaoxa-4,16-diazacyclohenicosan und dergleichen.
Beispiele für den Ionophoren, der einen Komplex mit einem Anion bildet, umfassen Tetraphenylarsoniumsalz, 6-Methoxy-N-(3-sulfopropyl)chinoliniumsalz und dergleichen.
Die Flüssigfilmelektrode wird in einem Verfahren zum Bestimmen eines spezifischen Ions als einem Analyten verwendet, indem ein Membranpotential gemessen wird, das erzeugt wird, wenn eine poröse Polymerschicht auf der Oberfläche einer Elektrode gebildet wird, und ein Ionophor in die Polymerschicht eindringt, der an das spezifische in einer Probe enthaltene Ion gebunden ist und in der Polymerschicht bewegt wird, um das spezifische Ion selektiv abzutrennen. Es ist selbstverständlich, dass die Verwendung des Ionophoren in dem elektrochemischen Nachweisverfahren nicht auf diese Flüssigfilmelektrode beschränkt ist.
Ein spezifisches Ion als ein Analyt kann gemessen werden, indem ein Membranpotential gemessen wird, das erzeugt wird, wenn das spezifische Ion an einen Ionophoren in einer Probenlösung gebunden wird und das Ion in einer Elektrode selektiv abgetrennt wird, die eine Polymerschicht aufweist, in der ungebundene Ionen sich nicht bewegen können und lediglich ein durch Bindung erzeugter Komplex sich bewegen kann.
In diesem Fall ist die nachweisbare Substanz ein Komplex zwischen dem Ionophor und dem spezifischen Ion, und die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz ist eine Komplexbildungsreaktion zwischen dem Ionophoren und dem spezifischen Ion durch Koordinationsbindung oder Ionenbindung. Ein Analyt wird gemessen, indem ein Membranpotential elektrochemisch gemessen wird, das gemäß der Konzentration eines spezifischen Ions, das der zuvor beschriebene Analyt ist, erzeugt wird.
2. In der vorliegenden Erfindung angewandte Messverfahren.
Das erfindungsgemäße Messverfahren wird vorzugsweise bei einem Verfahren angewendet, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, das eine solche nachweisbare Substanz bildet, bevorzugter auf die folgenden Verfahren.

(a) Ein Verfahren, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, das die Bildungsreaktion von Wasserstoffperoxid oder eine Oxidationsreaktion, bei der Wasserstoffperoxid als ein Oxidationsmittel verwendet wird, umfasst, insbesondere ein Verfahren zum Messen einer Farbstoffverbindung, die durch die Bildung von Wasserstoffperoxid aus einem Analyten durch ein Oxidase-Reaktionssystem erzeugt wird, und Durchführen einer Oxidations-Reduktions-Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und einem reaktiven Farberzeuger (Farbstoffvorstufe) in Gegenwart von Peroxidase.
(b) Ein Verfahren, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, das die Bildungsreaktion von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH) oder eine Reaktion, bei der NADH oder NADPH als ein Reduktionsmittel verwendet wird, mit einschließt, insbesondere ein Verfahren zum Messen einer Farbstoffverbindung, die erzeugt wird, indem NADH oder NADPH aus einem Analyten durch ein Dehydrogenase-Reaktionssystem und dessen Re duktion durch Einwirkenlassen auf eine Farbstoffvorstufe in Gegenwart eines Elektronenträgers gebildet werden.
(c) Ein Verfahren zum Messen eines Nitrits, Diazoniumsalzes oder einer Kupplungsverbindung durch Erzeugen eines Diazoniumsalzes, indem Nitrit mit einem aromatischen primären Amin unter sauren Bedingungen unter Bildung eines Diazoniumsalzes umgesetzt wird, das erzeugte Diazoniumsalz mit einem zu kuppelnden Reagenz umgesetzt wird, um einen Azofarbstoff zu bilden und Messen des erzeugten Azofarbstoffs.
(d) Ein Verfahren zum Messen einer Substanz, die mit einem fluoreszierenden Enzymsubstrat oder einer Alkaliphosphatase markiert ist, indem die Fluoreszenz gemessen wird, die erzeugt wird, indem eine fluoreszierende Substanz gebildet wird, indem ein Phosphat aus einem fluoreszierenden Enzymsubstrat wie 4-Methylumbelliferon, das einen Phosporsäureester aufweist, durch die Funktion von Alkaliphosphatase isoliert wird und die fluoreszierende Substanz mit angeregtem Licht bestrahlt wird.
(e) Ein Verfahren zum Messen einer Oxidase/Reduktase und einer mit einer Oxidase/Reduktase markierten Substanz, in dem eine Stromantwort gemessen wird, wenn ein Mediator wie beispielsweise ein 1,4-Diaminobenzol durch die Oxidase/Reduktase oxidiert/reduziert wird und die erzeugte oxidierte/reduzierte Form des Mediators durch eine Elektrodenreaktin reduziert/oxidiert wird.

Die nachweisbare Substanz kann der Analyt sein. Als Beispiel hierfür wird ein Analyt bestimmt, indem die elektrochemische Antwort gemessen wird, wenn in Wasser aufgelöste Glukose an der Oberfläche der Elektrode oxidiert wird.
Das vierte erfindungsgemäße Messverfahren kann insbesondere ein Messverfahren sein, bei dem ein Reaktionssystem verwendet wird, das eine nachweisbare Substanz in einem Solvens bildet und die Bildungsreaktion einer in dem Solvens unlöslichen Substanz umfasst, vorzugsweise ein Messverfahren, bei dem eine unlösliche nachweisbare Substanz gebildet wird, insbesondere vorzugsweise ein Messverfahren, bei dem die nachweisbare Substanz eine optisch nachweisbare Substanz ist.
Das Solvens unterliegt keiner besonderen Einschränkung und es können herkömmliche bekannte Solventien verwendet werden. Beispiele für das Solvens umfassen Wasser wie destilliertes Wasser, Alkohole wie Ethanol, Ketone wie Aceton, Ether wie Die thylether, Ester wie Ethylacetat, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Chloroform, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol und Toluol und dergleichen. Ein für einen Analyten geeignetes Solvens und ein Nachweisreaktionssystem dafür können aus diesen ausgewählt werden. Von diesen ist Wasser bevorzugt. In der Trockenchemie ist es bekannt, dass eine Probenflüssigkeit wie Blut, Speichel und Urin, die einen Analyten enthält, als ein Reaktionssolvens verwendet werden kann.
Das Messverfahren, bei dem die Bildungsreaktion einer Substanz verwendet wird, die in einem Reaktionssolvens unlöslich ist, in dem die Reaktion durchgeführt wird, unterliegt keiner besonderen Einschränkung. Beispiele hier umfassen ein Verfahren, bei dem eine Reaktion verwendet wird, bei der eine in einem Reaktionssolvens unlösliche optisch nachweisbare Substanz gebildet wird, ein Verfahren, bei dem eine Reaktion verwendet wird, bei der eine optisch nachweisbare Substanz und ein Nebenprodukt gebildet wird, das bzw. die in einem Solvens, in dem die Reaktion durchgeführt wird, unlöslich ist bzw. sind, und ein Verfahren, bei dem eine Reaktion verwendet wird, bei der eine elektrochemisch nachweisbare Substanz und ein in einem Reaktionssolvens unlösliches Nebenprodukt gebildet werden.
Das Messverfahren, bei dem eine Reaktion verwendet wird, bei der eine in einem Reaktionssolvens unlösliche optisch nachweisbare Substanz gebildet wird, unterliegt keiner besonderen Einschränkung, es kann jedoch eines der folgenden Nachweisreaktionen sein.
Oxidationsreaktionen umfassen eine Reaktion zum Nachweis von Wasserstoffperoxid durch die Oxidationskondensation von Phenol und 4-Amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-on in einer wässerigen Lösung, eine Reaktion zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, bei der N-Methylacridon gebildet wird, eine in Wasser unlösliche fluoreszierende Substanz, indem N-Methylacridin-9-carboxylat in einer wässerigen Lösung oxidiert wird, eine Reaktion zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, die eine Reaktion zum Oxidieren einer wässerigen Lösung von 10-(Carboxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino)phenothiazinsalz in Gegenwart von Alkansulfonat und Bewirken von Farbentwicklung umfasst, und dergleichen.
Reduktionsreaktionen umfassen eine Reaktion zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, die 7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on bildet, eine fluoreszierende Substanz, die in einer sauren wässerigen Lösung unlöslich ist, durch Reduktion von 7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on-10-oxid, eine Reaktion zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, die einen in Wasser unlöslichen Formazanfarbstoff bildet, durch Reduktion von 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumsalz, 5-Cyano-2,3-bis(4-methylphenyl)-2H-tetrazoliumsalz, 2,3-Bis(4-cyanophenyl)-5-cyano-2H-tetrazoliumsalz oder dergleichen, und dergleichen.
Andere Reaktionen umfassen eine Reaktion zum Nachweis von Allylsulfatase durch eine Reaktion zwischen 4-Methylumbelliferylsulfat und Arylsulfatase in einer schwach sauren wässerigen Lösung, eine Reaktion zum Nachweis von β-Glucosidase durch eine Reaktion zwischen 2-Chloro-4-nitrophenyl-β-D-glucopyranosid und β-Glucosidase in einer wässerigen Lösung, eine Reaktion zum Nachweis von Aldehyd durch eine Kondensationsreaktion zwischen Azobenzol-p-phenylhydrazinsulfonsäure und Aldehyd, eine Reaktion zum Nachweis von salpetriger Säure einschließlich Diazo-Kopplung zwischen einem Diazoniumsalz und 2-Naphthol, eine Reaktion zum Nachweis eines Kobaltions durch eine Bildungsreaktion eines farbigen unlöslichen Komplexes zwischen 1,3-Diamino-4-(5-bromo-2-pyridylazo)benzol und einem Kobaltion in einer neutralen wässerigen Lösung und dergleichen.
Das Messverfahren, bei dem die Bildungsreaktion einer optisch nachweisbaren Substanz verwendet wird, das die Bildungsreaktion eines in einem Reaktionssolvens unlöslichen Nebenprodukts umfasst, oder das Messverfahren, bei dem die Bildungsreaktion einer elektrochemisch nachweisbaren Substanz verwendet wird, welches die Bildungsreaktion eines in einem Reaktionssolvens unlöslichen Nebenprodukts mit einschließt, wird aufgrund der Schwierigkeiten, die in dem Abschnitt über den Stand der Technik zuvor beschrieben wurden, selten verwendet. Daher werden hier Beispiele der obigen Messverfahren nicht angeführt. Es ist jedoch selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung dadurch nicht eingeschränkt wird.
Es ist ein üblicherweise beobachtetes Phänomen, dass eine unlösliche Substanz aus einer flüssigen Phase sich sofort abtrennt und an eine nahe gelegene feste Phase adsorbiert wird, wenn sie in einem Solvens gebildet wird, das sie nicht auflöst. Wenn in der Nähe keine feste Phase vorliegt, bildet die unlösliche Substanz eine Anordnung von Molekülen in einer flüssigen Phase, die Anordnung der Moleküle wächst weiter und setzt sich als ein Aggregat oder Niederschlag ab. Die erfindungsgemäße anorga nische Schichtverbindung ist ein feines Partikel, das fein genug ist, um gleichförmig dispergiert werden zu können. Da unlösliche nachweisbare Substanzen, wie beispielsweise eine unlösliche nachweisbare Substanz und ein Nebenprodukt in der vorliegenden Erfindung, unmittelbar nachdem sie gebildet worden sind, ein einzelnes Molekül oder eine sehr kleine Anordnung von Molekülen sind, werden die unlöslichen Substanzen an die anorganische Schichtverbindung effizient adsorbiert und miteinander gleichförmig dispergiert.
Das vierte erfindungsgemäße Messverfahren ist ein Messverfahren, das bewirkt, dass eine anorganische Schichtverbindung eine Funktion aufweist, um verschiedene Arten von Substanzen zu adsorbieren und gleichförmig zu dispergieren, so dass sie in einem Nachweisreaktionssystem vorliegen, das eine unlösliche Substanz bildet, wodurch die unlösliche Substanz adsorbiert wird, und das die Schwierigkeiten überwindet, die von der unlöslichen Substanz hervorgerufen werden, wie sie in dem Abschnitt über den Stand der Technik beschrieben sind. Darüber hinaus unterbricht die Gegenwart der anorganischen Schichtverbindung den Ablauf der Nachweisreaktion und den Nachweis nicht. In dem vierten erfindungsgemäßen Messverfahren ist das Reaktionssystem, das die Bildungsreaktion einer unlöslichen Substanz umfasst, besonders bevorzugt die Reduktionsreaktion eines Tetrazoliumsalzes.
Beispiele für den Analyten, der mittels des ersten bis vierten erfindungsgemäßen Messverfahren gemessen werden kann, umfassen biologische Komponenten in Körperflüssigkeiten wie Urin und Blut, Spurenmengen von Substanzen, die in der Nahrung, Arzneimitteln oder der Umwelt vorliegen, industrielle chemische Substanzen, Spurenmengen von in Abfall enthaltenen Substanzen und dergleichen.
3. Anorganische Schichtverbindung
Das erfindungsgemäße Messverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in das Reaktionssystem eine anorganische Schichtverbindung einschließlich der Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz eingebracht wird. Die anorganische Schichtverbindung wird im Folgenden beschrieben.
Die erfindungsgemäß verwendete anorganische Schichtverbindung ist eine anorganische Verbindung, die eine Kristallstruktur aus Blattstrukturschichten aufweist, die eine über der anderen aufgeschichtet sind, wobei jede Schicht aus einem Satz von Polyedern wie Si-Tetraedern oder Al-Oktaedem, die in derselben Ebene angeordnet sind, zusammengesetzt ist, wie beispielsweise bei Schichttonmineralien und Hydrotalcit.
Als Tonmineralien werden Aluminiumsilikatmineralien bezeichnet, die den größten Teil von Ton (eine feine erdbodenartige anorganische granuläre Substanz, die in nassem Zustand verformbar ist) bildet. Sie sind im Allgemeinen aus kleinsten Struktureinheiten zusammengesetzt, die Si-Tetraeder sind, wobei Si von 4 O's (Sauerstoffatomen) und Al- oder Mg-Oktaedern umgeben ist, wobei Al oder Mg von 6 OH-Gruppen oder O's umgeben ist.
Die Struktur des Schichttonminerals ist eine, in der ein hexagonales Netzblatt mit Si-Tetraedern gebildet wird, die sich eine Ebene und O's an den verbleibenden Ecken teilen, die in der gleichen Richtung orientiert sind (Tetraederblatt), oder ein Blatt wird gebildet mit Al (oder Mg)-Oktaedern, die sich Kantenwinkel (ridge angles) teilen (Oktaederblatt), und diese Blätter sind eines auf dem anderen laminiert. Mineralien, die eine Struktur aufweisen, bei der eine Mehrheit von 1:1 Schichten, wobei jede Schicht aus einer Tetraederblattschicht und einer Oktaederblattschicht besteht, eine auf der anderen laminiert ist, werden als Mineralien vom 1:1 Typ bezeichnet, und Mineralien, die eine Struktur aufweisen, bei der eine andere Oktaederblattschicht zwischen die Schichten vom 2:1 Typ eingeschoben sind, werden als Mineralien vom 2:1:1 Typ bezeichnet. Mineralien, die Mg(OH)₂-Oktaederblätter umfassen und an sämtlichen Oktaederpositionen Metallionen aufweisen, werden als Mineralien vom Trioktaeder-Typ bezeichnet und Mineralien, die Al(OH)₃-Oktaederblätter umfassen und bei denen 1/3 der Oktaederpositionen nicht besetzt sind, werden als Mineralien vom Dioktaeder-Typ bezeichnet. Die erfindungsgemäß verwendete anorganische Schichtverbindung ist vorzugsweise ein Mineral vom 2:1 Typ.
Die erfindungsgemäß verwendete anorganische Schichtverbindung enthält mindestens ein Element, das ausgewählt ist aus Lithium, Natrium, Kalium, Magnesium, Aluminium, Silizium, Sauerstoff, Wasserstoff, Fluor und Kohlenstoff. Die anorganische Schichtverbindung kann eine Verbindung sein, die durch eine derfolgenden Formeln dargestellt wird. Die durch eine der folgenden Formeln dargestellte Verbindung kann Kristallwasser enthalten. Diese Formeln sind die Formeln mineralogisch und chemisch reiner Verbindungen. Da die tatsächliche anorganische Schichtverbindung Verunreinigungen wie Natriumsilikat enthalten kann, stimmt die chemische Formel der anorganischen Schichtverbindung, die durch Elementaranalyse bestimmt worden ist, nicht immer mit einer dieser Formeln überein, wie in der Literatur beschrieben worden ist (D. W. Thompson, J. T. Butterworth, J. Colloid Interf. Sci., 151, 236–243 (1992)). M_xSi₄(Al_2-xMg_x)O₁₂X₂ (1)in der M eines von H, Li, Na und K ist, X eines von OH und F, und x eine positive Zahl von kleiner als 2 ist. M_x(Si_4-xAl_x)Al₂O₁₂X₂ (2)in der M eines von N, Li, Na und K ist, und X eines von OH und F ist, und x eine positive Zahl von weniger als 4 ist. M_xSi₄(Mg_3-xLi_x)O₁₀X₂ (3)in der M eines von N, Li, Na und K ist, und X eines von OH und F ist, und x eine positive Zahl von weniger als 3 ist. M_x(Si_4-xAl_x)Mg₃O₁₀X₂ (4)in der M eines von H, Li, Na und K ist, und X eines von OH und F ist, und x eine positive Zahl von weniger als 4 ist. MSi₄Mg_2,5O₁₀X₂ (5)in der M eines von Li und Na ist, vorzugsweise Na und X eines von OH und F ist, vorzugsweise F. M₂Si₄Mg₂O₁₀X₂ (6)in der M eines von Li und Na ist, vorzugsweise Li, und X eines von OH und F, vorzugsweise F. Mg₆Al₂(OH)₁₆X_x (7)in der X eines von Halogen, NO₃, SO₄, CO₃ und OH oder ein Anion einer organischen Säure, vorzugsweise CO₃ ist, und x 2 ist, wenn X Halogen, OH, NO₃ oder eine einwertige organische Säure ist, und 1 ist wenn X SO₄, CO₃ oder eine zweiwertige organische Säure ist. Na_0,33Si₄(Mg_2,67Li_0,33)O₁₀X₂ (8)in der X entweder OH oder F ist, vorzugsweise OH. Na_a-b(Si_4-aAl_a)(Mg_3-bAl_b)O₁₀X₂ (9)in der X entweder OH oder F ist, vorzugsweise OH, a eine positive Zahl kleiner 4 ist, und b eine positive Zahl kleiner 3 ist, vorausgesetzt, dass a–b > 0.
Beispiele für die erfindungsgemäß verwendete anorganische Schichtverbindung umfassen Tonmineralien vom 1:1 Typ wie Kaolinit, Halloysit und Serpentin; Tonminerale vom 2:1 Typ wie Talk, Pyrophyllit, Smektit, Vermiculit (dargestellt durch die Formel 2 der zuvor angegebenen Formeln) und Glimmer einschließlich Fluorotetrakieselglimmer (fluorotetrasilicic mica) (Formel 5) und Taeniolit (Formel 6); Tonmineralien vom 2:1:1 Typ wie Chlorit; zwischen Mineralien vom 2:1 bis 2:1:1 Typ; Para-amorphe Tonmineralien wie Imogolit; amorphe Tonmineralien wie Allophan; Hydrotalcit (Formel 7) und dergleichen.
Entsprechend der Ionenspezies, die in dem isomorph substituierten Tetraeder und Oktaeder enthalten sind, wird der Smektit in einen Dioktaeder-Typ wie Montmorillonit (Formel 1) aufgeteilt, Bentonit, der ein Naturprodukt ist, das 40 bis 80% Montmorillonit enthält, und Beidellit (Formel 2); einen Trioktaeder-Typ wie Hektorit (Formel 3, vorzugsweise Formel 8), Saponit (Formel 4, vorzugsweise Formel 9), und Nontronit, und dergleichen.
Der Hydrotalcit ist ein Schichtmineral, das durch die vorstehende Formel 7 dargestellt wird, insbesondere Mg₆Al₂(OH)₁₆CO₃·4H₂O, in dem Teile von Mg²⁺ von Mg(OH)₂ (Brucit, der eine Laminatstruktur aufweist, die aus Sauerstoffoctahederschichten bestehen, die in der Mitte Mg²⁺ aufweisen) isomorph durch Al³⁺ substituiert sind. Der Hydrotalcit weist eine positive Ladung auf, hält durch CO₃ ^2- zwischen den Schichten elektrische Neutralität aufrecht und weist eine Anionenaustauschbarkeit auf. Es ist kein Silikatmineral, wird jedoch häufig als ein Tonmineral behandelt.
Die Zusammensetzungen einiger erfindungsgemäß verwendeter zuvor beschriebener anorganischer Schichtverbindungen sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

*: Ml ist ein austauschbares Kation, das durch ein einwertiges Kation dargestellt wird.

Der durchschnittliche Partikeldurchmesser der in der erfindungsgemäß verwendeten anorganischen Schichtverbindung unterliegt keiner besonderen Beschränkung, wenn er klein genug ist, um eine gleichförmige Dispersion der Verbindung zu ermöglichen. Da die anorganische Schichtverbindung im Allgemeinen ein flacheres Teilchen ist und ein dynamisches Gleichgewicht aufweist, das die Aggregation und Spaltung mehrerer Partikel wiederholt wird, ist es schwierig, den durchschnittlichen Partikeldurchmesser zu definieren. Es ist nicht einfach, einen bevorzugten durchschnittlichen Partikeldurchmesserbereich zu spezifizieren. Man kann sagen, der durch Mittel wie beispielsweise Lichtstreuverfahren oder Beobachtung durch ein Elektronenmikroskop gemessene Wert beträgt vorzugsweise 1 nm oder mehr und 20 μm oder weniger, bevorzugter 10 nm oder mehr und 2 μm oder weniger, wenn die anorganische Schichtverbindung in Wasser dispergiert ist. Da die anorganische Schichtverbindung ein Ionenaustauschvermögen aufweist, wird angenommen, dass die anorganische Schichtverbindung gemäß der Ladung und Polarität eines Farbstoffs oder dergleichen adsorbiert. Die Ionenaustauschfähigkeit der anorganischen Schichtverbindung stammt von der Ladung der Schicht, die durch die Substitution von Metallionen, die eine Schicht bilden, erzeugt wird. Der absolute Wert der Ladung der Schicht beträgt dann vorzugsweise etwa 0,2 bis 1 für Gruppen von Atomen der Zusammensetzungen der zuvor in Tabelle 1 gezeigten Formeln.
Eine anorganische Schichtverbindung, die Übergangsmetallionen wie Eisenionen als substituierende Ionen in der Struktur oder als Verunreinigungen enthält, wird durch die Metallionen gefärbt und zeigt darüber hinaus oxidierende/reduzierende Eigenschaften und erzeugt eine Nebenreaktion mit dem Ergebnis, dass sie eine schlechte Transparenz aufweist. Die anorganische Schichtverbindung ist daher vorzugsweise nicht mit Übergangsmetallionen substituiert, die vorliegende Erfindung ist dadurch jedoch nicht eingeschränkt.
In den zuvor erwähnten anorganischen Schichtverbindungen wie Tonmineralien kann der Abstand, die Ladung und Polarität zwischen Schichten im Voraus eingestellt werden, indem eine Säule wie beispielsweise ein quaternäres Ammoniumsalz eingeführt wird.
Von den zuvor genannten erfindungsgemäß verwendeten anorganischen Schichtverbindungen sind Tonminerale vom 2:1 Typ bevorzugter und besonders bevorzugt sind quellende Tonmineralien, die eine Ionenaustauschfähigkeit aufweisen.
Von den quellenden Tonmineralien sind bevorzugtere Bentonit, Smektit, Vermiculit und synthetische Fluorglimmer, und besonders bevorzugt sind synthetischer Smektit wie synthetischer Hektorit und synthetischer Saponit und synthetischer Glimmer (natürlicher Glimmer ist im Allgemeinen ein nicht-quellendes Tonmineral) wie beispielsweise quellender synthetischer Glimmer (Na-Typ-Glimmer), der durch synthetischen Fluoroglimmer typifiziert wird. Die Quellfunktion der quellenden Tonmineralien rührt von einem austauschbaren Kation oder Anion her. Eine quellende anorganische Schichtverbindung wird vorzugsweise verwendet, da die nachweisbare Substanz von der Oberfläche der Zwischenschichten und der Oberfläche eines als Kartenhaus bezeichneten Tonverbandes rasch adsorbiert wird. Tonmineralien können anionische Substanzen, kationische Substanzen und nicht-ionische polare organische Verbindungen adsorbieren und Hydrotalcit kann anionische Verbindungen adsorbieren. Verbindungen, die durch die anorganischen Schichtverbindungen adsorbiert werden können, sind ausführlich beschrieben in Kapitel 11 „Interaction of Clays and Organic Compounds" der „An Introduction to Clay Colloid Chemistry" zweite Ausgabe von H. Van Olphen (Krie ger Publishment, Malabar). Sie können in der vorliegenden Erfindung alleine oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet werden.
Die zuvor genannte erfindungsgemäß verwendete anorganische Schichtverbindung kann synthetisch oder natürlich sein, ist jedoch vorzugsweise synthetisch. Anders als natürliche anorganische Schichtverbindungen sind synthetische anorganische Schichtverbindungen chemisch gleichförmig und ermöglichen eine quantitative Handhabung der nachweisbaren Substanz, die adsorbiert worden ist, und eine quantitative und optische Handhabung der nachweisbaren Substanz, da sie keine gefärbten Metalle, wie Eisen, zwischen den Schichten aufweisen und dementsprechend eine große Transparenz aufweisen. Der hier verwendete Begriff „synthetisch" bedeutet, dass anorganische Schichtverbindungen hauptsächlich durch ein hydrothermales synthetisches Verfahren oder Schmelzverfahren, zumindest im Falle von Smektit, hergestellt werden. Quellende Tonmineralien, die durch Reinigen natürlicher Produkte erhalten werden, werden ebenfalls vorzugsweise verwendet.
Diese anorganischen Schichtverbindungen sind im Handel erhältlich. Beispiele hierfür umfassen Lucentite SWN und Lucentite SWF (synthetischer Hektorit) und ME (Fluor-Glimmer) von Co-op Chemical Co., Smecton SA (synthetischer Saponit) und Kunimine Kogyo Co., Thixopy W (synthetischer Hektorit) und Kyoword 500 (synthetischer Hydrotalcit) von Kyowa Chemical Industry Co., Raponite (synthetischer Hektorit) von Laporte Co., natürlicher Bentonit, der von Nacalai Tesque Co. vertrieben wird, Multigel (Bentonit) von Toyojun Kogyo Co., und dergleichen (Bezeichnungen mit großen Anfangsbuchstaben sind Handelsnamen.).
Es ist bekannt, dass die zuvor genannten anorganischen Schichtverbindungen anorganische Verbindungen, wie Amine, Polyene und verschiedene Farbstoffe adsorbieren. Sie sind als Wasserbehandlungsmittel verwendet worden, das Öl, Farbstoffe und dergleichen adsorbiert, als ein Proteinentfernungsmittel, das bei der Herstellung von Wein, süßem Sake und dergleichen verwendet wird, als ein Entfärbungs- und Reinigungsmittel, das Verunreinigungen adsorbiert und entfernt und dergleichen. Diese anorganischen Schichtverbindungen sind in den letzten Jahren bekannt als eine Substanz, die eine spezifische Reaktionsstelle bereit stellt, indem sie ein als „Metachromasie" bezeichnetes Phänomen verursacht und ist darüber hinaus als eine Substanz bekannt, die die optische Stabilität eines natürlichen Farbstoffs verbessert.
In dem ersten erfindungsgemäßen Verfahren wurde jedoch gefunden, dass die Messempfindlichkeit erhöht werden kann, indem man es ermöglicht, dass die nachweisbare Substanz von der anorganischen Schichtverbindung adsorbiert wird. Dadurch kann durch die Zugabe der anorganischen Schichtverbindung die Messung von Wasserstoffperoxid in dem zuvor genannten Reaktionssystem, bei dem beispielsweise 4-AA und ein Wasserstoffdonor verwendet wird, quantitativer durchgeführt werden. Ein Fall, bei dem die Empfindlichkeit der Messung erhöht wird, indem eine anorganische Schichtverbindung wie beispielsweise ein Tonmineral bei der Messung einer Substanz verwendet wird, wurde bislang noch nicht beschrieben.
In dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren wurde versucht, diese anorganischen Schichtverbindungen einem Reaktionssystem zuzufügen, und zwar auf Grund der Annahme, dass es solche Effekte gibt, dass ein Komplex gebildet wird durch die Adsorption der nachweisbaren Substanz an die anorganische Schichtverbindung, die nachweisbare Substanz von dem Reaktionssystem geschützt wird und die Elektronenkonzentration, die an einer Zersetzungsreaktion beteiligt ist, durch Adsorption verändert wird. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die nachweisbare Substanz durch die anorganischen Schichtverbindungen adsorbiert wird und die adsorbierte, nachweisbare Substanz in Gegenwart von überschüssigem Wasserstoffperoxid oder Ascorbinsäure völlig stabil vorliegen kann. Durch die Zugabe der anorganischen Schichtverbindung kann die Messung von Wasserstoffperoxid in dem zuvor genannten Reaktionssystem, bei dem 4-AA und ein Wasserstoffdonor verwendet wird, z. B. mit höherer Genauigkeit durchgeführt werden. Ein Fall, bei dem eine anorganische Schichtverbindung, wie beispielsweise ein Tonmineral, zu einem Reaktionssystem zum Messen eines Analyten, zum Stabilisieren der gebildeten nachweisbaren Substanz und zum Verbessern der Empfindlichkeit und Genauigkeit der Messung des Analyten zugegeben wird, ist bislang noch nicht beschrieben worden.
In dem dritten erfindungsgemäßen Verfahren wurde gefunden, dass die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz in Gegenwart der anorganischen Schichtverbindung für Analysezwecke ablaufen kann, und obwohl der Mechanismus nicht vollständig bekannt ist, wird die Reaktionsvorstufe der nachweisbaren Substanz durch die anorganische Schichtverbindung adsorbiert und auf der Oberfläche der anorganischen Schicht verbindung konzentriert, um die Geschwindigkeit der Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz zu verbessern, wodurch eine schnellere Messung ermöglicht wird.
In dem vierten erfindungsgemäßen Verfahren wurde gefunden, dass selbst wenn eine unlösliche Substanz gebildet wird, ein hochempfindlicher rascher Nachweis durchgeführt werden kann, indem die anorganische Schichtverbindung in dem Solvens des Reaktionssystems, das die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz einschließt dispergiert wird. Ein Fall, bei dem die anorganische Schichtverbindung, wie beispielsweise ein Tonmaterial in einem Solvens dispergiert wird, um eine Substanz zu messen, ist bislang noch nicht beschrieben worden.
Noch überraschender ist, dass die Messgenauigkeit durch die Zugabe einer anorganischen Schichtverbindung nicht beeinträchtigt wird, da eine Nachweisreaktion nicht unterbrochen wird, selbst wenn die anorganische Schichtverbindung in einem Reaktionssystem vorliegt.
Ein Verfahren zum Einbringen der anorganischen Schichtverbindung in das Reaktionssystem des erfindungsgemäßen Verfahrens hängt ab von dem verwendeten Reaktionssystem, und vorzugsweise wird die anorganische Schichtverbindung in dem Reaktionsmedium des Reaktionssystems in einer Form ausgewählt aus Dispersion, Sol, Gel, Aufschlämmung, Agglomerat, Aggregat und porösem Sinterkörper dispergiert. Das Reaktionsmedium des Reaktionssystems kann das Reaktionssolvens der Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz sein. In dem vierten erfindungsgemäßen Verfahren ist es das Reaktionssolvens der Bildungsreaktion einer in dem Reaktionssolvens unlöslichen Substanz.
Damit die anorganische Schichtverbindung im Reaktionssystem vorliegt, wird bevorzugter die anorganische Schichtverbindung in einem Solvens dispergiert und die erhaltene Dispersion wird dem Reaktionssystem zugegeben. Das Solvens unterliegt keiner besonderen Einschränkung und es können beliebige herkömmlich bekannte Solventien verwendet werden. Beispiele für das Solvens umfassen Wasser, wie beispielsweise destilliertes Wasser, Alkohole wie Ethanol, Ketone wie Aceton, Äther wie Dietyläther, Ester wie Ethylacetat, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Chloroform, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol und Toluol, und dergleichen, von denen eine für einen Analyten und ein Nachweisreaktionssystem dafür geeignete ausgewählt werden kann. Vorzugsweise wird die anorganische Schichtverbindung in einem Puffer dispergiert, der im Folgenden beschrieben wird, und die erhaltene Pufferdispersion wird dem Reaktionssystem zugegeben. In der sogenannten Dry Chemistry ist es bekannt, dass eine Probenlösung, wie Blut, Speichel und Urin, die einen Analyten enthält, als ein Reaktionssolvens verwendet werden kann.
Die Menge der zugegebenen anorganischen Schichtverbindung wird gemäß einem verwendeten Reaktionssystem bestimmt. Je nach der verwendeten anorganischen Schichtverbindung ist es bevorzugt, beispielsweise einen Fall zu vermeiden, bei dem die Anzahl der Adsorptionsstellen für eine nachweisbare Substanz zu gering ist und die nachweisbare Substanz nicht vollständig adsorbiert wird und in der Lösung verbleibt, oder einen Fall, bei dem die Anzahl der Adsorptionsstellen zu groß ist und es Unterschiede in der Konzentration der an diesen Stellen adsorbierten nachweisbaren Substanz gibt.
Die bevorzugte Menge der anorganischen Schichtverbindung, die dem Reaktionssystem zugegeben wird, wird wie folgt bestimmt. Das heisst, da die anorganische Schichtverbindung einen Farbstoff oder dergleichen in einer Menge adsorbiert, die hauptsächlich dem Grad der zuvor genannten Schichtenladung entspricht, kann die Gesamtanzahl an Adsorptionsstellen des Farbstoffs oder dergleichen für jede Art anorganischer Schichtverbindungen erhalten werden. Wenn die Konzentration eines Reagenzes in einem Nachweisreaktionssystem bestimmt wird, kann die ungefähre maximale Menge eines gebildeten Farbstoffs oder dergleichen berechnet werden, und jede Art anorganischer Schichtverbindung kann zugegeben werden, so dass die maximale Menge des Farbstoffs oder dergleichen, der gebildet werden kann, die gesamten Adsorptionsstellen der anorganischen Schichtverbindungen nicht übersteigt.
Die Zeit für die Zugabe der anorganischen Schichtverbindung unterliegt keiner besonderen Einschränkung und kann daher vor oder nach der Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz liegen. Vorzugsweise wird die anorganische Schichtverbindung zu einem Reaktionssystem vor der Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz zugegeben und in dem Reaktionssystem dispergiert.
Der Grund, warum die anorganische Schichtverbindung in dem Reaktionssystem dispergiert wird, ist, dass eine Wechselwirkung wie beispielsweise Adsorption zwischen der Reaktionsstartsubstanz, der Reaktionszwischenstufe oder dem Reaktionsprodukt, die an der Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz beteiligt sind, und der anorganischen Schichtverbindung ohne weiteres eintreten kann. Ein anderer Grund ist, dass ein Zustand, bei dem die anorganische Schichtverbindung ohne Konzentrationsunterschiede gleichförmig dispergiert ist, für einen Nachweis geeignet ist. Der hier verwendete Begriff „Dispersion" bedeutet daher einen Zustand bei dem die anorganische Schichtverbindung in einer Lösung dispergiert ist oder den Zustand eines Soles oder Geles oder einen Zustand der zum Nachweis geeignet ist, bei dem die zuvor genannte Wechselwirkung ohne weiteres stattfindet.
In dem vierten erfindungsgemäßen Verfahren kann eine unlösliche Substanz von der anorganischen Schichtverbindung adsorbiert werden, indem die anorganische Schichtverbindung in dem Reaktionssolvens gleichförmig dispergiert wird, damit sie in dem Reaktionssystem vorliegt.
Das Dispersionsmedium, in dem die anorganische Schichtverbindung dispergiert wird, ist nicht immer dasselbe wie ein Reaktionssolvens, in dem eine Reaktion stattfindet. Die anorganische Schichtverbindung kann in einer Dispersion dispergiert werden, die ein Reaktionssolvens als Dispersionsmedium enthält, oder ein Sol, ein Gel, ein Agglomerat, ein Aggregat oder einen porösen Sinterkörper, den das Reaktionssolvens durchdringen kann. Das Dispersionsmedium unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wenn die anorganische Schichtverbindung in ihm gleichförmig dispergiert werden kann.
Die anorganische Schichtverbindung in der Form eines Sols, Gels, Agglomerats, Aggregats oder porösen Sinterkörpers, die das Reaktionssolvens durchdringen kann, kann als ein Nachweisbereich verwendet werden, der auch als ein Reaktionsbereich in einem Teststück in der Trockenchemie oder dergleichen dient. Wenn die anorganische Schichtverbindung gleichförmig dispergiert werden kann, kann das erfindungsgemäße Messverfahren in dem Teststück angewandt werden.
Wenn die anorganische Schichtverbindung, die ein austauschbares Kation oder austauschbares Anion aufweist, durch Rühren oder Ultraschall in Wasser dispergiert wird, kann eine gleichförmige Dispersion erhalten werden, wenn sie eine geeignete Konzentration aufweist. Durch die Zugabe eines Elektrolyten oder einer organischen Verbin dung oder durch langes Stehen oder Temperaturänderungen können jedoch die Partikel der anorganischen Schichtverbindung agglomerieren, aggregieren oder ein Gel bilden oder ausfallen. Die Agglomeration wird im Allgemeinen verursacht durch leichte Wechselwirkung der Partikel und die Partikel können durch Rühren auf einfache Weise redispergiert werden.
Die Dispersion, Agglomeration und Redispersion der anorganischen Schichtverbindung werden beispielsweise ausführlich beschrieben in Kapitel III „The Theon of Stability of Hydrophobic Sols", Kapitel IV „Successes of the Theon of Stability – Further Theories and Refinement", Kapitel VII „Electric Double-Layer Structure and Stability of Clay Suspensions" und Kapitel VIII „Peptization of Clay Suspensions" in „An Introduction to Clay Colloid Chemistry, Second Edition" von H. Van Olphen (Krieger Publishment, Malabar).
Der Grad der Adsorption wird beeinflusst durch die Zusammensetzung eines Puffers (pH, Ionenstärke, Komponenten, die einen Komplex bilden, und dergleichen). Smektit, der in gereinigtem Wasser dispergiert ist, adsorbiert beispielsweise kaum Brilliant Blau FCF, wogegen Smektit, der in einer Bis-Tris-Pufferlösung mit einem pH von 6,5 dispergiert ist [hergestellt aus Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan und Salzsäure] diesen Farbstoff rasch adsorbiert.
Beispiele für den Puffer oder die Pufferlösung, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, umfassen eine Phosphorsäure-Pufferlösung, Zitronensäure-Pufferlösung, N-(2-acetoamid)iminodiessigsäure-Pufferlösung und dergleichen, neben der zuvor genannten Bis-Tris-Pufferlösung. Die vorliegende Erfindung ist auf diese nicht beschränkt und eine geeignete wird entsprechend dem verwendeten Reaktionssystem entsprechend ausgewählt. Der pH, die Konzentration und dergleichen des Puffers werden vorzugsweise entsprechend dem verwendeten Reaktionssystems in geeigneter Weise ausgewählt.
Die Zeit für die Zugabe des Puffers unterliegt keiner besonderen Einschränkung und kann vor oder nach der Zugabe der anorganischen Schichtverbindung liegen. Er wird vorzugsweise als eine Pufferlösung zugegeben, die die anorganische Schichtverbindung darin dispergiert enthält, und zwar zu einem Reaktionssystem zusammen mit der anorganischen Schichtverbindung.
4. Surfactant
Bei einer Messung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedene Surfactants zu dem Reaktionssystem zugegeben werden. Die Zugabe eines Surfactants ermöglicht es, eine Probe gleichförmig zu dispergieren, die eine kaum lösliche Substanz enthält, und die Probe gleichförmig und rasch in den Testbereich eines Teststückes eindringen zu lassen, indem die Benetzbarkeit durch die Probe verbessert wird. Da das Surfactant eine Funktion aufweist, eine an der Grenzfläche adsorbierte Substanz zu dispergieren oder aufzulösen, steht dies im Widerspruch zu der Adsorption der gebildeten nachweisbaren Substanz an die anorganische Schichtverbindung oder der Auflösung der nachweisbaren Substanz. Daher kann es die Wirkung der vorliegenden Erfindung schwächen. Als Surfactant, das in Kombination mit der anorganischen Schichtverbindung in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird vorzugsweise ein Surfactant ausgewählt, das die Adsorption der gebildeten nachweisbaren Substanz an die anorganische Schichtverbindung nicht stört. Die Menge des verwendeten Surfactants ist vorzugsweise gering genug, um die Beeinträchtigung der Adsorption zu verhindern. Um die Adsorptionsstärke zwischen der nachweisbaren Substanz, wie beispielsweise einem Farbstoff, und der anorganischen Schichtverbindung einzustellen, kann ein für das Reaktionssystem geeignetes bekanntes Surfactant verwendet werden und die Menge des zugegebenen Surfactants kann kontrolliert werden.
Der Surfactant-Typ, der die Adsorption nicht beeinträchtigt, kann einer sein, dessen Molekulargewicht nicht viel größer ist als das des gebildeten Farbstoffs und dessen Organizität und Anorganizität der folgenden Gleichung genügen: (Anorganizität) = (2,37 ± 0,23) × (Organizität) – 186,2 ± 117,1
Die obige Gleichung wird erhalten, indem der Adsorptionsinterferenz-Effekt und die Beziehung zwischen der Anorganizität und der Organizität eines jeden von verschiedenen Surfactants mit bekannten Strukturen untersucht wird. D. h. einer jeden funktionellen Gruppe oder Atom wird eine Anzahl von Punkten zugeordnet, z. B. wird 20 einem einzelnen Kohlenstoffatom als eine Organizität zugeordnet, 100 einer Hydroxylgruppe als Anorganizität, 30 Polyethylenoxid als eine Organizität und 60 dem Polyethylenoxid als einer Anorganizität, 70 einer Nitrogruppe als Organizität und 70 der Nitrogruppe als Anorganizität. Dann werden die gesamten Anorganizitätswerte und die gesamten Organizitätswerte erhalten, indem die Anzahl der Punkte für funktionelle Gruppen und Atome, die eine Bindung bilden, summiert werden. Es ist ein konzeptionelles organisches Diagramm bekannt, in welchem eine Gesamtanorganizität und eine Gesamtorganizität in rechtwinkligen Koordinatenachsen aufgetragen sind, wobei Verbindungen, die ähnliche Eigenschaften aufweisen können, sich im selben Bereich der rechtwinkligen Koordinatenachsen befinden und allgemeine Eigenschaften ohne Abhängigkeit von der Struktur einer Verbindung erscheinen (Yoshio Kohda, „Organic Conceptional Diagram – Basis and Application", S. 11, Sankyo Shuppan (1984)). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Adsorptionsinterferenz-Effekte untersucht und die Beziehung zwischen den anorganischen Werten und organischen Werten vieler Surfactants mit bekannten Strukturen untersucht und haben gefunden, dass Surfactants, die die Adsorption nicht stören, der obigen Gleichung in dem konzeptionellen organischen Diagramm genügen. Obwohl Berechnungsdaten auf dem zuvor genannten organischen konzeptionellen Diagramm in dem zuvor genannten Buch für die Berechnung der Anorganizität und der Organizität verwendet werden können, wurde die obige Gleichung aus Berechnungsdaten erhalten, die in „Personal Computer Organic Conceptional Diagram"-Programm, hergestellt von Dr. Yoshio Honma (The Chemical Software Society of Japan und dergleichen) angegeben sind.
Typ und Menge eines Surfactants, die eine Adsorption nicht beeinträchtigen, können wie folgt ausgewählt werden.

(1) Wasserstoffperoxid wird zu einer Reaktionslösung zugegeben, die vorbestimmte Menge an Smektit, 4-AA und N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin enthält, um Farbe zu entwickeln.
(2) Ein Surfactant wird zu derselben Konzentration zu einer Reaktionslösung zugegeben, die dieselbe Zusammensetzung aufweist wie in (1) zuvor, und Wasserstoffperoxid wird zugegeben, um Farbe zu entwickeln.
(3) Smektit wird durch geeignete Mittel wie Absetzen, zentrifugale Sedimentation oder Filtration abgetrennt, der Farbton des Überstands oder Filtrats mittels eines Spektrophotometers gemessen und die Mengen des gebildeten von dem Smektit absorbierten Farbstoff zwischen (1) und (2) verglichen. Wenn eine Ausflockung, verursacht durch Adsorption, beobachtet wird, wird alternativ die Menge der Adsorption mit dem Grad der Ausflockung oder dem Absetzen bewertet.
(4) Die Art und Menge eines Surfactants, das keinen Unterschied hervorruft, wenn es zugegeben wird und wenn es nicht zugegeben wird, wird ausgewählt. Bevorzugte Beispiele für ein Surfactant, das durch die vorstehenden Verfahren ausgewählt wird, umfassen Zucker-Alkylether wie n-Octyl-β-D-glucopyranosid; Zucker-Alkylthioether wie n-Octyl-β-D-thioglucopyranosid und n-Heptyl-β-D-thioglucopyranosid; Superamide wie n-Octanoyl-N-methylglucamid und n-Nonanoyl-N-methylglucamid, Zuckerester wie β-D-Fructopyranosyl-α-D-glucopyranosidmonodecanoat; N,N-bis(3-D-Gluconamidpropyl)deoxycolamid und dergleichen.

Die Menge des zugegebenen Surfactants unterliegt keiner besonderen Einschränkung und das Verhältnis von Surfactant zur Gesamtmenge der anorganischen Schichtverbindungen unterliegt ebenfalls keiner besonderen Einschränkung. Eine Menge, die für die Arten des Surfactants und die anorganische Schichtverbindung und das Reaktionssystem geeignet ist, kann ausgewählt werden. Das Surfactant wird in einer Menge verwendet, so dass seine Wirkung ausreichend gezeigt werden kann, beispielsweise eine Menge, welche die kritische Micell-Konzentration des in einer wässerigen Lösung verwendeten Surfactants nicht stark übersteigt. Beispielsweise werden eine 0,3%-ige wässerige Lösung von n-Octyl-β-D-thioglucopyranosid, eine 0,3%-ige wässerige Lösung von β-D-fructopyranosyl-α-D-glucopyranosidmonodecanoat und eine 0,3%-ige wässerige Lösung von N,N-Bis(3-D-gluconamidpropyl)deoxycolamid vorzugsweise verwendet.
Das Surfactant wird vorzugsweise verwendet, wenn eine Messung gemäß den ersten bis dritten erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wird.
5. Ausführungsformen des Messverfahrens
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messverfahrens wird die anorganische Schichtverbindung dem Reaktionssystem vorher zugegeben und in dem Reaktionssystem dispergiert. In der Dispersion kann ein transluzentes kolloidales Agglomerat erzeugt werden, das Agglomerat braucht jedoch nicht immer in der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. Dieses Agglomerat kann als ein Komplex angesehen werden, der die anorganische Schichtverbindung und die von diesem adsorbierte nachweisbare Substanz umfasst. Dieses Agglomerat kann durch Rühren gleichförmig dispergiert werden. Wenn dieses Agglomerat unerwünscht ist, wird die Dispersibilität der anorganischen Schichtverbindung durch Verwendung einer Phosphat-Pufferlösung verbessert, wodurch es möglich wird, die Produktion eines Agglomerats zu unterdrücken.
Es ist auch möglich, die Messempfindlichkeit weiter zu verbessern, indem man die nachweisbare Substanz, die schließlich zum Nachweis verwendet wird, durch die anorganische Schichtverbindung adsorbieren lässt, wodurch sie sich absetzt, und man die nachweisbare Substanz von dem Reaktionssystem abtrennt und aufkonzentriert. Das Verfahren zum Abtrennen der anorganischen Schichtverbindung, von der die nachweisbare Substanz adsorbiert worden ist, unterliegt keiner besonderen Einschränkung, und wird ausgewählt aus beispielsweise Absetzen, Zentrifugieren, Filtrieren, Chromatographie, Elektrophorese, Solvensverdampfung und dergleichen. Insbesondere die Filtration einer Dispersion der anorganischen Schichtverbindung, die in der vorliegenden Erfindung als Beispiel dient, kann beispielsweise durchgeführt werden, indem eine Polysulfon-Ultrafiltrationmembran verwendet wird, die eine Ausschlussgrenze von etwa 10000 oder eine Porengröße von etwa 5 nm aufweist.
Erfindungsgemäß wird die von der anorganischen Schichtverbindung adsorbierte nachweisbare Substanz gemessen. Das Messverfahren kann ausgewählt werden aus einem Absorptionsmessverfahren, Fluoreszenzmessverfahren, Lumineszenzmessverfahren, elektrochemischen Messverfahren, Lichtstreuungmessverfahren, Reflexionsmessverfahren oder dergleichen. Vorzugsweise ist es ein optisches Messverfahren wie Kolorimetrie wie beispielsweise Absorptiometrie mittels eines Absorptiometers oder dergleichen. Da die erfindungsgemäß verwendete anorganische Schichtverbindung kaum Licht im sichtbaren oder nahen infraroten Bereich absorbiert, selbst in Form einer kolloidalen Dispersion oder eines Gels, kann eine optische Messung durchgeführt werden. Wenn die Dispersion direkt gemessen wird, kann als das System beispielsweise ein Mittel wie ein Opalglasverfahren ausgewählt werden. Da die poröse Struktur, welche ein Reaktionssolvens durchdringen kann, unter Verwendung der anorganischen Schichtverbindung hergestellt werden kann, wie im Folgenden beschrieben wird, wird ein Teststück, das diesen Bereich als Nachweisbereich aufweist, der auch als ein Reaktionsbereich dient, verwendet, um die Reflexionsmessung, Absorptionsmessung, Fluoreszenzmessung und dergleichen durchzuführen. Ein elektrochemisches Messverfahren zum Messen eines Oxidations-/Reduktionsstroms oder eines Membranpotentials mit einer Elektrode kann ebenfalls verwendet werden. Die Elektrode wird mit der anorganischen Schichtverbindung, von der die nachweisbare Substanz adsorbiert worden ist, in Kontakt gebracht, um eine elektrochemische Antwort mit hoher Empfindlichkeit zu messen.
II. Erfindungsgemäßes Teststück
Das erfindungsgemäße Teststück ist ein analytisches Teststück zum Messen eines Analyten, indem eine nachweisbare Substanz gemessen wird, die gebildet wird, wenn der in einer Probe enthaltene Analyt mit einem Reagenz reagiert. Das Teststück umfasst mindestens einen Testbereich, der einen Nachweisbereich zum Nachweis der nachweisbaren Substanz aufweist.
Der Testbereich ist ein funktioneller Bereich, der für eine Reihe von analytischen Prozessen der Probe wie der Absorption, Diffusion, Reaktion, Nachweis und dergleichen in dem Teststück verantwortlich ist. Der Testbereich, dessen Struktur keiner besonderen Einschränkung unterliegt, umfasst im Allgemeinen den Nachweisbereich zum Nachweis der nachweisbaren Substanz, wie beispielsweise eines Farbstoffs, mittels Reflexion, Transmission/Absorption, Fluoreszenz oder dergleichen; einen Probenansaugbereich, der am Ende oder nahe dem Ende des Testbereichs bereitgestellt wird, um die Probe in den Testbereich anzusaugen oder einzuführen; einen Diffusions/Infiltrationsbereich, um die Probe in den Testbereich gleichförmig eindringen und verbreiten zu lassen; einen Reagenzbereich, der ein Reagenz enthält, welches mit dem in der Probe enthaltenen Analyten reagiert; einen Reaktionsbereich, in dem eine Reaktion wie beispielsweise eine Nachweisreaktion stattfindet; einen Entwicklungsbereich zum Abtrennen einer in einer Probe enthaltenen Komponente durch einen durch eine Nachweisreaktion gebildeten Farbstoff durch eine Funktion, die der Chromatographie ähnlich ist; einen Zeitkontrollbereich zum Kontrollieren des Ablaufs der Erfindung, indem die Zeit verwendet wird, während der sich die Probe bewegt; einen Haltebereich, um eine in der Probe enthaltene Komponente oder den gebildeten Farbstoff durch eine Adsorptionsfunktion festzuhalten oder zu entfernen; einen Adsorptionsbereich, der am Ende oder nahe dem Ende des Testbereichs auf einer Seite bereitgestellt wird, die dem Probenansaugbereich bezogen auf den Nachweisbereich gegenüber liegt, um überschüssige Probenlösung, eine Waschlösung und eine Entwicklungslösung zu absorbieren, um einen Rückfluss zu verhindern, und dergleichen.
Diese Bereiche, die die Funktionen des Testbereichs tragen, können einander bezüglich ihrer Funktion überlappen. Ein einzelner Bereich kann eine Mehrzahl von Funktionen aufweisen, beispielsweise kann der Nachweisbereich auch als der Reagenzbereich und der Reaktionsbereich dienen, und der Nachweisbereich kann auch als der Haltebereich dienen.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Teststücks ist ein Teststück, das mindestens einen mehrschichtigen Testbereich umfasst, der aus zwei oder mehreren Schichten zusammengesetzt ist, die eine Nachweisschicht zum Nachweis der nachweisbaren Substanz als den Nachweisbereich enthalten. Andere Schichten als die Nachweisschicht enthalten eine Probenansaugschicht zum Ansaugen einer Probe und um sie in den Testbereich einzuführen; eine Diffusionsschicht für ein gleichförmiges Eindringen und Verbreiten der Probe in dem Testbereich; eine Reagenzschicht, die ein Reagenz enthält, das mit dem in der Probe enthaltenen Analyten reagiert; eine Reaktionsschicht, in der eine Reaktion wie beispielsweise eine Nachweisreaktion stattfindet; eine Entwicklungsschicht oder Halteschicht, die zwischen der Reaktionsschicht und der Nachweisschicht gebildet wird, und eine Funktion aufweist, um eine störende Komponente zu entfernen; eine Absorptionsschicht zum Absorbieren eines Probenüberschusses einer Waschlösung oder einer zugegebenen Entwicklungslösung, um einen Rückfluss zu verhindern; eine Adhäsionsschicht zum Fixieren des Testbereichs auf einem Träger; und dergleichen. Besonders bevorzugt ist ein Teststück, das eine Diffusionsschicht umfasst, um die Probe zu verbreiten, zusätzlich zu der Nachweisschicht, so dass die Probe durch die Diffusionsschicht hindurchgeht, und verbreitet wird und die Nachweisschicht erreicht. Das erfindungsgemäße Teststück kann ein Teststück sein, das einen einzelnen Testbereich aufweist oder ein Mehrfachteststück, das zwei oder mehrere Testbereiche aufweist. Im Fall des Mehrfachteststücks kann eine Mehrzahl von Proben gleichzeitig analysiert werden, und zwei oder mehr in einer Probe enthaltene Analyten können gleichzeitig analysiert werden, indem unterschiedliche Reagenzien für unterschiedliche Substanzen verwendet werden.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Teststücks ist ein Teststück, das mindestens einen Testbereich umfasst, der eine Nachweisfläche zum Nachweis der nachweisbaren Substanz als den Nachweisbereich aufweist. Auf dem Teststück können andere Flächen als die Nachweisfläche gebildet werden, beispiels weise eine Probenansaugfläche zum Ansaugen und Einführen einer Probe in den Testbereich; eine Diffusionsfläche zum gleichförmigen Einführen und Verbreiten der Probe in den Testbereich; eine Reagenzfläche, die ein Reagenz enthält, das mit einem in der Probe enthaltenen Analyten reagiert; eine Reaktionsfläche, wo eine Reaktion wie beispielsweise eine Nachweisreaktion stattfindet; eine Entwicklungsfläche zum Abtrennen einer in der Probe enthaltenen Komponente oder eines durch eine Nachweisreaktion gebildeten Farbstoffs durch eine Funktion ähnlich der Chromatographie, wie beispielsweise Adsorption oder Verteilung; einen Zeitkontrollbereich zum Kontrollieren des Ablaufs einer Reaktion unter Verwendung der Zeit, während der die Probe sich bewegt; eine Haltefläche, um eine in einer Probe enthaltene Komponente oder den gebildeten Farbstoff durch eine Adsorptionsfunktion festzuhalten oder zu entfernen; eine Absorptionsfläche zum Absorbieren überschüssiger Probenlösung, einer Waschlösung oder einer Entwicklungslösung, um einen Rückfluss zu verhindern; und dergleichen. Besonders bevorzugt ist es ein Teststück, das eine Diffusionsfläche umfasst, um die Probe zu verbreiten, zusätzlich zu der Nachweisfläche, so dass die auf das Ende oder dergleichen des Teststücks aufgetropfte Probe durch die Diffusionsfläche hindurchtreten kann, über die Ebene des Teststücks hauptsächlich mittels einer kapillaren Infiltrationswirkung wandern kann und die Nachweisfläche erreicht. In diesem Fall kann die Nachweisfläche die zuvor erwähnte mehrschichtige Struktur aufweisen, die aus zwei oder mehreren Schichten, einschließlich der Nachweisschicht der nachweisbaren Substanz, zusammengesetzt ist. Das erfindungsgemäße Teststück kann ein Teststück sein, das lediglich einen Testbereich umfasst, der aus einem Satz der Nachweisfläche und der Reagenzfläche zusammengesetzt ist, oder ein Mehrfachteststück, das zwei oder mehrere Testbereiche darauf umfasst. Im Fall des Mehrfachteststücks kann eine Mehrzahl von Proben gleichzeitig analysiert werden, und zwei oder mehr in der Probe enthaltene Analyten können gleichzeitig analysiert werden, indem verschiedene Reagenzien für verschiedene Substanzen verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung kann der Reaktionsbereich, in dem der in der Probe enthaltene Analyt mit dem Reagenz reagiert, von dem Nachweisbereich getrennt bereitgestellt werden, so dass die nachweisbare Substanz in dem Reaktionsbereich gebildet wird und dann in den Nachweisbereich eingeführt und nachgewiesen wird. In diesem Fall wird der Nachweisbereich vorzugsweise an einer Stelle bereitgestellt, den die Probe erreicht, nachdem sie diffundiert ist und durch den Reaktionsbereich hindurchgegangen ist. Insbesondere wird die Nachweisschicht vorzugsweise an einer Stelle gebil det, welche die Probe erreicht, nachdem sie von der Oberfläche des mehrschichtigen Testbereichs eindringt, durch die Diffusionsschicht hindurchgeht, um zu diffundieren, als eine Zwischenschicht zu der Reaktionsschicht wandert und durch die Reaktionsschicht hindurchgeht. Die Nachweisfläche, die Reaktionsfläche und die Diffusionsfläche werden auf dem Teststück gebildet und die Nachweisfläche wird vorzugsweise in einer Fläche gebildet, welche die Probe erreicht, nachdem sie über die Ebene gewandert ist, durch die Diffusionsfläche hindurchgedrungen ist, zu der Reaktionsfläche gewandert ist und durch die Reaktionsfläche hindurchgegangen ist.
In der vorliegenden Erfindung kann der Nachweisbereich auch als Reaktionsbereich dienen, in dem der in der Probe enthaltene Analyt mit dem Reagenz reagiert, so dass die nachweisbare Substanz durch eine Reaktion zwischen dem in der Probe enthaltenen Analyten und dem Reagenz in dem Nachweisbereich gebildet werden kann.
Der Nachweisbereich der vorliegenden Erfindung ist ein Bereich, in dem die nachweisbare Substanz, wie beispielsweise ein Farbstoff, der durch eine Reaktion zwischen dem in der Probe enthaltenen Analyten und dem Reagenz gebildet wird, tatsächlich nachgewiesen wird. Der Nachweisbereich kann jedoch auch als der Reaktionsbereich dienen, in dem die zuvor genannte Reaktion stattfindet, oder als der Reagenzbereich dienen, der das Reagenz enthält wie zuvor beschrieben wurde. In diesem Fall ist das Reagenz im Allgemeinen vorher in dem Nachweisbereich enthalten. In der vorliegenden Erfindung kann das Teststück unabhängig von dem Reaktionsbereich und dem Reagenzbereich einen Nachweisbereich aufweisen. In diesem Fall kann das Reagenz nicht in dem Testbereich enthalten sein und kann vor und/oder nach Zugabe der Probe zugegeben werden. Oder es kann eine Lösung der nachweisbaren Substanz, wie beispielsweise ein Farbstoff, der durch eine Reaktion zwischen dem Analyten und der Probe gebildet wird, zugegeben werden.
Das erfindungsgemäße Teststück umfasst im Allgemeinen den Testbereich und einen Trägerbereich, der wie ein Blatt, ein Rohr oder ein Stab geformt ist, um den Testbereich zu stützen, und gegebenenfalls einen Sensor, wie beispielsweise eine Elektrode, eine Ansaugvorrichtung für die Probenlösung und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung wird vorzugsweise bei einem Teststück angewandt, bei dem ein Reagenz, das die nachweisbare Substanz, wie beispielsweise einen Farbstoff, bilden kann, und das im Folgenden beschriebene Reaktionssystem verwendet wird.
Das Reagenz unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wenn es durch Wechselwirkung, beispielsweise Adsorption, zwischen der nachweisbaren Substanz wie einem durch eine Reaktion gebildeten Farbstoff und der erfindungsgemäß verwendeten anorganischen Schichtverbindung einen Komplex bilden kann, wie in dem Abschnitt über das erfindungsgemäße Messverfahren bereits beschrieben worden ist.
Das Reagenz zum Bilden der nachweisbaren Substanz, die durch die anorganische Schichtverbindung oder dergleichen adsorbiert werden soll, kann in großem Umfang gefunden werden in Verbindungen wie beispielsweise einer Farbstoffvorstufe zum Bilden einer optisch nachweisbaren Substanz, wie beispielsweise eines Farbstoffs oder eines fluoreszierenden Farbstoffs durch eine Oxidations-Reduktions-Reaktion, eine Säure-Base-Reaktion, eine Kondensationsreaktion, eine Komplexbildungsreaktion und dergleichen, Verbindungen zum Bilden der elektrochemisch nachweisbaren oxidierten/reduzierten Form eines Elektronenträgers oder eine Komplexverbindung und dergleichen.
Da die Probe, das Reagenz oder das Reaktionsprodukt häufig in Form einer Lösung vorliegen, die Wasser als ein Solvens umfasst, wird die nachweisbare Substanz, wenn sie wasserlöslich ist, ohne Weiteres verbreitet und eluiert. Wenn die nachweisbare Substanz wasserlöslich ist, ist die Wirkung der vorliegenden Erfindung besonders ausgezeichnet. Daher ist das verwendete Reagenz vorzugsweise ein Reagenz zum Bilden einer wasserlöslichen nachweisbaren Verbindung. Tatsächlich werden eine große Anzahl solcher Reagenzien verwendet. Das Reagenz ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Probe, das Reagenz oder das Reaktionsprodukt können in einem anderen Solvens als Wasser aufgelöst werden. In diesem Fall kann das verwendete Reagenz ein Reagenz zum Bilden einer nachweisbaren Substanz sein, die durch dieses Solvens verbreitet und eluiert wird. Ein Reagenz zum Bilden einer nachweisbaren Substanz, die in dem Solvens der Probe, des Reagenzes oder des Reaktionsproduktes unlöslich ist, kann verwendet werden.
Reagenzien sind akzeptabel, wenn sie nachweisbare Substanzen bilden, wie sie in der Beschreibung des erfindungsgemäßen Testverfahrens aufgeführt sind. Bevorzugte Beispiele für das Reagenz umfassen Verbindungen, die ein konjugiertes System aufweisen, wie beispielsweise einen aromatischen Ring, insbesondere Reagenzien (die Chinonfarbstoffe bilden, wenn sie oxidationskondensiert werden) für einen Kuppler, wie z. B. 4-Amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-on und einen Wasserstoffdonor (N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin und dergleichen) als Farbstoffvorstufen; Farbstoffvorstufen zum Bilden von farberzeugenden Farbstoffen durch Oxidation wie beispielsweise o-Tolidin und Benzidine (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und dergleichen); Leukosubstanzen (entwickeln Farbe, wenn sie oxidiert werden) von Farbstoffen wie beispielsweise 2,6-Dichloro-4-((4-hydroxyphenyl)imino]-2,5-cyclohexadien-1-on; Verbindungen zum Bilden von fluoreszierenden Substanzen, wenn sie oxidiert werden, wie beispielsweise 4-Hydroxyphenylessigsäure; lumineszierende Substanzen wie chemilumineszierende Substanzen; Reagenzien zum Bilden von Farbstoffen, wenn sie reduziert werden, wie Tetrazoliumsalz (bildet Formazan, wenn sie reduziert werden) und 1,1'-Dimethyl-4,4'-bipyridiniumsalz; Verbindungen, die durch pH-Änderungen Farbe entwickeln oder ihre Farbe ändern, wie beispielsweise Bromkresol Grün; bekannte Reagenzien für Farbreaktionen wie Diazoniumsalze (bilden Azofarbstoffe durch Kupplung) einschließlich 2-Methoxy-4-morpholinobenzoldiazoniumsalz und 2,3-Dimethyl-2,3-bis(hydroxyamino)butan (entwickelt Farbe, wenn es mit Aldehyd reagiert); bekannte Reaktionsreagenzien wie o-Phthalaldehyd (bildet eine fluoreszierende Substanz, wenn es mit Histamin reagiert); Enzymsubstrate wie 4-Methylumbelliferylphosphat; Verbindungen, die durch Bildung eines Komplexes Farbe entwickeln oder ihre Farbe ändern wie 2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-[N-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]anilinsalz; und Verbindungen, die in der Lage sind, die vorstehenden nachweisbaren Substanzen zu bilden.
Reaktionssysteme zum Bilden der zuvor genannten nachweisbaren Substanzen sind diejenigen, die in den Messverfahren verwendet werden, wie sie in dem Abschnitt über das erfindungsgemäße Messverfahren beschrieben sind. Die Reaktionssysteme umfassen die Folgenden.

(a) Ein Reaktionssystem, dass eine Reaktion zum Bilden von Wasserstoffperoxid oder eine Oxidationsreaktion unter Verwendung von Wasserstoffperoxid als einem Oxidationsmittelumfasst.
(b) Ein Reaktionssystem, dass eine Reaktion zur Bildung von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) oder Nicotinamidadenindinucleophosphat (NADPH) oder eine Reaktion, in der NADH oder NADPH als ein Reduktionsmittel fungieren, umfasst.
(c) Ein Reaktionssystem, bei dem eine Reaktion verwendet wird zum Bilden eines Diazoniumsalzes, indem salpetrige Säure mit einem aromatischen primären Amin in Gegenwart einer Säure umgesetzt wird.
(d) Ein Reaktionssystem, das eine Reaktion umfasst, in dem ein fluoreszierendes Enzymsubstrat wie 4-Methylumbelliferon, das einen Phosphorsäureester aufweist, eine fluoreszierende Substanz bildet, indem ein Phosphat durch die Funktion von Alkaliphosphatase abgetrennt wird.
(e) Ein Reaktionssystem, dass eine Reaktion zum Bilden einer oxidierten/reduzierten Form eines Elektronenträgers umfasst, indem der Elektronenträger, wie beispielsweise 1,4-Diaminobenzol, mit einem oxidierenden/reduzierenden Enzym oxidiert/reduziert wird.

Analytische Verfahren, bei denen die zuvor genannten Reaktionssysteme verwendet werden, umfassen Immunoassays wie ELISA, Immunochromatographie, Urinuntersuchungen, biochemische Blutuntersuchungen, Kolorimetrie und dergleichen. Teststücke, die in diesen analytischen Verfahren verwendet werden, sind ausführlich beschrieben in Dokumenten wie H. G. Curme et al., Clinical Chemistry, 24 (8), 1335–1342 (1978); B. Walter, Analytical Chemistry, 55 (4), 498A (1983); Asaji Kondo, Bunseki, 1984 (7), 534; Asaji Kondo, Bunseki, 1986 (6), 387; Bunseki Kagaku Binran, S.8 (herausgegeben von der Japan Society for Analytical Chemistry: vierte überarbeitete Ausgabe, Maruzen (1991)); Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 6–213886 (1994) (Masao Kitajima et al.); M. P. Allen et al., Clinical Chemistry, 36 (9), 1591–1597 (1990); D. Noble, Analytical Chemistry, 65 (23), 1037A (1993); R. F. Zuk et al., Clinical Chemistry, 31 (7), 1144–1150 (1985) und dergleichen. Analyte, die durch diese Verfahren analysiert werden können, umfassen biologische Komponenten, die in Körperflüssigkeiten wie Urin und Blut enthalten sind, Spurenmengen von Substanzen, die in der Nahrung, Arzneimitteln oder der Umwelt vorliegen, industrielle chemische Substanzen, Spurenmengen von in Abfall enthaltenen Substanzen, und dergleichen. Das erfindungsgemäße Teststück kann bei der Analyse dieser Substanzen verwendet werden.
Eine Probe, bei der das erfindungsgemäße Teststück angewendet werden kann, kann lediglich einen Analyten oder zwei oder mehrere Analyten enthalten.
Eine bekannte Verbindung, die im Allgemeinen in einem analytischen Teststück verwendet wird, wie beispielsweise ein hydrophiles Polymer, kann in dem Testbereich des erfindungsgemäßen Teststücks nach Bedarf enthalten sein.
In der vorliegenden Erfindung muss eine anorganische Schichtverbindung in dem Testbereich des Teststücks enthalten sein, vorzugsweise dem Testbereich, der ein Bereich ist, in dem ein gebildeter Farbstoff des Testbereichs vorliegt.
Das heißt, die anorganische Schichtverbindung muss in mindestens einer Nachweisschicht oder Nachweisfläche, die den Testbereich bilden, enthalten sein. Insbesondere in einem mehrschichtigen Testbereich, der aus zwei oder mehreren Schichten einschließlich der Nachweisschicht zusammengesetzt ist, ist die anorganische Schichtverbindung mindestens in der Nachweisschicht enthalten. In diesem Fall kann die anorganische Schichtverbindung darüber hinaus in einer anderen Schicht als der Nachweisschicht enthalten sein, beispielsweise der Probenansaugschicht, der Diffusionsschicht, der Reagenzschicht, der Reaktionsschicht, der adhäsiven Schicht, der Halteschicht, der Entwicklungsschicht, der Absorptionsschicht oder dergleichen.
Wenn der Testbereich die Nachweisfläche aufweist, ist die anorganische Schichtverbindung mindestens in der Nachweisfläche enthalten. Darüber hinaus kann die anorganische Schichtverbindung in einer anderen Fläche als der zuvor genannten Nachweisfläche enthalten sein, beispielsweise der Probenansaugfläche, der Diffusionsfläche, der Reagenzfläche, der Reaktionsfläche, der Entwicklungsfläche, der Zeitkontrollfläche, der Haltefläche, der Absorptionsfläche oder dergleichen. In diesem Fall kann die Nachweisfläche eine mehrschichtige Struktur aufweisen. In diesem Fall ist die anorganische Schichtverbindung von den Schichten, welche die Nachweisfläche bilden, zumindest in der Nachweisschicht enthalten. Die anorganische Schichtverbindung kann darüber hinaus in anderen Schichten enthalten sein.
Wenn der Testbereich außer dem Nachweisbereich einen Reaktionsbereich aufweist, in dem ein in einer Probe enthaltener Analyt mit einem Reagenz reagiert, wird der Nachweisbereich vorzugsweise an einer Stelle bereitgestellt, welche die Probe erreicht, nachdem sie diffundiert ist und durch den Reaktionsbereich hindurchgeht, so dass die in dem Reaktionsbereich gebildete nachweisbare Substanz zu dem Nach weisbereich wandert, der die anorganische Schichtverbindung enthält, um nachgewiesen zu werden.
Beispiele für die anorganische Schichtverbindung, die in dem erfindungsgemäßen Teststück verwendet wird, umfassen die in der vorstehenden Beschreibung des erfindungsgemäßen Messverfahrens angeführten. Wie bei dem erfindungsgemäßen Messverfahren, sind von diesen anorganischen Schichtverbindungen Tonmineralien vom 2:1 Typ bevorzugt und besonders bevorzugt sind quellende Tonmineralien, die ein Ionenaustauschvermögen aufweisen. Von den quellenden Tonmineralien sind Bentonit, Smektit, Vermicullit und synthetische Glimmer (natürliche Glimmer ist im Allgemeinen ein nicht-quellendes Tonmineral) wie beispielsweise quellende synthetische Glimmer (oder Glimmer vom Na-Typ) wie beispielsweise synthetische Fluoroglimmer, mehr bevorzugt, und besonders bevorzugt sind synthetische Smektite wie synthetischer Hektorit und synthetischer Saponit und synthetischer Fluoroglimmer. Sie können alleine oder in Kombination von zweien oder mehreren verwendet werden. Bislang ist kein Versuch unternommen worden, eine anorganische Schichtverbindung in ein Teststück einzubringen und seine Wirkung auf die Unterdrückung der Diffusion oder Elution eines Farbstoffs oder dergleichen auszunutzen.
Wenn die anorganische Schichtverbindung zu dem Testbereich wie beispielsweise dem Nachweisbereich zugegeben wird, wird eine Nachweisreaktion überraschenderweise nicht beeinträchtigt. Dabei ermöglicht es die Zugabe dieser anorganischen Schichtverbindung, wobei beispielsweise von dem obigen Reaktionssystem Gebrauch gemacht wird und 4-AA und ein Wasserstoffdonor verwendet werden, eine Prüfung genauer und einfacher durchzuführen, ohne Elution fürchten zu müssen.
Ein Bereich, der die anorganische Schichtverbindung des Testbereichs enthält, ist vorzugsweise eine poröse Struktur, obwohl seine keiner besonderen Einschränkung unterliegt, sie wird jedoch vorzugsweise hauptsächlich durch die anorganische Schichtverbindung oder die anorganische Schichtverbindung und zumindest eine poröse Substanz gebildet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hydrophilen Polymeren, Membranfiltern, Faseranordnungen wie Filterpapier, Tuch, und Glasfilter, und feine Pulver organischer und anorganischer Verbindungen wie Cellulose und Diatomeenerde.
Die durch die anorganische Schichtverbindung gebildete poröse Struktur ist ein Sol, ein Gel, ein Agglomerat oder Aggregat der anorganischen Schichtverbindung, oder ein poröser Körper, der durch Trocknen oder Sintern dieser erhalten wird. Ein später noch zu beschreibender Puffer kann zu der porösen Struktur zugegeben werden. Beispielsweise wird ein Tropfen einer 1%-igen Dispersion der anorganischen Schichtverbindung auf einen Träger getropft, gegossen und lyophilisiert, um eine absorptive poröse Schicht zu erhalten.
Der Träger kann wie ein Blatt, ein Rohr oder ein Stab geformt sein. Das Material des Trägers unterliegt keiner besonderen Einschränkung und kann ausgewählt sein aus Faseranordnungen wie Filterpapier, nicht-gewebtem Tuch, Tüchern und Glasfiltern; granulären Substanzen wie Glasbeads, Polymerbeads und Titandioxid; granulären Substanzen und feinen Pulvern wie Cellulose, Diatomeenerde, löslichem Salz und hydrophoben Polysaccharidpulvern; Membranfiltern; organischen Polymeren wie Kunststoffplatten einschließlich Polyethylenterephthalat (PET) und Polystyrol und dergleichen. Bevorzugter ist die Substanz ein Gel eines hydrophilen Polymers oder ein Membranfilter oder eine Kunststoffplatte, deren Oberfläche hydrophil gemacht wurde.
Das hydrophile Polymer kann ein Polymer, ein Copolymer, eine assoziierte Substanz oder dergleichen sein, die eine chemische Struktur enthält wie beispielsweise ein Polyalkylenoxid wie beispielsweise Polyethylenoxid und Polypropylenoxid; Cellulosederivate wie beispielsweise Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose; Gelatine oder Derivate davon (wie beispielsweise phthalisierte Gelatine); andere Polysaccharide oder Derivate davon (Agarose, Carrageenan, Chitin, Chitosan oder dergleichen); Polyvinylalkohol; Polyvinylpyrrolidon; Polyacrylat (Natriumpolyacrylat, Copolymere davon mit Maleinsäure oder dergleichen); Polyacrylamid; Polymethacrylsäure (Polyhydroxyethylmethacrylat oder dergleichen); Methacrylamid; Polysulfon; Polyimid; Polystyrol; Polycarbonat; Polyetheretherketon; Polyoxymethylen; Natriumalginat; oder Polyolefinharz wie beispielsweise Polyethylen, Polypropylen oder Polyfluoroethylen, die hydrophil gemacht worden sind (durch UV-Exposition, Silanol-Behandlung oder dergleichen).
Vorzugsweise weist das zuvor genannte hydrophile Polymer eine Netzwerkstruktur auf, die durch Pfropfpolymerisation erzeugt wurde, wobei ein Quervernetzungsmittel oder eine Assoziation aufgrund hydrophober Affinität verwendet wurde und es ist unlöslich in Wasser.
Beispiele für das hydrophile Polymer umfassen mit Glutaraldehyd quervernetztes Polylysin, quervernetztes Polyethylenoxidprodukt, Polyacrylamidpfropfpolymer, Polyacrylatpfropfpolymere, Stärke-Acrylat-Pfropfpolymere und dergleichen.
Mindestens eine poröse Substanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hydrophilen Polymeren, Membranfiltern, Faseranordnungen und feinen Pulvern organischer und anorganischer Verbindungen und die anorganische Schichtverbindung können beide in dem Testbereich enthalten sein, um die poröse Struktur zu bilden. Um diese poröse Struktur zu bilden, kann ein Verfahren verwendet werden, bei dem eine Gemischlösung aus einer eine poröse Struktur bildenden Substanz und der anorganischen Schichtverbindung hergestellt wird und auf den zuvor beschriebenen Träger aufgegossen oder dieser damit imprägniert wird, ein Verfahren, bei dem eine eine poröse Struktur bildende Substanz zur Bildung eines porösen Trägers verwendet wird wie beispielsweise ein poröser Film und eine Dispersion oder eine Gemischlösung der anorganischen Schichtverbindung auf den porösen Träger gegossen oder dieser damit imprägniert wird, oder dergleichen.
Zum Mischen der anorganischen Schichtverbindung zum Zeitpunkt der Herstellung der porösen Struktur wird beispielsweise ein Verfahren verwendet, bei dem die anorganische Schichtverbindung mit einem hydrophilen Polymer oder seinen Pulvern verknetet und zu einem Film geformt wird. Alternativ kann eine Pufferlösung, in der die anorganische Schichtverbindung aufgelöst oder in einem später zu beschreibenden Puffer dispergiert ist, getrocknet werden und das erhaltene getrocknete Produkt kann mit einer Rohsubstanz gemischt werden.
Wenn der poröse Träger mit der Dispersion oder der Gemischlösung der anorganischen Schichtverbindung imprägniert wird, unterliegt die Art des verwendeten Solvens keiner besonderen Einschränkung und es können herkömmlich bekannte Lösungsmittel verwendet werden. Ein für das verwendete Nachweisreaktionssystem geeignetes Solvens kann ausgewählt sein aus Wasser wie destilliertem Wasser, Alkoholen wie Ethanol, Ketonen wie Aceton, Ethern wie Diethylether, Estern wie Ethylacetat, halogenierten Kohlenwasserstoffen wie Chloroform, und aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Benzol und Toluol. Vorzugsweise wird der poröse Träger mit einer Pufferlösung imprägniert, die die anorganische Schichtverbindung in einem später zu beschreiben den Puffer aufgelöst oder dispergiert umfasst. Die Konzentration der Lösung oder Dispersion kann entsprechend einem Reaktionssystem oder dergleichen in geeigneter Weise ausgewählt werden und unterliegt keiner besonderen Einschränkung.
Ein Verfahren zum Bilden einer Schicht oder einer Fläche, die die anorganische Schichtverbindung enthalten, wird im Folgenden beschrieben.
Um die Schicht oder die Fläche, welche die anorganische Schichtverbindung enthalten, zu bilden, kann eine poröse Struktur verwendet werden, die durch Trocknen oder Sintern eines Sols, eines Gels, eines Agglomerats oder eines Aggregates der anorganischen Schichtverbindung erhalten wird, verwendet werden. Beispielsweise wird ein Tropfen einer 1%-igen Dispersion der anorganischen Schichtverbindung auf ein Kunststoffblatt gegossen und lyophilisiert, wobei eine poröse Schicht erhalten wird, die ein hohes Absorptionsvermögen aufweist.
Mindestens eine eine poröse Struktur bildende Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den zuvor genannten hydrophilen Polymeren, Membranfiltern, Filteranordnungen und organischen und anorganischen Pulvern kann bei der Bildung verwendet werden.
Das hydrophile Polymer ist besonders bevorzugt Gelatine, Polyacrylsäure oder ein Derivat davon, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol, Polysaccharid oder ein Derivat davon, Polypeptid, oder Polyamin oder ein Derivat davon. Das hydrophile Polymer kann als ein Gel oder ein getrocknetes Produkt davon verwendet werden. Das hydrophile Polymer kann ein Gel sein, dessen Quervernetzungsgrad durch Zugabe eines bekannten Quervemetzungsmittels wie beispielsweise Glutaraldehyd gesteuert wird. Diese hydrophilen Polymere können alleine oder in Kombination verwendet werden.
Um eine poröse Struktur zu erhalten, welche die zuvor genannte Substanz und die anorganische Schichtverbindung enthält, können verschiedene Verfahren verwendet werden, die bereits in dem Abschnitt über das Verfahren zum Einbringen der anorganischen Schichtverbindung in den Testbereich beschrieben worden sind. Beispielsweise wird ein Filterpapier mit einer 1%-igen Dispersion der in einer Pufferlösung dispergierten anorganischen Schichtverbindung imprägniert und mit heißer Luft getrocknet, um eine poröse Fläche zu erhalten. Ein kleines Stück des Filterpapiers wird an einem Kunststoffblatt fixiert, wobei eine poröse Schicht erhalten wird.
Es kann beispielsweise das folgende Verfahren eingesetzt werden. Dieselbe Menge einer wässerigen Lösung eines Polyacrylamids, das eine vorher bestimmte Konzentration aufweist, wird mit einer 3%-igen Dispersion der anorganischen Schichtverbindung in einem Gewichtsverhältnis Polyacrylamid/anorganische Schichtverbindung von 1:1 bis 4:1 gemischt und mehrere Stunden lang gut gerührt. Der pH der erhaltenen Gemischlösung wird auf etwa 5 bis 9 eingestellt, indem eine verdünnte wässerige Lösung von Natriumcarbonat oder Essigsäure falls nötig zugegeben wird. Falls nötig, wird die Gemischlösung alkalisch gemacht, N,N-Methylbisacrylamid zu einer Konzentration von 2% zugegeben und die Gemischlösung Elektronenstrahlen ausgesetzt, um eine Quervernetzungsreaktion zu bewirken. Mit der so erhaltenen Gemischlösung wird eine Kunststoffplatte überzogen und getrocknet, wobei ein poröser Film erhalten wird.
Die auf diese Weise gebildete poröse Struktur, die die anorganische Schichtverbindung enthält, weist insbesondere ein hervorragendes Absorptionsvermögen auf und wird vorzugsweise als der Testbereich des Teststückes verwendet. Selbstverständlich ist das Bildungsbeispiel für den Testbereich nicht hierauf beschränkt. Beispielsweise kann die Bildung der Testbereiche von verschiedenen bekannten Teststücken angewendet werden. Diese Teststücke sind in Dokumenten beschrieben wie H. G. Curme et al., Clinical Chemistry, 24 (8), 1335–1342 (1978); B. Walker, Analytical Chemistry, 55(4), 498A (1983); Asaji Kondo „Bunseki" 1984 (7), 534; R. F. Zuk et al., Clinical Chemistry, 31 (7), 1144–1150 (1985); Asaji Kondo, Bunseki, 1986 (6), 387; Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 2–6541 (1990) (K. Hildenbrand); M. P. Allen et al., Clinical Chemistry, 36 (9), 1591–1597 (1990); Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 3–163361 (1991) (E. J. Kiser et al.); Bunseki Kagaku Binran, S. 8 (herausgegeben von der Japan Society for Analytical Chemistry: vierte überarbeitete Ausgabe, Maruzen (1991)); D. Noble, Analytical Chemistry, 65 (23), 1037A (1993); Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 5–157745 (1993) (Hidehiko Manabe et al.); Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 6–213886 (1994) (Masao Kitajima et al.); Japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 6–222061 (1994) (N. Brandt et al.); und dergleichen.
Die Konzentration einer Dispersion der anorganischen Schichtverbindung, das Mischungsverhältnis davon zu dem hydrophilen Polymer, und ein zu kontrollierender pH- Wert werden in geeigneter Weise auf der Basis von Parametern ausgewählt wie beispielsweise der Art der anorganischen Schichtverbindung, der Art eines zu adsorbierenden Farbstoffs, der Art und Menge des verwendeten hydrophilen Polymers, der Art und Menge des Puffers und der Viskosität der Gemischlösung, um eine erforderliche Porosität, Filmdicke der porösen Schicht und mechanische Festigkeit des Testbereichs zu erhalten.
Durch Zugabe eines Reagenzes, das mit einem in einer Probe enthaltenen Analyten unter Bildung der nachweisbaren Substanz an der so gebildeten porösen Struktur reagiert, kann die poröse Struktur als der Testbereich des Teststückes verwendet werden.
Die Menge der zugegebenen anorganischen Schichtverbindung wird gemäß einem verwendeten Reaktionssystem bestimmt. Je nach der verwendeten anorganischen Schichtverbindung ist es bevorzugt, beispielsweise einen Fall zu verhindern, bei dem die Anzahl der Adsorptionsstellen für die gebildete Substanz zu gering ist und die gebildete Substanz nicht vollständig adsorbiert werden kann und in der Lösung verbleibt, oder einen Fall, bei dem die Anzahl der Adsorptionsstellen zu groß ist und Unterschiede in der Konzentration der gebildeten Substanz, die an diesen Stellen adsorbiert ist, vorliegen, wie bei dem erfindungsgemäßen Messverfahren. Was die bevorzugte Menge der dem Reaktionssystem zuzugebenden Schichtverbindung betrifft, kann die Gesamtzahl der Adsorptionsstellen für einen Farbstoff oder dergleichen für jede Art von anorganischer Schichtverbindung erhalten werden, und jede Art von anorganischer Schichtverbindung kann zugegeben werden, so dass die maximale Menge des Farbstoffs oder dergleichen, die geformt werden kann, die Gesamtadsorptionsstellen der anorganischen Schichtverbindung nicht übersteigen.
Da, wie zuvor beschrieben wurde, der Grad der Adsorption durch die Zusammensetzung (pH, Ionenstärke, komplexbildende Komponenten und dergleichen) eines Puffers beeinflusst wird, kann er auf einen bestimmten Grad eingestellt werden, indem die Zusammensetzung, Konzentration oder pH des Puffers verändert wird oder die Menge einer zugegebenen Verbindung geändert wird, die mit einem Farbstoff oder dergleichen um die Adsorption an die anorganische Schichtverbindung konkurriert. Beispiele für die konkurrierende Verbindung umfassen Metallionen, organische Amine, Carbonsäuren, Phosphate und dergleichen. Surfactants und lösliche Polymere können ebenfalls verwendet werden.
Die Art des Puffers oder der Pufferlösung, die verwendet werden, der pH und die Konzentration des Puffers und dergleichen sind die gleichen, wie sie in dem Abschnitt über das erfindungsgemäße Messverfahren beschrieben sind.
Das Verfahren für die Zugabe eines Puffers unterliegt keiner besonderen Einschränkung. Ein Puffer kann als eine Pufferlösung zugegeben werden, in der die anorganische Schichtverbindung aufgelöst oder dispergiert ist oder als ein getrocknetes Produkt zusammen mit der anorganischen Schichtverbindung enthalten sein.
Bei der Herstellung eines Teststücks wird, obwohl in einer Dispersion der anorganischen Schichtverbindung ein transluzentes kolloidales Agglomerat gebildet werden kann, dieses Agglomerat durch Rühren der Dispersion gleichförmig redispergiert. Wenn das Agglomerat besonders unerwünscht ist, wird die Verwendung einer Phospatpufferlösung empfohlen, um das Dispersionsvermögen der anorganischen Schichtverbindung zu verbessern, wodurch es ermöglicht wird, die Bildung des Agglomerats zu unterdrücken.
Darüber hinaus können verschiedene Surfactants in dem Testbereich enthalten sein. Die Zugabe eines Surfactants verbessert die Beschichtungseigenschaften des Testbereichs oder dergleichen auf dem Träger. Da das Surfactant Funktionen zum Adsorbieren an der Grenzfläche und Dispergieren oder Auflösen einer Substanz aufweist, steht dies im Widerspruch zu der Adsorption der gebildeten nachweisbaren Substanz an die anorganische Schichtverbindung oder löst die gebildete nachweisbare Substanz auf, wodurch die Wirkung der vorliegenden Erfindung geschwächt werden kann. Ein Surfactant, das die Adsorption der gebildeten nachweisbaren Substanz an die anorganische Schichtverbindung nicht beeinträchtigt, wird daher vorzugsweise als das Surfactant ausgewählt, das in Kombination mit der anorganischen Schichtverbindung in der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Die Menge des verwendeten Surfactants ist vorzugsweise so gering, dass die zuvor genannte Beeinträchtigung vermieden wird. Die Art und Menge des Surfactants ist die gleiche wie die in dem vorstehenden Abschnitt über das erfindungsgemäße Verfahren beschriebene.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter veranschaulichen.
Beispiel 1
Peroxidase (POD), 4-AA und N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin (im Folgenden als EHSDA abgekürzt) als Farbstoffvorstufen, Bis-Tris-Puffer (pH 6,5) als ein Puffer und Smektit als eine anorganische Schichtverbindung wurden bei Endkonzentrationen, die in Tabelle gezeigt sind, verwendet und Wasserstoffperoxid wurde zu diesen zu einer Endkonzentration von 120 μmol/l zugegeben und reagieren gelassen, um eine Reaktionslösung zu erhalten. Das Absorptionsspektrum eines agglomerierten Teils der erhaltenen Reaktionslösung wurde bei einer Wellenlänge von 450 bis 750 nm gemessen.
POD, 4-AA, EHSDA und Bis-Tris-Puffer wurden zu Endkonzentrationen verwendet, die in Tabelle 3 angegeben sind, und Wasserstoffperoxid wurde zu diesen zu einer Endkonzentration von 120 μmol/l zugegeben und reagieren gelassen, um eine Reaktionslösung zu erhalten. Das Absorptionsspektrum der erhaltenen Reaktionslösung wurde ebenfalls bei einer Wellenlänge von 450 bis 750 nm gemessen.
Die Messung des Absorptionsvermögen wurde unter Verwendung des JascoV-550 (Japan Spectroscopic Co. Ltd.) bei Intervallen von 0,5 nm durchgeführt. Die Tastrate betrug 200 nm/min und die Bandbreite betrug 1,0 nm. Eine Wegwerfzelle, die eine Zellenlänge von 1 cm aufweist (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) wurde verwendet und ein 0,1 ml Schlitz wurde verwendet, um nur einen agglomerierten Teil zu messen, als ein Agglomerat erzeugt wurde, wenn Smektit zugegeben wurde. Die Messergebnisse sind in 1 gezeigt. Tabelle 2

*1) 4-Aminoantipyrin (4-Amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-on)
*2) N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin
*3) Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan
*4) Lucentile SWN (synthetischer Smektit: hergestellt von Co-op Chemical Co.)

Die verwendeten Reagenzien sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4
Wie aus den Ergebnissen von 1 hervorgeht, konnte bestätigt werden, dass eine Reaktion unter der Bedingung, dass ein Farbstoff an Smektit adsorbiert wird, ebenso abläuft wie unter der Bedingung, dass kein Smektit zugegeben wurde. Das Absorptionsmaximum, wenn kein Smektit zugegeben wurde, lag bei etwa 593 nm und das Absorptionsmaximum, wenn Smektit zugegeben wurde, lag bei etwa 587 nm.
Beispiel 2
POD, 4-AA, EHSDA und ein Bis-tris-Puffer (pH 6,5) wurden mit den in Tabelle 3 angegebenen Endkonzentrationen in eine Quarzzelle mit einer Zellenlänge von 1 cm gegeben und 3 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nachdem die Temperatur eingestellt war, wurde Wasserstoffperoxid zugegeben, das eine in Tabelle 5 angegebene Konzentration aufwies, um eine Reaktion zu starten und das Absorptionsvermögen wurde 3 Minuten nach Reaktionsbeginn gemessen. Diese Reaktion war 3 Minuten nach der Messung vollständig zu Ende.
Das verwendete Instrument war das JascoV-550 (Japan Spectroscopic Co. Ltd.) und die Messwellenlänge betrug 593 nm (Wellenlänge nahe dem Absorptionsmaximum). Aus diesem Ergebnis konnte eine Eichkurve von Wasserstoffperoxid, wenn kein Smektit zugegeben wurde, erhalten werden.
Tabelle 5
Beispiel 3
Experimentelles Verfahren
POD, 4-AA, EHSDA, ein Bis-tris-Puffer (pH 6,5) und synthetischer Smektit wurden in eine Wegwerfzelle einer Zellenlänge von 1 cm (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) mit den in der obigen Tabelle 2 angegebenen Endkonzentrationen gegeben, und die Temperatur wurde für 180 Sekunden auf 37°C eingestellt. Nach der Temperatureinstellung wurde Wasserstoffperoxid zu einer in Tabelle 6 angegebenen Endkonzentration zugefügt, und das Absorptionsvermögen wurde von 10 Sekunden nach Zugabe von Wasserstoffperoxid bis 1800 Sekunden bei Intervallen von 2 Sekunden gemessen. Das JascoV-550 (Japan Spectroscopie Co. Ltd.) wurde als Messvorrichtung verwendet und die Messwellenlänge betrug 577 nm (Wellenlänge nahe der Wellenlänge der maximalen Absorption). Um lediglich einen agglomerierten Teil zu messen, wurde ein 0,1 ml Schlitz verwendet. Das Messergebnis bei einer Wasserstoffperoxidkonzentration von 0 μmol/l wurde als Blindprobe verwendet, die Differenz des Absorptionsvermögens (ΔAbs) von der Blindprobe bei 1800 Sekunden nach dem Start der Messung wurde erhalten und eine Eichkurve von Wasserstoffperoxid, wenn Smektit zugegeben wurde, wurde erhalten.
Ergebnis
Das Ergebnis ist in 2 gezeigt zusammen mit dem Ergebnis, wenn in Beispiel 2 kein Smektit zugegeben wurde. Eine Eichkurve, die die logarithmische Darstellung sowohl in der Ordinatenachse als auch in der Abszissenachse der Eichkurve von 2 zeigt, ist in 3 angegeben. Aus den Tabellen 5 und 6 und 2 und 3 geht hervor, dass eine Korrelation besteht zwischen Absorptionsvermögen, das durch den Azofarbstoff und Wasserstoffperoxid erhalten wird. Wenn Smektit zugegeben wurde, wurde bei einer Wasserstoffperoxidkonzentration von 0 bis 200 μmol/l eine Eichkurve von r = 0,999 (r = Korrelationskoeffizient) erhalten.
Aus den 2 und 3 geht hervor, dass, wenn kein Smektit zugegeben wurde, die minimale Nachweisgrenze bei etwa 6 μmol/l lag, wogegen, wenn Smektit zugegeben wurde, die minimale Nachweisgrenze auf 3 μmol/l verbessert wurde. Die Steigung der Eichkurve betrug das etwa Zweifache dessen, wenn kein Smektit zugegeben wurde.
Tabelle 6
Beispiel 4
Experimentelles Verfahren
POD, 4-AA, EHSDA, ein Bis-tris-Puffer (pH 6,5) und synthetischer Smektit wurden in eine Wegwerfzelle einer Zellenlänge von 1 cm (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) zu den in der obigen Tabelle 2 angegebenen Endkonzentrationen gegeben, und die Temperatur wurde 180 Sekunden lang auf 37°C eingestellt. Nach der Temperatureinstellung wurde Wasserstoffperoxid zu einer Endkonzentration von 100 μmol/l zugegeben und das Absorptionsvermögen wurde ab 20 Sekunden nach Zugabe des Wasserstoffperoxids 600 Sekunden lang bei Intervallen von 2 Sekunden gemessen. Das JascoV-550 (Japan Spectroscopic Co. Ltd.) wurde als Messinstrument verwendet, und die Messwellenlänge betrug 577 nm (Wellenlänge nahe der Wellenlänge der maximalen Absorption). Um lediglich einen agglomerierten Teil zu messen, wurde ein 0,1 ml Schlitz verwendet. Das Messergebnis bei einer Wasserstoffperoxidkonzentration von 0 μmol/l wurde als Blindprobe verwendet.
POD, 4-AA, EHSDA und ein Bis-tris-Puffer (pH 6,5) wurden in eine Wegwerfzelle einer Zellenlänge von 1 cm (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) zu den in der vorstehenden Tabelle 3 angegebenen Endkonzentrationen gegeben, und die Temperatur wurde 180 Sekunden lang auf 37°C eingestellt. Nach der Temperatureinstellung wurde Wasserstoffperoxid zu einer Endkonzentration von 100 μmol/l zugegeben, und das Absorptionsvermögen wurde ab 20 Sekunden nach der Zugabe von Wasserstoffperoxid 600 Sekunden lang bei Intervallen von 2 Sekunden gemessen. Das JascoV-550 (Japan Spectroscopic Co. Ltd.) wurde als Messinstrument verwendet, und die Messwellenlänge betrug 593 nm (Wellenlänge nahe der Wellenlänge der maximalen Absorption). Es wurde ein 0,1 ml Schlitz verwendet.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 4 angegeben. Aus 4 geht hervor, dass die Zugabe von Smektit eine Erhöhung der Empfindlichkeit bewirkt. Es wird bestätigt, dass eine Farbentwicklungsreaktion etwa 30 Sekunden nach Zugabe von Wasserstoffperoxid einen Endpunkt erreicht. Selbst wenn Smektit zugegeben wurde, nachdem sich ohne Zugabe von Smektit Farbe entwickelt hatte, wurden die Adsorption und Agglomeration eines Farbstoffs beobachtet.
Beispiel 5
3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-bisphenylen)-bis[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (im Folgenden als „Tetrazoliumsalz" abgekürzt) als ein Tetrazoliumsalz, ein Phosphatpuffer (ein Gemisch aus Dinatriumhydrogenphosphat und Natriumdihydrogenphosphat, das einen pH von 8,5 aufweist) als ein Puffer, L-Ascorbinsäure und Smektit (Handelsname: Lucentite SWN: von Co-op Chemical Co. hergestellter synthetischer Smektit) wurden zu den in Tabelle 7 angegebenen Endkonzentrationen in ein Wegwerfröhrchen gegeben und unter Farbentwicklung miteinander reagieren gelassen. Diese Reaktion ist bekannt als eine Reaktion zur Bildung von wasserunlöslichem Formazan. Die erhaltene Farbentwicklungslösung wurde 10-fach verdünnt und das Absorptionsspektrum der Lösung wurde bei einer Wellenlänge von 400 bis 800 nm gemessen.
Zum Vergleich wurden das Tetrazoliumsalz, der Phosphatpuffer und die L-Ascorbinsäure in einem Wegwerfröhrchen zu in Tabelle 7 angegebenen Endkonzentrationen gegeben, wie zuvor beschrieben wurde, ohne Zugabe von Smektit und miteinander unter Farbentwicklung reagieren gelassen. Das Absorptionsspektrum der erhaltenen Farbentwicklungslösung wurde bei einer Wellenlänge von 400 bis 800 nm gemessen.
Das JascoV-550 Spektrophotometer von Japan Spectroscopic Co. Ltd. wurde zum Messen des Absorptionsvermögens verwendet. Eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) mit einer Zellenlänge von 1 cm wurde verwendet. Die Messergebnisse sind in 5 angegeben.
Tabelle 7
Es wurde Blau entwickelt und die Wellenlänge des Absorptionsmaximums betrug etwa 633 nm in dem System, dem kein Smektit zugefügt worden war. Rotes Purpur wurde entwickelt, und die Wellenlänge des Absorptionsmaximums betrug etwa 535 nm in dem System, dem Smektit zugefügt worden war. Es konnte bestätigt werden, dass eine Reaktion ablief unter der Bedingung, dass Smektit zugegeben wurde, ebenso wie unter der Bedingung, dass kein Smektit zugegeben wurde. Darüber hinaus trennte sich von der inneren Oberfläche der Zelle in dem System, dem kein Smektit zugegeben worden war, ein als Formazan angesehener Niederschlag ab, wogegen weder ein Niederschlag noch ein Agglomerat in der Zelle des Systems beobachtet wurde, dem Smektit zugegeben worden war. Da das Absorptionsmaximum sich zur Seite der kürzeren Wellenlänge verschiebt, wird davon ausgegangen, dass, wenn dasselbe Farbentwicklungsreaktionssystem wie in diesem Beispiel verwendet wird, es besser ist, die Messung des Absorptionsvermögens bei 633 nm (für das System, dem kein Smektit zugefügt wurde) bzw. 535 nm (für das System, dem Smektit zugefügt wurde) durchzuführen, welches Wellenlängen nahe den Wellenlängen des Absorptionsmaximums für das System, dem Smektit zugefügt wurde bzw. für das System, dem kein Smektit zugefügt wurde, sind.
Beispiel 6
Es wurde das gleiche Tetrazoliumsalz, Phosphatpuffer (pH 8,5) und Smektit, wie die in Beispiel 5 verwendeten zu den in Tabelle 8 angegebenen Endkonzentrationen in ein Wegwerfröhrchen gegeben und 3 Minuten lang bei 30°C inkubiert. Nach Inkubation wurde L-Ascorbinsäure zu Endkonzentrationen (0 bis 333 μmol/l), die in Tabelle 9 angegeben sind, zugegeben und 30 Minuten lang bei 30°C reagieren gelassen, und das Absorptionsvermögen wurde gemessen (Messwellenlänge von 535 nm). Eine Probe, die erhalten wurde, wenn keine Ascorbinsäure zugegeben wurde, wurde als Blindprobe verwendet, und aus den Messergebnissen wurde eine Eichkurve erstellt.
Zum Vergleich wurde das Tetrazoliumsalz und der Phosphatpuffer zu den in Tabelle 8 angegebenen Endkonzentrationen auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben in ein Wegwerfröhrchen gegeben, mit der Ausnahme, dass Smektit nicht zugefügt wurde und 3 Minuten lang bei 30°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde Ascorbinsäure zu Endkonzentrationen (0 bis 333 mol/l), wie in Tabelle 10 gezeigt, zugegeben und 30 Minuten lang bei 30°C reagieren gelassen, und das Absorptionsvermögen wurde gemessen (Messwellenlänge von 633 nm). Eine Probe, die erhalten wurde, wenn keine Ascorbinsäure zugefügt wurde, wurde als Blindprobe verwendet, und aus den Messergebnissen wurde eine Eichkurve erstellt.
6 zeigt die erhaltenen Eichkurven. In dem System, dem kein Smektit zugefügt wurde, wurde eine Eichkurve von r (Korrelationskoeffizient) = 0,9972 erhalten bei einer Ascorbinsäure-Endkonzentration von 41,7 bis 333,3 μmol/l. In dem System, dem Smektit zugefügt wurde, wurde eine Eichkurve von r = 0,9985 bei einer Ascorbinsäure-Endkonzentration von 5,2 bis 133,3 μmol/l erhalten. Es ist ersichtlich, dass die Steigung der erhaltenen Eichkurve in dem System, dem Smektit zugefügt wurde, etwa das 2,5-fache derjenigen des Systems, dem kein Smektit zugefügt wurde, beträgt, und dass eine die Empfindlichkeit verbessernde Wirkung durch die Zugabe von Smektit erhalten werden konnte. Darüber hinaus trennte sich von der inneren Oberfläche des Röhrchens in dem System, dem kein Smektit zugefügt worden war, ein als Formazan angesehener Niederschlag ab, wogegen in dem Röhrchen in dem System, dem kein Smektit zugefügt worden war, weder ein Niederschlag noch ein Agglomerat beobachtet wurde.
Das JascoV-550 Spektrophotometer von Japan Spectroscopic Co. Ltd. wurde zum Messen des Absorptionsvermögen verwendet. Eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) mit einer Zellenlänge von 1 cm wurde verwendet. Tabelle 8
Tabelle 9: System, dem Smektit zugefügt wurde
Tabelle 10: System, dem kein Smektit zugefügt wurde
Beispiel 7
Salzsäure, Smektit (Lucentite SWN von Co-op Chemical Co.), 2,4-Dichloroanilin und Natriumnitrit wurden zu in Tabelle 11 angegebenen Endkonzentrationen in der angegebenen Reihenfolge gegeben und miteinander vermischt, und ein Tsuda-Reagens (N,N-Diethyl-N'1-naphthylnaphthylethylen-diaminoxalat) wurde zugegeben und mit dem Gemisch reagieren gelassen. Auf diese Weise wurde ein Azofarbstoff gebildet und eine Farbentwicklung bewirkt. Das Absorptionsspektrum des Farbstoffs wurde bei einer Wellenlänge von 400 bis 800 nm gemessen. Das Natriumnitrit wurde in vier verschiedenen Konzentrationen zugegeben (0, 8, 16 und 33 μmol/l). Die Ergebnisse sind in 7 angegeben.
Zum Vergleich wurden Salzsäure, 2,4-Dichloroanilin und Natriumnitrit zu den in Tabelle 11 angegebenen Endkonzentrationen auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben zugegeben, mit der Ausnahme, dass kein Smektit zugegeben wurde, und ein Tsuda-Reagens wurde zugegeben, um Farbe zu entwickeln. Das Absorptionsspektrum des erhaltenen Gemischs wurde bei einer Wellenlänge von 400 bis 800 nm gemessen. Das Natriumnitrit wurde in vier verschiedenen Konzentrationen (0, 8, 16 und 33 μmol/l) zugegeben. Die Ergebnisse sind in 8 angegeben. Die Absorptionsspektren des Systems, dem Smektit zugegeben worden war, und des Systems, dem kein Smektit zugegeben worden war, die erhalten wurden, wenn die Konzentration von Natriumnitrit 33 μmol/l betrug, sind in 9 angegeben. Es wurde das JascoV-550 Spektrophotometer der Japan Spectroscopic Co. Ltd. zum Messen des Absorptionsvermögens verwendet. Es wurde eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) mit einer Zellenlänge von 1 cm verwendet.
Tabelle 11
In dem System, dem kein Smektit zugefügt worden war, wurde Purpurrot entwickelt und die Wellenlänge des Absorptionsmaximums betrug etwa 540 nm. In dem System, dem Smektit zugefügt worden war, wurde Purpur entwickelt und die Wellenlänge des Absorptionsmaximums betrug etwa 555 nm. Es konnte bestätigt werden, dass eine Reaktion abläuft unter der Bedingung, dass Smektit zugegeben wurde, ebenso wie unter der Bedingung, dass kein Smektit zugegeben wurde. Da sich das Absorptionsmaximum zu der Seite längerer Wellenlängen verschiebt, wird angenommen, dass, wenn dasselbe Farbentwicklungsreaktionssystem wie das dieses Beispiels verwendet wird, es besser ist, die Messung des Absorptionsvermögens bei 540 nm (für das System, dem kein Smektit zugefügt wurde) bzw. 555 nm (für das System, dem Smektit zugefügt wurde) durchzuführen, welches Wellenlängen nahe den Wellenlängen des Absorptionsmaximums des Systems, dem Smektit zugefügt wurde bzw. des Systems, dem kein Smektit zugefügt wurde, sind.
Beispiel 8
Es wurden dieselbe Salzsäure, 2,4-Dichloroanilin, Natriumnitrit und Tsuda-Reagens wie die in Beispiel 7 verwendeten in eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) zu in Tabelle 12 angegebenen Endkonzentrationen gegeben und 10 Minuten lang bei 30°C miteinander reagieren gelassen. Nachdem die Farbe vollständig entwickelt war, wurde Smektit zugegeben, um ein Agglomerat zu bilden und auszufallen. Ab 30 Sekunden nach der Zugabe des Smektits wurde das Absorptionsvermögen des Agglomerats 20 Minuten lang bei Intervallen von 1 Sekunde gemessen (Messwellenlänge von 555 nm). Um lediglich das Absorptionsvermögen des Agglomerats zu messen, wurde ein 0,1 ml Schlitz verwendet. Natriumnitrit wurde zu in Tabelle 13 angegebenen Endkonzentrationen zugegeben (0 bis 50 μmol/l). Das Ergebnis einer Probe, die erhalten wurde, wenn die Endkonzentration von Natriumnitrit 0 μmol/l betrug, wurde als Blindprobe verwendet, und die Differenz des Absorptionsvermögens der Blindprobe (ΔAbs) 20 Minuten nach Beginn der Messung wurde erhalten, um eine Eichkurve zu erstellen.
Als ein System, dem kein Smektit zugefügt wurde, wurden Salzsäure, 2,4-Dichloroanilin und Natriumnitrit zu in Tabelle 12 angegebenen Endkonzentrationen auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben in eine Wegwerfzelle gegeben und 3 Minuten lang bei 30°C inkubiert. Ein Tsuda-Reagens wurde zugegeben und das Absorptionsvermögen ab 10 Sekunden nach der Zugabe 10 Minuten lang bei Intervallen von 1 Sekunde (Messwellenlänge von 540 nm) gemessen. Natriumnitrit wurde zu in Tabelle 14 angegebenen Endkonzentrationen (0 bis 50 μmol/l) zugegeben. Das Absorptionsvermögen 10 Minuten nach der Messung wurde erhalten, um eine Eichkurve zu erstellen. Das Ergebnis einer Probe, die erhalten wurde, wenn die Endkonzentration von Natriumnitrit 0 μmol/l betrug, wurde als Blindprobe verwendet. Das in diesem Versuch verwendete Reaktionssystem erreichte einen Endpunkt vollständig in 10 Minuten.
10 zeigt die erhaltenen Eichkurven. In dem System, dem kein Smektit zugefügt wurde, wurde eine Eichkurve von r (Korrelationskoeffizient) = 0,9991 bei einer Natriumnitrit-Endkonzentration von 1,6 bis 50,0 μmol/l erhalten. In dem System, dem Smektit zugefügt wurde, wurde eine Eichkurve von r = 0,9940 bei einer Natriumnitrit-Endkonzentration von 0,4 bis 25,0 μmol/l erhalten. Die Neigung der erhaltenen Eichkurve in dem System, dem Smektit zugefügt wurde, betrug etwa das 2,5-fache derjenigen des Systems, dem kein Smektit zugefügt wurde. Es ist ersichtlich, dass ein die Empfindlichkeit erhöhender Effekt durch die Zugabe von Smektit erhalten werden kann.
Es wurde das JascoV-550 Spektrophotometer der Japan Spectroscopic Co. Ltd. zum Messen der Absorptionsvermögens verwendet. Es wurde eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) mit einer Zellenlänge von 1 cm verwendet. Tabelle 12
Tabelle 13: System, dem Smektit zugefügt wurde
Tabelle 14: System, dem kein Smektit zugefügt wurde
Beispiel 9
POD, 4-AA und N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin (im Folgenden als EHSDMeA abgekürzt) als Farbstoffvorstufen, ein Bis-tris-Puffer (pH 6,5) als ein Puffer und Smektit als eine anorganische Schichtverbindung wurden in eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Methacrylat), die eine Zellenlänge von 1 cm aufwies, zu in Tabelle 15 angegebenen Endkonzentrationen gegeben, und diese Probe wurde 180 Sekunden lang bei 37°C inkubiert. Als eine andere Probe wurden die vorstehenden Komponenten mit Ausnahme von Smektit zu denselben Konzentrationen hergestellt und auf gleiche Weise inkubiert.
Nach Einstellung der Temperatur wurden zu jeder dieser Proben zu einer in Tabelle 15 angegebenen Endkonzentration Wasserstoffperoxid zugegeben, und das Absorptionsvermögen wurde ab 20 Sekunden nach der Zugabe des Wasserstoffperoxids 1800 Sekunden lang bei Intervallen von 2 Sekunden gemessen. Es wurde das JascoV-550 Spektrophotometer der Japan Spectroscopic Co. Ltd. verwendet, und die Messwellenlänge betrug 630 nm. Da ein Agglomerat gebildet wurde, wenn Smektit zugegeben wurde, wurde ein 0,1 ml Schlitz verwendet, um lediglich einen agglomerierten Teil zu messen. Als ein Hintergrund für das System, dem Smektit zugefügt wurde, wurde eine Probe hergestellt, in dem Smektit zu derselben Konzentration zugegeben wurde, ohne Wasserstoffperoxid zuzugeben, und diese Reaktionslösung wurde gleichfalls gemessen.
Tabelle 15

*1) 4-Aminoantipyrin (4-Amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3N-pyrazol-3-on)
*2) N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin
*3) Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan
*4) Lucentite SWN (synthetischer Smektit: hergestellt von Co-op Chemical Co.)

Die verwendeten Reagenzien sind in der folgenden Tabelle 16 angegeben.
Tabelle 16
Die Ergebnisse sind in 11 angegeben. Wie aus 11 hervorgeht, wurde etwa 3 Minuten nach Beginn der Reaktion in dem System, dem kein Smektit zugegeben wurde, eine Verminderung des Absorptionsvermögens beobachtet, wogegen in dem System, dem Smektit zugegeben wurde, keine Verminderung des Absorptionsvermögens beobachtet wurde. Es konnte daher bestätigt werden, dass die Nachweisreaktion ablief, wenn Smektit zugegeben wurde, ebenso wie wenn kein Smektit zugegeben wurde, und darüber hinaus, dass ein Farbstoff, der durch eine Oxidationskondensation zwischen 4-AA und EHSDMeA gebildet wurde, von Wasserstoffperoxid nicht oxidiert und zersetzt wurde und seine Verfärbung aufgrund seiner Adsorption an Smektit unterdrückt wurde.
Beispiel 10
POD, 4-AA und EHSDMeA, ein Bis-tris-Puffer (pH 6,5) und Smektit wurden zu den in Tabelle 17 und 18 angegebenen Endkonzentrationen in eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Methacrylat), die eine Zellenlänge von 1 cm aufwies, gegeben, um fünf verschiedene Proben (Proben Nr. 1 bis 5) herzustellen, und jede Probe wurde 180 Sekunden lang bei 37°C inkubiert.
Nach Einstellen der Temperatur wurden zu jeder dieser Proben Wasserstoffperoxid in einer in Tabelle 18 angegebenen Menge zugegeben, um eine Reaktion zu starten. Ascorbinsäure wurde auch in einer in Tabelle 18 angegebenen Menge zugegeben, und zwar 60 Sekunden nach Zugabe von Wasserstoffperoxid, und das Absorptionsvermögen wurde 20 Sekunden nach der Zugabe in Intervallen von 1 Sekunde 300 Sekunden lang gemessen. Es wurde das JascoV-550 Spektrophotometer der Japan Spectroscopic Co. Ltd. als eine Messvorrichtung verwendet, und die Messwellenlänge betrug 630 nm. Es wurde ein 0,1 ml Schlitz verwendet, um lediglich einen agglomerierten Teil zu messen.
Tabelle 17

*1) Lucentite SWN (synthetischer Smektit, hergestellt von Co-op Chemical Co.)

Tabelle 18
Die verwendeten Reagenzien sind in der folgenden Tabelle 19 angegeben. Tabelle 19
Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 und 12 angegeben. 13 ist eine vergrößerte Ansicht eines Abschnitts von 0 bis 60 Sekunden in 12. Das Absorptionsvermögen (Abs) 0, 60 und 300 Sekunden nach Beginn der Messung ist in Tabelle 20 angegeben. Darüber hinaus wurde, um den Einfluss der Agglomeration zu subtrahieren, für die Proben Nr. 3 und 4 ΔAbs aus der Differenz des Absorptionsvermögens von Probe Nr. 5 erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 als Daten in Klammern angegeben.
Wie aus den 12 und 13 ersichtlich ist, trat in dem System, dem kein Smektit zugefügt wurde, unmittelbar nach Zugabe von Ascorbinsäure Verfärbung ein. Zum Zeitpunkt des Beginns der Messung (20 Sekunden nach Zugabe von Ascorbinsäure) wurde lediglich etwa 20% Farbentwicklung beobachtet, wenn keine Ascorbinsäure zugegeben wurde, und die Probe wurde 60 Sekunden nach Beginn der Messung (80 Sekunden nach Zugabe von Ascorbinsäure) achromatisch.
Im Gegensatz dazu wurde in dem System, dem Smektit zugegeben wurde, zum Zeitpunkt des Beginns der Messung (20 Sekunden nach der Zugabe von Ascorbinsäure) etwa 90% Farbentwicklung beobachtet, etwa 80% Farbentwicklung wurde 60 Sekunden nach Beginn der Messung (80 Sekunden nach der Zugabe von Ascorbinsäure), und etwa 50% Farbentwicklung 300 Sekunden nach Beginn der Messung (320 Sekunden nach der Zugabe von Ascorbinsäure) beobachtet.
Es konnte aus diesem Ergebnis bestätigt werden, dass die Reduktion und Zersetzung eines durch Ascorbinsäure gebildeten Farbstoffs durch die Zugabe von Smektit unterdrückt wurde.
Tabelle 20
Beispiel 11
3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium]chlorid (im Folgenden als „Tetrazoliumsalz" abgekürzt) als ein Tetrazoliumsalz, ein Phosphatpuffer, ein Gemisch aus Dinatriumhydrogenphosphat und Natriumdihydrogenphosphat, das einen pH von 8,5 aufwies) als ein Puffer, L-Ascorbinsäure und Smektit (Handelsname: Lucentite SWN, ein von Co-op Chemical Co. hergestellter synthetischer Smektit) wurden zu in Tabelle 21 angegebenen Endkonzentrationen in eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Polymethylmethacrylat) gegeben und 180 Sekunden lang bei 30°C inkubiert. Danach wurde L-Ascorbinsäure zugegeben, um eine Reaktion zu starten. Das Absorptionsvermögen wurde ab 10 Sekunden nach Zugabe bei Intervallen von 1 Sekunde 300 Sekunden lang gemessen, um den Zeitverlauf des Absorptionsvermögens zu beobachten. Die Messwellenlänge betrug 535 nm, und die Reaktionstemperatur betrug 30°C.
Zum Vergleich wurden das Tetrazoliumsalz und der Phosphatpuffer zu in Tabelle 21 angegebenen Endkonzentrationen auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben in eine Wegwerfzelle gegeben, mit der Ausnahme, dass Smektit nicht zugegeben wurde, und 180 Sekunden lang bei 30°C inkubiert. Danach wurde L-Ascorbinsäure zugegeben, um eine Reaktion zu starten. Das Absorptionsvermögen wurde ab 10 Sekunden nach Zugabe 300 Sekunden lang bei Intervallen von 1 Sekunde gemessen, um den Zeitverlauf des Absorptionsvermögens zu beobachten. Die Messwellenlänge betrug 633 nm, und die Reaktionstemperatur betrug 30°C.
Es wurde das JascoV-550 Spektrophotometer der Japan Spectroscopic Co. Ltd. zum Messen des Absorptionsvermögens verwendet, und es wurde eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Polymethylmethacrylat), die eine Zellenlänge von 1 cm aufwies, verwendet. Beide der vorstehenden Messwellenlängen liegen nahe den Wellenlängen des Absorptionsmaximums. 14 ist eine graphische Darstellung, die das Absorptionsvermögen in Bezug auf die vergangene Zeit zeigt. Die Reaktion wurde etwa 50 Sekunden nach Beginn der Messung in dem System, dem Smektit zugefügt wurde, stabil, wogegen die Reaktion in dem System, dem kein Smektit zugefügt wurde, etwa 300 Sekunden nach Beginn der Messung stabil wurde. Daraus geht hervor, dass die Reaktionsgeschwindigkeit durch Zugabe von Smektit erhöht wird.
Diese Reaktion ist als eine Reaktion zur Bildung von wasserunlöslichem Formazan bekannt. In dem System, dem Smektit zugefügt wurde, wurde in der Zelle kein Niederschlag oder Agglomeration beobachtet.
Tabelle 21
Beispiel 12
Salzsäure, Smektit (Lucentite SWN von Co-op Chemical Co.), 2,4-Dichloroanilin und Natriumnitrit wurden zu den in Tabelle 22 angegebenen Endkonzentrationen in eine Wegwerfzelle gegeben und 180 Sekunden lang bei 30°C inkubiert. Die Konzentration des Natriumnitrits betrug 1,6, 6,3, 12,5, 35,0 und 50,0 μmol/l innerhalb des Bereichs von 0 bis 50 μmol/l.
Nach Inkubation wurde ein Tsuda-Reagens (N,N-Diethyl-N'-1-naphthylnaphthylethylendiaminoxalat) zugegeben, und das Absorptionsvermögen wurde ab 10 Sekunden nach Zugabe 600 Sekunden lang bei Intervallen von 1 Sekunde gemessen, um den Zeitverlauf des Absorptionsvermögens zu beobachten. Die Messwellenlänge betrug 555 nm, und die Reaktionstemperatur betrug 30°C.
Zum Vergleich wurden Salzsäure, 2,4-Dichloroanilin und Natriumnitrit zu den in Tabelle 22 angegebenen Endkonzentrationen auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben in eine Wegwerfzelle gegeben, mit der Ausnahme, dass kein Smektit zugegeben wurde, und 180 Sekunden lang bei 30°C inkubiert.
Danach wurde ein Tsuda-Reagens zugegeben und das Absorptionsvermögen ab 10 Sekunden nach Zugabe 600 Sekunden lang bei Intervallen von 1 Sekunde gemessen, um den Zeitverlauf der Absorptionsvermögens zu beobachten. Die Messwellenlänge betrug 540 nm, und die Reaktionstemperatur betrug 30°C.
Es wurde das JascoV-550 Spektrophotometer der Japan Spectroscopic Co. Ltd. zum Messen des Absorptionsvermögen verwendet, und es wurde eine Wegwerfzelle (hergestellt aus Polymethylmethacrylat), die eine Zellenlänge von 1 cm aufwies, verwendet. Beide Messwellenlängen liegen nahe den Wellenlängen des Absorptionsmaximums.
15 bis 17 sind graphische Darstellungen, die die Messergebnisse des Absorptionsvermögens bezüglich der vergangenen Zeit zeigen. Dabei ist 15 eine graphische Darstellung in dem System, dem kein Smektit zugegeben wurde, 16 ist eine graphische Darstellung in dem System, dem Smektit zugegeben wurde, 17 ist eine graphische Darstellung in dem System, dem Smektit zugegeben wurde, und dem System, dem kein Smektit zugegeben wurde, wenn die Konzentration des Natriumnitrits 25,0 μmol/l beträgt. Gemäß dieser Figuren erreicht die Reaktion in etwa 300 Sekunden nach dem Beginn der Messung in dem System, dem kein Smektit zugegeben wurde, einen Endpunkt, wogegen die Reaktion in dem System, dem Smektit zugegeben wurde, in etwa 30 Sekunden nach dem Beginn der Messung einen Endpunkt erreicht. Daraus geht hervor, dass die Reaktionsgeschwindigkeit durch die Zugabe von Smektit erhöht wird.
Tabelle 22
Beispiel 13
POD, 4-AA und N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin (im Folgenden als EHSDA abgekürzt) als Farbstoffvorstufen und Bis-tris-Puffer (pH 6,5) als ein Puffer wurden zu den in Tabelle 23 angegebenen Endkonzentrationen verwendet, und dazu wurde Wasserstoffperoxid zugegeben, um eine Farbentwicklungslösung zu erhalten. 30 μl der erhaltenen Farbentwicklungslösung wurde auf Filterpapier (Nr. 2 von Toyo Roshi Co.) getropft, das mit einer 1%-igen Dispersion (Solvens: destilliertes Wasser) einer anorganischen Schichtverbindung (synthetischer Smektit: Handelsname Lucentite SWN von Co-op Chemical Co.) imprägniert war, und getrocknet, und auf unbehandeltes Filterpapier, um die Ausbreitung der Farbentwicklungslösung zu beobachten. Unter der Annahme, dass die Farbentwicklungslösung in Form eines Kreises eindrang und sich ausbreitete, wurden der größte Teil und der kleinste Teil des Durchmessers des Kreises gemessen, um die Fläche eines farbstoffdurchdrungenen Fleckes aus deren Mittelwert zu erhalten.
Tabelle 23

*1) 4-Aminoantipyrin (4-Amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-on)
*2) N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin
*3) Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan

Die verwendeten Reagenzien sind in der folgenden Tabelle 24 angegeben.
Tabelle 24
Die erhaltenen Durchmesser, Fläche und Farbton für den Fleck sind in Tabelle 25 angegeben. 18 und 19 zeigen schematisch Filterpapier, in dem die Farbentwicklungslösung ausgebreitet ist.
Tabelle 25
In dem mit einer Smektitdispersion imprägnierten Filterpapier war im Vergleich zu dem unbehandelten Filterpapier die Ausbreitung eines Farbstoffs unterdrückter und der Fleck war kleiner (etwa 1/8 der Fläche). Es wurde jedoch ein achromatischer Teil ohne einen Farbstoff der Farbentwicklungslösung in demselben Ausmaß durchdrungen wie der des unbehandelten Filterpapiers. Dadurch wurde bestätigt, dass der Farbstoff an in dem Filterpapier enthaltenen Smektit selektiv adsorbiert wurde.
Es wurde visuell beobachtet, dass der Farbton des Flecks in dem mit Smektit imprägnierten Filterpapier dunkler war als in dem unbehandelten Filterpapier und dass der Farbton sich zur Seite der kurzen Wellenlänge verschob. Darüber hinaus eluierte der Farbstoff selbst dann nicht, wenn das mit Smektit imprägnierte Filterpapier mit Wasser gewaschen wurde.
Es wurde gefunden, dass der Farbstoff an das Filterpapier durch die Zugabe von Smektit zu dem Filterpapier adsorbiert wurde und dass die Diffusion des Farbstoffs dadurch verhindert wurde und die Elution des Farbstoffs ebenfalls verhindert wurde.
Deshalb ist daher ersichtlich, dass, wenn das erfindungsgemäße Teststück verwendet wird, der gebildete Farbstoff nicht wandert oder eluiert und die Genauigkeit und Empfindlichkeit der Messung verbessert werden kann. Es ist ebenfalls ersichtlich, dass die Messung auf einfache Weise durchgeführt werden kann, da der Farbstoff nicht wandert oder durch das Trocknen des Testbereichs konzentriert wird und der gebildete Farbstoff selbst dann nicht eluiert, wenn das Teststück in die Probe eingetaucht gehalten wird.
Beispiel 14
Urintestpapier (Mehrfachtestpapier zum Messen von Nitrit, Glucose, okkultem Blut, Bilirubin und Urobilinogen, die im Urin enthalten sind: allgemeines Testpapier, das auf dem Markt erhältlich ist, hergestellt durch Bilden eines Testbereichs mittels imprägniertem Filterpapier mit jedem Reagens und Fixieren des Filterpapiers auf einem Kunststofffilm zusammen mit einem Testbereich zum Kalibrieren) wurde in Kontrollurin eingetaucht, der durch übliche Rezeptur hergestellt wurde, sofort wieder herausgezogen und etwa 30 Sekunden lang stehen gelassen bis eine Färbung beobachtet wurde, und ein Stück desselben Smektit-imprägnierten Filterpapiers, das in Beispiel 13 verwendet wurde, wurde gegen das Testpapier gepresst, um einen Farbstoff auf das Stück des Smektit-imprägnierten Filterpapiers zu übertragen. Die Ausbreitung des Farbstoffs auf dem Stück des Filterpapiers wurde visuell beobachtet. Das Stück des Filterpapiers wurde gut unter laufendem Wasser gewaschen, um visuell zu beobachten, ob Farbe austrat.
Als Kontrollen wurden Toyo Filterpapier Nr. 2 und Toyo Filterpapier Nr. 131, das bzw. die nicht mit Smektit behandelt waren, verwendet, um denselben Vorgang durchzuführen.
Das Messverfahren und die Formulierung in jedem Test waren wie folgt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 26 angegeben.
Nitrit-Test: Griess-Verfahren
Man ließ 4-Aminobenzolarsonsäure unter sauren Bedingungen mit einem Nitrit unter Bildung eines Diazoniumsalzes reagieren und das Diazoniumsalz wurde dann mit N-1-Naphthylethylendiamindihydrochlorid unter Bildung eines Azofarbstoffs gekuppelt. Für die Formulierung wurde ein Blatt Filterpapier mit 0,26 mg N-1-Naphthylethylendiamindihydrochlorid und 0,57 mg 4-Aminobenzolarsonsäure imprägniert und in 100 Teile aufgeteilt. Eines davon wurde zu einem Testbereich gemacht. Ein Teil absorbierte etwa 6 μl einer Lösung.
Glucose-Test:
Mittels Glucoseoxidase gebildetes Wasserstoffperoxid wurde mit einem Farbindikator (Tetrabase und Guajac als Chromogene) durch die katalytische Funktion von Peroxidase unter Farbentwicklung durch Oxidation reagieren gelassen. Für die Formulierung wurde ein Blatt Filterpapier mit 470 IU Glucoseoxidase, 219 PU Peroxidase, 13,0 mg Tetrabase und 4,3 mg Guajac imprägniert und in 100 Teile aufgeteilt. Eines davon wurde zu einem Testbereich gemacht. Ein Teil absorbierte etwa 6 μl einer Lösung.
Okkultbluttest:
Dies ist ein Verfahren, das die Zersetzung von Cumolhydroperoxid durch Hämoglobin und die Oxidationsfarbentwicklung von o-Tolidin durch den Sauerstoff einer gebildeten aktiven Gruppe einsetzt. Derselbe Effekt kann erwartet werden, wenn ein Benzidin (wie beispielsweise 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) anstelle von o-Tolidin verwendet wird. Für die Formulierung wurde ein Stück Filterpapier mit 52,6 mg Cumolhydroperoxid und 7,6 mg o-Tolidin imprägniert und in 100 Teile aufgeteilt. Eines davon wurde zu einem Testbereich gemacht. Ein Teil absorbierte etwa 6 μl einer Lösung.
Bilirubin-Test:
Dies ist ein Verfahren, das eine rasche Reaktion einsetzt, bei der ein Diazoniumsalz gebildet wurde aus 2-Methyl-5-nitroanilin oder Sulfanilsäure und Natriumnitrit als Diazoreagens unter sauren Bedingungen und mit Bilirubin in Gegenwart von Dyphyllin unter Bildung von Azobilirubin gekuppelt wurde. Für die Formulierung wurde ein Blatt Filterpapier mit 3,8 mg 2-Methyl-5-nitroanilin, 2,1 mg Natriumnitrit und einer geringen Menge Dyphyllin imprägniert und in 100 Teile aufgeteilt. Eines davon wurde zu einem Testbereich gemacht. Ein Bereich absorbierte 6 μl einer Lösung.
Urobilinogen-Test:
Dies ist ein Verfahren, das eine Azo-Kupplungsreaktion zwischen Urobilinogen und einem 3,3'-Dimethoxybiphenyl-4,4'-diazoniumbortetrafluoridsalz unter sauren Bedingungen einsetzt. Für die Formulierung wurde ein Blatt Filterpapier mit 0,36 mg 3,3'-Dimethoxybiphenyl-4,4'-diazoniumtetrafluoridborat imprägniert und in 100 Teile aufgeteilt. Eines davon wurde zu einem Testbereich gemacht. Ein Teil absorbierte etwa 6 μl einer Lösung.
Tabelle 26

Ausbreiten von Farbstoff... o: keine Ausbreitung, x: große Ausbreitung
Verlust von Farbe... o: Farbe kommt nicht heraus x: Farbe kommt heraus

Wie durch die Ergebnisse der Tabelle 26 gezeigt wird, wurde ein Farbstoff an Filterpapier adsorbiert, das mit einer anorganischen Schichtverbindung imprägniert war, und zwar ohne Ausbreitung und die Farbe ging beim Waschen nicht heraus. Daraus geht hervor, dass die Diffusion des Farbstoffs unterdrückt wird und die Elution des Farbstoffs in dem mit der anorganischen Schichtverbindung imprägnierten Filterpapier verhindert wird. In dem erfindungsgemäßen Teststück wandert oder eluiert der gebildete Farbstoff daher nicht, und es ist eine Verbesserung der Genauigkeit und Empfindlichkeit der Messung zu erwarten. Da die Konzentration und Wanderung des Farbstoffs durch Trocknen des Testbereichs nicht eintritt und der gebildete Farbstoff nicht eluiert, während das Teststück in der Probe eingetaucht ist, kann die Messung auf einfache Weise durchgeführt werden. Da der gebildete Farbstoff den benachbarten Testbereich in dem Mehrfachteststück nicht verunreinigt, ist darüber hinaus das Intervall zwischen benachbarten Testbereichen verkleinert, wodurch es ermöglicht wird, die Größe des Teststücks zu vermindern.
Wenn der gebildete Farbstoff bei Raumtemperatur ohne Lichtabschirmung der Luft ausgesetzt war, während der Farbstoff in unbehandeltes Filterpapier eindrang, wurden Farbveränderung und Verfärbung beobachtet, und etwa 1 Monat später wurde eine Färbung beobachtet, die völlig verschieden war von derjenigen direkt nach einer Reaktion. Andererseits wurden, wenn der gebildete Farbstoff, der an Filterpapier adsorbiert war, eine anorganische Schichtverbindung enthielt bei Raumtemperatur ohne Lichtabschirmung der Luft ausgesetzt war, selbst für mindestens 3 Monate keine Farbänderung und Verfärbung beobachtet.
Die obigen Tatsachen zeigen die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung. D. h., wenn das erfindungsgemäße Teststück verwendet wird, wird eine Probe bei einem Patienten zu Hause entnommen, eine Reaktionsfärbung auf dem Teststück bewirkt, und dieses Teststück wird an ein Untersuchungscenter an einem entfernten Ort geschickt, und es wird dasselbe Messergebnis wie direkt nach der Reaktionsfärbung erhalten. Mit anderen Worten, das erfindungsgemäße Teststück ist farbstabil, und ist unabhängig von der durch Trocknen verursachten Konzentration eines Farbstoffs und dessen durch Wassereintritt verursachten Elution. Daher kann es als Teststück verwendet werden, das mit der Post verschickt werden kann.
Beispiel 15
Eine Lösung, die, wie in der folgenden Tabelle 27 gezeigt, hergestellt wurde, wurde auf einen Polyethylenterephthalat (PET)-Film aufgebracht, der mit ultraviolettem Licht behandelt war, und zwar mittels eines Streichmessers zu einer Filmdicke von 100 μm und getrocknet. Dieser Überzugsfilm wurde in 1-cm Quadratstück geschnitten und zwar zusammen mit dem PET-Film, und das Stück wurde sandwichförmig zwischen Glasplatten gegeben, die einen Abstand von 500 μm zwischen sich aufwiesen, wie in 20 gezeigt ist, um eine Reaktionszelle herzustellen. 20 zeigt diese Reaktionszelle schematisch.
Zu dieser Reaktionszelle wurden 2 mmol/l Wasserstoffperoxid zugegeben, und die Farbentwicklung wurde an diesem Punkt beobachtet. Eine auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben hergestellte Lösung, mit der Ausnahme, dass kein Smektit zugegeben wurde, wurde verwendet, um eine Reaktionszelle zu bilden, und es wurde Farbentwicklung beobachtet. Tabelle 27

*1) Lucentite SWN (synthetischer Smektit der Co-op Chemical Co.)
*2) Hydroxyethylpropylcellulose

Es wurde Elution des gebildeten Farbstoffs aus dem Überzugsfilm beobachtet, der ohne Zugabe von Smektit gebildet wurde. Andererseits wurde, wenn Smektit zugegeben wurde, keine Elution des gebildeten Farbstoffs beobachtet.
Beispiel 16
Ein Beispiel für die Formulierung der Herstellung des erfindungsgemäßen Teststücks, das eine Nachweisschicht aufweist, die aus einer porösen Struktur zusammengesetzt ist, wird im Folgenden gezeigt. Dieses Teststück ist in 21 schematisch dargestellt.
Filterpapier (2 Chr von Whatman Co.) wurde in eine Reagenslösung eingetaucht, die GOD (Glucoseoxidase) und POD als Enzyme enthielt, die, wie in der folgenden Tabelle 28 angegeben, hergestellt wurde, und 30 Minuten lang bei 40°C getrocknet. Dieses Filterpapier wurde in Stücke von 5 mm × 5 mm geschnitten, die dann an ein Ende eines weißen Kunststofffilms von 5 mm × 100 mm mittels doppelt beschichtetem Klebebands geklebt wurden, wobei ein Teststück hergestellt wurde, das einen aus dem Filterpapier zusammengesetzten Testbereich aufwies.
Tabelle 28
Bei diesem Teststück wurden 6 μl Blutplasma mit einer Pipette auf den Testbereich getropft, oder das Teststück wurde in in einem Glas gesammelten Urin eingetaucht, und man ließ eine Reaktion ablaufen, und dann wurde die Intensität der in der Nachweisschicht entwickelten Farbe mit einem Reflektiometer oder dergleichen gemessen, so dass die in dem Blutplasma oder Urin enthaltene Glucosekonzentration gemessen werden kann. Die poröse Strukturschicht, welche die erfindungsgemäße anorganische Schichtverbindung enthält, kann als Nachweisschicht verwendet werden, die auch als Probenansaugschicht, als Reagensschicht und als die Reaktionsschicht in dem erfindungsgemäßen Teststück dienen.
Beispiel 17
Ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung des Teststücks, das eine Nachweisfläche mit poröser Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist, wird im Folgenden beschrieben. 22 zeigt dieses Teststück schematisch.
Filterpapier (2 Chr von Whatman Co.) wurde in eine Reagenslösung eingetaucht, die GOD und POD als Enzyme enthielt, und, wie in der folgenden Tabelle 29 angegeben, hergestellt wurde, und 30 Minuten lang bei 40°C getrocknet. Dieses Filterpapier wurde in ein Stück von 5 mm × 5 mm geschnitten, das dann an ein anderes Filterpapier von 5 mm × 100 mm (2 Chr von Whatman Co.) an einer vorher bestimmten Stelle (Reaktionsfläche in 22) durch Druck geklebt wurde. Danach wurde ein anderes Filterpapier (2 Chr von Whatman Co.) in eine Dispersion einer anorganischen Schichtverbindung eingetaucht, die, wie in der folgenden Tabelle 30 gezeigt, hergestellt wurde, und auf natürliche Weise bei Raumtemperatur getrocknet. Dieses Filterpapier wurde in ein Stück von 5 mm × 5 mm geschnitten, das dann zu dem obigen Filterpapier von 5 mm × 100 mm (2 Chr von Whatman Co.) geklebt wurde, das an einer vorher bestimmten Stelle (Haltefläche in 22) mittels Druck geklebt wurde. Das so hergestellte Teststück wies eine Probenansaugfläche, eine Diffusionsfläche, eine Reaktionsfläche, eine Haltefläche zum Adsorbieren einer nachweisbaren Substanz und eine Fläche zum Absorbieren von überschüssiger Probe auf. Die Haltefläche diente auch als eine Nachweisfläche. Tabelle 29
Tabelle 30
Die Probenansaugfläche dieses Teststücks wurde in das Blutplasma eingetaucht, das in einer Küvette gesammelt war oder in den Urin, der in einem Glas gesammelt war. Die Probe trat durch die Probenansaugfläche hindurch und die Diffusionsfläche hindurch und erreichte die Reaktionsfläche, wo sie mit dem Reagens gemischt wurde und eine Reaktionslösung wurde. Nachdem die Reaktionslösung weiter durch die Fläche der Reaktionszeitkontrolle und der Haltefläche durchgetreten war, wurde das Teststück herausgezogen. Die Intensität der Färbung in dem Haltebereich wurde mit einem Reflektiometer oder dergleichen gemessen, um die Konzentration von in dem Blutplasma oder dem Urin enthaltener Glucose zu messen.
Die poröse Struktur, die die erfindungsgemäße anorganische Schichtverbindung enthält, kann als die Nachweisfläche verwendet werden, die auch als die Haltefläche zum Adsorbieren einer nachweisbaren Substanz (Farbstoff) dient, die in der Reaktionslösung in diesem Beispiel des Teststücks enthalten ist.
Industrielle Anwendbarkeit
Das erfindungsgemäße Testverfahren kann als ein Verfahren mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit zum Messen einer Substanz verwendet werden. D. h. gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Verfahren wird eine hochempfindliche Messung durch Messen einer nachweisbaren Substanz ermöglicht, nachdem eine anorganische Schichtverbindung wie ein Tonmaterial zu einem Reaktionssystem zugegeben wird, um die nachweisbare Substanz zu adsorbieren. Gemäß dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren wird durch Zugabe einer anorganischen Schichtverbindung wie beispielsweise eines Tonminerals zu einem Reaktionssystem eine nachweisbare Substanz wie ein Farbstoff an der anorganischen Schichtverbindung adsorbiert und geschützt, wodurch die Zersetzung der nachweisbaren Substanz durch überschüssiges Wasserstoffperoxid, reduzierende Ascorbinsäure oder dergleichen unterdrückt werden kann und die nachweisbare Substanz stabilisiert werden kann. Daher kann eine Verfärbung oder dergleichen vermieden werden, wenn ein Farbstoff die nachweisbare Substanz ist, und es ist eine stabile, hochempfindliche und hochgenaue Messung möglich. Gemäß dem dritten erfindungsgemäßen Verfahren wird durch Zugabe einer anorganischen Schichtverbindung wie einem Tonmineral zu einem Reaktionssystem, das eine nachweisbare Substanz bildet, die Geschwindigkeit der Bildungsreaktion erhöht, um eine rasche Messung zu ermöglichen. Gemäß dem vierten erfindungsgemäßen Verfahren wird, indem die Bildungsreaktion einer nachweisbaren Substanz durch Dispergieren einer anorganischen Schichtverbindung wie beispielsweise einem Tonmaterials in einem Reaktionssolvens eine hochempfindliche Messung ermöglicht, selbst in einem Reaktionssystem, das eine unlösliche Substanz bildet. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Teststück wird ein Farbstoff oder dergleichen kaum diffundiert und eluiert, und es wird eine empfindlichere und genaue einfache Analyse ermöglicht.
Das erfindungsgemäße Messverfahren kann zum Nachweis, zur Bestimmung oder dergleichen von biologischen Komponenten verwendet werden, die in Körperflüssigkeiten wie Urin und Blut, Nahrungsmitteln, Arzneimitteln, Substanzen, die in der Umwelt in Spurenmengen vorliegen, industriellen chemischen Substanzen, die in Abfall in Spurenmengen vorliegen und dergleichen, verwendet werden.

Claims

Verfahren zum Messen eines Analyten, das einen Schritt umfasst, bei dem eine nachweisbare Substanz gemessen wird, indem ein Reaktionssystem verwendet wird, das eine Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz umfasst, welche auf einer chemischen Reaktion eines Reagenses mit dem in einer Probe enthaltenen Analyten beruht, wobei eine anorganische Schichtverbindung, die ausgewählt ist aus Schichttonmineralien und Hydrotalcit zu dem Reaktionssystem zugegeben wird, welches die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz in einer Menge aufweist, welche eine Adsorption der nachweisbaren Substanz bewirkt, wodurch die Messempfindlichkeit der nachweisbaren Substanz erhöht wird.
Verfahren zum Messen eines Analyten nach Anspruch 1, wobei die anorganische Schichtverbindung zu dem Reaktionssystem in einer Menge zugegeben wird, die eine Unterdrückung der Zersetzung der nachweisbaren Substanz bewirkt.
Verfahren zum Messen eines Analyten nach Anspruch 1, wobei die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz in Gegenwart einer Menge der anorganischen Schichtverbindung durchgeführt wird, die eine Erhöhung einer Reaktionsgeschwindigkeit der Bildungsreaktion bewirkt.
Verfahren zum Messen eines Analyten nach Anspruch 1, wobei mindestens eine der Reaktionen, die das Reaktionssystem bilden, die Bildungsreaktion einer im einem Reaktionsolvens unlöslichen Substanz ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die anorganische Schichtverbindung ein 2:1 Typ Tonmineral ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das 2:1 Typ Tonmineral ein quellendes Schichttonmineral ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das quellende Schichttonmineral mindestens ein Element ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bentonit, Smektit, Vermiculit und synthetischem Fluorglimmer ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Smektit ein synthetischer Smektit ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der synthetische Smektit mindestens ein Element ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hektorit und Saponit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die anorganische Schichtverbindung Hydrotalcit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die nachweisbare Substanz mittels eines optischen Verfahrens oder eines elektro-chemischen Verfahrens nachgewiesen werden kann.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die nachweisbare Substanz ein mittels eines optischen Verfahrens nachweisbarer Farbstoff ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz eine Oxidations-Reduktions-Reaktion ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die nachweisbare Substanz eine Verbindung ist, die mittels eines elektro-chemischen Verfahrens nachweisbar ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Elektronenträger, einem Elektronendonor und einem Elektronenrezeptor.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz eine Oxidations-Reduktions-Reaktion ist und das Reaktionssystem, welches die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz umfasst, eine Bildungsreaktion von Wasserstoffperoxid oder eine Oxidationsreaktion, bei der Wasserstoffperoxid als ein Oxidationsmittel verwendet wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz eine Oxidations-Reduktions-Reaktion ist und das Reaktionssystem, das die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz umfasst, die Bildungsreaktion von Nikotinamidadenindinucleotid oder Nikotinamidadenindinucleotidphosphat oder eine Reaktion, in der Nikotinamidadenindinucleotid oder Nikotinamidadenindinucleotidphosphat als Reduktionsmittel wirkt, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Analyt gemessen wird durch colorimetrische Bestimmung einer Menge eines Farbstoffs, der eine quantitative Korrelation mit dem Analyten aufweist und durch eine Oxidations-Reduktions-Reaktion zwischen aus dem Analyten durch eine chemische Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxid und einem oxidierbaren Farbkuppler gebildet wird, wobei zumindest eine Zersetzung des Farbstoffs durch Wasserstoffperoxid durch Zugabe der anorganischen Schichtverbindung zu einem System der Oxidations-Reduktions-Reaktion unterdrückt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Analyt gemessen wird durch Bestimmen einer Menge einer Azoverbindung, die eine quantitative Korrelation mit dem Analyten aufweist und gebildet wird durch eine Kupplungsreaktion zwischen einem Diazoniumsalz, das aus dem Analyten durch eine chemische Reaktion gebildet wird, und einem Kupplungsmittel, wobei die Zersetzung der Azoverbindung durch Zugabe der anorganischen Schichtverbindung zu einem System der Kupplungsreaktion unterdrückt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zersetzung der nachweisbaren Substanz die Zersetzung der nachweisbaren Substanz durch Ascorbinsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei eine Ausgangssubstanz oder eine Zwischenstufe der Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz eine kationische Verbindung ist, die an die anorganische Schichtverbindung adsorbiert werden kann.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Ausgangssubstanz oder die Reaktionszwischenstufe ein Diazoniumsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Ausgangssubstanz oder die Zwischenstufe ein Tetrazoliumsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz eine Reduktionsreaktion eines Tetrazoliumsalzes ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die anorganische Schichtverbindung in einem Reaktionsmedium des Reaktionssystems in Form eines Elementes aus der Gruppe bestehend aus Dispersion, Gel, Sol, Aufschlämmung, Agglomerat, Aggregat und gesintertem porösem Körper ausgewählten dispergiert ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die anorganische Schichtverbindung zu dem Reaktionssystem als eine Dispersion der anorganischen Schichtverbindung zugegeben wird.
Analytisches Teststück zum Messen eines Analyten durch Messen einer nachweisbaren Substanz unter Verwendung eines Reaktionssystems, welches eine Bildungsreaktion der nachweisbaren Substanz, basierend auf einer chemischen Reaktion des in einer Probe enthaltenen Analyten, umfasst, wobei das Teststück mindestens einen Testbereich umfasst, der einen Nachweisbereich aufweist, welcher eine Nachweisfläche (23) zum Nachweisen der nachweisbaren Substanz und einen Reaktionsbereich, wo der in der Probe enthaltene Analyt mit einem Reagens (26) reagiert, aufweist und die nachweisbare Substanz in dem Reaktionsbereich (30) gebildet wird, und das Teststück eine anorganische Schichtverbindung (25), die ausgewählt ist aus Schichttonmineralien und Hydrotalcit, zumindest in der Nachweisfläche in einer Menge enthält, die ein Adsorbieren der nachweisbaren Subs-tanz bewirkt, wodurch die Messempfindlichkeit der nachweisbaren Substanz erhöht wird.
Teststück nach Anspruch 26, das mindestens einen Testbereich als den Nachweisbereich umfasst, der zusammengesetzt ist aus zwei oder mehr Schichten einschließlich einer Nachweisschicht (23) zum Nachweis der nachweisbaren Substanz und die anorganische Schichtverbindung (25) zumindest in der Nachweisschicht enthält.
Teststück nach Anspruch 27, wobei der Testbereich eine Diffusionsschicht (29) zum Diffundieren einer Probe umfasst, so dass die Probe überall durch die Diffusionsschicht hindurch tritt, um sich auszubreiten und die Nachweisschicht (23) erreicht.
Analytisches Teststück nach Anspruch 26, wobei das Teststück auch eine Diffusionsfläche zum Diffundieren der Probe umfasst, so dass die Probe durch die Diffusionsfläche hindurch tritt, um sich auszubreiten, und die Nachweisfläche erreicht und das Teststück zumindest in der Nachweisfläche eine anorganische Schichtverbindung enthält.
Teststück nach Anspruch 26, wobei die Nachweisfläche aus zwei oder mehreren Schichten einschließlich einer Nachweisschicht (23) zum Nachweis der nachweisbaren Substanz gebildet ist.
Teststück nach Anspruch 26, wobei der Nachweisbereich an einer Stelle bereit gestellt wird, die die Probe erreicht, nachdem die Probe diffundiert ist und durch den Reaktionsbereich durchtritt.
Teststück nach Anspruch 26, wobei die nachweisbare Substanz durch eine Reaktion zwischen dem in der Probe enthaltenen Analyten und einem Reagens in dem Nachweisbereich gebildet wird.
Teststück nach einem der Ansprüche 26 bis 32, wobei ein Bereich, der die anorganische Schichtverbindung in dem Teststück enthält, aus einer porösen Struktur gebildet ist.
Teststück nach Anspruch 33, wobei die poröse Struktur durch die anorganische Schichtverbindung oder durch die anorganische Schichtverbindung und mindestens einem Element ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem hydrophilen Polymer, einem Membranfilter, einer Faseranordnung und feinen Pulvern organischer und anorganischer Verbindungen gebildet ist.
Teststück nach einem der Ansprüche 26 bis 32, wobei die anorganische Schichtverbindung ein 2:1 Typ Tonmineral ist.
Teststück nach Anspruch 35, wobei das 2:1 Typ Tonmineral ein quellendes Schichttonmineral ist.
Teststück nach Anspruch 36, wobei das quellende Schichttonmaterial mindestens ein Element ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bentonit, Smektit, Vermiculit und synthetischen Fluorglimmer ist.
Teststück nach Anspruch 37, wobei der Smektit synthetischer Smektit ist.
Teststück nach Anspruch 38, wobei der synthetische Smektit mindestens ein Element aus der Gruppe bestehend aus Hektorit und Saponit ist.
Teststück nach einem der Ansprüche 26 bis 32, wobei in dem Testbereich ein Reagens enthalten ist.
Teststück nach Anspruch 40, wobei das Reagens in dem Testbereich durch Zugabe einer Lösung des Reagenses vor und/oder nach der Zugabe der Probe zu dem Testbereich enthalten ist.
Teststück nach einem der Ansprüche 26 bis 32, wobei ein Puffer oder ein getrocknetes Produkt davon darüber hinaus in einem Bereich enthalten ist, der die anorganische Schichtverbindung enthält.
Teststück nach einem der Ansprüche 26 bis 32, wobei das Reagens in der Lage ist, eine Substanz zu bilden, welche durch ein optisches Verfahren nachweisbar ist, wenn das Reagens mit dem Analyten reagiert.
Teststück nach Anspruch 43, wobei die Substanz, die durch das optische Verfahren nachweisbar ist, wasserlöslich ist.