JPWO2018051822A1 - ２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２ｈ−テトラゾリウム塩、ならびに当該塩を含む生体成分濃度測定用試薬および当該塩を用いる生体成分濃度の測定方法 - Google Patents
２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２ｈ−テトラゾリウム塩、ならびに当該塩を含む生体成分濃度測定用試薬および当該塩を用いる生体成分濃度の測定方法 Download PDFInfo
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Abstract
血液の吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上）に十分な発色ピークを有する化合物を提供する。下記式（１）：式（１）において、ｍは、スルホ基（−ＳＯ３−）がテトラゾール骨格の５位のフェニル基に結合する数であり、１または２であり、ｎは、Ｒ２がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０〜２の整数であり、ｐは、スルホ基（−ＳＯ３−）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０または１であり、ｎ＋ｐは１以上であり、ｑは１または２であり、ｑが２の場合、各ＯＲ３は隣接して配置され、この際、各ＯＲ３が互いに環を形成してもよく、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす；で示される、２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩。
Description
本発明は、２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、ならびに当該塩を含む生体成分濃度測定用試薬および当該塩を用いる生体成分濃度の測定方法に関する。
臨床化学検査では、血液や尿等の生体の体液に含まれる生体成分の量を色素量として検出定量する方法があり、この方法に用いる試薬を発色試薬と呼んでいる。
例えば、特開平８-５３４４４号公報では、下記構造：
（Ｒ１は水素原子またはメトキシ基を表わし、Ｒ２は水素原子、カルボキシル基またはスルホン酸を表わす）を有する水溶性テトラゾリウム塩化合物を用いて還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドを定量する方法が開示されている。
上記特開平８−５３４４４号公報のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンは高い水溶性を有するが、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上）での発色強度が十分でない。このため、上記特開平８−５３４４４号公報のテトラゾリウム塩では、全血サンプルに対しては十分な感度を達成することができない。
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、生体成分濃度測定用試薬は、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上）に十分な発色ピークを有する。これにより、全血サンプルに対しても十分な感度で生体成分を定量できる手段を提供することを目的とする。
本発明の他の目的は、生体成分濃度測定用試薬の水溶性は維持しつつ、全血をサンプルとした場合でも十分な感度でかつ安定的に生体成分を定量できる手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、テトラゾール骨格の、２位にメトキシ基またはエトキシ基が導入されたベンゾチアゾリル基を、３位に置換フェニル基を、および５位に少なくとも１個のスルホ基（−ＳＯ３ −）を有するフェニル基を有するテトラゾリウム塩が上記課題を解決することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、上記目的は、下記式（１）：
式（１）において、Ｒ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ２は、ニトロ基、−ＯＲ４、およびカルボキシル基（−ＣＯＯ−）からなる群から選択されるいずれか一つであり、複数のＲ２は同一であっても異なっていてもよく、Ｒ３は、水素原子、メチル基またはエチル基であり、少なくとも１はメチル基またはエチル基であり、Ｒ４は、メチル基またはエチル基であり、ｍは、スルホ基（−ＳＯ３ −）がテトラゾール骨格の５位のフェニル基に結合する数であり、１または２であり、ｎは、Ｒ２がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０〜２の整数であり、ｐは、スルホ基（−ＳＯ３ −）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０または１であり、ｎ＋ｐは１以上であり、ｑは１または２であり、ｑが２の場合、各ＯＲ３は隣接して配置され、この際、各ＯＲ３が互いに環を形成してもよく、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす；で示される、２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩によって達成できる。
本発明の第一の側面では、下記式（１）：
の構造を有する２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩が提供される。本明細書において、上記式（１）の２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩を、単に「本発明のテトラゾリウム塩」または「テトラゾリウム塩」とも称する。
本発明のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物は、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上）に極大吸収波長を有する。このため、血液中に存在する着色物質の影響が少なく、測定誤差を減らすことができる。なお、本明細書において、本発明のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物を、単に「ホルマザン化合物」とも称する。
上記特開平８−５３４４４号公報のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンは５１０〜５５０ｎｍに極大吸収を有する（段落「００１１」）。事実、上記特開平８−５３４４４号公報の実施例３では、ＮＡＤＨ濃度を５５０ｎｍにおける吸光度で定量している（段落「００２９」、図２）。一方、全血サンプルを用いて生体成分（例えば、グルコース）濃度を測定する場合には、測定波長が、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域にあることが必要である。血液中の赤血球濃度を検出するための波長は、５１０〜５４０ｎｍ程度であり、酸素化ヘモグロビンの極大吸収波長は５５０ｎｍ前後である。このため、全血を試料とする生体成分測定の場合、ホルマザンの極大吸収波長が６００ｎｍ以上にあることが好ましい。してみると、特開平８−５３４４４号公報のテトラゾリウム塩から生じるホルマザンでは、血球による影響を十分排除することはできず、良好な感度で生体成分濃度を測定することは困難であった。このため、特開平８−５３４４４号公報のテトラゾリウム塩の極大吸収波長をより長波長域側にシフトさせる必要がある。一般的に、ある種のホルマザンに遷移金属イオン（例えば、ニッケルイオンやコバルトイオン）を作用させ、キレート化合物を生成させることにより、極大吸収波長を長波長側にシフトすることができる。しかし、特開平８−５３４４４号公報の実施例３において、長波長側にシフトさせるために遷移金属イオン（例えば、ニッケルイオン）を添加してもキレートを形成せず（後述の比較例５参照）、さらに遷移金属イオンの添加量が増えると、沈殿物を形成する。このため、特開平８−５３４４４号公報のテトラゾリウム塩は、全血サンプルに対しては試薬として好適に使用できるとは言い難い。
これに対して、本発明のテトラゾリウム塩から生じるホルマザン化合物は、極大吸収波長が血液の吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上、特に６３０ｎｍ以上）にある。このため、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、生体試料に由来するノイズを減らすことができる。すなわち、生体成分に関するシグナルを感度よく検出できる。上記効果を奏する詳細なメカニズムは依然として不明であるが、以下のように考えられる。なお、以下のメカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
本発明のテトラゾリウム塩は、テトラゾール骨格の２位のベンゾチアゾリル基がアルコキシ基で置換されているため、テトラゾリウム塩から生じるホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の極大吸収波長を、長波長側にシフトすることが可能である（後述の実施例２と比較例１との比較）ことを、本発明者は見出した。
また、テトラゾール環の２位に存在するベンゾチアゾリル基により、本発明のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンはＣｏ２＋やＮｉ２＋等の遷移金属イオンと効率よくかつ速やかにキレート化合物を形成することができる。これはベンゾチアゾリル基の窒素原子よるものと考えられる。ここで、ベンゾチアゾリル基をアルコキシ基で置換した場合、アルコキシ基が電子供与性であるため、ベンゾチアゾリル基の電子密度が高まり、ホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の形成が一層速やかに行われると考えられる。したがって、テトラゾール環の２位に存在するベンゾチアゾリル基上にアルコキシ基を導入することが、テトラゾリウム塩から生じるホルマザンの遷移金属化合物とのキレート能を維持しつつ、極大吸収波長を長波長側にシフトさせる上で、非常に重要であると考えられる（後述の実施例２と比較例２との比較）。
よって、本発明のテトラゾリウム塩によれば、本発明のテトラゾリウム塩から生成するホルマザン化合物の極大吸収波長を、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上、特に６３０ｎｍ以上）にさらにシフトできる。このため、極大吸収波長が血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上）で生体成分濃度を測定することが可能となり、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、全血サンプル中の生体成分濃度であっても正確に測定することができる。
さらに、本発明のテトラゾリウム塩は、テトラゾール骨格の５位のフェニル基が１または２のスルホ基（−ＳＯ３ −）を有し、かつ、テトラゾール骨格の３位のフェニル基が０または１のスルホ基（−ＳＯ３ −）を有する。ゆえに、テトラゾリウム塩は、化合物中に、１〜３のスルホ基（−ＳＯ３ −）を有する。このため、テトラゾリウム塩は、水溶性がある。また、本発明のテトラゾリウム塩は安定性に優れる。
したがって、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、感度よくかつすみやかに生体成分濃度を測定できる。また、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、長期間保存した後であっても、生体成分濃度を感度良く測定できる。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明の一形態のテトラゾリウム塩は、下記式（１）：
の構造を有する。式（１）において、Ｒ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ２は、ニトロ基、−ＯＲ４、およびカルボキシル基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ３は、水素原子、メチル基またはエチル基であり、少なくとも１はメチル基またはエチル基であり、Ｒ４は、メチル基またはエチル基であり、ｍは、スルホ基（−ＳＯ３ −）がテトラゾール骨格の５位のフェニル基に結合する数であり、１または２であり、ｎは、Ｒ２がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０〜２の整数であり、ｐは、亜硫酸イオン（−ＳＯ３ −）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０または１であり、ｎ＋ｐは１以上であり、ｑは１または２であり、ｑが２の場合、各ＯＲ３は隣接して配置され、この際、各ＯＲ３が互いに環を形成してもよく、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす。
本発明の他の形態のテトラゾリウム塩は、下記式（１’）：
の構造を有する。この際、Ｒ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ２は、ニトロ基、−ＯＲ４、およびカルボキシル基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、メチル基またはエチル基であり、ｍは、スルホ基（−ＳＯ３ −）がテトラゾール骨格の５位のフェニル基に結合する数であり、１または２であり、ｎは、Ｒ２がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０〜２の整数であり、ｐは、スルホ基（−ＳＯ３ −）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０または１であり、ｎ＋ｐは１以上であり、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす。
式（１）において、テトラゾール骨格の２位には置換ベンゾチアゾリル基が存在する。上記式（１）において、テトラゾール環の２位にベンゾチアゾリル基が存在することにより、遷移金属化合物と効率よくかつ速やかにキレート化合物を形成できる（ホルマザン化合物の極大吸収波長を長波長域にシフトできる）。そして、テトラゾール骨格の２位のベンゾチアゾリル基に、少なくとも１のメトキシ基またはエトキシ基が導入されることで、さらに生成するホルマザンとＮｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の極大吸収波長が長波長側にシフトする（後述の実施例２と比較例１との比較）。
また、ｑは１または２である。ここで、ｑ＝１の場合、Ｒ３は、メチル基またはエチル基であり、水溶性の観点からはメチル基であることが好ましい。Ｒ３が炭素原子数３以上のアルキル基である場合には、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンは、水溶性に劣るため好ましくない。
式（１）において、Ｎｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の長波長側への極大吸収波長のシフトの効果の点で、テトラゾール骨格の２位に存在する置換ベンゾチアゾリル基の−ＯＲ３の少なくとも１がベンゾチアゾリル基の６位に結合することが好ましい。
ｑ＝１の場合、テトラゾール骨格の２位に存在するベンゾチアゾリル基の置換基である−ＯＲ３の置換位置は特に限定されるものではなく、４位、５位、６位、または７位のいずれであってもよい。Ｎｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の長波長側への極大吸収波長のシフトの効果の点では、−ＯＲ３の置換位置は、ベンゾチアゾリル基の６位に結合することが好ましい。
ｑ＝２の場合、Ｒ３は、水素原子、メチル基またはエチル基であり、少なくとも一がメチル基、またはエチル基である。また、ｑが２である場合、各ＯＲ３は隣接して配置され、各ＯＲ３が互いに環を形成してもよい。この際、好適な組み合わせとしては、Ｒ３が、水素原子およびメチル基の組み合わせ、メチル基およびメチル基の組み合わせである。ｑ＝２の場合、テトラゾール骨格の２位に存在するベンゾチアゾリル基の置換基である−ＯＲ３の置換位置は２つの−ＯＲ３が隣接して配置されれば特に限定されるものではなく、４，５位、５，６位、または６，７位のいずれであってもよい。Ｎｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の長波長側への極大吸収波長のシフトの効果の点では、少なくとも一の−ＯＲ３の置換位置は、ベンゾチアゾリル基の６位に結合することが好ましく、すなわち、２つの−ＯＲ３の置換位置は、５，６位、または６，７位であることが好ましい。具体的には、ｑが２である場合、テトラゾール骨格の２位に存在する置換ベンゾチアゾリル基は以下のいずれかの置換基であることが好ましい。
さらには、ｑが２である場合、テトラゾール骨格の２位に存在する置換ベンゾチアゾリル基は上記いずれかの置換基である場合、テトラゾール骨格の３位に存在する置換スルホ化フェニル基が、４−メトキシ−５−スルホフェニル基であることが、Ｎｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の長波長側への極大吸収波長のシフトの効果の点で好ましい。
式（１）において、テトラゾール骨格の５位には置換スルホ化フェニル基が存在する。該スルホ化フェニル基の置換基であるＲ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基からなる群から選択されるいずれか一つである。テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性を向上させるという観点からは、Ｒ１は、水素原子または水酸基であることが好ましく、幅広いｐＨ領域で遷移金属イオンとのキレートを安定的に形成できることから、Ｒ１は水素原子であることがより好ましい。また、Ｒ１が水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基である場合の置換位置は特に限定されないが、４位であることが好ましい。
テトラゾール骨格の５位には、スルホ基（−ＳＯ３ −）が少なくとも１個存在する（ｍ＝１または２）。これにより、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性が向上するものと考えられる。式（１）において、ｍは、スルホ基（−ＳＯ３ −）がテトラゾール骨格の５位のフェニル基に結合する数であり、１または２である。特にスルホ基が２位または４位にある場合、さらには、２，４位にある場合には、よりいっそうの水溶性の向上が発揮出来る。さらにスルホ基が２，４位にある場合には合成するためのビルディングブロックの合成が容易である点で、有利である。水溶性が高く、また、幅広いｐＨ領域で遷移金属イオンとのキレート化合物を安定的に形成することができる、または水溶性が向上することから、ｍ＝２であることが好ましく、ｍ＝２であり、Ｒ１が水素原子であることがより好ましい。
この際、ｍ＝２である場合には、スルホ基（−ＳＯ３ −）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であるｐが１であることが好ましい。かような置換基数を選択することで、テトラゾリウム塩およびこれから生じるホルマザンの水溶性が一層向上する。
なお、水溶性の観点からは、下記（１）〜（４）：（１）ｍ＝２かつｐ＝１である、（２）ｍ＝１かつｎ＝０である、（３）テトラゾール骨格の５位に存在するフェニル基において、Ｒ１が水酸基であり、この際、スルホ基（ＳＯ３−）および水酸基が２，４位、または４，６位にある、（４）ｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基である、のいずれかを満たすことが好ましく、（１）ｍ＝２かつｐ＝１または、（４）：ｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基であることがより好ましい。また、上記（３）では、スルホ基（ＳＯ３−）および水酸基が、ベンゼン環上で隣接した置換基として存在しないため、水素結合することがなく、または少なく、両置換基が効率的に水溶性に寄与できるためであると考えられる。
ここで、テトラゾール骨格の５位に存在するフェニル基へのスルホ基（−ＳＯ３ −）の結合位置は特に制限されない。テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性のさらなる向上効果、極大吸収波長を長波長側へシフトすることができることの点から、ｍ＝２の場合には、スルホ基（−ＳＯ３ −）は、フェニル基の、２，４位、３，５位に存在することが好ましい。フェニル基の２，４位にスルホ基が存在することが特に好ましく、高濃度の遷移金属イオンの存在下でも沈殿が発生しないテトラゾリウム塩化合物とすることができる。すなわち、このテトラゾリウム塩を発色試薬として使用することで、生体成分が高濃度な場合であっても、定量可能な生体成分測定試薬組成物を調製できる。すなわち、本発明の好ましい形態では、テトラゾール骨格の５位のフェニル基が、スルホ基（−ＳＯ３ −）が２，４位に存在するフェニル基であることが好ましい。
式（１）において、テトラゾール骨格の３位には置換フェニル基が存在する。フェニル基は必須に置換されるため、ｎ＋ｐは１以上である。
テトラゾール骨格の３位のフェニル基の置換基としてのＲ２は、ニトロ基、−ＯＲ４、およびカルボキシル基からなる群から選択されるいずれか一つである。Ｒ２は、ホルマザンと遷移金属イオンとのキレート形成性の観点からは、ニトロ基または−ＯＲ４であることが好ましく、水溶性の観点からは、カルボキシル基であることが好ましい。また、ｎは、Ｒ２がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０〜２の整数である。下記に記載のように、Ｒ２を導入することで、化合物の極大吸収波長を長波長域に移動させることや、化合物の安定性を向上させることが可能となるため、ｎ＝１または２であることが好ましい。Ｒ２が２存在する場合、すなわち、ｎ＝２である場合、Ｒ２は同じであっても異なるものであってもよい。
ｎ＝１または２である場合、少なくとも１のＲ２が−ＯＲ４基であることが好ましい。すなわち、本発明の好適な形態は、ｎが１または２であり、かつ、少なくとも１のＲ２が−ＯＲ４基である。フェニル基の置換基としてアルコキシ基を導入することで、化合物の安定性が向上する。テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性を向上させるという観点からは、−ＯＲ４基がメトキシ基であることが好ましい。ここで、Ｒ４は、メチル基またはエチル基であり、水溶性の観点からはメチル基であることが好ましい。Ｒ４が炭素原子数３以上のアルキル基である場合には、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンは、水溶性に劣るため好ましくない。
ｎが１または２である場合の、Ｒ２の置換位置は特に限定されないが、テトラゾール骨格の３位に存在する置換スルホフェニル基の２位、３位、４位、５位または６位であることが好ましく、少なくとも一のＲ２が２位または４位にあることが好ましく、２位および／または４位であることが好ましい。かような構造とすることで、水溶性が向上するとともに、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの安定性を向上させることができる。
ｐは、スルホ基（−ＳＯ３ −）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０または１である。テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性を向上させるという観点からは、ｐ＝１であることが好ましい。なお、ｐ＝１の場合、スルホ基は電子吸引性基であるため、他の電子吸引性基（例えば、ニトロ基）があると、テトラゾリウム環上の窒素原子のカチオン電荷を不安定化させ、化合物の安定性を低下させる場合がある。上述したとおり、フェニル基の置換基としてアルコキシ基を導入することで、化合物の安定性が向上するが、ニトロ基が同時に導入されると、アルコキシ基導入による安定性の向上が発揮されない場合がある。このため、安定性向上という観点からは、ｐ＝１の場合には、ｎが１または２であり、好ましくは、ｎが１であり、かつ、Ｒ２は、−ＯＲ４、およびカルボキシル基からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、Ｒ２は−ＯＲ４であることがより好ましい。または、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性を向上させるという観点からは、ｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基であることが好ましい。すなわち、好適な実施形態は、式（１）において、ｐが１である、またはｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基である。より好適には、ｍ＝２かつｐ＝１である、またはｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基である。
ｐ＝１である場合、テトラゾール骨格の３位のフェニル基を置換するスルホ基（−ＳＯ３ −）の置換位置は特に限定されるものではないが、３位または５位であることが好ましい。この位置にスルホ基が置換することで、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの安定性をより有効に向上できる。
また、式（１）において、テトラゾール骨格の３位に存在する置換基が、４−メトキシ−３−スルホフェニル基、２−メトキシ−５−スルホフェニル基、２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル基、２−メトキシ−４−ニトロフェニル基、４−スルホフェニル基、４−カルボキシ−２−メトキシフェニル基、５−カルボキシ−２−メトキシフェニル基、３−カルボキシ−４−メトキシフェニル基、または４−メトキシ−５−スルホフェニル基が好ましく、４−メトキシ−３−スルホフェニル基、２−メトキシ−５−スルホフェニル基、３−カルボキシ−４−メトキシフェニル基、または４−メトキシ−５−スルホフェニル基であることがより好ましく、４−メトキシ−３−スルホフェニル基、４−メトキシ−５−スルホフェニル基、または、２−メトキシ−５−スルホフェニル基であることが特に好ましい。かような構造とすることで、発色感度が向上し、水溶性が向上するとともに、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの安定性を向上させることができる。また、ホルマザン化合物自体の極大吸収波長をより長波長域にすることができることから、テトラゾール骨格の３位に存在するフェニル基が、４−メトキシ−３−スルホフェニル基であることが特に好ましい。
式（１）に存在するスルホ基の総数（ｍ＋ｐ）は、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性を向上させるという観点から、２以上であることが好ましく、３であることがより好ましい。
上記式（１）において、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす。ここで、Ｘは、アニオン（スルホ基（−ＳＯ３ −））を中和するために存在する。このため、アルカリ金属の種類は特に制限されず、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムのいずれでもよい。
テトラゾリウム塩の好ましい例としては、以下のものが挙げられる。なお、下記構造において、Ｘは、アルカリ金属を表わす。
本発明のテトラゾリウム塩の製造方法は、特に制限されず、従来公知の方法が同様にしてまたは適宜修飾して適用できる。例えば、アルデヒドとヒドラジンの脱水縮合によりヒドラゾンを合成し、次いで、対応するジアゾニウム塩を水性溶媒中、塩基性条件下で反応させて、ホルマザンを得る。ここで、塩基性化剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。次いで得られたホルマザンを亜硝酸エチル、亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を用いアルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール）中で酸化し、式（１）のテトラゾリウム塩を得ることができる。一実施形態を挙げると、下記構造：
を有するヒドラジノ置換ベンゾチアゾールと、下記構造：
を有する置換スルホ化ベンズアルデヒドとを反応させて、下記構造：
を有するヒドラゾン化合物を得る。一方、下記構造：
を有する置換スルホ化アニリンを氷冷しながら塩酸を加え、さらに亜硝酸ナトリウム溶液を滴下して、下記構造：
を有する塩化ベンゼンジアゾニウム化合物を得る。上記にて得られたヒドラゾン化合物と塩化ベンゼンジアゾニウム化合物とを塩基性条件（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム存在）下で反応させて、下記構造：
を有するホルマザン化合物を得る。次いで、このようにして得られたホルマザン化合物を、酸化剤（例えば、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸エチル、亜硝酸ブチル等の亜硝酸エステル）を用いてアルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール）中で酸化することによって、本発明のテトラゾリウム塩が得られる。
本発明のテトラゾリウム塩から生成するホルマザン、またはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物は、単独でまたは遷移金属化合物とのキレート化合物を形成することにより、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上、特に６５０ｎｍ以上）に極大吸収波長を有する。また、本発明のテトラゾリウム塩は、高い水溶性を有する。このため、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、生体試料、特に全血サンプルに対しても感度よく生体成分濃度を測定できる。具体的には、本発明のテトラゾリウム塩から生成したホルマザン、またはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）は、好ましくは６００ｎｍ以上、より好ましくは６３０ｎｍ以上、特に好ましくは６５０ｎｍ以上である。このような極大吸収波長を有するホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物（ゆえに、このようなホルマザンを生成できるテトラゾリウム塩）であれば、血液の吸収の影響を受けにくく、生体成分濃度をより正確にかつ良好な感度で測定できる。ここで、本発明のテトラゾリウム塩から生成したホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）の上限は、特に制限されないが、通常、９００ｎｍ以下であり、好ましくは８００ｎｍ以下である。なお、本明細書において、極大吸収波長（λｍａｘ）は、下記実施例に記載の方法に従って測定された値を採用する。
したがって、本発明の第二の側面では、本発明の２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを含む生体成分濃度測定用試薬が提供される。また、本発明の第三の側面では、生体試料に、本発明の２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム、酸化還元酵素および遷移金属化合物を添加して、発色量を測定し、当該発色量に基づいて前記生体試料中の生体成分の濃度を定量することを有する、生体成分濃度の測定方法が提供される。
本発明において、生体成分測定対象は、目的とする生体成分を含むものであれば特に制限されない。具体的には、血液、ならびに尿、唾液、間質液等の体液などが生体成分測定対象として挙げられる。また、生体成分は、特に制限されず、通常、比色法または電極法により測定される生体成分が同様にして使用できる。具体的には、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、尿酸などが挙げられる。すなわち、本発明の第二の側面における好ましい形態によると、本発明の生体成分濃度測定用試薬は、血液または体液中の、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、尿酸の濃度の測定のために使用される。また、本発明の第三の側面における好ましい形態によると、生体試料中の生体成分が、血液または体液中の、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、尿酸である。
本発明の生体成分濃度測定用試薬は、本発明のテトラゾリウム塩を必須に含む。上述したように、生体成分濃度測定用試薬では、テトラゾリウム塩の還元反応により生成したホルマザンは、現在流通しているテトラゾリウム塩と比較して、長波長側に極大吸収波長を有する。本発明のテトラゾリム塩は、遷移金属イオンとキレート化合物を生成することにより、極大吸収波長をさらに長波長側にシフトすることができる。このため、特に全血サンプル中の生体成分濃度を測定する場合には、遷移金属化合物を含むことが好ましい。すなわち、本発明の好ましい形態では、生体成分濃度測定用試薬は、さらに遷移金属化合物を含む。当該形態によると、全血サンプル中の生体成分濃度を測定する場合であっても、ホルマザンが血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上）に極大吸収波長を有する。このため、生体試料、特に全血サンプルに対しても、生体成分濃度の測定感度をさらに向上できる。生体成分濃度測定用試薬が遷移金属化合物を含む場合に使用できる遷移金属化合物としては、特に制限されない。具体的には、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）などの遷移金属イオンを生成できる化合物が使用できる。このようなイオンであれば、ホルマザンの極大吸収波長をより長波長側にシフトできる。これらのうち、ニッケルイオンが好ましい。ニッケルイオンは、酸化や還元作用を受けにくいため、測定誤差をより有効に低減できる。すなわち、本発明の好ましい形態によると、遷移金属化合物は、ニッケル化合物である。また、上記遷移金属イオンを生成する化合物は特に制限されないが、水性液体（例えば、水、緩衝液、血液、体液）中でイオンを生成するものであることが好ましい。例えば、上記遷移金属の、塩化物、臭化物、硫酸塩、有機酸塩などが挙げられる。上記遷移金属化合物は、１種を単独で使用しても、または２種以上を併用してもよい。また、本形態において、遷移金属化合物の含有量は、特に制限されないが、ホルマザン化合物の所望の極大吸収波長に応じて適切に選択できる。具体的には、遷移金属化合物の含有量は、遷移金属（遷移金属イオン）が、テトラゾリウム塩 １モルに対して、好ましくは０．１〜１０モル、より好ましくは０．５〜４モルとなるような量である。このような量であれば、ホルマザン化合物の極大吸収波長を所望の波長域にまでシフトできる。
生体成分濃度測定用試薬は、上記遷移金属化合物に加えてまたは上記遷移金属化合物に代えて、さらに他の成分を含んでもよい。ここで、他の成分としては、通常、測定対象である生体成分の種類に応じて適切に選択され、生体成分濃度を測定するために添加される成分が同様にして使用できる。具体的には、酸化還元酵素、電子伝達体、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤などが挙げられる。ここで、上記他の成分は、それぞれ、１種を単独で使用しても、または２種以上を組み合わせてしてもよい。また、上記他の成分のそれぞれは、１種を単独で使用しても、または２種以上を併用してもよい。
ここで、酸化還元酵素は、特に制限されず、測定される対象である生体成分の種類によって適切に選択されうる。具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＮＡＤ）およびニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするもの（ＧＤＨ−ＮＡＤＰ）等のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、尿酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。ここで、酸化還元酵素は、１種を単独で使用しても、または２種以上を組み合わせてもよい。例えば、生体成分がグルコースである場合には、酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼやグルコースオキシダーゼであることが好ましい。また、生体成分がコレステロールである場合には、酸化還元酵素がコレステロールデヒドロゲナーゼやコレステロールオキシダーゼであることが好ましい。生体成分濃度測定用試薬が酸化還元酵素を含む場合の、酸化還元酵素の含有量は、特に制限されず、テトラゾリウム塩の量に応じて適宜選択できる。電子伝達体は、特に制限されず、公知の電子伝達体が使用してもよい。具体的には、ジアホラーゼ、フェナジンメチルサルフェート（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート（１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳまたはｍ−ＰＭＳ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）などが挙げられる。ここで、電子伝達体は、１種を単独で使用しても、または２種以上を組み合わせてもよい。生体成分濃度測定用試薬が電子伝達体を含む場合の、電子伝達体の含有量は、特に制限されず、テトラゾリウム塩の量に応じて適宜選択できる。例えば、電子伝達体の含有量は、テトラゾリウム塩に対して、好ましくは０．０５〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％である。このような量であれば、還元反応をより効率よく進行できる。
上記のうち、生体成分濃度測定用試薬は、遷移金属化合物及び酸化還元酵素をさらに含むことが好ましく、遷移金属化合物、酸化還元酵素及び電子伝達体をさらに含むことがより好ましい。すなわち、本発明の好ましい形態によると、生体成分濃度測定用試薬は、本発明の２−置換ベンゾチアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム、遷移金属化合物及び酸化還元酵素を含む。また、本発明のより好ましい形態によると、生体成分濃度測定用試薬は、本発明の２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、遷移金属化合物、酸化還元酵素及び電子伝達体を含む。ここで、例えば、生体成分がβ−Ｄ−グルコースであり、遷移金属化合物が塩化ニッケルであり、酸化還元酵素がフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＦＡＤ）であり、電子伝達体が１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート（ｍ−ＰＭＳ）である場合には、まず、β−Ｄ−グルコース及びｍ−ＰＭＳがＧＤＨ−ＦＡＤの作用を受けて、グルコン酸及び還元型のｍ−ＰＭＳになり、この還元型のｍ−ＰＭＳ及びテトラゾリウム塩からｍ−ＰＭＳおよびホルマザンになり、発色する。また、このホルマザンがニッケルイオンとキレート化合物を形成して、極大吸収波長がより長波長域側（例えば、６００ｎｍ以上）にシフトする。このため、本発明の生体成分濃度測定用試薬を用いることによって、血色素の吸収による影響を低減できるため、生体試料、特に全血サンプルに対しても感度よく生体成分濃度を測定できる。
生体成分濃度測定用試薬の使用形態は、特に制限されず、固体、ゲル状、ゾル状、または液体のいずれの形態であってもよい。生体成分濃度測定用試薬は、さらに水、バッファー、界面活性剤等を含んでもよい。ここで、バッファーは、特に制限されず、一般的に生体成分濃度を測定する際に使用されるバッファーが同様にして使用できる。具体的には、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン−塩酸緩衝剤、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤、トリス−ホウ酸緩衝剤、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤、またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤が好ましい。ここで、緩衝剤の濃度としては、特に制限されないが、０．０１〜１．０Ｍであるのが好ましい。なお、本発明において緩衝剤の濃度とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度（Ｍ、ｍｏｌ／Ｌ）をいう。また、緩衝液のｐＨは、生体成分に対して作用を及ぼさないことが好ましい。上記観点から、緩衝液のｐＨは、中性付近、例えば、５．０〜８．０程度であることが好ましい。なお、生体成分濃度測定用試薬が液状である場合の、テトラゾリウム塩の濃度は、所望の生体成分濃度を測定できる濃度であれば特に制限されないが、テトラゾリウム塩が所望の生体成分の存在量に対して十分量含まれることが好ましい。上記観点及び通常測定すべき生体成分濃度などを考慮すると、テトラゾリウム塩の濃度は、生体成分濃度測定用試薬において、好ましくは０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。このような量であれば、テトラゾリウム塩は、生体試料に含まれる実質的にすべて（例えば、９５モル％以上、好ましくは９８モル％以上、特に好ましくは１００モル％）の生体成分の量に応じて反応する。このため、所望の生体成分濃度を正確にかつ良好な感度で速やかに測定できる。
本発明の生体成分濃度測定用試薬を用いることにより、生体試料中に含まれる特定の生体成分濃度を良好な感度にて測定できる。ここで、測定方法は、特に制限されず、測定対象となる生体成分の種類に応じて適宜選択できる。例えば、生体成分がβ−Ｄ−グルコースであり、酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である場合には、グルコースがＧＤＨによって酸化されてグルコン酸を生成するが、その際にＧＤＨの補酵素または電子伝達物質が還元されることを利用したものであり、具体的には結果として還元されたテトラゾリウム塩（ゆえにホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物）の呈色度合を光学的に測定する方法（比色法）、および酸化還元反応によって生じた電流を測定する方法（電極法）に大別される。上記方法のうち、比色法による血糖値の測定は、血糖値の算出の際にヘマトクリット値を用いた補正を行ないやすい、製造工程が簡易である等の利点を有している。このため、生体成分濃度測定用試薬は比色法に好適に使用できる。特に全血サンプル中のグルコース濃度を測定する場合には、比色法が好ましく使用される。
本発明の生体成分濃度測定用試薬は、そのままの形態で生体成分濃度の測定に使用されてもよいが、生体成分濃度測定用チップに組み込まれてもよい。すなわち、本発明は、本発明の生体成分濃度測定用試薬を含む生体成分濃度測定用チップ（以下では、単に「測定用チップ」とも称する）をも提供する。また、本発明の生体成分濃度測定用試薬や方法は、自動分析機や測定キット、簡易血糖計等に組み込まれ、日常的な臨床検査に使用できる。また、本発明の試薬を市販のバイオセンサに組み込むことも可能である。なお、生体成分濃度測定用試薬を生体成分濃度測定用チップに組み込む場合には、１チップ当たりの試薬の含有量は、特に制限されず、通常当該分野において使用される量が同様にして採用できるが、テトラゾリウム塩が所望の生体成分の存在量に対して十分量で含まれることが好ましい。上記観点及び通常測定すべき生体成分濃度などを考慮すると、テトラゾリウム塩の濃度は、１チップ当たり、好ましくは３〜５０ｎｍｏｌ、より好ましくは１０〜３０ｎｍｏｌである。このような量であれば、テトラゾリウム塩は、生体試料に含まれる実質的にすべての生体成分の量に応じて反応する。このため、所望の生体成分濃度を正確にかつ良好な感度で速やかに測定できる。
以下では、比色法により血糖値を測定するに使用される本発明の測定用チップ（比色式血糖計）の形態を、図を参照しながら説明する。しかしながら、本発明は、本発明の生体成分濃度測定用試薬を使用することを特徴とし、チップの構造は特に制限されない。このため、本発明の生体成分濃度測定用試薬を、市販の測定用チップやＷＯ２０１４／０４９７０ならびにＷＯ２０１６／０５１９３０等の公報に記載されるチップに適用してもよい。同様にして、下記実施形態では、血糖値の測定を目的としたチップの具体的な形態を説明するが、測定用チップは当該用途に限定されず、他の用途にも同様にしてまたは適切に修飾して適用できる。
図９は、本実施形態に係る測定用チップを用いたグルコース（血糖）の検出に用いられる血糖計を概略的に示す平面図である。
図９において、血糖計１０は、血液サンプル中のグルコース（血糖）を測定する機器として構成されている。この血糖計１０は、主に、ユーザ（被検者）が操作するパーソナルユースとして用いられ得る。ユーザは、食前の血糖を測定して自身の血糖管理を行うこともできる。また、医療従事者が被検者の健康状態を評価するために血糖計１０を使用することもでき、この場合、血糖計１０を適宜改変して医療施設等に設置可能な構成としてもよい。
血糖計１０は、血液サンプル中に含まれるグルコースの含有量（血糖値）を光学的に測定する、比色法の原理を採用している。特に、この血糖計１０は、所定波長の測定光を分析サンプル（血液）に照射し、分析サンプルを透過した光を受光する、透過タイプの測定部１４により血糖測定を行う。
血糖計１０は、血液を取り込んだ測定用チップ１２を装着して、または測定用チップ１２を装着した状態で測定用チップ１２に血液を取り込み、測定部１４によりグルコースを検出する。測定用チップ１２は、１回の測定毎に廃棄するディスポーザブルタイプに構成されてもよい。一方、血糖計１０は、ユーザが測定を簡易に繰り返すことができるように、携帯可能且つ頑強な機器に構成されることが好ましい。
測定用チップ１２は、図１０に示すように、板状に形成されたチップ本体部１８と、チップ本体部１８の内部で板面の面方向に延びる空洞部２０（液体用空洞部）とを備える。
チップ本体部１８は、図１０に示すように、血糖計１０の挿入および離脱方向（血糖計１０の先端および基端方向、すなわちＢ方向）に長い長辺２２を有すると共に、Ａ方向に短い短辺２４を有する長方形状に形成されている。例えば、チップ本体部１８の長辺２２の長さは、短辺２４の２倍以上の長さに設定されるとよい。これにより測定用チップ１２は、血糖計１０に対して充分な挿入量が確保される。
また、チップ本体部１８の厚みは、長方形状に形成された側面に比べて極めて小さく（薄く）形成される（図１０では、敢えて十分な厚みを有するように図示している）。例えば、チップ本体部１８の厚みは、上述した短辺２４の１／１０以下に設定されることが好ましい。このチップ本体部１８の厚みについては、血糖計１０の挿入孔５８の形状に応じて適宜設計されるとよい。
測定用チップ１２は、空洞部２０を有するように、一対の板片３０と、一対のスペーサ３２とによりチップ本体部１８を構成している。
図１１は、図９の測定用チップを示す上面視図である。図１１中では、チップ本体部１８の角部が尖っているが、例えば角部は丸角に形成されてもよい。また、チップ本体部１８は、薄板状に限定されるものではなく、その形状を自由に設計してよいことは勿論である。例えば、チップ本体部１８は、上面視で、正方形状や他の多角形状、または円形状（楕円形状を含む）等に形成されてもよい。
チップ本体部１８の内部に設けられる空洞部２０は、チップ本体部１８の短軸方向中間位置にあり、チップ本体部１８の長手方向にわたって直線状に形成される。この空洞部２０は、チップ本体部１８の先端辺２４ａに形成された先端口部２０ａと、基端辺２４ｂに形成された基端口部２０ｂにそれぞれ連なり、チップ本体部１８の外側に連通している。空洞部２０は、先端口部２０ａからユーザの血液を取り込むと、毛細管現象に基づき延在方向に沿って血液を流動させ得る。空洞部２０を流動する血液は少量であり、基端口部２０ｂまで移動しても張力により漏れが抑止される。なお、チップ本体部１８の基端辺２４ｂ側には、血液を吸収する吸収部（例えば、後述するスペーサ３２を基端側のみ多孔質体としたもの等）が設けられていてもよい。
また、空洞部２０の所定位置（例えば、図１１中に示す先端口部２０ａと基端口部２０ｂの中間点よりも若干基端寄りの位置）には、血液中のグルコース（血糖）と反応することにより血液中のグルコース（血糖）濃度に応じた色に呈色する試薬（発色試薬）２６が塗布され、血糖計１０により測定がなされる測定対象部２８が設定されている。空洞部２０を基端方向に流動する血液が測定対象部２８に塗布された試薬２６と接触し、血液と試薬２６とが反応することで呈色する。なお、空洞部２０の長手方向上において、試薬２６の塗布位置と測定対象部２８は互いにずれていてもよく、例えば試薬２６が塗布された反応部を測定対象部２８の血液流動方向上流側に設けてもよい。
測定用チップ１２は、以上の空洞部２０を有するように、一対の板片３０と、一対のスペーサ３２とによりチップ本体部１８を構成している。一対の板片３０は、側面視でそれぞれ上述した長方形状に形成され、互いに積層方向に配置される。つまり、一対の板片３０は、チップ本体部１８の両側面（上面および下面）を構成している。各板片３０の板厚は、非常に小さく、例えば、５〜５０μｍ程度の同一寸法に設定されるとよい。２つ（一組）の板片３０の厚みは、相互に異なっていてもよい。
一対の板片３０は、面方向と直交する方向からある程度の押圧力が加えられても、板形状を維持して塑性変形しない強度を有する。また、各板片３０は、測定光が透過可能となるように透明部又は半透明部分を備える。さらに、各板片３０は、空洞部２０において血液を流動させ得るように適度な親水性を有する平坦状の板面に形成されていることが好ましい。
各板片３０を構成する材料は、特に限定されるものではないが、熱可塑性樹脂材料、ガラス、石英等を適用するとよい。熱可塑性樹脂材料としては、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプ口ピレンなど）、シクロオレフィンポリマー、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテフタレート、ポリエチレンナフタレートなど）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリアミド、フッ素樹脂等の高分子材料又はこれらの混合物が挙げられる。
また、一対のスペーサ３２は、一対の板片３０の間に挟まれるように配置され、所定の接合手段（接着剤等）よりに各板片３０の対向面に強固に接着される。つまり各スペーサ３２は、一対の板片３０同士を離間させるように間に配置されることで、一対の板片３０と一対のスペーサ３２自体の間に空洞部２０を形成させる部材である。この場合、一方のスペーサ３２は、図１１中のチップ本体部１８の上側長辺２２ａに接し、この上側長辺２２ａに沿って先端および基端方向に延びるように配置される。他方のスペーサ３２は、図１１中のチップ本体部１８の下側長辺２２ｂに接し、この下側長辺２２ｂに沿って先端および基端方向に延びるように配置される。
一対のスペーサ３２を構成する材料（基材）は、特に限定されるものではないが、例えば、スチレン系、ポリオレフィン系、ポリウレタン系、ポリエステル系、ポリアミド系、ポリブタジエン系、トランスポリイソプレン系、フッ素ゴム系、塩素化ポリエチレン系等の各種熱可塑性エラストマーが挙げられる。または、熱可塑性エス卜ラマ一以外にも、弾性変形可能な種々の材料を適用してもよく、また弾性変形可能な多孔質体（例えばスポンジ）等の構造体を適用してもよい。さらに、一対の板片３０の間で硬化状態又は半硬化状態となることにより板片３０同士を接着する接着剤を基材の一方または両面に有するスペーサ３２として適用してもよい。またさらに、スペーサ３２は、試薬２６を含有することで、空洞部２０に試薬２６を溶出する構成であってもよい。
板片３０やスペーサ３２は、親水化処理されたものであってもよい。親水化処理の方法としては、例えば界面活性剤、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、水溶性シリコーンの他、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等の親水性高分子を含有した水溶液を浸漬法またはスプレー法等により塗布する方法や、プラズマ照射、グロー放電、コロナ放電、紫外線照射（例えば、エキシマ光照射）等の方法等が挙げられ、これらの方法を単独又は組み合わせてもよい。
次に血糖計１０の装置本体１６について説明する。図９に示すように、血糖計１０は、外観を構成する筐体４０を有する。筐体４０は、ユーザが把持操作し易い大きさでその内部に血糖計１０の制御部４２を収容する箱体部４４と、箱体部４４の一辺（先端側）から先端方向に突出し内部に光学系の測定部１４を収容する筒状の測光部４６とを含む。また、箱体部４４の上面には、電源ボタン４８、操作ボタン５０、ディスプレイ５２が設けられ、測光部４６の上面にはイジェク卜レバー５４が設けられている。
電源ボタン４８は、ユーザの操作下に、血糖計１０の起動と起動停止を切り換える。操作ボタン５０は、起動状態となった血糖計１０において、ユーザの操作に基づき、血糖値の測定や表示を行う、測定結果（過去の測定結果を含む）の表示を切り換える等の操作部として機能する。ディスプレイ５２は、液晶や有機ＥＬ等により構成され、測定結果の表示やエラー表示等のように測定操作においてユーザに提供する情報を表示する。
イジェク卜レバー５４は、先端および基端方向に移動可能に設けられ、測光部４６内に設けられる図示しないイジェク卜ピンのロックを解除して、イジェク卜ピンを先端方向に進出可能とする。
一方、装置本体１６の測光部４６は、ユーザの指等に先端を押し当てるために、箱体部４４から先端方向に長く延出している。図１０に示すように、この測光部４６には、挿入孔５８を有するチップ装着部６０と、血中のグルコース（血糖）を光学的に検出する測定部１４とが設けられる。
チップ装着部６０は、高い硬質性（剛性）を有する材料（例えば、ステンレス）により、外方向に突出するフランジ部６０ａを先端側に備え、軸方向に所定長さを有する筒状に形成される。このチップ装着部６０は、樹脂材料で構成された測光部４６の先端面と軸心部（中心部）にわたって位置決め固定される。測光部４６の内面には、図１２Ａに示すように、チップ装着部６０を強固に固定する固定壁４６ａが突出形成されている。
チップ装着部６０を構成する材料としては、例えば、ステンレスやチタン等の金属、アルマイト皮膜処理をしたアルミニウム、液晶ポリマー、ガラスやマイカ等のフィラーを添加したプラスティック、ニッケルめっき等で表面を硬化皮膜したプラスティック、カーボンファイバー、ファインセラミック等、硬質で安易に寸法が変化せず、また繰り返し測定用チップの抜き差しをしても摩耗しにくく、且つ寸法精度良く加工可能な材料が挙げられる。この中でも金属材料を適用すれば、チップ装着部６０の製造（射出成形やプレス成形等）時に、高い寸法精度且つ容易に挿入孔５８を成形することができる。なお、装置本体１６は、測光部４６自体を硬質な材料（例えば、金属材料）により構成することで、チップ装着部６０を一体成形していてもよい。
チップ装着部６０の軸心部には、このチップ装着部６０の壁部６２に囲われることにより挿入孔５８が設けられる。挿入孔５８は、挿入方向（Ｂ方向）に長く、左右幅方向（Ａ方向）に短い断面長方形状に形成されている。挿入孔５８は、チップ装着部６０が測光部４６に固着された状態で、その先端面から奥部（基端方向）に向かって所定深さを有する。
チップ装着部６０の先端側には、挿入孔５８に連なると共に、外部に連通する挿入開口部５８ａが形成される。この挿入開口部５８ａの挿入方向（Ｂ方向）の寸法は、測定用チップ１２の短辺２４の寸法（Ａ方向の長さ）に一致している。また、挿入開口部５８ａの左右幅方向の寸法、すなわち挿入孔５８の側面を構成する一対の壁部６２の間隔は、図１２Ａに示すように、測定用チップ１２の積層方向の厚み（図１２Ａ中のＴａｌｌ）と実質的に同じである。
チップ装着部６０は、挿入孔５８（測定用孔部５９）が延在する途中位置に、測光部４６の固定壁４６ａと協働して一対の素子収容空間６４を形成している。一対の素子収容空間６４は、測定部１４の一部であり、挿入孔５８を挟んで互いに対向位置に設けられ、チップ装着部６０により形成された各導光部６６を介して測定用孔部５９に連通している。
測定部１４は、一方の素子収容空間６４に発光素子６８を収容することで発光部７０を構成し、他方の素子収容空間６４に受光素子７２を収容することで受光部７４を構成している。チップ装着部６０の導光部６６は、適宜な直径を有する円形状の穴に形成されることで、所謂アパーチャの役割を果たしている。
発光部７０の発光素子６８は、第１の波長を有する測定光を測定用チップ１２に照射する第１発光素子６８ａと、第１の波長とは異なる第２の波長を有する測定光を測定用チップ１２に照射する第２発光素子６８ｂとを含む（図１０中では図示を省略する）。第１発光素子６８ａと第２発光素子６８ｂは、素子収容空間６４の導光部６６を臨む位置に並設されている。
発光素子６８（第１及び第２発光素子６８ａ、６８ｂ）は、発光ダイオード（ＬＥＤ）で構成され得る。第１の波長は、血糖量に応じた試薬２６の呈色濃度を検出するための波長であり、例えば、６００ｎｍ〜６８０ｎｍである。第２の波長は、血液中の赤血球濃度を検出するための波長であり、例えば、５１０ｎｍ〜５４０ｎｍである。箱体部４４内の制御部４２は、駆動電流を供給して、第１及び第２発光素子６８ａ、６８ｂをそれぞれ所定タイミングで発光させる。この場合、呈色濃度から得られる血糖値を赤血球濃度から得られるヘマトクリット値を用いて補正し、血糖値を求める。なお、さらに他の測定波長で測定することで、血球に起因するノイズを補正してもよい。
受光部７４は、素子収容空間６４の導光部６６を臨む位置に１つの受光素子７２を配置して構成される。この受光部７４は、測定用チップ１２からの透過光を受光するものであり、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）で構成され得る。
また、挿入孔５８の底部（基端面）には、イジェクトレバー５４に連結されたイジェクトピン５６（イジェクト部）が設けられている。イジェクトピン５６は、測光部４６の軸方向に沿って延びる棒部５６ａと、棒部５６ａの先端部で径方向外側に大径な受部５６ｂとを備える。受部５６ｂには、挿入孔５８に挿入された測定用チップ１２の基端辺２４ｂが接触する。また、挿入孔５８の底部とイジェクトピン５６の受部５６ｂの間には、イジェクトピン５６を非接触に囲うコイルバネ７６が設けられている。コイルバネ７６は、イジェクトピン５６の受部５６ｂを弾性的に支持する。
測定用チップ１２の挿入が完了すると、図１２Ｂに示すように、測定用チップ１２の測定対象部２８が導光部６６に重なる位置に配置される。
イジェクトピン５６は、ユーザによる測定用チップ１２の挿入に伴い受部５６ｂが押されることで基端方向に変位し、筐体４０内に設けられた図示しないロック機構によりロック（固定）される。コイルバネ７６は、受部５６ｂの変位に従って弾性的に収縮する。そして、ユーザのイジェクトレバー５４の操作により、イジェクトピン５６が多少移動するとロック機構のロックが解除され、コイルバネ７６の弾性復元力により先端方向にスライドする。これにより、測定用チップ１２がイジェクトピン５６に押し出されて、挿入孔５８から取り出される。
図９に戻り、装置本体１６の制御部４２は、例えば、図示しない演算部、記憶部、入出力部を有する制御回路によって構成される。この制御部４２は、周知のコンピュータを適用することが可能である。制御部４２は、例えば、ユーザの操作ボタン５０の操作下に、測定部１４を駆動制御して血中のグルコースを検出及び算出し、ディスプレイ５２に算出した血糖値を表示する。
例えば、測定用チップ１２に対し測定光を透過させて分析対象物（例えば、グルコース）を測定する血糖計１０において、制御部４２は、以下の式（Ａ）で示すＢｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ則に基づいて測定結果を算出する。
上記式（Ａ）において、ｌ０は血液サンプルに入射する前の光の強度、ｌ１は血液サンプルから出射した後の光の強度、αは吸光係数、Ｌは測定光が通過する距離（セル長）である。
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、下記実施例において、特記しない限り、操作は室温（２５℃）で行われた。また、特記しない限り、「％」および「部」は、それぞれ、「質量％」および「質量部」を意味する。
実施例１：テトラゾリウム化合物１の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１の合成
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．５９ｇ及び（６−メトキシベンゾチアゾール−２−イル）ヒドラジン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１．０ｇをＲＯ水６０ｍＬに懸濁させた。この懸濁液を、酢酸酸性下、ウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。この残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿をドラフト中で乾燥させて、ヒドラゾン化合物１を得た。１．８ｇ回収し、収率７０質量％であった。
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．５９ｇ及び（６−メトキシベンゾチアゾール−２−イル）ヒドラジン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１．０ｇをＲＯ水６０ｍＬに懸濁させた。この懸濁液を、酢酸酸性下、ウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。この残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿をドラフト中で乾燥させて、ヒドラゾン化合物１を得た。１．８ｇ回収し、収率７０質量％であった。
２．ホルマザン化合物１の合成
上記１．のヒドラゾン化合物１ ０．７６ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．２６４ｇをＲＯ水４．０９ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ １３０μＬを加え溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物１を含む溶液（ホルマザン化合物１溶液）を調製した。このホルマザン化合物１溶液を、９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物１を得た。
上記１．のヒドラゾン化合物１ ０．７６ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．２６４ｇをＲＯ水４．０９ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ １３０μＬを加え溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物１を含む溶液（ホルマザン化合物１溶液）を調製した。このホルマザン化合物１溶液を、９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物１を得た。
３．ホルマザン化合物１の精製およびテトラゾリウム化合物１の合成
上記２．のホルマザン化合物１をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物１溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１溶液を精製した。採取したフラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
上記２．のホルマザン化合物１をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物１溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１溶液を精製した。採取したフラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物１の回収
上記３．の反応溶液に対し、ジエチルエーテル加えて、テトラゾリウム化合物１を沈殿させた。この沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物１を得た（１２０ｍｇ、収率：１１．８質量％）。
上記３．の反応溶液に対し、ジエチルエーテル加えて、テトラゾリウム化合物１を沈殿させた。この沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物１を得た（１２０ｍｇ、収率：１１．８質量％）。
実施例２：テトラゾリウム化合物２の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物２）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物２）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１の合成
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成と同様にしてヒドラゾン化合物１を合成した。
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成と同様にしてヒドラゾン化合物１を合成した。
２．ホルマザン化合物２の合成
上記のヒドラゾン化合物１ ０．７６ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。ｏ−アニシジン−５−スルホン酸（ｏ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．２６４ｇをＲＯ水４．０９ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ １３０μＬを加え溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物２を含む溶液（ホルマザン化合物２溶液）を調製した。このホルマザン化合物２溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。得られた沈殿を乾燥させることにより、ホルマザン化合物２を得た。
上記のヒドラゾン化合物１ ０．７６ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。ｏ−アニシジン−５−スルホン酸（ｏ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．２６４ｇをＲＯ水４．０９ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ １３０μＬを加え溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物２を含む溶液（ホルマザン化合物２溶液）を調製した。このホルマザン化合物２溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。得られた沈殿を乾燥させることにより、ホルマザン化合物２を得た。
３．ホルマザン化合物２の精製およびテトラゾリウム化合物２の合成
上記２．のホルマザン化合物２をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物２溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物２溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
上記２．のホルマザン化合物２をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物２溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物２溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物２の回収
上記３．の反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物２を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。この沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物２を得た。
上記３．の反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物２を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。この沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物２を得た。
実施例３：テトラゾリウム化合物３の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物３）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物３）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１の合成
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成と同様にしてヒドラゾン化合物１を合成した。
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成と同様にしてヒドラゾン化合物１を合成した。
２．ホルマザン化合物３の合成
上記のヒドラゾン化合物１ ０．７６ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。２−Ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（五二化学工業株式会社製）０．３５１ｇをＲＯ水５．０ｍＬに溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物３を含む溶液（ホルマザン化合物３溶液）を調製した。このホルマザン化合物３溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物３を得た。
上記のヒドラゾン化合物１ ０．７６ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。２−Ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（五二化学工業株式会社製）０．３５１ｇをＲＯ水５．０ｍＬに溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物３を含む溶液（ホルマザン化合物３溶液）を調製した。このホルマザン化合物３溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物３を得た。
３．ホルマザン化合物３の精製およびテトラゾリウム化合物３の合成
上記２．のホルマザン化合物３をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物３溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物３溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
上記２．のホルマザン化合物３をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物３溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物３溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物３の回収
上記３．の反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物３を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。この沈殿を乾燥させ、テトラゾリウム化合物３を得た。
上記３．の反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物３を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。この沈殿を乾燥させ、テトラゾリウム化合物３を得た。
実施例４：テトラゾリウム化合物４の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物４）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物４）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１の合成
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成と同様にしてヒドラゾン化合物１を合成した。
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成と同様にしてヒドラゾン化合物１を合成した。
２．ホルマザン化合物４の合成
上記のヒドラゾン化合物１ ０．７６ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。２−メトキシ−４−ニトロアニリン（２−Ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ）（東京化成工業株式会社製）０．２１９ｇをＲＯ水１．５ｍＬおよびアセトニトリル５ｍＬに溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物４を含む溶液（ホルマザン化合物４溶液）を調製した。このホルマザン化合物４溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整した後、溶媒を除去した。得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物４を得た。
上記のヒドラゾン化合物１ ０．７６ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。２−メトキシ−４−ニトロアニリン（２−Ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ）（東京化成工業株式会社製）０．２１９ｇをＲＯ水１．５ｍＬおよびアセトニトリル５ｍＬに溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物４を含む溶液（ホルマザン化合物４溶液）を調製した。このホルマザン化合物４溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整した後、溶媒を除去した。得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物４を得た。
３．テトラゾリウム化合物４の合成
上記２．で得られたホルマザン化合物４をメタノール１５ｍＬに懸濁させ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
上記２．で得られたホルマザン化合物４をメタノール１５ｍＬに懸濁させ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物４の回収
上記３．で得られた反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物４を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。この沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物４を得た。
上記３．で得られた反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物４を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。この沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物４を得た。
実施例５：テトラゾリウム化合物５の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物５）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物５）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物５の合成
２−ホルミル−５−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ２−Ｆｏｒｍｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（和光純薬工業株式会社製）１．２１３ｇ及び（６−メトキシベンゾチアゾール−２−イル）ヒドラジン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１．０５６ｇをＤＭＦ４３ｍＬに溶解させた。この溶液を酢酸酸性下、ウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄した後、沈殿を分離した。この沈殿を乾燥させて、ヒドラゾン化合物５を得た。
２−ホルミル−５−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ２−Ｆｏｒｍｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（和光純薬工業株式会社製）１．２１３ｇ及び（６−メトキシベンゾチアゾール−２−イル）ヒドラジン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１．０５６ｇをＤＭＦ４３ｍＬに溶解させた。この溶液を酢酸酸性下、ウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄した後、沈殿を分離した。この沈殿を乾燥させて、ヒドラゾン化合物５を得た。
２．ホルマザン化合物５の合成
上記で得られたヒドラゾン化合物５ １．０５ｇをＲＯ水２０ｍＬおよびＤＭＦ２０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物５溶液を調製した。ｏ−アニシジン−５−スルホン酸（ｏ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁させた後、１０Ｎ ＮａＯＨ ２６０μＬを加え、溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物５溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物５を含む溶液（ホルマザン化合物５溶液）を調製した。このホルマザン化合物５溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整した後、溶媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで洗浄した後、沈殿を分離した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物５を得た。
上記で得られたヒドラゾン化合物５ １．０５ｇをＲＯ水２０ｍＬおよびＤＭＦ２０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物５溶液を調製した。ｏ−アニシジン−５−スルホン酸（ｏ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁させた後、１０Ｎ ＮａＯＨ ２６０μＬを加え、溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物５溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物５を含む溶液（ホルマザン化合物５溶液）を調製した。このホルマザン化合物５溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整した後、溶媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで洗浄した後、沈殿を分離した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物５を得た。
３．テトラゾリウム化合物５の合成
上記２．で得られたホルマザン化合物５をＲＯ水１０ｍＬに溶解させた。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。上記のカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物５溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分に、メタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
上記２．で得られたホルマザン化合物５をＲＯ水１０ｍＬに溶解させた。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。上記のカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物５溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分に、メタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物５の回収
上記３．で得られた反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物５を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物５を得た（１２０ｍｇ、収率：７．６質量％）。
上記３．で得られた反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物５を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物５を得た（１２０ｍｇ、収率：７．６質量％）。
実施例６：テトラゾリウム化合物６の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物６）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物６）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物６の合成
５−ホルミル−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（４−Ｆｏｒｍｙｌ−１−ｐｈｅｎｏｌ −２−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）（Ｔ＆Ｗ社製）１．２１３ｇ及び（６−メトキシベンゾチアゾール−２−イル）ヒドラジン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１．０５６ｇをＤＭＦ４３ｍＬに溶解させた。この溶液を、酢酸酸性下、ウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄した後、遠心分離にて沈殿を分離した。得られた沈殿を乾燥させてヒドラゾン化合物６を得た。
５−ホルミル−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（４−Ｆｏｒｍｙｌ−１−ｐｈｅｎｏｌ −２−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）（Ｔ＆Ｗ社製）１．２１３ｇ及び（６−メトキシベンゾチアゾール−２−イル）ヒドラジン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１．０５６ｇをＤＭＦ４３ｍＬに溶解させた。この溶液を、酢酸酸性下、ウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。得られた残渣をジエチルエーテルで洗浄した後、遠心分離にて沈殿を分離した。得られた沈殿を乾燥させてヒドラゾン化合物６を得た。
２．ホルマザン化合物６の合成
上記で得られたヒドラゾン化合物６ １．０５ｇをＲＯ水２０ｍＬおよびＤＭＦ２０ｍＬに溶解して、ヒドラゾン化合物６溶液を調製した。ｏ−アニシジン−５−スルホン酸（ｏ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ ２６０μＬを加え溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持しながら、ヒドラゾン化合物６溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ６００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物６を含む溶液（ホルマザン化合物６溶液）を調製した。このホルマザン化合物６溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを６．８に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで洗浄した後、遠心分離にて沈殿を分離した。得られた沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物６を得た。
上記で得られたヒドラゾン化合物６ １．０５ｇをＲＯ水２０ｍＬおよびＤＭＦ２０ｍＬに溶解して、ヒドラゾン化合物６溶液を調製した。ｏ−アニシジン−５−スルホン酸（ｏ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ ２６０μＬを加え溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持しながら、ヒドラゾン化合物６溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ６００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物６を含む溶液（ホルマザン化合物６溶液）を調製した。このホルマザン化合物６溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを６．８に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで洗浄した後、遠心分離にて沈殿を分離した。得られた沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物６を得た。
３．テトラゾリウム化合物６の合成
上記２．で得られたホルマザン化合物６をメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
上記２．で得られたホルマザン化合物６をメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物６の回収
上記３．で得られた反応溶液に対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物６を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿を乾燥させ、テトラゾリウム化合物６を得た。
上記３．で得られた反応溶液に対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物６を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿を乾燥させ、テトラゾリウム化合物６を得た。
実施例７：テトラゾリウム化合物７の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物７）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物７）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物７の合成
２−スルホベンズアルデヒドナトリウム（２−Ｓｕｌｆｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔ）（東京化成工業株式会社製）２５．０ｇ及びｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸０．５水和物（ｐ−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）２２．６ｇをＲＯ水２５０ｍＬに溶解させ、酢酸ナトリウム１１．８ｇを加えウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。得られた残渣をメタノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。得られた沈殿を乾燥させて、ヒドラゾン化合物７を得た。
２−スルホベンズアルデヒドナトリウム（２−Ｓｕｌｆｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔ）（東京化成工業株式会社製）２５．０ｇ及びｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸０．５水和物（ｐ−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）２２．６ｇをＲＯ水２５０ｍＬに溶解させ、酢酸ナトリウム１１．８ｇを加えウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。得られた残渣をメタノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。得られた沈殿を乾燥させて、ヒドラゾン化合物７を得た。
２．ホルマザン化合物７の合成
上記で得られたヒドラゾン化合物７ ０．６ｇをＲＯ水２０ｍＬに溶解して、ヒドラゾン化合物７溶液を調製した。２−アミノ−６−メトキシベンゾチアゾール（２−Ａｍｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（東京化成工業株式会社製）０．２３４ｇをＲＯ水１．５ｍＬ、アセトニトリル５ｍＬに溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物７溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物７を含む溶液（ホルマザン化合物７溶液）を調製した。このホルマザン化合物７溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物７を得た。
上記で得られたヒドラゾン化合物７ ０．６ｇをＲＯ水２０ｍＬに溶解して、ヒドラゾン化合物７溶液を調製した。２−アミノ−６−メトキシベンゾチアゾール（２−Ａｍｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（東京化成工業株式会社製）０．２３４ｇをＲＯ水１．５ｍＬ、アセトニトリル５ｍＬに溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物７溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物７を含む溶液（ホルマザン化合物７溶液）を調製した。このホルマザン化合物７溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物７を得た。
３．テトラゾリウム化合物７の合成
上記２．のホルマザン化合物７をメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
上記２．のホルマザン化合物７をメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物７の回収
上記３．の反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物７を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿を乾燥させ、テトラゾリウム化合物７を得た。
上記３．の反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物７を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿を乾燥させ、テトラゾリウム化合物７を得た。
実施例８：テトラゾリウム化合物８の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物８）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物８）を合成した。
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成において、４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）を５−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（５−ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）（東京化成工業株式会社製）に変更したこと、ホルマザン化合物１の合成において、アミンをｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎｅ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）から、ｏ−アニシジン−３−スルホン酸（ｏ−ａｎｉｓｉｄｉｎｅ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、テトラゾリウム化合物８を得た。
実施例９：テトラゾリウム化合物９の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物９）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物９）を合成した。
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成において、４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）を５−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウムに変更したこと以外は、実施例１と同様にして、テトラゾリウム化合物９を得た。
実施例１０：テトラゾリウム化合物１０の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１０）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１０）を合成した。
実施例１のホルマザン化合物１の合成において、アミンをｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎｅ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）から、４−アミノ−３−メトキシ安息香酸（４−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、テトラゾリウム化合物１０を得た。
実施例１１：テトラゾリウム化合物１１の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１１）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１１）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１１の合成
５−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（５−ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）（東京化成工業株式会社製）４．６５ｇ（０．０１５ｍｏｌ）及び（６−メトキシベンゾチアゾール−２−イル）ヒドラジン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）２．９３ｇ（０．０１５ｍｏｌ）をＤＭＦ５０ｍＬおよびＲＯ水５０ｍＬの混合液に溶解した。この溶液に、酢酸８６０μＬを加えて、ウォーターバス（６０℃）で２時間、攪拌しながら加熱した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去し、残渣を得た。この残渣をジエチルエーテルで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させて、ヒドラゾン化合物１１を得た。
５−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（５−ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）（東京化成工業株式会社製）４．６５ｇ（０．０１５ｍｏｌ）及び（６−メトキシベンゾチアゾール−２−イル）ヒドラジン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）２．９３ｇ（０．０１５ｍｏｌ）をＤＭＦ５０ｍＬおよびＲＯ水５０ｍＬの混合液に溶解した。この溶液に、酢酸８６０μＬを加えて、ウォーターバス（６０℃）で２時間、攪拌しながら加熱した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去し、残渣を得た。この残渣をジエチルエーテルで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させて、ヒドラゾン化合物１１を得た。
２．ホルマザン化合物１１の合成
上記１．のヒドラゾン化合物１１ １．４ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ５ｍＬの混合液に溶解し、ヒドラゾン化合物１１溶液を調製した。３−アミノ−４−メトキシ安息香酸（３−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．３３４ｇをＲＯ水１ｍＬおよびＤＭＦ５ｍＬの混合液に溶解した。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ４００μＬを加えた後、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１５２ｇを１ｍＬに溶解）をさらに加えてし、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１１溶液に加えた。次に、１０Ｎ ＮａＯＨ ６００μＬを加え、２時間室温で攪拌して、ホルマザン化合物１１を含む溶液（ホルマザン化合物１１溶液）を調製した。このホルマザン化合物１１溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、濃縮した。濃縮したホルマザン化合物１１にＲＯ水１０ｍＬ加えて溶解し、ホルマザン化合物１１溶液を調製した。
上記１．のヒドラゾン化合物１１ １．４ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ５ｍＬの混合液に溶解し、ヒドラゾン化合物１１溶液を調製した。３−アミノ−４−メトキシ安息香酸（３−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．３３４ｇをＲＯ水１ｍＬおよびＤＭＦ５ｍＬの混合液に溶解した。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ４００μＬを加えた後、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１５２ｇを１ｍＬに溶解）をさらに加えてし、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１１溶液に加えた。次に、１０Ｎ ＮａＯＨ ６００μＬを加え、２時間室温で攪拌して、ホルマザン化合物１１を含む溶液（ホルマザン化合物１１溶液）を調製した。このホルマザン化合物１１溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、濃縮した。濃縮したホルマザン化合物１１にＲＯ水１０ｍＬ加えて溶解し、ホルマザン化合物１１溶液を調製した。
３．ホルマザン化合物１１の精製およびテトラゾリウム化合物１１の合成
ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１１溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形分にメタノール１００ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ４００μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、４８時間、室温、遮光にて攪拌した。
ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１１溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形分にメタノール１００ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ４００μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、４８時間、室温、遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物１１の回収
上記の溶液をエバポレーターにて乾燥させた。次に、ＲＯ水１０ｍＬ加えて、１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３で中和し、溶解させた。これをセパコア分取システムで精製し、オレンジ色のフラクションを採取した。このフラクションを、エバポレ−ターで溶媒を除去し、固形分を得た。この固形分にメタノール５ｍＬ加えて溶解させた後、ジエチルエーテル５０ｍＬ加えて沈殿物を得た。この沈殿物を乾燥させて、テトラゾリウム化合物１１を得た。
上記の溶液をエバポレーターにて乾燥させた。次に、ＲＯ水１０ｍＬ加えて、１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３で中和し、溶解させた。これをセパコア分取システムで精製し、オレンジ色のフラクションを採取した。このフラクションを、エバポレ−ターで溶媒を除去し、固形分を得た。この固形分にメタノール５ｍＬ加えて溶解させた後、ジエチルエーテル５０ｍＬ加えて沈殿物を得た。この沈殿物を乾燥させて、テトラゾリウム化合物１１を得た。
実施例１２：テトラゾリウム化合物１２の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１２）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１２）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１の合成
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成と同様にしてヒドラゾン化合物１を合成した。
実施例１の１．ヒドラゾン化合物１の合成と同様にしてヒドラゾン化合物１を合成した。
２．ホルマザン化合物１２の合成
ヒドラゾン化合物１ １．４ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ５ｍＬの混合溶液に加えて、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。５−アミノ−２−メトキシ−安息香酸（５−Ａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製） ０．３３４ｇをＲＯ水１ｍＬおよびＤＭＦ５ｍＬに加えて溶解した。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ４００μＬを加えた後、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１５２ｇを１ｍＬに溶解：和光純薬）をさらに加えて、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に加えた。続いて、１０Ｎ ＮａＯＨ ６００μＬを加えた後、２時間室温で攪拌して、ホルマザン化合物１２を含む溶液（ホルマザン化合物１２溶液）を調製した。ホルマザン化合物１２溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去して、ホルマザン化合物１２を得た。
ヒドラゾン化合物１ １．４ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ５ｍＬの混合溶液に加えて、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。５−アミノ−２−メトキシ−安息香酸（５−Ａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製） ０．３３４ｇをＲＯ水１ｍＬおよびＤＭＦ５ｍＬに加えて溶解した。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ４００μＬを加えた後、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１５２ｇを１ｍＬに溶解：和光純薬）をさらに加えて、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に加えた。続いて、１０Ｎ ＮａＯＨ ６００μＬを加えた後、２時間室温で攪拌して、ホルマザン化合物１２を含む溶液（ホルマザン化合物１２溶液）を調製した。ホルマザン化合物１２溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去して、ホルマザン化合物１２を得た。
３．ホルマザン化合物１２の精製およびテトラゾリウム化合物１２の合成
上記２．のホルマザン化合物１２をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物１２溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いてホルマザン化合物１２溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１００ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ４００μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液１５ｍＬを加えて４８時間、室温、遮光にて攪拌した。
上記２．のホルマザン化合物１２をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物１２溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いてホルマザン化合物１２溶液を精製した。採取した赤色フラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１００ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ４００μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液１５ｍＬを加えて４８時間、室温、遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物１２の回収、および再カラム精製
上記３．の溶液を乾燥させた後、ＲＯ水１０ｍＬ加え、１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３で中和して溶解した。これをカラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）で精製し、オレンジ色のフラクションを採取した。このフラクションを、エバポレ−ターで溶媒を除去して固形分を得た。この固形分にメタノール５ｍＬ加えて溶解した後、ジエチルエーテル５０ｍＬ加えて沈殿物を得た。この沈殿物を乾燥させ、テトラゾリウム化合物１２を得た（３００ｍｇ、収率:１７％）。
上記３．の溶液を乾燥させた後、ＲＯ水１０ｍＬ加え、１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３で中和して溶解した。これをカラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）で精製し、オレンジ色のフラクションを採取した。このフラクションを、エバポレ−ターで溶媒を除去して固形分を得た。この固形分にメタノール５ｍＬ加えて溶解した後、ジエチルエーテル５０ｍＬ加えて沈殿物を得た。この沈殿物を乾燥させ、テトラゾリウム化合物１２を得た（３００ｍｇ、収率:１７％）。
実施例１３：テトラゾリウム化合物１３の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１３）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１３）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１３の合成
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業社製）１．３８ｇ及び６−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌｏ［４，５−ｆ］［１，３］ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ（Ｍａｔｒｉｘ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．９８３１ｇをＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬに懸濁させた。この懸濁液を、酢酸酸性下、ウォーターバス（６０℃）で９０分間、攪拌した。加熱攪拌終了後、濃縮した（０トール、６０℃）。この残渣をジエチルエーテルで２回洗浄した後、沈殿を分取した。この沈殿物を乾燥させて、ヒドラゾン化合物１３を得た。
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業社製）１．３８ｇ及び６−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌｏ［４，５−ｆ］［１，３］ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ（Ｍａｔｒｉｘ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．９８３１ｇをＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬに懸濁させた。この懸濁液を、酢酸酸性下、ウォーターバス（６０℃）で９０分間、攪拌した。加熱攪拌終了後、濃縮した（０トール、６０℃）。この残渣をジエチルエーテルで２回洗浄した後、沈殿を分取した。この沈殿物を乾燥させて、ヒドラゾン化合物１３を得た。
２．ホルマザン化合物１３の合成
上記のヒドラゾン化合物１３ ０．１ｇをＲＯ水１ｍＬおよびＤＭＦ１ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１３溶液を調製した。このヒドラゾン化合物１３溶液を、０℃に保持し、ｏ−アニシジン−５−スルホン酸（ｏ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．０４ｇをＲＯ水１ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ ２０μＬを加えて溶解させた。この溶液を、０℃に保持し、１０Ｎ ＨＣｌ ４０μＬを加えた後、亜硝酸ナトリウム溶液をさらに加えて、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１３溶液に滴下した。続いて、１０Ｎ ＮａＯＨ ４０μＬを加え、４℃で攪拌して、ホルマザン化合物１３を含む溶液（ホルマザン化合物１３溶液）を調製した。このホルマザン化合物１３溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。得られた沈殿を乾燥させることにより、ホルマザン化合物１３を得た。
上記のヒドラゾン化合物１３ ０．１ｇをＲＯ水１ｍＬおよびＤＭＦ１ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１３溶液を調製した。このヒドラゾン化合物１３溶液を、０℃に保持し、ｏ−アニシジン−５−スルホン酸（ｏ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−５−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．０４ｇをＲＯ水１ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ ２０μＬを加えて溶解させた。この溶液を、０℃に保持し、１０Ｎ ＨＣｌ ４０μＬを加えた後、亜硝酸ナトリウム溶液をさらに加えて、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１３溶液に滴下した。続いて、１０Ｎ ＮａＯＨ ４０μＬを加え、４℃で攪拌して、ホルマザン化合物１３を含む溶液（ホルマザン化合物１３溶液）を調製した。このホルマザン化合物１３溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。得られた沈殿を乾燥させることにより、ホルマザン化合物１３を得た。
得られたホルマザン化合物を実施例１と同様にして精製し、また同様にしてテトラゾリウム化合物を合成、回収してテトラゾリウム化合物１３を合成した。
実施例１４〜１６：テトラゾリウム化合物１４〜１６の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１４〜１６）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１４〜１６）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１４〜１６の合成
各試薬、各溶媒を下記の通り添加したこと以外は、実施例１３と同様にしてヒドラゾン化合物１４〜１６を合成した。
各試薬、各溶媒を下記の通り添加したこと以外は、実施例１３と同様にしてヒドラゾン化合物１４〜１６を合成した。
２．ホルマザン化合物１４〜１６の合成
各試薬、各溶媒を下記の通り添加したこと以外は、実施例１３と同様にしてヒドラゾン化合物１４〜１６の合成を合成した。
各試薬、各溶媒を下記の通り添加したこと以外は、実施例１３と同様にしてヒドラゾン化合物１４〜１６の合成を合成した。
得られたホルマザン化合物を実施例１と同様にして精製し、また同様にしてテトラゾリウム化合物を合成、回収してテトラゾリウム化合物１４〜１６を合成した。
実施例１７：テトラゾリウム化合物１７の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１７）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１７）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１７の合成
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．３８ｇ（４．４６ｍｍｏｌ）及び６−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌｏ［４，５−ｆ］［１，３］ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ０．９８ｇ（４．４６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬの混合液に溶解させた。この溶解液に酢酸２５６μＬを加えウォーターバス（６０℃）で２時間、攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去して残渣を得た。この残渣をジエチルエーテルで１時間攪拌し、洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ヒドラゾン化合物１７を得た。
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．３８ｇ（４．４６ｍｍｏｌ）及び６−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌｏ［４，５−ｆ］［１，３］ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ０．９８ｇ（４．４６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬの混合液に溶解させた。この溶解液に酢酸２５６μＬを加えウォーターバス（６０℃）で２時間、攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去して残渣を得た。この残渣をジエチルエーテルで１時間攪拌し、洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ヒドラゾン化合物１７を得た。
２．ホルマザン化合物１７の合成
上記１．のヒドラゾン化合物１７ １．８１ｇをＲＯ水１５ｍＬおよびＤＭＦ１５ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１７溶液を調製した。ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁し、１０Ｎ ＮａＯＨ ２６０μＬをさらに加えて溶解させた。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加えて、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１９４ｇを１ｍＬに溶解：和光純薬）を加えて、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１７溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを加えて、−２０℃下で攪拌した。その後、この溶液の溶媒を除去し、乾燥させて、ホルマザン化合物１７を得た。
上記１．のヒドラゾン化合物１７ １．８１ｇをＲＯ水１５ｍＬおよびＤＭＦ１５ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１７溶液を調製した。ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁し、１０Ｎ ＮａＯＨ ２６０μＬをさらに加えて溶解させた。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加えて、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１９４ｇを１ｍＬに溶解：和光純薬）を加えて、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１７溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを加えて、−２０℃下で攪拌した。その後、この溶液の溶媒を除去し、乾燥させて、ホルマザン化合物１７を得た。
３．ホルマザン化合物１７の精製およびテトラゾリウム化合物１７の合成
上記２．のホルマザン化合物１７にＲＯ水１５ｍＬを加えて、ホルマザン化合物１７溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１７溶液を精製し、赤色フラクションを採取した。このフラクションの溶媒を除去し、得られた固形分にメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温、遮光にて攪拌した。
上記２．のホルマザン化合物１７にＲＯ水１５ｍＬを加えて、ホルマザン化合物１７溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１７溶液を精製し、赤色フラクションを採取した。このフラクションの溶媒を除去し、得られた固形分にメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温、遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物１７の精製・回収
上記３．で得られた溶液を減圧乾固し、残渣を得た。この残渣に、ＲＯ水を１５ｍＬ加えて溶解した。この溶液を、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットし、テトラゾリウム化合物１７を含むオレンジ色のフラクションを採取した。このフラクションを、減圧乾固してテトラゾリウム化合物１７を含む精製物を得た。この精製物に、メタノール５ｍＬを加えて溶解した。その後、攪拌しながらジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物１７を沈殿させた。この液を、遠心分離して、上清を除去した。残った沈殿（テトラゾリウム化合物１７）を乾燥させ、テトラゾリウム化合物１７を得た（６２０ｍｇ、収率：２６質量％、ＵＰＬＣでの純度分析結果９６．１％）。
上記３．で得られた溶液を減圧乾固し、残渣を得た。この残渣に、ＲＯ水を１５ｍＬ加えて溶解した。この溶液を、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットし、テトラゾリウム化合物１７を含むオレンジ色のフラクションを採取した。このフラクションを、減圧乾固してテトラゾリウム化合物１７を含む精製物を得た。この精製物に、メタノール５ｍＬを加えて溶解した。その後、攪拌しながらジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物１７を沈殿させた。この液を、遠心分離して、上清を除去した。残った沈殿（テトラゾリウム化合物１７）を乾燥させ、テトラゾリウム化合物１７を得た（６２０ｍｇ、収率：２６質量％、ＵＰＬＣでの純度分析結果９６．１％）。
実施例１８：テトラゾリウム化合物１８の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１８）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１８）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１８の合成
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．２７ｇ（４．１１ｍｍｏｌ）及び２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−５，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ０．９６６ｇ（４．１１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬの混合液に加えて溶解した。この溶解液に、酢酸２３６μＬを加えウォーターバス（６０℃）上で２時間攪拌した。加熱攪拌終了後、減圧乾個し、残渣を得た。この残渣を、ジエチルエーテルで攪拌洗浄した後、沈殿を分取した。この沈殿を、乾燥させてヒドラゾン化合物１８を得た。
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．２７ｇ（４．１１ｍｍｏｌ）及び２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−５，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ０．９６６ｇ（４．１１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬの混合液に加えて溶解した。この溶解液に、酢酸２３６μＬを加えウォーターバス（６０℃）上で２時間攪拌した。加熱攪拌終了後、減圧乾個し、残渣を得た。この残渣を、ジエチルエーテルで攪拌洗浄した後、沈殿を分取した。この沈殿を、乾燥させてヒドラゾン化合物１８を得た。
２．ホルマザン化合物１８の合成
ホルマザン化合物１８ １．８１ｇをＲＯ水１５ｍＬおよびＤＭＦ１５ｍＬの混合液に加えて溶解させた。ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁した後、これに１０Ｎ ＮａＯＨ２６０μＬを加えて溶解させた。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加えて、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１９４ｇを１ｍＬに溶解：和光純薬）を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを滴下し、１時間、−２０℃で攪拌し、ホルマザン化合物１８溶液を得た。このホルマザン化合物１８溶液を減圧乾固して残渣を得た。この残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物１８を得た。
ホルマザン化合物１８ １．８１ｇをＲＯ水１５ｍＬおよびＤＭＦ１５ｍＬの混合液に加えて溶解させた。ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁した後、これに１０Ｎ ＮａＯＨ２６０μＬを加えて溶解させた。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加えて、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１９４ｇを１ｍＬに溶解：和光純薬）を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを滴下し、１時間、−２０℃で攪拌し、ホルマザン化合物１８溶液を得た。このホルマザン化合物１８溶液を減圧乾固して残渣を得た。この残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物１８を得た。
３．ホルマザン化合物１８の精製およびテトラゾリウム化合物１８の合成
上記２．のホルマザン化合物１８をＲＯ水１５ｍＬ加えて溶解し、ホルマザン化合物１８溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（２０ｃｍ×５ｃｍ）に、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ（ナカライテスクス）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１８溶液を含むフラクションを採取した。このフラクションの溶媒を除去し、得られた固形分にメタノール１００ｍＬ、１５％亜硝酸エチル−エタノール溶液（東京化成工業株式会社製）２０ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ０．５ｍＬを加えて、４８時間、室温、遮光にて攪拌し、テトラゾリム化合物１８を含む溶液を得た。
上記２．のホルマザン化合物１８をＲＯ水１５ｍＬ加えて溶解し、ホルマザン化合物１８溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（２０ｃｍ×５ｃｍ）に、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ（ナカライテスクス）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１８溶液を含むフラクションを採取した。このフラクションの溶媒を除去し、得られた固形分にメタノール１００ｍＬ、１５％亜硝酸エチル−エタノール溶液（東京化成工業株式会社製）２０ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ０．５ｍＬを加えて、４８時間、室温、遮光にて攪拌し、テトラゾリム化合物１８を含む溶液を得た。
４．テトラゾリウム化合物１８の回収
上記３．で得られた溶液を、減圧乾固し、テトラゾリウム化合物１８の粗精製物を得た。この粗精製物にＲＯ水を１５ｍＬ加えて溶解した。この溶液をカラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、テトラゾリウム化合物１８を精製した。採取したフラクション溶液を、減圧乾固して残渣を得た。この残渣を、メタノール１０ｍＬに懸濁させた。さらに、ジエチルエーテルを攪拌しながら１００ｍＬ加えて、テトラゾリウム化合物１８を沈殿させた。この液を、遠心分離して上清を除去することで、沈殿を洗浄した。残った沈殿（テトラゾリウム化合物１８）を乾燥させた（収量：１．２ｇ、収率：５１％、ＵＰＬＣでの純度分析９９．２％）。
上記３．で得られた溶液を、減圧乾固し、テトラゾリウム化合物１８の粗精製物を得た。この粗精製物にＲＯ水を１５ｍＬ加えて溶解した。この溶液をカラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、テトラゾリウム化合物１８を精製した。採取したフラクション溶液を、減圧乾固して残渣を得た。この残渣を、メタノール１０ｍＬに懸濁させた。さらに、ジエチルエーテルを攪拌しながら１００ｍＬ加えて、テトラゾリウム化合物１８を沈殿させた。この液を、遠心分離して上清を除去することで、沈殿を洗浄した。残った沈殿（テトラゾリウム化合物１８）を乾燥させた（収量：１．２ｇ、収率：５１％、ＵＰＬＣでの純度分析９９．２％）。
実施例１９：テトラゾリウム化合物１９の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１９）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１９）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物１９の合成
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．２７ｇ（４．１１ｍｍｏｌ）及び２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６，７−ｄｉｈｙｄｒｏ［１，４］ｄｉｏｘｉｎｏ［２，３−ｆ］［１，３］ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ０．９７６ｇ（４．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬの混合液に溶解した。この溶液に酢酸２３６μＬを加え、ウォーターバス（６０℃）で２時間加熱攪拌した。加熱攪拌終了後、減圧乾固し、残渣を得た。この残渣に、ジエチルエーテルを加えて１時間攪拌洗浄後、遠心分離にて沈殿を分取した。その後、減圧下で一晩乾燥させ、ヒドラゾン化合物１９を得た。
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．２７ｇ（４．１１ｍｍｏｌ）及び２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−６，７−ｄｉｈｙｄｒｏ［１，４］ｄｉｏｘｉｎｏ［２，３−ｆ］［１，３］ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ０．９７６ｇ（４．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬの混合液に溶解した。この溶液に酢酸２３６μＬを加え、ウォーターバス（６０℃）で２時間加熱攪拌した。加熱攪拌終了後、減圧乾固し、残渣を得た。この残渣に、ジエチルエーテルを加えて１時間攪拌洗浄後、遠心分離にて沈殿を分取した。その後、減圧下で一晩乾燥させ、ヒドラゾン化合物１９を得た。
２．ホルマザン化合物１９の合成
ヒドラゾン化合物１９ １．８１ｇを、ＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１９溶液を調製した。ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁させた。この懸濁液に１０Ｎ ＮａＯＨ２６０μＬを加えて溶解した。この溶液を、０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１９４ｇを１ｍＬに溶解）を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１９溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを加えて、１時間、−２０℃下で攪拌し、ホルマザン化合物１９を含む溶液を得た。この溶液を、減圧乾固し、残渣を得た。この残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物１９を得た。
ヒドラゾン化合物１９ １．８１ｇを、ＲＯ水１０ｍＬおよびＤＭＦ１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１９溶液を調製した。ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁させた。この懸濁液に１０Ｎ ＮａＯＨ２６０μＬを加えて溶解した。この溶液を、０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１９４ｇを１ｍＬに溶解）を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１９溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを加えて、１時間、−２０℃下で攪拌し、ホルマザン化合物１９を含む溶液を得た。この溶液を、減圧乾固し、残渣を得た。この残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物１９を得た。
３．ホルマザン化合物１９の精製およびテトラゾリウム化合物１９の合成
上記２．のホルマザン化合物１９にＲＯ水１５ｍＬを加えて溶解し、ホルマザン化合物１９溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（２０ｃｍ×５ｃｍ）に、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ（ナカライテスクス）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１９溶液を精製した。採取した赤色のフラクションの溶媒を減圧乾固して残渣を得た。この残渣に、メタノール１００ｍＬ、１５％亜硝酸エチル−エタノール溶液（東京化成工業株式会社製）２０ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ０．５ｍＬを加えて、４８時間、室温、遮光にて攪拌した。
上記２．のホルマザン化合物１９にＲＯ水１５ｍＬを加えて溶解し、ホルマザン化合物１９溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（２０ｃｍ×５ｃｍ）に、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ（ナカライテスクス）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１９溶液を精製した。採取した赤色のフラクションの溶媒を減圧乾固して残渣を得た。この残渣に、メタノール１００ｍＬ、１５％亜硝酸エチル−エタノール溶液（東京化成工業株式会社製）２０ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ０．５ｍＬを加えて、４８時間、室温、遮光にて攪拌した。
４，テトラゾリウム化合物１９の回収
上記３．で得た溶液を減圧乾固し、残渣を得た。このテトラゾリウム化合物１９を含む残渣に、ＲＯ水を１５ｍＬ加えて、溶解させた。この溶液を、セパコア分取システムで精製した。回収したフラクションを減圧乾固し、テトラゾリウム化合物１９を含む残渣を得た。この残渣にメタノール５ｍＬ加えて溶解させた。この溶液を、攪拌しながらジエチルエーテルを１００ｍＬ加えて、テトラゾリウム化合物１９を沈殿させた。これを遠心分離して上清を除去することで、沈殿を洗浄した。残った沈殿（テトラゾリウム化合物１９）を乾燥させ、テトラゾリウム化合物１９を得た（収量：０．９３ｇ、収率：４０質量％、ＵＰＬＣでの純度分析９６．４％）。
上記３．で得た溶液を減圧乾固し、残渣を得た。このテトラゾリウム化合物１９を含む残渣に、ＲＯ水を１５ｍＬ加えて、溶解させた。この溶液を、セパコア分取システムで精製した。回収したフラクションを減圧乾固し、テトラゾリウム化合物１９を含む残渣を得た。この残渣にメタノール５ｍＬ加えて溶解させた。この溶液を、攪拌しながらジエチルエーテルを１００ｍＬ加えて、テトラゾリウム化合物１９を沈殿させた。これを遠心分離して上清を除去することで、沈殿を洗浄した。残った沈殿（テトラゾリウム化合物１９）を乾燥させ、テトラゾリウム化合物１９を得た（収量：０．９３ｇ、収率：４０質量％、ＵＰＬＣでの純度分析９６．４％）。
実施例２０：テトラゾリウム化合物２０の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物２０）を合成した。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物２０）を合成した。
１．ヒドラゾン化合物２０の合成
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．３８ｇ（４．４６ｍｍｏｌ）および（６−Ｅｔｈｏｘｙ−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｈｙｄｒａｚｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ０．９８ｇ（４．４６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物２０溶液を調製した。この溶液に酢酸２５６μＬを加え、ウォーターバス（６０℃）で２時間加熱攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去して残渣を得た。この残渣に、１００ｍＬのジエチルエーテルを加えて１時間攪拌した後、遠心分離して沈殿を分取した。ドラフト中で２時間放置し、その後、減圧下で一晩乾燥させ、ヒドラゾン化合物２０を得た。
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４−Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．３８ｇ（４．４６ｍｍｏｌ）および（６−Ｅｔｈｏｘｙ−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｈｙｄｒａｚｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） ０．９８ｇ（４．４６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ１０ｍＬおよびＲＯ水１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物２０溶液を調製した。この溶液に酢酸２５６μＬを加え、ウォーターバス（６０℃）で２時間加熱攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去して残渣を得た。この残渣に、１００ｍＬのジエチルエーテルを加えて１時間攪拌した後、遠心分離して沈殿を分取した。ドラフト中で２時間放置し、その後、減圧下で一晩乾燥させ、ヒドラゾン化合物２０を得た。
２．ホルマザン化合物２０の合成
ヒドラゾン化合物２０ １．８１ｇを、ＲＯ水１５ｍＬおよびＤＭＦ１５ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物２０溶液を調製した。これとは別に、ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ ２６０μＬを加え溶解させた。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え（白濁、亜硝酸を加えれば溶解）、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１９４ｇを１ｍＬに溶解）を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物２０溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを滴下し、１時間、−２０℃で攪拌して、ホルマザン化合物２０溶液を得た。このホルマザン化合物２０溶液の溶媒をエバポレーターで除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物２０を得た。
ヒドラゾン化合物２０ １．８１ｇを、ＲＯ水１５ｍＬおよびＤＭＦ１５ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物２０溶液を調製した。これとは別に、ｐ−アニシジン−３−スルホン酸（ｐ−ａｎｉｓｉｄｉｎ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．５２８ｇをＲＯ水８．１８ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ ２６０μＬを加え溶解させた。この溶液を０℃に保持し、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え（白濁、亜硝酸を加えれば溶解）、亜硝酸ナトリウム溶液（０．１９４ｇを１ｍＬに溶解）を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物２０溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ６００μＬを滴下し、１時間、−２０℃で攪拌して、ホルマザン化合物２０溶液を得た。このホルマザン化合物２０溶液の溶媒をエバポレーターで除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物２０を得た。
３．ホルマザン化合物２０の精製およびテトラゾリウム化合物２０の合成
上記２．のホルマザン化合物２０をＲＯ水１５ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物２０溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いてホルマザン化合物２０溶液を含むフラクションを採取した。このフラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１００ｍＬ、１５％亜硝酸エチル−エタノール溶液（東京化成工業株式会社製）２０ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ０．５ｍＬを加えて、４８時間、室温、遮光にて攪拌した。
上記２．のホルマザン化合物２０をＲＯ水１５ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物２０溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いてホルマザン化合物２０溶液を含むフラクションを採取した。このフラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１００ｍＬ、１５％亜硝酸エチル−エタノール溶液（東京化成工業株式会社製）２０ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ０．５ｍＬを加えて、４８時間、室温、遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物２０の回収
上記３．の溶液を、減圧乾固し、テトラゾリウム化合物２０の粗精製物を得た。この粗精製物に、ＲＯ水を１５ｍＬ加えて、溶解し、この溶液をセパコア分取システムで精製した。回収したフラクション溶液の溶媒を除去し、テトラゾリウム化合物２０を含む残渣を得た。この残渣を、メタノール５ｍＬに溶解させた。その後、攪拌しながらジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物２０を沈殿させた。これを遠心分離して、沈殿を洗浄後、沈殿を分取した。この沈殿を乾燥して、テトラゾリウム化合物２０を得た（収量：１．４ｇ 収率：６０％、ＵＰＬＣでの純度分析結果１００．０％）。
上記３．の溶液を、減圧乾固し、テトラゾリウム化合物２０の粗精製物を得た。この粗精製物に、ＲＯ水を１５ｍＬ加えて、溶解し、この溶液をセパコア分取システムで精製した。回収したフラクション溶液の溶媒を除去し、テトラゾリウム化合物２０を含む残渣を得た。この残渣を、メタノール５ｍＬに溶解させた。その後、攪拌しながらジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物２０を沈殿させた。これを遠心分離して、沈殿を洗浄後、沈殿を分取した。この沈殿を乾燥して、テトラゾリウム化合物２０を得た（収量：１．４ｇ 収率：６０％、ＵＰＬＣでの純度分析結果１００．０％）。
上記実施例１〜２０で得られたテトラゾリウム化合物１〜２０および下記構造の比較化合物１〜５（比較例１〜５）について、下記方法に従って、極大吸収波長（λｍａｘ）、キレート速度、感度、および水溶性を評価し、結果を下記表３に示す。
（キレート速度および極大吸収波長（λｍａｘ）の評価）
各ホルマザン化合物の終濃度が５０〜２００ｍＭとなるように、１０ｍＭ ＭＯＰＳ水溶液を加えて、試料を１００μＬ作成した。このとき、いずれの試料も赤褐色であった。これとは別に、１Ｍのニッケルイオン水溶液を作製した。
各ホルマザン化合物の終濃度が５０〜２００ｍＭとなるように、１０ｍＭ ＭＯＰＳ水溶液を加えて、試料を１００μＬ作成した。このとき、いずれの試料も赤褐色であった。これとは別に、１Ｍのニッケルイオン水溶液を作製した。
上記試料に、作製したニッケルイオン水溶液を１０μＬ加え、素早く攪拌しながら、色調変化を観察した。ニッケル水溶液を添加してから発色を目視にて確認するまでの時間を計り、上記時間が１分以内である場合にはキレート速度を「○」とし、上記時間が１分を超えた場合にはキレート速度を「×」として評価した。なお、比較例２、５では、色調変化が観察されなかったため、キレート形成しなかったと判断し、表３において「キレートしない」と表示した。
各化合物のホルマザン水溶液とニッケル水溶液の混合溶液について、スペクトルを、分光光度計（測定セル長：１０ｍｍ）にて測定した（ｎ＝１）。各スペクトルに基づいて、各化合物のホルマザンでの極大吸収波長（λｍａｘ）（ｎｍ）を求めた。それぞれの結果は、表３に示される。一例として、ホルマザン化合物１とニッケルイオンとのキレート化合物のスペクトルを図１に示す。図１から、ホルマザン化合物１とニッケルイオンとのキレート化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）は６３０ｎｍであることが分かる。
また、図１９には、テトラゾリウム化合物１、１３〜１８から生成するホルマザンのＮｉ２＋キレート化合物のスペクトルを示す。極大吸収波長での吸光度を１００％とする。ｑ＝２であり、４−メトキシ−５−スルホフェニル基を有するホルマザン化合物１７または１８の極大吸収波長はより高波長側にシフトした。
（感度の評価）
各化合物 ０．０２ｍｍｏｌに、ＲＯ水 ７５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶解して、試料を調製した。対照として、２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ−３−（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−［４−（２−ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ−４） １１．６ｍｇに、ＲＯ水 ８５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶解して、対照試料を調製した。
各化合物 ０．０２ｍｍｏｌに、ＲＯ水 ７５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶解して、試料を調製した。対照として、２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ−３−（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−［４−（２−ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ−４） １１．６ｍｇに、ＲＯ水 ８５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶解して、対照試料を調製した。
別途、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＦＡＤ）（東洋紡社製、品番：ＧＬＤ−３５１）７ｍｇに、ＲＯ水 １００μＬを加えて、溶解し、ＧＤＨ溶液を調製した。また、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート（ｍ−ＰＭＳ）（株式会社同仁化学研究所製） ３．５ｍｇに、ＲＯ水 ２００μＬを加えて溶解し、ｓ−ＰＭＳ溶液を調製した。塩化ニッケル １２９ｍｇにＲＯ水１ｍＬ加えて溶解し、ニッケル溶液を調製した。
各試料１７５μＬに、それぞれ、上記にて調製したＧＤＨ溶液 １０μＬ、ｍ−ＰＭＳ溶液 ５μＬおよびニッケル溶液 １０μＬを加えて、反応溶液とした。また、対照試料１７５μＬに、上記にて調製したＧＤＨ溶液 １０μＬ及びｍ−ＰＭＳ溶液 ５μＬ、およびＲＯ水１０μＬを加えて、対照反応溶液とした。
１２５ｍｇ／ｄＬ、２５０ｍｇ／ｄＬ及び１０００ｍｇ／ｄＬ濃度のグルコース水溶液 １０μＬに、反応溶液をそれぞれ ４０μＬずつ加えて発色させ、スペクトルを分光光度計（測定セル長：５０μｍ）にて測定した（ｎ＝１）。各スペクトルにおいて、上記にて求めた各化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）での吸光度を測定し、発色溶液中のグルコース濃度及び吸光度をそれぞれ横軸及び縦軸として、プロットし、傾き（傾きｓａｍｐｌｅ）を求めた。
１２５ｍｇ／ｄＬ、２５０ｍｇ／ｄＬ及び１０００ｍｇ／ｄＬ濃度のグルコース溶液 １０μＬに、対照反応溶液をそれぞれ４０μＬずつ加えて発色させ、スペクトルを分光光度計（測定セル長：５０μｍ）にて測定した（ｎ＝１）。各スペクトルにおいて、ＷＳＴ−４の測定波長（λｍａｘ）である６５０ｎｍでの吸光度を測定し、グルコース濃度及び吸光度をそれぞれ横軸及び縦軸として、プロットし、傾き（傾きＷＳＴ−４）を求めた。
上記にて求めた傾きｓａｍｐｌｅを傾きＷＳＴ−４で除した値（傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４）が２以上である場合には感度を「◎」とし、上記傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４が１．５以上２未満である場合には感度を「○」とし、上記傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４が１超１．５未満である場合には感度を「△」とし、上記傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４が１以下である場合には感度を「×」として評価した。一例として、テトラゾリウム化合物１及びＷＳＴ−４のプロット図を図２に示す。図２は、テトラゾリウム化合物１及びＷＳＴ−４に関するグルコース濃度と生成ホルマザンの吸光度との関係を示すグラフである。図２から、化合物１及びＷＳＴ−４の傾きはそれぞれ０．００６３及び０．００２６であることから、傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４は約２．４であることが分かる。なお、傾きは各化合物の発色強度の指標となる。このため、傾きｓａｍｐｌｅを傾きＷＳＴ−４で除した値（傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４）が１倍を超えることは、公知の発色試薬であるＷＳＴ−４に比して長波長側での発色が高いことを意味する。
（水溶性の評価）
各化合物を、水溶液中の化合物の濃度が２００ｍＭとなるような量で、ＲＯ水 １００μＬ、０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬに加えた。５分間撹拌した後、沈殿物を目視で確認した。別途、各化合物を、水溶液中の化合物の濃度が１００ｍＭとなるような量で、ＲＯ水 １００μＬ、０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬに加えた。５分間撹拌した後、沈殿物を目視で確認した。さらに、別途、各化合物を、水溶液中の化合物の濃度が２０ｍＭとなるような量で、ＲＯ水 １００μＬ、０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬに加えた。５分間撹拌した後、沈殿物を目視で確認した。２００ｍＭの水溶液にて沈殿物がない場合には溶解性を◎とした。２００ｍＭの水溶液にて沈殿物がみられるが、１００ｍＭの水溶液にて沈殿物がない場合には溶解性を○とした。１００ｍＭの水溶液にて沈殿物がみられるが、２０ｍＭの水溶液にて沈殿物がない場合には、溶解性を「△」とした。２０ｍＭの水溶液にても沈殿物が認められる場合には、溶解性を「×」とした。
各化合物を、水溶液中の化合物の濃度が２００ｍＭとなるような量で、ＲＯ水 １００μＬ、０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬに加えた。５分間撹拌した後、沈殿物を目視で確認した。別途、各化合物を、水溶液中の化合物の濃度が１００ｍＭとなるような量で、ＲＯ水 １００μＬ、０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬに加えた。５分間撹拌した後、沈殿物を目視で確認した。さらに、別途、各化合物を、水溶液中の化合物の濃度が２０ｍＭとなるような量で、ＲＯ水 １００μＬ、０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬに加えた。５分間撹拌した後、沈殿物を目視で確認した。２００ｍＭの水溶液にて沈殿物がない場合には溶解性を◎とした。２００ｍＭの水溶液にて沈殿物がみられるが、１００ｍＭの水溶液にて沈殿物がない場合には溶解性を○とした。１００ｍＭの水溶液にて沈殿物がみられるが、２０ｍＭの水溶液にて沈殿物がない場合には、溶解性を「△」とした。２０ｍＭの水溶液にても沈殿物が認められる場合には、溶解性を「×」とした。
（安定性の評価）
各化合物 ０．０２ｍｍｏｌに、ＲＯ水 ７５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶かし、試料とした。
各化合物 ０．０２ｍｍｏｌに、ＲＯ水 ７５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶かし、試料とした。
この試料１７５μＬに、上記（感度の評価）と同様にして調製したＧＤＨ溶液 １０μＬ、ｍ−ＰＭＳ溶液 ５μＬおよびニッケル溶液 １０μＬを加えて、測定溶液を作製した。
対照として、２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ−３−（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−［４−（２−ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ−４） １１．６ｍｇに、ＲＯ水 ８５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶解し、対照試料を調製した。対照試料１７５μＬに、上記にて調製したＧＤＨ溶液 １０μＬ及びｍ−ＰＭＳ溶液 ５μＬ、およびＲＯ水１０μＬを加えて、対照反応溶液を作製した。
測定溶液作製時（０時間）、ならびに作製してから１時間、２時間及び６時間後に、上記にて調製した測定溶液のスペクトルを分光光度計（測定セル長：５０μｍ）にて測定した（ｎ＝１）。各スペクトルにおいて、上記にて求めた各化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）での吸光度を測定した。測定溶液作製時（０時間）、ならびに作製してから６時間後での吸光度を、それぞれ、Ａｂｓ０ｈ、及びＡｂｓ６ｈとする。６時間後の吸光度から測定溶液作製時（０時間）での吸光度を差し引いた値を測定時間で除した値［（Ａｂｓ６ｈ−Ａｂｓ０ｈ）／６］が０．０１以下である場合には安定性を「◎」とし、上記値が０．０１を超え、０．０５以下である場合には安定性を「○」とし、上記値が０．０５を超え０．１以下である場合には安定性を「△」とし、上記値が０．１を超える場合には「×」として評価した。一例として、テトラゾリウム化合物１の安定性評価結果を図３に示す。図３においては、測定溶液作製１時間後、２時間後及び、２４時間後での吸光度も併せて示す。図３から、化合物１の［（Ａｂｓ６ｈ−Ａｂｓ０ｈ）／６］は、約０．００８であることから、安定性は◎であることが分かる。なお、対照反応溶液の［（Ａｂｓ６ｈ−Ａｂｓ０ｈ）／６］は、約０．０１であった。
上記表３の結果から、実施例のテトラゾリウム塩を用いることによって、良好な感度で速やかに血糖値を測定できることがわかる。
さらに、実施例のテトラゾリウム塩から生じるホルマザンとニッケルイオンとのキレート化合物は６００ｎｍ以上の極大吸収波長（λｍａｘ）を示す。ゆえに、全血サンプルに対しても、血糖値等の生体成分濃度を高感度で正確に測定できると考察される。
表３に示されるように、本発明のテトラゾリウム塩は、良好な水溶性を示す。上記結果から、本発明のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンおよび当該ホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物もまた、本発明のテトラゾリウム塩と同様、良好な水溶性を示すことが推測される。
なお、（１）ｍ＝２かつｐ＝１、（２）ｍ＝１かつｎ＝０である、または（３）Ｒ１が水酸基であり、この際、スルホ基（ＳＯ３−）および水酸基が２，４位、または４，６位にある、または（４）：ｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基である、のいずれかである、テトラゾリウム塩１〜３、５、７〜２０はさらに良好な水溶性を示し、（１）ｍ＝２かつｐ＝１、または、（４）：ｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基である実施例１〜３、８〜２０は特に良好な水溶性を示す。
一方、実施例２のベンゾチアゾリル基のアルコキシ基を電子吸引性のニトロ基に変更したテトラゾリウム塩である比較例２の化合物は、ホルマザンと遷移金属イオンとのキレートを形成しない。ゆえに、テトラゾール環の２位に存在するベンゾチアゾリル基をアルコキシ基で置換することが、テトラゾリウム塩から生じるホルマザンの遷移金属化合物とのキレート能を維持しつつ、極大吸収波長を長波長側にシフトさせる上で、非常に重要であることがわかる。
（評価例１：血糖計センサでの評価）
１．塗布液の調製
実施例１でのテトラゾリウム化合物１ １４．５ｍｇに、ＲＯ水 ７５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶解し、試料を調製した。対照として、２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ−３−（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−［４−（２−ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ−４） １１．６ｍｇに、ＲＯ水 ８５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶解して、対照試料を調製した。
１．塗布液の調製
実施例１でのテトラゾリウム化合物１ １４．５ｍｇに、ＲＯ水 ７５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶解し、試料を調製した。対照として、２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ−３−（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−［４−（２−ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ−４） １１．６ｍｇに、ＲＯ水 ８５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを加えて溶解して、対照試料を調製した。
別途、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＦＡＤ）（東洋紡株式会社製、品番：ＧＬＤ−３５１）７ｍｇに、ＲＯ水 １００μＬを加えて溶解し、ＧＤＨ溶液を調製した。また、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート（ｍ−ＰＭＳ）（株式会社同仁化学研究所製） ３．５ｍｇに、ＲＯ水 ２００μＬを加えて溶解し、ｓ−ＰＭＳ溶液を調製した。塩化ニッケル １２９ｍｇにＲＯ水１ｍＬ加えて溶解し、ニッケル溶液を調製した。
試料に、上記にて調製したＧＤＨ溶液 １０μＬ、ｓ−ＰＭＳ溶液 ５μＬ、ニッケル溶液 １０μＬを加えて、塗布液を作製した。また、対照試料に、上記にて調製したＧＤＨ溶液 １０μＬ及びｓ−ＰＭＳ溶液 ５μＬを加えて、対照塗布液を作製した。
２．試薬リボンの作製
上記で得られた塗布液をＰＥＴフィルム上に塗布して試薬リボン１を作製した。塗布面積は１．５ｍｍ×７５ｍｍ（総塗布量５．６μＬ）であった。この試薬リボン１を長さ方向に切断し、試薬片２とした（１．５ｍｍ×３ｍｍ）。
上記で得られた塗布液をＰＥＴフィルム上に塗布して試薬リボン１を作製した。塗布面積は１．５ｍｍ×７５ｍｍ（総塗布量５．６μＬ）であった。この試薬リボン１を長さ方向に切断し、試薬片２とした（１．５ｍｍ×３ｍｍ）。
３．血糖計センサの組み立て
血糖計センサの一面となるＰＥＴフィルム５の両端に沿って、厚さ５０μｍの両面テープをスペーサとして設けた。次いで、試薬片２の試薬塗布面を下にして両面テープ４上に試薬片２を載せることで、血糖計センサを組み立てた。図４は血糖計センサの組み立てを示す模式図である。図４において、試薬リボン１を切断して試薬片２を得た後、該試薬片２の試薬塗布面３を下面にして、ＰＥＴフィルム５の両端に配置された両面テープ４上に設置する。その後、両面テープの余った接着部に図のようにしてＰＥＴフィルム７を設置する。この際、両面テープの間に流路６が形成される。
血糖計センサの一面となるＰＥＴフィルム５の両端に沿って、厚さ５０μｍの両面テープをスペーサとして設けた。次いで、試薬片２の試薬塗布面を下にして両面テープ４上に試薬片２を載せることで、血糖計センサを組み立てた。図４は血糖計センサの組み立てを示す模式図である。図４において、試薬リボン１を切断して試薬片２を得た後、該試薬片２の試薬塗布面３を下面にして、ＰＥＴフィルム５の両端に配置された両面テープ４上に設置する。その後、両面テープの余った接着部に図のようにしてＰＥＴフィルム７を設置する。この際、両面テープの間に流路６が形成される。
作製した血糖計センサの流路入口に全血サンプル（Ｈｔ４０、１００ｍｇ／ｄＬ）（ヘマトクリット値４０％、グルコース濃度１００ｍｇ／ｄＬ）を点着した。全血サンプル（Ｈｔ４０、１００ｍｇ／ｄＬ）は、以下のように作製した；ヘパリン入りの採血管に全血を採取し、この全血サンプルのヘマトクリット値を測定し、事前に分離して得た血漿を適宜加える、または全血サンプルの血漿を抜き取って全血サンプルのヘマトクリット値がＨｔ４０になるよう調節した。またこれらの全血サンプルに高濃度グルコース溶液（４０ｇ／ｄＬ）を適宜添加し、全血サンプル（Ｈｔ４０、１００ｍｇ／ｄＬ）を作製した。検体を試薬部に点着してから９秒後に、ファイバー分光光度計を用いてスペクトルを測定した。各化合物を用いた血糖計センサにおいて測定したスペクトルにて極大吸収波長での吸光度を測定した。全血サンプル（Ｈｔ４０、１００ｍｇ／ｄＬ）を測定とした場合の吸光度をＡｂｓＢＧ１００とする。
また、対照として、血糖値が０ｍｇ／ｄＬの検体（Ｈｔ４０、０ｍｇ／ｄＬ）を用い、同様にスペクトルを測定し、各化合物（化合物１およびＷＳＴ−４）での極大吸収波長での吸光度をＡｂｓＢＧ０とする。ここで、血糖値が０ｍｇ／ｄＬの検体（Ｈｔ４０、０ｍｇ／ｄＬ）は以下のように作製した。全血サンプル（Ｈｔ４０、１００ｍｇ／ｄＬ）１ｍＬに対し、グルコースオキシダーゼ（東洋紡株式会社製ＧＬＯ−２０１）を０．１ｍｇ添加した。添加後５分間室温で放置し、全血サンプル（Ｈｔ４０、０ｍｇ／ｄＬ）を作製した。
各化合物のΔＡｂｓ＝ＡｂｓＢＧ１００−ＡｂｓＢＧ０を求めた結果を図５に示す。
図５に示されるように、実施例１でのテトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサにおいて、ＷＳＴ−４（６５０ｎｍ）の３倍程度の発色があった。ゆえに、本発明のテトゾリウム塩を含む生体成分濃度測定試薬は、全血サンプルを用いた場合であっても、生体成分を感度よく検出することができることがわかる。
また、全血サンプル（Ｈｔ４０、１００ｍｇ／ｄＬ）と同様に全血サンプル（Ｈｔ４０、４００ｍｇ／ｄＬ）（ヘマトクリット値４０％、グルコース濃度４００ｍｇ／ｄＬ）を作製した。さらに、別途、グルコース水溶液（１００ｍｇ／ｄＬ）およびグルコース水溶液（４００ｍｇ／ｄＬ）を作製した。これらのサンプルについて、同様にして、実施例１でのテトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサを用いて、反応開始から９秒後に分光光度計にてスペクトルを測定した。結果を図６に示す。なお、図６Ａは、テトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサに全血サンプルを作用させた際のスペクトルを示す図である。また、図６Ｂは、テトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサにグルコース水溶液を作用させた際のスペクトルを示す図である。
図６に示されるように、実施例１でのテトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサにおいて、全血およびグルコース水溶液の双方において吸光度が０．２を超えるものとなった。このため、全血サンプルを用いた場合であっても、血液成分中の着色成分によるノイズが小さく、生体成分を感度よく検出することができることがわかる。
さらに、グルコース水溶液（８００ｍｇ／ｄＬ）を作製した。
作製した全血サンプル（Ｈｔ４０、０ｍｇ／ｄＬ）、全血サンプル（Ｈｔ４０、１００ｍｇ／ｄＬ）、全血サンプル（Ｈｔ４０、４００ｍｇ／ｄＬ）、グルコース水溶液（１００ｍｇ／ｄＬ）、グルコース水溶液（４００ｍｇ／ｄＬ）、グルコース水溶液（８００ｍｇ／ｄＬ）の各試料を、実施例１でのテトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサで測定した際の反応開始からの時間と、６３０ｎｍでの吸光度との関係を求めた。結果を図７に示す。なお、図７Ａは、テトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサに、全血サンプルを点着した際の反応開始からの時間と、６３０ｎｍでの吸光度との関係を示した図である。図７Ｂは、テトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサにグルコース溶液を作用させた際の反応開始からの時間と、６３０ｎｍでの吸光度との関係を示した図である。
図７に示されるように、実施例１でのテトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサにおいて、全血およびグルコース水の双方において５秒で発色が完了し、発色速度、感度ともに良好である。ゆえに、本発明のテトゾリウム塩を含む生体成分濃度測定試薬は、全血サンプルを用いた場合であっても、生体成分を感度よく、かつ速やかに検出することができる。
さらに、図８に全血サンプル（Ｈｔ４０）およびグルコース水溶液を、血糖計センサで測定した際のグルコース濃度と、ホルマザンおよびＮｉ２＋のキレート化合物の極大吸収波長における吸光度との関係を示すグラフを示す。吸光度の測定は、反応開始から９秒後に行った。なお、図８Ａは、テトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサに全血サンプルを作用させた際のグルコース濃度と、ホルマザンおよびＮｉ２＋のキレート化合物の吸光度との関係を示すグラフである。図８Ｂは、テトラゾリウム化合物１を適用した血糖計センサにグルコース水溶液を作用させた際のグルコース濃度と、ホルマザンおよびＮｉ２＋のキレート化合物の吸光度との関係を示すグラフである。
図８に示されるように、吸光度と血糖値とは直線関係（比例関係）を示す。これから、吸光度により血糖値を正確に測定できることが考察される。
これらのことから、生体試料に、本発明のテトラゾリウム塩、酸化還元酵素および遷移金属化合物を添加して、発色量を測定し、当該発色量に基づいて検量線を作製することにより、生体試料中の生体成分の濃度を正確に算出できる。
（評価例２：血糖計センサでの評価）
１．酢酸Ｎｉ、ＤＳＢ２０ｍＭ溶液の調製
０．５Ｍ酢酸Ｎｉ溶液０．６ｍＬ、ＲＯ水０．４ｍＬ、ＤＳＢ（ベンゼン−１，３−ジスルホン酸）８．７ｍｇを添加し、酢酸Ｎｉ・ＤＳＢ溶液を作製した。
１．酢酸Ｎｉ、ＤＳＢ２０ｍＭ溶液の調製
０．５Ｍ酢酸Ｎｉ溶液０．６ｍＬ、ＲＯ水０．４ｍＬ、ＤＳＢ（ベンゼン−１，３−ジスルホン酸）８．７ｍｇを添加し、酢酸Ｎｉ・ＤＳＢ溶液を作製した。
２．塗布液の調製
酢酸Ｎｉ・ＤＳＢ溶液８７μＬに１Ｎ ＮａＯＨ溶液４．７μＬ、ＲＯ水３０．３μＬ、各テトラゾリウム塩（化合物１７〜２０、化合物１） ４．８ｍｇを加えて、混和した。さらに、この液に、メタノール４μＬを、ＧＤＨ−ＦＡＤ １．７ｍｇを加えた。この液を、遠心分離し、上清を塗布液とした。
酢酸Ｎｉ・ＤＳＢ溶液８７μＬに１Ｎ ＮａＯＨ溶液４．７μＬ、ＲＯ水３０．３μＬ、各テトラゾリウム塩（化合物１７〜２０、化合物１） ４．８ｍｇを加えて、混和した。さらに、この液に、メタノール４μＬを、ＧＤＨ−ＦＡＤ １．７ｍｇを加えた。この液を、遠心分離し、上清を塗布液とした。
３．試薬片の作製
上記で得られた塗布液を、ＰＥＴフィルム上にインクジェット方式にて塗布して試薬リボンを作製した。この試薬リボンを長さ方向に切断し（１．５ｍｍ×３ｍｍ）、試薬片２とした。
上記で得られた塗布液を、ＰＥＴフィルム上にインクジェット方式にて塗布して試薬リボンを作製した。この試薬リボンを長さ方向に切断し（１．５ｍｍ×３ｍｍ）、試薬片２とした。
４．血糖計センサの組み立て
図１３Ａは血糖計センサの組み立てを示す模式図である。図１３Ａにおいて、試薬片２を得た後、試薬片２の試薬塗布面３を下面にして、ＰＥＴフィルム５上に設置し、血糖計センサを組み立てた。図１３Ａにおいて、試薬片２の試薬塗布面３を下面にしてＰＥＴフィルム５の両端に配置されたスペーサとしての両面テープ４上に設置した後、ＰＥＴフィルム５と同じ形状のＰＥＴフィルム７を試薬片２の上に更に押圧しながら貼り付けることで、内面の血液流路が段差形状の測定チップを得た。図１３Ｂは、測定チップの、縦または横方向の断面図である。ここでは、図１３Ｂに示される、流路部の流路長さ（Ｌ１）、流路幅（Ｗ）、流路厚み（ｔ１）、および試薬塗布部に相当する試薬部（測定部）の流路長さ（Ｌ２）、流路幅（Ｗ）、流路厚み（ｔ２）としては下記表のサイズのものを用いた。図１３Ｂにおいて、チップの流路は、試薬塗布面が配置されてなる試薬部と、流路において、試薬塗布面が配置されていない流路を流路部とからなる。
図１３Ａは血糖計センサの組み立てを示す模式図である。図１３Ａにおいて、試薬片２を得た後、試薬片２の試薬塗布面３を下面にして、ＰＥＴフィルム５上に設置し、血糖計センサを組み立てた。図１３Ａにおいて、試薬片２の試薬塗布面３を下面にしてＰＥＴフィルム５の両端に配置されたスペーサとしての両面テープ４上に設置した後、ＰＥＴフィルム５と同じ形状のＰＥＴフィルム７を試薬片２の上に更に押圧しながら貼り付けることで、内面の血液流路が段差形状の測定チップを得た。図１３Ｂは、測定チップの、縦または横方向の断面図である。ここでは、図１３Ｂに示される、流路部の流路長さ（Ｌ１）、流路幅（Ｗ）、流路厚み（ｔ１）、および試薬塗布部に相当する試薬部（測定部）の流路長さ（Ｌ２）、流路幅（Ｗ）、流路厚み（ｔ２）としては下記表のサイズのものを用いた。図１３Ｂにおいて、チップの流路は、試薬塗布面が配置されてなる試薬部と、流路において、試薬塗布面が配置されていない流路を流路部とからなる。
なお、流路部におけるチップ厚み方向に対して直交する方向（流路長手方向）の長さＬ１としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５〜１０ｍｍが好ましい。ここで、長さＬ１は、長いと、成分測定装置への装着（挿入）が容易となる点、および光学測定部への外乱光の進入が減少するという点で有利である。長さＬ１が短いと、検体量を少なくできる点で有利となる。よって、成分測定装置への装着（挿入）のしやすさ、外乱光の影響、及び検体量のバランスを考慮して、長さＬ１の上限と下限が決定される。試薬部における流路のチップ厚み方向に対して直交する方向（流路長手方向）の長さＬ２としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１〜４ｍｍが好ましい。ここで、長さＬ２は、長い方が、照射スポットの面積を長さ方向に大きく取れるため、精度良く測定ができる点で有利であるが、短い方が、検体量を少なくできる点で有利となる。よって、測定精度と検体量とのバランスを考慮して、長さＬ２の上限と下限が決定される。
４．作成したセンサの評価
作製した各テトラゾリウム塩を含むセンサにグルコース水（ｎ＝３）、または全血（ｎ＝５）を点着し、ファイバー分光光度計を使用して、ブランクスペクトル、発色スペクトル、発色タイムコースを確認した。発色色素の吸光度として、６５０ｎｍの吸光度を測定した。
作製した各テトラゾリウム塩を含むセンサにグルコース水（ｎ＝３）、または全血（ｎ＝５）を点着し、ファイバー分光光度計を使用して、ブランクスペクトル、発色スペクトル、発色タイムコースを確認した。発色色素の吸光度として、６５０ｎｍの吸光度を測定した。
図１４に、グルコース濃度０ｍｇ／ｄＬの水をセンサに点着した際のブランクのスペクトルを、図１５にグルコース濃度４００ｍｇ／ｄＬのグルコース水を点着したセンサの吸光度スペクトルから、グルコース濃度０ｍｇ／ｄＬの水を点着した吸光度スペクトル（図１４）を引いた、差分のスペクトル（グルコースの正味の発色量を意味する。）を示す。
本発明のテトラゾリウム化合物において、ベンゾチアゾール（benzothiazole）環６位（または５，６位）に置換するアルコキシ基の種々の置換基について、正味発色量のタイムコース（測定波長６５０ｎｍ）を測定した。血液サンプル由来のノイズ成分を反映する補正波長として、９００ｎｍにおける吸光度も測定した。発色量のタイムコースは、測定波長６５０ｎｍにおいて、反応開始から１５秒後の吸光度を１００％としたときの、各時間における割合％として示した。なお、「正味発色量」とは、同じヘマトクリット値の血液において、所望の血糖値（例えば、８００ｍｇ／ｍＬ）の血液を、血糖値測定試薬と反応させた場合の吸光度から、血糖値０ｍｇ／ｄＬの血液を、血糖値測定試薬と反応させたときの吸光度を差し引いた、正味の発色量である。発色量の計算に用いた吸光度は、発色以外の光学的なばらつきを除くため、６５０ｎｍの吸光度から、光学的なばらつきを補正するために９００ｎｍの吸光度を引いた値を用いた。６５０ｎｍの吸光度は、グルコースに由来する発色量と血球に由来する散乱光によるノイズを含む。９００ｎｍの吸光度は散乱光による６５０ｎｍのノイズの量を反映している。図１６にグルコース水溶液（８００ｍｇ／ｄＬ）を用いた際の吸光度スペクトルを、図１７に全血サンプル（Ｈｔ４０、８００ｍｇ／ｄＬ）（ヘマトクリット値４０％、グルコース濃度８００ｍｇ／ｄＬ）を用いた際の吸光度スペクトルを示す。これらの結果から、化合物１のベンゾチアゾール環の６位または５, ６位を、種々のアルコキシ基で置換した化合物１７、化合物１８、化合物１９、化合物２０は、いずれもグルコース測定試薬として使用可能なことを確認した。なお、評価例１、２ともに、透過光測定におけるセル長の影響を考慮して評価した。
（評価例３：モル吸光係数の推定）
上記キレート速度および極大吸収波長（λｍａｘ）の評価の欄に記載したものと同様にして、実施例１でのテトラゾリウム化合物１を用いて、測定溶液を作製した。
上記キレート速度および極大吸収波長（λｍａｘ）の評価の欄に記載したものと同様にして、実施例１でのテトラゾリウム化合物１を用いて、測定溶液を作製した。
図１３の血糖計センサを用いてモル吸光係数の推定をおこなった。この際、テトラゾリウム化合物１は、グルコースと１：１（モル）で反応すると仮定する。点着したグルコース水中に含まれるβグルコースの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）をｘとし、グルコース水を点着した血糖計センサの６３０ｎｍの吸光度を１ｃｍでの場合に換算したものをｙとし、その際の直線の傾きがモル吸光係数で表される（グルコース分子量１８０．１６ 溶液中のβグルコース比６２％で計算）。
図１８にβグルコースの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）をｘ、発色したホルマザンおよびＮｉ２＋のキレート化合物のλｍａｘ＝６３５ｎｍでの吸光度を１ｃｍでの場合に換算したもの（ａｂｓ／ｃｍ）をｙとしたときのグラフを示す。グラフより発色したホルマザンおよびＮｉ２＋のキレート化合物のλｍａｘ＝６３５ｎｍのモル吸光係数はε＝２２５９４Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍとなると推定される。
本出願は、２０１６年９月１４日に出願された日本特許出願番号２０１６−１７９９１１号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
１ 試薬リボン、
２ 試薬片、
３ 試薬塗布面、
４ 両面テープ、
５ ＰＥＴフィルム、
６ 流路、
７ ＰＥＴフィルム、
１０ 血糖計、
１２ 測定用チップ、
１４ 測定部、
１６ 装置本体、
１８ チップ本体部、
２０ 空洞部、
２０ａ 先端口部、
２０ｂ 基端口部、
２２ 長辺、
２２ａ 上側長辺、
２２ｂ 下側長辺、
２４ 短辺、
２４ａ 先端辺、
２４ｂ 基端辺、
２６ 試薬、
２８ 測定対象部、
３０ 板片、
３２ スペーサ、
４０ 筺体、
４２ 制御部、
４４ 箱体部、
４６ 測光部、
４８ 電源ボタン、
５０ 操作ボタン、
５２ ディスプレイ、
５４ イジェクトレバー、
５６ イジェクトピン、
５６ａ 棒部、
５６ｂ 受部、
５８ 挿入口、
５８ａ 挿入開口部、
５９ 測定用孔部、
６０ チップ装着部、
６０ａ フランジ部、
６２ 壁部、
６４ 素子収容空間、
６６ 導光部、
６８ 発光素子、
７０ 発光部、
７２ 受光素子、
７４ 受光部、
７６ コイルバネ。
２ 試薬片、
３ 試薬塗布面、
４ 両面テープ、
５ ＰＥＴフィルム、
６ 流路、
７ ＰＥＴフィルム、
１０ 血糖計、
１２ 測定用チップ、
１４ 測定部、
１６ 装置本体、
１８ チップ本体部、
２０ 空洞部、
２０ａ 先端口部、
２０ｂ 基端口部、
２２ 長辺、
２２ａ 上側長辺、
２２ｂ 下側長辺、
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２４ａ 先端辺、
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２６ 試薬、
２８ 測定対象部、
３０ 板片、
３２ スペーサ、
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４２ 制御部、
４４ 箱体部、
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４８ 電源ボタン、
５０ 操作ボタン、
５２ ディスプレイ、
５４ イジェクトレバー、
５６ イジェクトピン、
５６ａ 棒部、
５６ｂ 受部、
５８ 挿入口、
５８ａ 挿入開口部、
５９ 測定用孔部、
６０ チップ装着部、
６０ａ フランジ部、
６２ 壁部、
６４ 素子収容空間、
６６ 導光部、
６８ 発光素子、
７０ 発光部、
７２ 受光素子、
７４ 受光部、
７６ コイルバネ。
Claims (15)
- 下記式（１）：
- 前記式（１）において、ｍが２である、請求項１に記載のテトラゾリウム塩。
- 前記式（１）において、ｐが１である、またはｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基である、請求項１または２に記載のテトラゾリウム塩。
- 前記式（１）において、テトラゾール骨格の５位のフェニル基が、スルホ基（−ＳＯ３ −）が２位または４位に存在するフェニル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のテトラゾリウム塩。
- 前記式（１）において、テトラゾール骨格の２位に存在する置換ベンゾチアゾリル基の−ＯＲ３の少なくとも１がベンゾチアゾリル基の６位に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のテトラゾリウム塩。
- 前記式（１）において、ｎが１または２であり、かつ、少なくとも１のＲ２が−ＯＲ４基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のテトラゾリウム塩。
- 前記−ＯＲ４基がメトキシ基である、請求項６に記載のテトラゾリウム塩。
- 前記（１）において、ｐ＝１であり、テトラゾール骨格の３位のフェニル基が、スルホ基（−ＳＯ３ −）が３位または５位に存在するフェニル基である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のテトラゾリウム塩。
- 前記式（１）において、テトラゾール骨格の３位に存在するフェニル基が、４−メトキシ−３−スルホフェニル基、２−メトキシ−５−スルホフェニル基、３−カルボキシ−４−メトキシフェニル基、または４−メトキシ−５−スルホフェニル基である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のテトラゾリウム塩。
- 請求項１〜９のいずれか１項に記載のテトラゾリウム塩を含む生体成分濃度測定用試薬。
- さらに遷移金属化合物を含む、請求項１０に記載の生体成分濃度測定用試薬。
- 前記遷移金属化合物がニッケル化合物である、請求項１１に記載の生体成分濃度測定用試薬。
- 血液または体液中の、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、尿酸の濃度の測定のために使用される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の生体成分濃度測定用試薬。
- 生体試料に、請求項１〜９のいずれか１項に記載の２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−置換スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、酸化還元酵素および遷移金属化合物を添加して、発色量を測定し、当該発色量に基づいて前記生体試料中の生体成分の濃度を定量することを有する、生体成分濃度の測定方法。
- 前記生体試料中の生体成分が、血液または体液中の、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、尿酸である、請求項１４に記載の方法。
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