CN109689648B

CN109689648B - 2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2h-四唑鎓盐

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Publication number: CN109689648B
Application number: CN201780046705.9A
Authority: CN
Inventors: 佐藤嘉哉
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2016-09-14
Filing date: 2017-09-01
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2037-09-01
Also published as: WO2018051822A1; US10851094B2; EP3514156A1; US20210009578A1; JPWO2018051822A1; US11739083B2; US20190185465A1; JP6947736B2; CN109689648A; EP3514156A4

Abstract

本发明提供在与血液的吸收带不重合的波长范围(600nm以上)具有充分的显色峰的化合物。下述式(1)表示的2‑取代苯并噻唑基‑3‑取代苯基‑5‑取代磺化苯基‑2H‑四唑

盐：式(1)中，m为与四唑骨架的5位的苯基键合的磺基(‑SO₃‑)的个数，为1或者2，n为与四唑骨架的3位的苯基键合的R₂的个数，为0～2的整数，p为与四唑骨架的3位的苯基键合的磺基(‑SO₃‑)的个数，为0或者1，n+p为1以上，q为1或者2，q为2时，各OR₃邻接配置，此时，各OR₃可以相互形成环，X表示氢原子或者碱金属。

Description

2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑鎓盐

技术领域

本发明涉及2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑

盐、以及含有该盐的生物成分浓度测定用试剂和使用该盐的生物成分浓度的测定方法。

背景技术

在临床化学检查中，存在以色素量对血液、尿等生物体液中含有的生物成分的量进行检测定量的方法，将该方法中使用的试剂称为显色试剂。

例如，在日本特开平8-53444号公报中，公开了使用具有下述结构的水溶性四唑

盐化合物对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行定量的方法，

(R¹表示氢原子或者甲氧基，R²表示氢原子、羧基或者磺酸)。

发明内容

由上述日本特开平8-53444号公报的四唑

盐生成的甲臜具有高的水溶性，但在与血色素的主要吸收带不重合的波长范围(600nm以上)的显色强度不充分。因此，上述日本特开平8-53444号公报的四唑

盐无法对全血样品实现充分的灵敏度。

因此，本发明是鉴于上述事情而进行的，其目的在于使生物成分浓度测定用试剂在与血色素的主要吸收带不重合的波长范围(600nm以上)具有充分的显色峰。由此，提供能够以充分的灵敏度对全血样品定量生物成分的手段。

本发明的另一目的在于提供既能维持生物成分浓度测定用试剂的水溶性、又能在以全血为样品时以充分的灵敏度稳定地定量生物成分的手段。

本发明人等为了解决上述的问题进行了深入研究，结果发现在四唑骨架的2位具有导入了甲氧基或者乙氧基的苯并噻唑基、在3位具有取代苯基和在5位具有至少包含一个磺基(-SO₃ ^-)的苯基的四唑

盐能够解决上述课题，从而完成了本发明。

即，上述目的可以通过下述式(1)表示的2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑

盐来实现，

式(1)中，R¹为选自氢原子、羟基、甲氧基和乙氧基中的任一个， R²为选自硝基、-OR⁴和羧基(-COO^-)中的任一个，多个R²可以相同，也可以不同，R³为氢原子、甲基或者乙基，至少一个为甲基或者乙基， R⁴为甲基或者乙基，m为与四唑骨架的5位的苯基键合的磺基(-SO₃ ^-) 的个数，m为1或者2，n为与四唑骨架的3位的苯基键合的R²的个数， n为0～2的整数，p为与四唑骨架的3位的苯基键合的磺基(-SO₃ ^-)的个数，p为0或者1，n+p为1以上，q为1或者2，q为2时，各OR³邻接配置，此时，各OR³可以相互形成环，X表示氢原子或者碱金属。

附图说明

图1是表示由四唑

化合物1生成的甲臜的Ni²⁺螯合物的光谱的图。

图2是表示与四唑

化合物1和WST-4相关的葡萄糖浓度和生成的各甲臜的(对于四唑

化合物1为甲臜的Ni²⁺螯合物)吸光度的关系的图表。

图3是表示四唑

化合物1的稳定性评价结果的图。

图4是评价例1中使用的血糖仪传感器的示意图。

图5是表示使全血样品作用于使用了四唑

化合物1和WST-4的血糖仪传感器时得到的信号量(吸光度)的结果的图。

图6A是表示在使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器点涂全血样品时生成的甲臜的Ni²⁺螯合物的光谱的图。

图6B是表示在使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器点涂葡萄糖水溶液时生成的甲臜的Ni²⁺螯合物的光谱的图。

图7A是表示从在使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器点涂全血样品时开始测定的时间与生成的甲臜的Ni²⁺螯合物在极大吸收波长处的吸光度的关系的图。

图7B是表示从在使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器点涂葡萄糖水溶液时开始测定的时间与生成的甲臜的Ni²⁺螯合物在极大吸收波长处的吸光度的关系的图。

图8A是表示在使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器点涂全血样品时的葡萄糖浓度与生成的甲臜的Ni²⁺螯合物的吸光度的关系的图表。

图8B是表示在使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器点涂葡萄糖水溶液时的葡萄糖浓度与生成的甲臜的Ni²⁺螯合物的吸光度的关系的图表。

图9是示意性地表示安装有本方式涉及的测定用芯片的血糖仪(成分测定装置)的俯视图。

图10是将图9的测定用芯片和装置主体的测光部放大表示的立体图。

图11是表示图9的测定用芯片的侧视图。

图12A是表示图9的测定用芯片和装置主体的安装动作的第1俯视图。

图12B是接着图12A表示安装动作的第2俯视截面图。

图13A是评价例2中使用的血糖仪传感器的示意图。

图13B是用于说明图13A的血糖仪传感器的内表面的长度、宽度、厚度的图。

图14是点涂水的血糖仪传感器的吸光度光谱(空白)。

图15表示用点涂葡萄糖浓度400mg/dL的葡萄糖水的传感器的吸光度光谱减去点涂水的吸光度光谱(图14)而得到的差分光谱(表示葡萄糖的净显色量)。

图16是表示从在使用了各四唑

化合物的血糖仪传感器点涂葡萄糖水溶液(800mg/dL)时开始测定的时间与生成的甲臜的Ni²⁺螯合物在极大吸收波长处的吸光度的关系的图(将反应开始后15秒后的吸光度设为 100％)。

图17是表示从在使用了各四唑

化合物的血糖仪传感器点涂全血样品(Ht40，800mg/dL)(血细胞比容值40％，葡萄糖浓度800mg/dL) 时开始测定的时间与生成的甲臜的Ni²⁺螯合物在极大吸收波长处的吸光度的关系的图(将反应开始后15秒后的吸光度设为100％)。

图18是将β葡萄糖的浓度(mol/L)设为x，将显色的甲臜及Ni²⁺的螯合物在λmax＝635nm处的吸光度被换算成以1cm表示的情况的值 (abs/cm)设为y时的图表。

图19是表示由四唑

化合物1、13～18生成的甲臜的Ni²⁺螯合物的光谱的图。将各化合物在极大吸收波长处的吸光度设为100％。

具体实施方式

在本发明的第一方面，提供具有下述式(1)的结构的2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑

盐。

本说明书中，将上述式(1)的2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑

盐也简称为“本发明的四唑

盐”或者“四唑

盐”。

由本发明的四唑

盐生成的甲臜与过渡金属离子的螯合物在与血色素的主要吸收带不重合的波长范围(600nm以上)具有极大吸收波长。因此，血液中存在的着色物质的影响少，能够减少测定误差。应予说明，本说明书中，将由本发明的四唑

盐生成的甲臜与过渡金属离子的螯合物也简称为“甲臜化合物”。

由上述日本特开平8-53444号公报的四唑

盐生成的甲臜在510～ 550nm具有极大吸收(段落“0011”)。事实上，在上述日本特开平8-53444 号公报的实施例3中，用550nm处的吸光度对NADH浓度进行了定量(段落“0029”，图2)。另一方面，使用全血样品测定生物成分(例如葡萄糖) 浓度时，需要使测定波长位于与血色素的主要吸收带不重合的波长范围。用于检测血液中的红细胞浓度的波长为510～540nm左右，氧合血红蛋白的极大吸收波长为550nm左右。因此，在以全血为试样的生物成分测定中，甲臜的极大吸收波长优选为600nm以上。如此说来，由日本特开平 8-53444号公报的四唑

盐产生的甲臜无法充分排除血细胞的影响，难以以良好的灵敏度测定生物成分浓度。因此，需要使日本特开平8-53444号公报的四唑

盐的极大吸收波长向更长的波长范围侧移动。一般而言，通过使某种甲臜与过渡金属离子(例如镍离子、钴离子)作用而生成螯合物，能够使极大吸收波长向长波长侧移动。但是，在日本特开平8-53444号公报的实施例3中，即便为了向长波长侧移动而添加了过渡金属离子(例如镍离子)，也没有形成螯合物(参照后述的比较例5)，若进一步增加过渡金属离子的添加量，则形成沉淀物。因此，难以说日本特开平8-53444号公报的四唑

盐适合用作全血样品的试剂。

与此相对，由本发明的四唑

盐产生的甲臜化合物的极大吸收波长位于与血液的吸收带不重合的波长范围(600nm以上，特别是630nm以上)。因此，通过使用本发明的四唑

盐，能够减少来自生物试样的噪音。即，能够以良好的灵敏度检测与生物成分有关的信号。发挥上述效果的详细机制仍不明确，但考虑如下。应予说明，以下的机制是推测的，不限制本发明的技术范围。

本发明人发现由于本发明的四唑

盐中的四唑骨架的2位的苯并噻唑基被烷氧基取代，所以由四唑

盐产生的甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物的极大吸收波长能够向长波长侧移动(后述的实施例2与比较例 1的比较)。

另外，利用存在于四唑环的2位的苯并噻唑基，由本发明的四唑

盐生成的甲臜能够与Co²⁺、Ni²⁺等过渡金属离子高效且迅速地形成螯合物。认为这是由苯并噻唑基的氮原子所带来的效果。在此，认为用烷氧基取代苯并噻唑基时，由于烷氧基为供电子性，所以苯并噻唑基的电子密度提高，甲臜与过渡金属离子的螯合物的形成更迅速地进行。因此，认为在存在于四唑环的2位的苯并噻唑基上导入烷氧基对于维持由四唑

盐产生的甲臜与过渡金属化合物的螯合能力并使极大吸收波长向长波长侧移动而言是非常重要的(后述的实施例2与比较例2的比较)。

由此，根据本发明的四唑

盐，能够使由本发明的四唑

盐生成的甲臜化合物的极大吸收波长进一步移动到与血色素的主要吸收带不重合的波长范围(600nm以上，特别是630nm以上)。因此，能够在极大吸收波长不与血色素的主要吸收带重合的波长范围(600nm以上)测定生物成分浓度，通过使用本发明的四唑

盐，即便是全血样品中的生物成分浓度也能够正确地测定。

此外，本发明的四唑

盐中的四唑骨架的5位的苯基具有1或2个磺基(-SO₃ ^-)，且四唑骨架的3位的苯基具有0或1个磺基(-SO₃ ^-)。因此，四唑

盐在化合物中具有1～3个磺基(-SO₃ ^-)。因此，四唑

盐具有水溶性。另外，本发明的四唑

盐的稳定性优异。

因此，通过使用本发明的四唑

盐，能够以良好的灵敏度迅速地测定生物成分浓度。另外，通过使用本发明的四唑

盐，即便在长时间保存后，也能够以良好的灵敏度测定生物成分浓度。

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。

本发明的一个方式的四唑

盐具有下述式(1)的结构。

式(1)中，R¹为选自氢原子、羟基、甲氧基和乙氧基中的任一个， R²为选自硝基、-OR⁴和羧基中的任一个，R³为氢原子、甲基或者乙基，至少一个为甲基或者乙基，R⁴为甲基或者乙基，m为与四唑骨架的5位的苯基键合的磺基(-SO₃ ^-)的个数，为1或者2，n为与四唑骨架的3位的苯基键合的R²的个数，为0～2的整数，p为与四唑骨架的3位的苯基键合的亚硫酸根离子(-SO₃ ^-)的个数，为0或者1，n+p为1以上，q为1 或者2，q为2时，各OR³邻接配置，此时，各OR³可以相互形成环，X 表示氢原子或者碱金属。

本发明的另一方式的四唑

盐具有下述式(1’)的结构。

式(1’)

此时，R¹为选自氢原子、羟基、甲氧基和乙氧基中的任一个，R²为选自硝基、-OR⁴和羧基中的任一个，R³和R⁴各自独立地为甲基或者乙基， m为与四唑骨架的5位的苯基键合的磺基(-SO₃-)的个数，为1或者2，n为与四唑骨架的3位的苯基键合的R²的个数，为0～2的整数，p为与四唑骨架的3位的苯基键合的磺基(-SO₃ ^-)的个数，为0或者1，n+p 为1以上，X表示氢原子或者碱金属。

式(1)中，在四唑骨架的2位存在取代苯并噻唑基。在上述式(1) 中，通过使四唑环的2位存在苯并噻唑基，能够与过渡金属化合物高效且迅速地形成螯合物(能够使甲臜化合物的极大吸收波长向长波长范围移动)。而且，通过在四唑骨架的2位的苯并噻唑基导入至少一个甲氧基或者乙氧基，从而生成的甲臜与Ni²⁺等过渡金属离子形成螯合物时，极大吸收波长进一步向长波长侧移动(后述的实施例2与比较例1的比较)。

另外，q为1或者2。其中，q＝1时，R³为甲基或者乙基，从水溶性的观点考虑，优选为甲基。R³为碳原子数3以上的烷基时，四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的水溶性差，因而不优选。

式(1)中，从与Ni²⁺等过渡金属离子形成螯合物时极大吸收波长向长波长侧移动的效果考虑，优选存在于四唑骨架的2位的取代苯并噻唑基的-OR³中的至少一个键合于苯并噻唑基的6位。

q＝1时，存在于四唑骨架的2位的苯并噻唑基的取代基即-OR³的取代位置没有特别限定，可以为4位、5位、6位或者7位中的任一个位置。从与Ni²⁺等过渡金属离子形成螯合物时极大吸收波长向长波长侧移动的效果考虑，优选-OR³的取代位置键合于苯并噻唑基的6位。

q＝2时，R³为氢原子、甲基或者乙基，至少一个为甲基或者乙基。另外，q为2时，各OR³邻接配置，各OR³可以相互形成环。此时，作为优选的组合，R³为氢原子和甲基的组合、甲基和甲基的组合。q＝2时，存在于四唑骨架的2位的苯并噻唑基的取代基即-OR³的取代位置只要使2 个-OR³邻接配置就没有特别限定，可以为4,5位，5,6位或者6,7位中的任一个。从与Ni²⁺等过渡金属离子形成螯合物时极大吸收波长向长波长侧移动的效果考虑，优选至少一个-OR³的取代位置键合于苯并噻唑基的6位，即，2个-OR³的取代位置优选为5,6位或者6,7位。具体而言，q为2时，存在于四唑骨架的2位的取代苯并噻唑基优选为以下任一个取代基。

此外，q为2时，存在于四唑骨架的2位的取代苯并噻唑基为上述中的任一个取代基时，从与Ni²⁺等过渡金属离子形成螯合物时极大吸收波长向长波长侧移动的效果考虑，优选存在于四唑骨架的3位的取代磺化苯基为4-甲氧基-5-磺基苯基。

式(1)中，在四唑骨架的5位存在取代磺化苯基。作为该磺化苯基的取代基的R¹为选自氢原子、羟基、甲氧基和乙氧基中的任一个。从提高四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的水溶性的观点考虑，R¹优选为氢原子或者羟基，从能够在广泛的pH范围与过渡金属离子稳定地形成螯合物的角度出发，R¹更优选为氢原子。另外，R¹为羟基、甲氧基和乙氧基时的取代位置没有特别限定，优选为4位。

在四唑骨架的5位至少存在一个磺基(-SO₃ ^-)(m＝1或2)。由此，认为四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的水溶性提高。式(1)中，m为与四唑骨架的5位的苯基键合的磺基(-SO₃ ^-)的个数，为1或者2。特别是磺基位于2位或者4位时，进而位于2,4位时，能够使水溶性进一步提高。并且磺基位于2,4位时，在用于合成的构件(building blocks)的合成容易的方面有利。从水溶性高、并且在广泛的pH范围能够与过渡金属离子稳定地形成螯合物、或者提高水溶性的角度出发，优选m＝2，更优选m＝2、R¹为氢原子。

此时，m＝2时，与四唑骨架的3位的苯基键合的磺基(-SO₃ ^-)的个数即p优选为1。通过选择这样的取代基个数，能够进一步提高四唑

盐和由其产生的甲臜的水溶性。

应予说明，从水溶性的观点考虑，优选满足下述(1)～(4)中的任一个：(1)m＝2且p＝1，(2)m＝1且n＝0，(3)存在于四唑骨架的5 位的苯基中，R¹为羟基，此时，磺基(SO^3-)和羟基位于2,4位或者4,6 位，(4)p＝0且至少一个R²为羧基，更优选(1)m＝2且p＝1，或者(4) p＝0且至少一个R²为羧基。另外，认为在上述(3)中，由于磺基(SO^3-) 和羟基在苯环上不以邻接的取代基的形式存在，所以没有形成氢键，或者较少，两个取代基能够有效地有助于水溶性。

在此，磺基(-SO₃ ^-)对存在于四唑骨架的5位的苯基的键合位置没有特别限制。从四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的水溶性的进一步提高效果、能够使极大吸收波长向长波长侧移动的观点考虑，m＝2时，优选磺基(-SO₃ ^-)存在于苯基的2,4位、3,5位。特别优选磺基存在于苯基的2,4 位，能够形成即便在高浓度的过渡金属离子的存在下也不会产生沉淀的四唑

盐化合物。即，通过使用该四唑

盐作为显色试剂，即便在生物成分为高浓度的情况下，也能够制备可定量的生物成分测定试剂组合物。即，在本发明的优选方式中，四唑骨架的5位的苯基优选为磺基(-SO₃ ^-)存在于2,4位的苯基。

式(1)中，在四唑骨架的3位存在取代苯基。由于苯基必须被取代，所以n+p为1以上。

作为四唑骨架的3位的苯基的取代基的R²为选自硝基、-OR⁴和羧基中的任一个。从甲臜与过渡金属离子的螯合物形成性的观点考虑，R²优选为硝基或者-OR⁴，从水溶性的观点考虑，优选为羧基。另外，n为与四唑骨架的3位的苯基键合的R²的个数，为0～2的整数。如下所述，通过导入R²，能够使化合物的极大吸收波长向长波长范围移动，能够提高化合物的稳定性，因此优选n＝1或者2。R²存在2个时，即，n＝2时，R²可以相同，也可以不同。

n＝1或2时，至少一个R²优选为-OR⁴基。即，本发明的优选方式是 n为1或2，且至少一个R²为-OR⁴基。通过导入烷氧基作为苯基的取代基，化合物的稳定性提高。从提高四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的水溶性的观点考虑，-OR⁴基优选为甲氧基。其中，R⁴为甲基或者乙基，从水溶性的观点考虑，优选为甲基。R⁴为碳原子数3以上的烷基时，四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的水溶性差，因而不优选。

n为1或2时的R²的取代位置没有特别限定，优选存在于四唑骨架的 3位的取代磺基苯基的2位、3位、4位、5位或者6位，至少一个R²优选在2位或者4位，优选为2位和/或4位。通过成为这样的结构，水溶性提高，并且能够提高四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的稳定性。

p为与四唑骨架的3位的苯基键合的磺基(-SO₃ ^-)的个数，为0或者 1。从提高四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的水溶性的观点考虑，优选 p＝1。应予说明，p＝1时，磺基为吸电子性基团，如果存在其它的吸电子性基团(例如硝基)，则有时使四唑

环上的氮原子的阳离子电荷不稳定化，化合物的稳定性下降。如上所述，通过导入烷氧基作为苯基的取代基，化合物的稳定性提高，但若同时导入硝基，则有时无法发挥由导入烷氧基所带来的稳定性的提高。因此，从提高稳定性的观点考虑，p＝1时， n为1或者2，优选n为1，且R²优选为选自-OR⁴和羧基中的任一个，R²更优选为-OR⁴。另外，从提高四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的水溶性的观点考虑，优选p＝0且至少一个R²为羧基。即，优选的实施方式是式 (1)中p为1或者p＝0且至少一个R²为羧基。更优选m＝2且p＝1或者p＝0且至少一个R²为羧基。

p＝1时，取代四唑骨架的3位的苯基的磺基(-SO₃ ^-)的取代位置没有特别限定，优选为3位或者5位。通过使磺基在该位置取代，能够更有效地提高四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的稳定性。

另外，式(1)中，存在于四唑骨架的3位的取代基优选为4-甲氧基-3-磺基苯基、2-甲氧基-5-磺基苯基、2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基、2-甲氧基-4-硝基苯基、4-磺基苯基、4-羧基-2-甲氧基苯基、5-羧基-2-甲氧基苯基、 3-羧基-4-甲氧基苯基、或者4-甲氧基-5-磺基苯基，更优选为4-甲氧基-3- 磺基苯基、2-甲氧基-5-磺基苯基、3-羧基-4-甲氧基苯基、或者4-甲氧基-5- 磺基苯基，特别优选为4-甲氧基-3-磺基苯基、4-甲氧基-5-磺基苯基或者 2-甲氧基-5-磺基苯基。通过成为这样的结构，显色灵敏度提高，水溶性提高，并且能够提高四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的稳定性。另外，因为能够使甲臜化合物本身的极大吸收波长成为更长的波长范围，所以特别优选存在于四唑骨架的3位的苯基为4-甲氧基-3-磺基苯基。

从提高四唑

盐和由四唑

盐产生的甲臜的水溶性的观点考虑，式(1)中存在的磺基的总数(m+p)优选为2以上，更优选为3。

在上述式(1)中，X表示氢原子或者碱金属。其中，X是为了中和阴离子(磺基(-SO₃ ^-))而存在的。因此，碱金属的种类没有特别限制，可以为锂、钠、钾、铷、铯中的任一个。

作为四唑

盐的优选例，可举出以下的例子。应予说明，在下述结构中，X表示碱金属。

本发明的四唑

盐的制造方法没有特别限制，可以与一直以来公知的方法同样地进行或者适当地修饰后应用。例如，通过醛与肼的脱水缩合而合成腙，接下来，使对应的重氮盐在水性溶剂中、碱性条件下反应，得到甲臜。其中，作为碱性化剂，可使用氢氧化钠、氢氧化钾等。接下来可以使用亚硝酸乙酯、亚硝酸丁酯或者次氯酸钠等氧化剂将得到的甲臜在醇溶剂(例如甲醇、乙醇)中氧化，得到式(1)的四唑

盐。举出一个实施方式，使具有下述结构的肼基取代苯并噻唑

与具有下述结构的取代磺化苯甲醛反应，

得到具有下述结构的腙化合物。

另一方面，将具有下述结构的取代磺化苯胺冰冷的同时加入盐酸，进一步滴加亚硝酸钠溶液，

得到具有下述结构的氯化重氮苯化合物。

使上述得到的腙化合物与氯化重氮苯化合物在碱性条件(例如氢氧化钠、氢氧化钾存在)下反应，得到具有下述结构的甲臜化合物。

接下来，使用氧化剂(例如亚硝酸钠、亚硝酸乙酯、亚硝酸丁酯等亚硝酸酯)将如此得到的甲臜化合物在醇溶剂(例如甲醇、乙醇)中氧化，得到本发明的四唑

盐。

由本发明的四唑

盐生成的甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物通过单独或者与过渡金属化合物形成螯合物，从而在与血色素的主要吸收带不重合的波长范围(600nm以上，特别是650nm以上)具有极大吸收波长。另外，本发明的四唑

盐具有高的水溶性。因此，通过使用本发明的四唑

盐，即便对生物试样、特别是全血样品也能够以良好的灵敏度测定生物成分浓度。具体而言，由本发明的四唑

盐生成的甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物的极大吸收波长(λmax)优选为600nm以上，更优选为630nm以上，特别优选为650nm以上。如果为具有这样的极大吸收波长的甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物(因此，能够生成这样的甲臜的四唑

盐)，则不易受到血液的吸收的影响，能够以良好的灵敏度更准确地测定生物成分浓度。在此，由本发明的四唑

盐生成的甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物的极大吸收波长(λmax)的上限没有特别限制，通常为900nm以下，优选为800nm以下。应予说明，本说明书中，极大吸收波长(λmax)采用根据下述实施例中记载的方法测定的值。

因此，在本发明的第二方面，提供含有本发明的2-取代苯并噻唑基-3- 取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑

的生物成分浓度测定用试剂。另外，在本发明的第三方面，提供一种生物成分浓度的测定方法，具有下述步骤：在生物试样中添加本发明的2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑

氧化还原酶和过渡金属化合物，测定显色量，基于该显色量对上述生物试样中的生物成分的浓度进行定量。

本发明中，生物成分测定对象只要含有目标生物成分就没有特别限制。具体而言，可举出血液、以及尿、唾液、间质液等体液等作为生物成分测定对象。另外，生物成分没有特别限制，通常利用比色法或者电极法测定的生物成分可同样地使用。具体而言，可举出葡萄糖、胆固醇、中性脂肪、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、尿酸等。即，根据本发明的第二方面中的优选方式，本发明的生物成分浓度测定用试剂用于测定血液或体液中的葡萄糖、胆固醇、中性脂肪、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)、尿酸的浓度。另外，根据本发明的第三方面中的优选方式，生物试样中的生物成分为血液或体液中的葡萄糖、胆固醇、中性脂肪、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、尿酸。

本发明的生物成分浓度测定用试剂必须含有本发明的四唑

盐。如上所述，在生物成分浓度测定用试剂中，通过四唑

盐的还原反应生成的甲臜与现在流通的四唑

盐相比较，在长波长侧具有极大吸收波长。本发明的四唑

盐通过与过渡金属离子生成螯合物，能够使极大吸收波长进一步向长波长侧移动。因此，特别是测定全血样品中的生物成分浓度时，优选含有过渡金属化合物。即，在本发明的优选方式中，生物成分浓度测定用试剂进一步含有过渡金属化合物。根据该方式，即便在测定全血样品中的生物成分浓度的情况下，甲臜在与血色素的主要吸收带不重合的波长范围 (600nm以上)也具有极大吸收波长。因此，即便对于生物试样、特别是全血样品，也能够进一步提高生物成分浓度的测定灵敏度。生物成分浓度测定用试剂含有过渡金属化合物时，作为可使用的过渡金属化合物，没有特别限制。具体而言，可以使用能够生成镍离子(Ni²⁺)、钴离子(Co²⁺)、锌离子(Zn²⁺)、铜离子(Cu²⁺)等过渡金属离子的化合物。如果为这样的离子，则能够使甲臜的极大吸收波长向更长的波长侧移动。这些中，优选镍离子。由于镍离子不易受到氧化、还原作用，所以能够更有效地减少测定误差。即，根据本发明的优选方式，过渡金属化合物为镍化合物。另外，生成上述过渡金属离子的化合物没有特别限制，优选为在水性液体(例如水、缓冲液、血液、体液)中生成离子的化合物。例如，可举出上述过渡金属的氯化物、溴化物、硫酸盐、有机酸盐等。上述过渡金属化合物可以单独使用1种，或者并用2种以上。另外，在本方式中，过渡金属化合物的含量没有特别限制，可以根据甲臜化合物的所希望的极大吸收波长适当地选择。具体而言，过渡金属化合物的含量是过渡金属(过渡金属离子) 相对于四唑

盐1摩尔，优选成为0.1～10摩尔、更优选成为0.5～4摩尔的量。如果为这样的量，则能够使甲臜化合物的极大吸收波长移动至所希望的波长范围。

生物成分浓度测定用试剂可以在上述过渡金属化合物的基础上或者代替上述过渡金属化合物进一步含有其它的成分。在此，作为其它的成分，通常可根据作为测定对象的生物成分的种类适当地选择，为了测定生物成分浓度而添加的成分可同样地使用。具体而言，可举出氧化还原酶、电子载体、pH缓冲剂、表面活性剂等。其中，上述其它的成分可以分别单独使用1种，或者可以组合2种以上。另外，上述其它的成分各自可以单独使用1种，或者并用2种以上。

在此，氧化还原酶没有特别限制，可根据被测定的对象即生物成分的种类适当地选择。具体而言，可举出以葡萄糖脱氢酶(GDH)、吡咯喹啉醌(PQQ)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)、以黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH-FAD)、以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH-NAD)和以烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH-NADP)等葡萄糖脱氢酶 (GDH)，葡萄糖氧化酶(GOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、尿酸脱氢酶等。在此，氧化还原酶可以单独使用1种，或者组合2种以上。例如，生物成分为葡萄糖时，氧化还原酶优选为葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶。另外，生物成分为胆固醇时，氧化还原酶优选为胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶。生物成分浓度测定用试剂含有氧化还原酶时的氧化还原酶的含量没有特别限制，可根据四唑

盐的量适当地选择。电子载体没有特别限制，可以使用公知的电子载体。具体而言，可举出黄递酶、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate)(PMS)、1-甲氧基-5-甲基酚嗪

硫酸甲酯盐(1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate) (1-Methoxy PMS或m-PMS)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)等。在此，电子载体可以单独使用1种，或者组合2种以上。生物成分浓度测定用试剂含有电子载体时的电子载体的含量没有特别限制，可根据四唑

盐的量适当地选择。例如，电子载体的含量相对于四唑

盐，优选为0.05～10质量％，更优选为0.1～5质量％。如果为这样的量，则能够更高效地进行还原反应。

上述中，优选生物成分浓度测定用试剂进一步含有过渡金属化合物和氧化还原酶，更优选进一步含有过渡金属化合物、氧化还原酶和电子载体。即，根据本发明的优选方式，生物成分浓度测定用试剂含有本发明的2- 取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑

过渡金属化合物和氧化还原酶。另外，根据本发明的更优选的方式，生物成分浓度测定用试剂含有本发明的2-取代噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑

盐、过渡金属化合物、氧化还原酶和电子载体。其中，例如，生物成分为β-D-葡萄糖，过渡金属化合物为氯化镍，氧化还原酶为以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH-FAD)，电子载体为1-甲氧基-5-甲基酚嗪

硫酸甲酯盐(m-PMS)时，首先，β-D-葡萄糖和m-PMS受到 GDH-FAD的作用，变成葡萄糖酸和还原型的m-PMS，由该还原型的 m-PMS和四唑

盐转变成m-PMS和甲臜，显色。并且，该甲臜与镍离子形成螯合物，极大吸收波长向更长的波长范围侧(例如600nm以上)移动。因此，通过使用本发明的生物成分浓度测定用试剂，能够减少受血色素的吸收的影响，因此即便对生物试样、特别是全血样品也能够以良好的灵敏度测定生物成分浓度。

生物成分浓度测定用试剂的使用形态没有特别限制，可以为固体、凝胶状、溶胶状或者液体中的任一形态。生物成分浓度测定用试剂可以进一步含有水、缓冲液、表面活性剂等。在此，缓冲液没有特别限制，通常在测定生物成分浓度时使用的缓冲液可同样地使用。具体而言，可使用磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、柠檬酸-磷酸缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲剂(Tris-盐酸缓冲剂)、MES缓冲剂(2-吗啉乙磺酸缓冲剂)、TES缓冲剂(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲剂)、乙酸缓冲剂、MOPS缓冲剂(3-吗啉丙磺酸缓冲剂)、MOPS-NaOH缓冲剂、HEPES缓冲剂(4- (2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲剂)、HEPES-NaOH缓冲剂等GOOD缓冲剂、甘氨酸-盐酸缓冲剂、甘氨酸-NaOH缓冲剂、甘氨酰甘氨酸-NaOH缓冲剂、甘氨酰甘氨酸-KOH缓冲剂等氨基酸系缓冲剂、Tris-硼酸缓冲剂、硼酸-NaOH缓冲剂、硼酸缓冲剂等硼酸系缓冲剂、或者咪唑缓冲剂等。这些中，优选磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、柠檬酸-磷酸缓冲剂、Tris盐酸缓冲剂、MES缓冲剂、乙酸缓冲剂、MOPS缓冲剂、HEPES-NaOH缓冲剂。在此，作为缓冲剂的浓度，没有特别限制，优选为0.01～1.0M。应予说明，本发明中缓冲剂的浓度是指水性溶液中含有的缓冲剂的浓度(M，mol/ L)。另外，优选缓冲液的pH对生物成分不产生作用。从上述观点考虑，缓冲液的pH优选在中性附近，例如为5.0～8.0左右。应予说明，生物成分浓度测定用试剂为液态时的四唑

盐的浓度只要为能够测定所希望的生物成分浓度的浓度就没有特别限制，优选相对于所希望的生物成分的存在量含有足够量的四唑

盐。从上述观点和通常要测定的生物成分浓度等考虑，四唑

盐的浓度在生物成分浓度测定用试剂中，优选为0.01～0.2mol /L，更优选为0.05～0.1mol/L。如果为这样的量，则四唑

盐与生物试样含有的实质上全部(例如95摩尔％以上，优选为98摩尔％以上，特别优选为100摩尔％)的生物成分的量相应地反应。因此，能够以良好的灵敏度准确且迅速地测定所希望的生物成分浓度。

通过使用本发明的生物成分浓度测定用试剂，能够以良好的灵敏度测定生物试样中含有的特定的生物成分浓度。在此，测定方法没有特别限制，可根据作为测定对象的生物成分的种类适当地选择。例如，生物成分为β-D-葡萄糖，氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶(GDH)时，葡萄糖被GDH氧化而生成葡萄糖酸，但此时利用GDH的辅酶或电子传递物质被还原的作用，具体而言，结果大致分为：用光学方法测定被还原的四唑

盐(因此为甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物)的呈色程度的方法(比色法)，和测定由氧化还原反应产生的电流的方法(电极法)。上述方法中，基于比色法的血糖值的测定具有在计算血糖值时容易进行使用血细胞比容值的校正，制造工序简单等优点。因此，生物成分浓度测定用试剂可适当地用于比色法。特别是测定全血样品中的葡萄糖浓度时，优选采用比色法。

本发明的生物成分浓度测定用试剂可以以现有的形态直接用于生物成分浓度的测定，也可以设置到生物成分浓度测定用芯片中。即，本发明也提供含有本发明的生物成分浓度测定用试剂的生物成分浓度测定用芯片(以下，也简称为“测定用芯片”)。另外，本发明的生物成分浓度测定用试剂、方法可设置到自动分析机、测定试剂盒、简易血糖仪等中，可用于日常的临床检查。另外，也可以将本发明的试剂设置到市售的生物传感器中。应予说明，将生物成分浓度测定用试剂设置到生物成分浓度测定用芯片中时，每1个芯片中的试剂的含量没有特别限制，通常在该领域使用的量可同样地采用，优选相对于所希望的生物成分的存在量含有足够量的四唑

盐。从上述观点和通常要测定的生物成分浓度等考虑，在每1个芯片中，四唑

盐的浓度优选为3～50nmol，更优选为10～30nmol。如果为这样的量，则四唑

盐与生物试样含有的实质上全部的生物成分的量相应地反应。因此，能够以良好的灵敏度准确且迅速地测定所希望的生物成分浓度。

以下，参照附图对利用比色法测定血糖值时使用的本发明的测定用芯片(比色式血糖仪)的形态进行说明。然而，本发明的特征在于使用本发明的生物成分浓度测定用试剂，芯片的结构没有特别限制。因此，可以将本发明的生物成分浓度测定用试剂用于市售的测定用芯片、在WO2014/ 04970和WO2016/051930等公报中记载的芯片。同样地进行，在下述实施方式中，对以血糖值的测定为目的的芯片的具体形态进行说明，测定用芯片不限于该用途，也可以同样地或者适当地修饰后用于其它的用途。

图9是示意性地表示在使用本实施方式涉及的测定用芯片检测葡萄糖(血糖)时使用的血糖仪的俯视图。

图9中，血糖仪10构成为测定血液样品中的葡萄糖(血糖)的设备。该血糖仪10主要可用作使用者(受试者)操作的个人应用。使用者也可以测定餐前的血糖来进行自身的血糖管理。另外，医疗从业者为了评价受试者的健康状态，也可以使用血糖仪10，此时，也可适当地改变血糖仪10使其成为能够设置于医疗设施等的构成。

血糖仪10采用光学测定血液样品中含有的葡萄糖的含量(血糖值) 的比色法原理。特别是，该血糖仪10利用对分析样品(血液)照射规定波长的测定光并接受透过分析样品的光的透过型测定部14进行血糖测定。

血糖仪10通过安装导入了血液的测定用芯片12、或者在安装有测定用芯片12的状态下向测定用芯片12中导入血液，利用测定部14检测葡萄糖。测定用芯片12可以构成为1次测定后丢弃的一次性类型。另一方面，血糖仪10优选以使用者可简单地重复测定的方式构成为可携带且坚固的设备。

测定用芯片12如图10所示，具备形成为板状的芯片主体部18和在芯片主体部18的内部沿板面的面方向延伸的空洞部20(液体用空洞部)。

芯片主体部18如图10所示，形成为在血糖仪10的插入和脱离方向 (血糖仪10的前端和基端方向，即B方向)具有长的长边22且在A方向具有短的短边24的长方形。例如，芯片主体部18的长边22的长度可以被设定成短边24的2倍以上的长度。由此可确保测定用芯片12相对血糖仪10具有充分的插入量。

另外，芯片主体部18的厚度与形成为长方形的侧面相比，形成为极小(薄)的厚度(图10中，勉强以具有充分厚度的方式图示)。例如，芯片主体部18的厚度优选被设定为上述的短边24的1/10以下。该芯片主体部18的厚度可以根据血糖仪10的插入孔58的形状适当地设计。

测定用芯片12以具有空洞部20的方式由一对板片30和一对隔离件 32构成芯片主体部18。

图11是表示图9的测定用芯片的俯视图。在图11中，芯片主体部18 的角部是尖的，但例如角部可以形成为圆角。另外，芯片主体部18不限定于薄板状，当然可以自由地设计其形状。例如，芯片主体部18在俯视时可以形成为正方形、其它的多边形或者圆形(包括椭圆形)等。

设置于芯片主体部18的内部的空洞部20位于芯片主体部18的短轴方向中间位置，在芯片主体部18的长边方向形成为直线状。该空洞部20 分别与形成于芯片主体部18的前端边24a的前端口部20a和形成于基端边24b的基端口部20b连接，并与芯片主体部18的外侧连通。若空洞部 20从前端口部20a导入使用者的血液，则血液可基于毛细管现象沿着延伸方向流动。在空洞部20内流动的血液为少量的，即便移动至基端口部20b 也可因张力而抑制漏出。应予说明，在芯片主体部18的基端边24b侧可以设置吸收血液的吸收部(例如，使后述的隔离件32仅在基端侧为多孔体等)。

另外，在空洞部20的规定位置(例如在图11中所示的前端口部20a 与基端口部20b的中间点稍偏向基端的位置)设定有利用血糖仪10进行测定的测定对象部28，在测定对象部28涂布有通过与血液中的葡萄糖(血糖)反应而显现出与血液中的葡萄糖(血糖)浓度对应的颜色的试剂(显色试剂)26。在空洞部20内向基端方向流动的血液与涂布在测定对象部28的试剂26接触，血液与试剂26发生反应而显色。应予说明，在空洞部20的长边方向上，试剂26的涂布位置与测定对象部28可以相互分开，例如可以将涂布有试剂26的反应部设置在测定对象部28的血液流动方向上游侧。

测定用芯片12以具有以上的空洞部20的方式由一对板片30和一对隔离件32构成芯片主体部18。一对板片30从侧面看分别形成为上述的长方形，相互配置在层叠方向。也就是说，一对板片30构成了芯片主体部18的两侧面(上表面和下表面)。各板片30的板厚非常小，例如，可以设定为5～50μm左右的相同尺寸。2个(一组)板片30的厚度可以相互不同。

一对板片30具有即便从与面方向正交的方向施加某种程度的按压力仍可维持板形状而不发生塑性变形的强度。另外，各板片30具备透明部或者半透明部分以能够透过测定光。并且，各板片30优选形成为具有适当的亲水性的平坦状的板面以使血液可在空洞部20流动。

构成各板片30的材料没有特别限定，可以应用热塑性树脂材料、玻璃、石英等。作为热塑性树脂材料，例如，可举出聚烯烃(例如聚乙烯、聚丙烯等)、环烯烃聚合物、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯等)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、ABS树脂、丙烯酸树脂、聚酰胺、氟树脂等高分子材料或它们的混合物。

另外，一对隔离件32以被夹在一对板片30之间的方式配置，通过规定的接合方法(粘接剂等)被牢固地粘接在各板片30的相对面。也就是说，各隔离件32是以使一对板片30彼此分离的方式配置在一对板片30 之间，在一对板片30和一对隔离件32自身之间形成空孔部20的部件。这种情况下，一个隔离件32以与图11中的芯片主体部18的上侧长边22a 相接并沿着该上侧长边22a在前端和基端方向延伸的方式配置。另一个隔离件32以与图11中的芯片主体部18的下侧长边22b相接且沿着该下侧长边22b在前端和基端方向延伸的方式配置。

构成一对隔离件32的材料(基材)没有特别限定，例如，可举出苯乙烯系、聚烯烃系、聚氨酯系、聚酯系、聚酰胺系、聚丁二烯系、反式聚异戊二烯系、氟橡胶系、氯化聚乙烯系等各种热塑性弹性体。或者，除了热塑性弹性体以外，也可以使用可弹性变形的各种材料，另外还可以使用可弹性变形的多孔体(例如海绵)等结构体。此外，可以使用在基材的一面或两面具有通过在一对板片30间变成固化状态或半固化状态而将板片 30彼此粘接的粘接剂的隔离件32。另外，隔离件32可以是通过含有试剂 26而向空洞部20溶出试剂26的构成。

板片30、隔离件32可以是经过亲水化处理的部件。作为亲水化处理的方法，例如可举出利用浸渍法或喷雾法等涂布含有表面活性剂、聚乙二醇、聚丙二醇、羟丙基纤维素、水溶性有机硅、以及聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺等亲水性高分子的水溶液的方法；等离子体照射、辉光放电、电晕放电、紫外线照射(例如准分子光照射)等方法等，这些方法可以单独使用或者组合使用。

接下来对血糖仪10的装置主体16进行说明。如图9所示，血糖仪 10具有构成外观的壳体40。壳体40包括箱体部44和筒状的测光部46，上述箱体部44为使用者容易把持操作的大小，在其内部收纳有血糖仪10 的控制部42；上述筒状的测光部46从箱体部44的一边(前端侧)向前端方向突出，在内部收纳有光学系统的测定部14。另外，在箱体部44的上表面设置有电源按钮48、操作按钮50、显示器52，在测光部46的上表面设置有弹出杆54。

电源按钮48在使用者的操作下可切换血糖仪10的启动和启动停止。操作按钮50在成为启动状态的血糖仪10中，作为根据使用者的操作进行血糖值的测定、显示的切换测定结果(包括以前的测定结果)的显示等的操作部发挥功能。显示器52由液晶、有机EL等构成，以测定结果的显示、错误显示等方式在测定操作中显示向使用者提供的信息。

弹出杆54被设置成能够向前端和基端方向移动，通过解除设置于测光部46内的未图示的弹出针的锁定，能够将弹出针向前端方向推进。

另一方面，为了将前端抵接至使用者的手指等，装置主体16的测光部46从箱体部44向前端方向延长伸出。如图10所示，在该测光部46设置有具有插入孔58的芯片安装部60和光学检测血中的葡萄糖(血糖)的测定部14。

芯片安装部60利用具有高的硬质性(刚性)的材料(例如不锈钢) 形成为在前端侧具备向外方向突出的凸缘部60a且在轴向具有规定长度的筒状。该芯片安装部60被定位固定在由树脂材料构成的测光部46的前端面和轴心部(中心部)。在测光部46的内表面，如图12A所示，突出形成有牢固地固定芯片安装部60的固定壁46a。

作为构成芯片安装部60的材料，例如，可举出不锈钢、钛等金属，经过防蚀铝皮膜处理的铝，液晶聚合物，添加玻璃、云母等填充剂的塑料、用镀镍等在表面进行固化而形成皮膜的塑料，碳纤维、精细陶瓷等硬的且尺寸不容易变化，并且即使反复进行测定用芯片的插拔也不容易磨损，且能够进行尺寸精度好的加工的材料。其中若使用金属材料，则在芯片安装部60的制造(注塑成型、冲压成型等)时，能够高尺寸精度且容易地将插入孔58成型。应予说明，装置主体16可以通过由硬的材料(例如金属材料)构成测光部46本身而将芯片安装部60进行一体成型

在芯片安装部60的轴心部，通过被该芯片安装部60的壁部62包围而设置插入孔58。插入孔58形成为在插入方向(B方向)长且在左右宽度方向(A方向)短的截面长方形。插入孔58在芯片安装部60被固定于测光部46的状态下，从其前端面向内部(基端方向)具有规定深度。

在芯片安装部60的前端侧形成与插入孔58连接且与外部连通的插入开口部58a。该插入开口部58a的插入方向(B方向)的尺寸与测定用芯片12的短边24的尺寸(A方向的长度)一致。另外，插入开口部58a的左右宽度方向的尺寸，即构成插入孔58的侧面的一对壁部62的间隔如图 12A所示，与测定用芯片12的层叠方向的厚度(图12A中的Tall)实质上相同。

芯片安装部60在插入孔58(测定用孔部59)延伸的中途位置与测光部46的固定壁46a配合地形成一对元件收容空间64。一对元件收容空间 64为测定部14的一部分，以夹持插入孔58的方式设置于相互对置的位置，介由利用芯片安装部60形成的各导光部66与测定用孔部59连通。

测定部14通过在一个元件收容空间64收容发光元件68而构成发光部70，通过在另一个元件收容空间64收容受光元件72而构成受光部74。芯片安装部60的导光部66通过形成为具有适当的直径的圆形的孔而发挥所谓的光圈的作用。

发光部70的发光元件68包括将具有第1波长的测定光向测定用芯片 12照射的第1发光元件68a和将具有与第1波长不同的第2波长的测定光向测定用芯片12照射的第2发光元件68b(图10中省略图示)。第1发光元件68a和第2发光元件68b并列设置在面对元件收容空间64的导光部66的位置。

发光元件68(第1和第2发光元件68a、68b)可由发光二极管(LED) 构成。第1波长是用于检测与血糖量对应的试剂26的呈色浓度的波长，例如，为600nm～680nm。第2波长是用于检测血液中的红细胞浓度的波长，例如，为510nm～540nm。箱体部44内的控制部42供给驱动电流，使第1和第2发光元件68a、68b分别在规定时刻发光。这种情况下，使用由红细胞浓度得到的血细胞比容值校正由呈色浓度得到的血糖值，求出血糖值。应予说明，可以通过进一步以其它的测定波长测定，校正由血细胞引起的噪音。

受光部74通过在面对元件收容空间64的导光部66的位置配置一个受光元件72而构成。该受光部74接受来自测定用芯片12的透过光，例如可由光电二极管(PD)构成。

另外，在插入孔58的底部(基端面)设置有与弹出杆54连接的弹出针56(弹出部)。弹出针56具备沿测光部46的轴向延伸的棒部56a和在棒部56a的前端部向径向外侧延伸的大直径的接受部56b。接受部56b与被插入到插入孔58的测定用芯片12的基端边24b接触。另外，在插入孔 58的底部与弹出针56的接受部56b之间设置有以非接触的方式包围弹出针56的螺旋弹簧76。螺旋弹簧76弹性支承弹出针56的接受部56b。

测定用芯片12的插入结束时，如图12B所示，测定用芯片12的测定对象部28配置于与导光部66重合的位置。

随着使用者将测定用芯片12插入，接受部56b被按压而向基端方向位移，弹出针56被设置于壳体40内的未图示的锁定机构锁定(固定)。螺旋弹簧76根据接受部56b的位移发生弹性收缩。然后，通过使用者的弹出杆54的操作，弹出针56稍微移动，锁定机构的锁定被解除，利用螺旋弹簧76的弹性恢复力而向前端方向滑动。由此，测定用芯片12被弹出针56推出，从插入孔58取出。

返回图9，装置主体16的控制部42例如由具有未图示的运算部、存储部、输入输出部的控制电路构成。该控制部42可以使用公知的计算机。控制部42例如在使用者的操作按钮50的操作下，驱动控制测定部14检测和计算血中的葡萄糖，并在显示器52上显示算出的血糖值。

例如，在使测定光透过测定用芯片12而测定分析对象物(例如葡萄糖)的血糖仪10中，控制部42基于以下的式(A)表示的Beer-Lambert 定律计算测定结果。

log₁₀(l₁/l₀)＝-αL …(A)

在上述式(A)中，l₀为射入血液样品之前的光的强度，l₁为从血液样品射出后的光的强度，α为吸光系数，L为测定光通过的距离(样品池长度)。

实施例

利用以下的实施例和比较例对本发明的效果进行说明。但是，本发明的技术范围不限于以下的实施例。应予说明，在下述实施例中，只要没有特殊说明，则操作在室温(25℃)下进行。另外，只要没有特殊说明，则“％”和“份”分别表示“质量％”和“质量份”。

实施例1：四唑

化合物1的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物1)。

四唑

化合物1

1.腙化合物1的合成

使4-甲酰苯-1，3-二磺酸二钠(Disodium 4-Formylbenzene- 1，3-disulfonate)(东京化成工业株式会社制)1.59g和(6-甲氧基苯并噻唑 -2-基)肼(2-Hydrazino-6-methoxy-1，3-benzothiazole)(Santa Cruz Biotechnology公司制)1.0g悬浮于RO水60mL中。将该悬浮液在乙酸酸性下在水浴中于60℃加热·搅拌2小时。在加热搅拌结束后，除去溶剂。用异丙醇清洗该残渣后，滤出沉淀。使该沉淀在通风中干燥，得到腙化合物1。回收1.8g，收率为70质量％。

2.甲臜化合物1的合成

使0.76g上述1.的腙化合物1溶解于RO水10mL和DMF10mL的混合液中，制备腙化合物1溶液。使对茴香胺-3-磺酸(p-anisidin-3-sulfonic acid)(东京化成工业株式会社制)0.264g悬浮于RO水4.09mL中，加入 10N的NaOH 130μL使其溶解。边将该溶液保持在0℃，边加入9.6N的 HCl 280μL，滴加亚硝酸钠溶液，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在 -20℃，滴加到腙化合物1溶液中。滴加结束后，滴加10N的NaOH 300μL，在室温(25℃)下搅拌2小时，制备含有甲臜化合物1的溶液(甲臜化合物1溶液)。用9.6N的HCl将该甲臜化合物1溶液的pH调节成中性，除去溶剂。用异丙醇清洗得到的残渣后，滤出沉淀。使该沉淀干燥，得到甲臜化合物1。

3.甲臜化合物1的纯化和四唑

化合物1的合成

使上述2.的甲臜化合物1溶解于RO水10mL中，制作甲臜化合物1 溶液。在一次性色谱柱(大小：20cm×5cm)中填充柱色谱用填充剂(Nacalai Tesque株式会社制，COSMOSIL40C₁₈-PREP)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统，将甲臜化合物1溶液纯化。除去采取的馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇15mL、9.6N的HCl 250μL、15％亚硝酸乙酯(CH₃CH₂NO₂)-乙醇溶液5mL，在室温(25℃)遮光下搅拌72小时。

4.四唑

化合物1的回收

向上述3.的反应溶液中加入二乙醚，使四唑化合物1沉淀。对该沉淀进行离心分离，除去上清液后，进一步用二乙醚清洗。使得到的沉淀在通风柜中干燥，得到四唑

化合物1(120mg，收率：11.8质量％)。

实施例2：四唑

化合物2的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物2)。

四唑

化合物2

1.腙化合物1的合成

与实施例1的1.腙化合物1的合成同样地进行，合成腙化合物1。

2.甲臜化合物2的合成

使0.76g上述的腙化合物1溶解于RO水10mL和DMF10mL的混合液中，制备腙化合物1溶液。使邻茴香胺-5-磺酸(o-anisidin-5-sulfonic acid)(东京化成工业株式会社制)0.264g悬浮于RO水4.09mL中，加入10N的NaOH 130μL使其溶解。边将该溶液保持在0℃，边加入9.6N的 HCl 280μL，滴加亚硝酸钠溶液，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在 -20℃，滴加到腙化合物1溶液中。滴加结束后，滴加10N的NaOH 300μL，在室温(25℃)下搅拌2小时，制备含有甲臜化合物2的溶液(甲臜化合物2溶液)。用9.6N的HCl将该甲臜化合物2溶液的pH调节成中性，除去溶剂。用异丙醇清洗得到的残渣后，滤出沉淀。使得到的沉淀干燥，由此，得到甲臜化合物2。

3.甲臜化合物2的纯化和四唑

化合物2的合成

使上述2.的甲臜化合物2溶解于RO水10mL中，制备甲臜化合物2 溶液。在一次性色谱柱(大小：20cm×5cm)中填充柱色谱用填充剂(Nacalai Tesque株式会社制，COSMOSIL40C₁₈-PREP)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统，将甲臜化合物2溶液纯化。除去采取的红色馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇15mL、9.6N的HCl 250μL、15％亚硝酸乙酯(CH₃CH₂NO₂)- 乙醇溶液5mL，在室温(25℃)遮光下搅拌72小时。

4.四唑

化合物2的回收

向上述3.的反应溶液5mL中加入二乙醚，使四唑

化合物2沉淀。将沉淀进行离心分离，除去上清液后，进一步用二乙醚清洗。使该沉淀在通风柜中干燥，得到四唑

化合物2。

实施例3：四唑

化合物3的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物3)。

四唑

化合物3

1.腙化合物1的合成

2.甲臜化合物3的合成

使0.76g上述的腙化合物1溶解于RO水10mL和DMF10mL的混合液中，制备腙化合物1溶液。使2-甲氧基-4-硝基苯胺-5-磺酸钠盐(五二化学工业株式会社制)0.351g溶解于RO水5.0mL中。边将该溶液保持在 0℃，边加入9.6N的HCl 280μL，滴加亚硝酸钠溶液，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙化合物1溶液中。滴加结束后，滴加 10N的NaOH300μL，在室温(25℃)下搅拌2小时，制备含有甲臜化合物3的溶液(甲臜化合物3溶液)。用9.6N的HCl将该甲臜化合物3溶液的pH调节成中性，除去溶剂。用异丙醇清洗得到的残渣后，滤出沉淀。使该沉淀干燥，得到甲臜化合物3。

3.甲臜化合物3的纯化和四唑

化合物3的合成

使上述2.的甲臜化合物3溶解于RO水10mL中，制备甲臜化合物3 溶液。在一次性色谱柱(大小：20cm×5cm)中填充柱色谱用填充剂(Nacalai Tesque株式会社制，COSMOSIL40C₁₈-PREP)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统，将甲臜化合物3溶液纯化。除去采取的红色馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇15mL、9.6N的HCl 250μL、15％亚硝酸乙酯(CH₃CH₂NO₂)- 乙醇溶液5mL，在室温(25℃)遮光下搅拌72小时。

4.四唑

化合物3的回收

向上述3.的反应溶液5mL中加入二乙醚，使四唑

化合物3沉淀。将沉淀进行离心分离，除去上清液后，进一步用二乙醚清洗。使该沉淀干燥，得到四唑

化合物3。

实施例4：四唑

化合物4的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物4)。

四唑

化合物4

1.腙化合物1的合成

2.甲臜化合物4的合成

使0.76g上述的腙化合物1溶解于RO水10mL和DMF10mL的混合液中，制备腙化合物1溶液。使2-甲氧基-4-硝基苯胺(2-甲氧基-4-硝基苯胺)(东京化成工业株式会社制)0.219g溶解于RO水1.5mL和乙腈5mL 中。边将该溶液保持在0℃，边加入9.6N的HCl 280μL，滴加亚硝酸钠溶液，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙化合物1溶液中。滴加结束后，滴加10N的NaOH 300μL，在室温(25℃)下搅拌2小时，制备含有甲臜化合物4的溶液(甲臜化合物4溶液)。用9.6N的HCl 将该甲臜化合物4溶液的pH调节成中性后，除去溶剂。用二乙醚清洗得到的残渣后，滤出沉淀。使该沉淀干燥，得到甲臜化合物4。

3.四唑

化合物4的合成

使上述2.中得到的甲臜化合物4悬浮于甲醇15mL，加入9.6N的HCl 250μL、15％亚硝酸乙酯(CH₃CH₂NO₂)-乙醇溶液5mL，在室温(25℃) 遮光下搅拌72小时。

4.四唑

化合物4的回收

向上述3.中得到的反应溶液5mL中加入二乙醚，使四唑

化合物4 沉淀。将沉淀进行离心分离，除去上清液后，进一步用二乙醚清洗。使该沉淀在通风柜中干燥，得到四唑

化合物4。

实施例5：四唑

化合物5的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物5)。

四唑

化合物5

1.腙化合物5的合成

使2-甲酰基-5-羟基苯磺酸钠(Sodium 2-Formyl-5-hydroxybenzene sulfonate)(和光纯药工业株式会社制)1.213g和(6-甲氧基苯并噻唑-2- 基)肼(2-Hydrazino-6-methoxy-1,3-benzothiazole)(Santa Cruz Biotechnology公司制)1.056g溶解于DMF43mL中。将该溶液在乙酸酸性下，在水浴中于60℃加热·搅拌2小时。在加热搅拌结束后，除去溶剂。用二乙醚清洗得到的残渣后，将沉淀分离。使该沉淀干燥，得到腙化合物 5。

2.甲臜化合物5的合成

使1.05g上述中得到的腙化合物5溶解于RO水20mL和DMF20mL 的混合液中，制备腙化合物5溶液。使邻茴香胺-5-磺酸 (o-anisidin-5-sulfonic acid)(东京化成工业株式会社制)0.528g悬浮于RO 水8.18mL后，加入10N的NaOH 260μL，使其溶解。边将该溶液保持在0℃，边加入9.6N的HCl 560μL，滴加亚硝酸钠溶液，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙化合物5溶液中。滴加结束后，滴加 10N的NaOH600μL，在室温(25℃)下搅拌2小时，得到含有甲臜化合物5的溶液(甲臜化合物5溶液)。用9.6N的HCl将该甲臜化合物5溶液的pH调节成中性后，除去溶剂。用乙酸乙酯清洗得到的残渣后，将沉淀分离。使该沉淀干燥，得到甲臜化合物5。

3.四唑

化合物5的合成

使上述2.中得到的甲臜化合物5溶解于RO水10mL中。在一次性色谱柱(大小：20cm×5cm)中填充柱色谱用填充剂(Nacalai Tesque株式会社制，COSMOSIL 40C₁₈-PREP)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本 BUCHI公司制，商品名：Sepacore)。使用上述的色谱柱系统，将甲臜化合物5溶液纯化。除去采取的红色馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇15mL、9.6N的HCl 250μL、15％亚硝酸乙酯(CH₃CH₂NO₂)-乙醇溶液5mL，在室温(25℃)遮光下搅拌72小时。

4.四唑

化合物5的回收

向上述3.中得到的反应溶液5mL中加入二乙醚，使四唑

化合物5 沉淀。将沉淀进行离心分离，除去上清液后，进一步用二乙醚清洗。使得到的沉淀在通风柜中干燥，得到四唑

化合物5(120mg，收率：7.6质量％)。

实施例6：四唑

化合物6的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物6)。

四唑

化合物6

1.腙化合物6的合成

使5-甲酰基-2-羟基苯磺酸钠(4-Formyl-1-phenol-2-sulfonic acid sodiumsalt)(T&W公司制)1.213g和(6-甲氧基苯并噻唑-2-基)肼 (2-Hydrazino-6-methoxy-1,3-benzothiazole)(Santa Cruz Biotechnology公司制)1.056g溶解于DMF43mL中。将该溶液在乙酸酸性下，在水浴中于 60℃加热·搅拌2小时。在加热搅拌结束后，除去溶剂。用二乙醚清洗得到的残渣后，通过离心分离将沉淀分离。使得到的沉淀干燥而得到腙化合物6。

2.甲臜化合物6的合成

使1.05g上述中得到的腙化合物6溶解于RO水20mL和DMF20mL 中，制备腙化合物6溶液。使邻茴香胺-5-磺酸(o-anisidin-5-sulfonic acid) (东京化成工业株式会社制)0.528g悬浮于RO水8.18mL，加入10N的 NaOH 260μL使其溶解。边将该溶液保持在0℃，边加入9.6N的HCl 560μL，滴加亚硝酸钠溶液，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，并滴加到腙化合物6溶液中。滴加结束后，滴加10N的NaOH 600μL，在室温 (25℃)下搅拌2小时，制备含有甲臜化合物6的溶液(甲臜化合物6溶液)。用9.6N的HCl将该甲臜化合物6溶液的pH调节至6.8，除去溶剂。用乙酸乙酯清洗得到的残渣后，通过离心分离将沉淀分离。使得到的沉淀干燥，得到甲臜化合物6。

3.四唑

化合物6的合成

在上述2.中得到的甲臜化合物6中加入甲醇15mL、9.6N的HCl 250μL、15％亚硝酸乙酯(CH₃CH₂NO₂)-乙醇溶液5mL，在室温(25℃) 遮光下搅拌72小时。

4.四唑

化合物6的回收

向上述3.中得到的反应溶液中加入二乙醚，使四唑

化合物6沉淀。将沉淀进行离心分离，除去上清液后，进一步用二乙醚清洗。使得到的沉淀干燥，得到四唑

化合物6。

实施例7：四唑

化合物7的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物7)。

四唑

化合物7

1.腙化合物7的合成

使苯甲醛-2-磺酸钠(2-Sulfobenzaldehyde Sodium Salt)(东京化成工业株式会社制)25.0g和对肼基苯磺酸半水合物 (p-Hydrazinobenzenesulfonic Acid)(东京化成工业株式会社制)22.6g溶解于RO水250mL中，加入乙酸钠11.8g在水浴中于60℃加热·搅拌2小时。在加热搅拌结束后，除去溶剂。用甲醇清洗得到的残渣后，滤出沉淀。使得到的沉淀干燥，得到腙化合物7。

2.甲臜化合物7的合成

使0.6g上述中得到的腙化合物7溶解于RO水20mL，制备腙化合物 7溶液。使2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑(2-Amino-6-methoxybenzothiazole) (东京化成工业株式会社制)0.234g溶解于RO水1.5mL、乙腈5mL中。边将该溶液保持在0℃，边加入9.6N的HCl 280μL，滴加亚硝酸钠溶液，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙化合物7溶液中。滴加结束后，滴加10N的NaOH 300μL，在室温(25℃)下搅拌2小时，制备含有甲臜化合物7的溶液(甲臜化合物7溶液)。用9.6N的HCl将该甲臜化合物7溶液的pH调节成中性，除去溶剂。用异丙醇清洗得到的残渣后，滤出沉淀。使该沉淀干燥，得到甲臜化合物7。

3.四唑

化合物7的合成

在上述2.的甲臜化合物7中加入甲醇15mL、9.6N的HCl 250μL、15％亚硝酸乙酯(CH₃CH₂NO₂)-乙醇溶液5mL，在室温(25℃)遮光下搅拌 72小时。

4.四唑

化合物7的回收

向上述3.的反应溶液5mL中加入二乙醚，使四唑

化合物7沉淀。将沉淀进行离心分离，除去上清液后，进一步用二乙醚清洗。使得到的沉淀干燥，得到四唑

化合物7。

实施例8：四唑

化合物8的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物8)。

四唑

化合物8

在实施例1的1.腙化合物1的合成中，将4-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠 (Disodium 4-Formylbenzene-1,3-disulfonate)(东京化成工业株式会社制) 变更为5-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠(5-formylbenzene-1,3-disulfonic acid disodium salt)(东京化成工业株式会社制)，在甲臜化合物1的合成中，将胺由对茴香胺-3-磺酸(p-anisidine-3-sulfonicacid)(东京化成工业株式会社制)变更为邻茴香胺-3-磺酸(o-anisidine-5-sulfonicAcid)，除此之外，与实施例1同样地进行，得到四唑

化合物8。

实施例9：四唑

化合物9的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物9)。

四唑

化合物9

在实施例1的1.腙化合物1的合成中，将4-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠 (Disodium 4-Formylbenzene-1,3-disulfonate)(东京化成工业株式会社制) 变更为5-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠，除此之外，与实施例1同样地进行，得到四唑

化合物9。

实施例10：四唑

化合物10的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物10)。

四唑

化合物10

在实施例1的甲臜化合物1的合成中，将胺由对茴香胺-3-磺酸 (p-anisidine-3-sulfonic acid)(东京化成工业株式会社制)变更为4-氨基-3- 甲氧基苯甲酸(4-Amino-3-methoxybenzoic Acid)(东京化成工业株式会社制)，除此之外，与实施例1同样地进行，得到四唑

化合物10。

实施例11：四唑

化合物11的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物11)。

四唑

化合物11

1.腙化合物11的合成

将5-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠(5-formylbenzene-1,3-disulfonic aciddisodium salt)(东京化成工业株式会社制)4.65g(0.015mol)和(6-甲氧基苯并噻唑-2-基)肼(2-Hydrazino-6-methoxy-1,3-benzothiazole)(Santa Cruz Biotechnology公司制)2.93g(0.015mol)溶解于DMF50mL和RO 水50mL的混合液中。在该溶液中加入乙酸860μL，在水浴(60℃)中一边搅拌一边加热2小时。在加热搅拌结束后，除去溶剂，得到残渣。用二乙醚清洗该残渣后，滤出沉淀。使该沉淀干燥，得到腙化合物11。

2.甲臜化合物11的合成

使1.4g上述1.的腙化合物11溶解于RO水10mL和DMF5mL的混合液中，制备腙化合物11溶液。使3-氨基-4-甲氧基苯甲酸 (3-Amino-4-methoxybenzoic Acid)(东京化成工业株式会社制)0.334g溶解于RO水1mL和DMF5mL的混合液中。将该溶液保持在0℃，加入9.6N 的HCl 400μL后，进一步加入亚硝酸钠溶液(将0.152g溶解至1mL)，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，加入到腙化合物11溶液中。接下来，加入10N的NaOH 600μL，在室温下搅拌2小时，制备含有甲臜化合物11的溶液(甲臜化合物11溶液)。用9.6N的HCl将该甲臜化合物11溶液的pH调节成中性，并浓缩。在浓缩的甲臜化合物11中加入RO 水10mL进行溶解，制备甲臜化合物11溶液。

3.甲臜化合物11的纯化和四唑

化合物11的合成

在一次性色谱柱(大小：20cm×5cm)中填充柱色谱用填充剂(Nacalai Tesque株式会社制，COSMOSIL40C₁₈-PREP)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统，将甲臜化合物11溶液纯化。除去采取的红色馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇100mL、9.6N的HCl 400μL、15％亚硝酸乙酯(CH₃CH₂NO₂) -乙醇溶液5mL，在室温遮光下搅拌48小时。

4.四唑

化合物11的回收

用蒸发器将上述的溶液干燥。接下来，加入RO水10mL，并用1M 的Na₂CO₃中和，使其溶解。将其用Sepacore分离提取系统纯化，采取橙色的馏分。用蒸发器除去该馏分的溶剂，得到固体成分。在该固体成分中加入甲醇5mL使其溶解后，加入二乙醚50mL得到沉淀物。使该沉淀物干燥，得到四唑

化合物11。

实施例12：四唑

化合物12的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物12)。

四唑

化合物12

1.腙化合物1的合成

2.甲臜化合物12的合成

将1.4g腙化合物1加入到RO水10mL和DMF5mL的混合溶液中，制备腙化合物1溶液。将5-氨基-2-甲氧基-苯甲酸 (5-Amino-2-methoxybenzoic Acid)(东京化成工业株式会社制)0.334g加入到RO水1mL和DMF5mL中使其溶解。将该溶液保持在0℃，加入9.6N 的HCl 400μL后，进一步加入亚硝酸钠溶液(将0.152g溶解至1mL：和光纯药)，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，加入到腙化合物1 溶液中。接着，加入10N的NaOH 600μL后，在室温下搅拌2小时，制备含有甲臜化合物12的溶液(甲臜化合物12溶液)。用9.6N的HCl将甲臜化合物12溶液的pH调节成中性，除去溶剂，得到甲臜化合物12。

3.甲臜化合物12的纯化和四唑

化合物12的合成

将上述2.的甲臜化合物12溶解于RO水10mL，制备甲臜化合物12 溶液。在一次性色谱柱(大小：20cm×5cm)中填充柱色谱用填充剂(Nacalai Tesque株式会社制，COSMOSIL40C₁₈-PREP)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统将甲臜化合物12溶液纯化。除去采取的红色馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇100mL、9.6N的HCl 400μL、15％亚硝酸乙酯(CH₃CH₂NO₂) -乙醇溶液15mL，在室温遮光下搅拌48小时。

4.四唑

化合物12的回收和色谱柱再纯化

使上述3.的溶液干燥后，加入到RO水10mL中，用1M Na₂CO₃进行中和使其溶解。将其用色谱柱分离提取系统(日本BUCHI公司制，商品名：Sepacore)纯化，采取橙色的馏分。用蒸发器除去该馏分的溶剂而得到固体成分。在该固体成分中加入甲醇5mL进行溶解后，加入二乙醚50mL 得到沉淀物。使该沉淀物干燥，得到四唑

化合物12(300mg，收率:17％)。

实施例13：四唑

化合物13的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物13)。

四唑

化合物13

1.腙化合物13的合成

使4-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠(Disodium 4-Formylbenzene- 1,3-disulfonate)(东京化成工业公司制)1.38g和6-肼基[1,3]二氧代[4， 5-f][1,3]苯并噻唑(Matrixscientific公司制)0.9831g悬浮于DMF10mL 和RO水10mL中。将该悬浮液在乙酸酸性下，在水浴(60℃)中搅拌90 分钟。在加热搅拌结束后，进行浓缩(0Torr，60℃)。用二乙醚将该残渣清洗2次后，分离提取沉淀。使该沉淀物干燥，得到腙化合物13。

2.甲臜化合物13的合成

使0.1g上述的腙化合物13溶解于RO水1mL和DMF1mL的混合液中，制备腙化合物13溶液。将该腙化合物13溶液保持在0℃，使邻茴香胺-5-磺酸(o-anisidin-5-sulfonicacid)(东京化成工业株式会社制)0.04g 悬浮于RO水1mL，加入10N的NaOH 20μL使其溶解。将该溶液保持在0℃，加入10N的HCl 40μL后，进一步加入亚硝酸钠溶液，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙化合物13溶液中。接着，加入10N 的NaOH 40μL，在4℃下搅拌，制备含有甲臜化合物13的溶液(甲臜化合物13溶液)。用9.6N的HCl将该甲臜化合物13溶液的pH调节成中性，除去溶剂。用异丙醇清洗得到的残渣后，滤出沉淀。使得到的沉淀干燥，由此，得到甲臜化合物13。

将得到的甲臜化合物与实施例1同样地进行纯化，另外同样地合成、回收四唑

化合物，合成四唑

化合物13。

实施例14～16：四唑

化合物14～16的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物14～ 16)。

四唑

化合物14

四唑

化合物15

四唑

化合物16

1.腙化合物14～16的合成

如下添加各试剂、各溶剂，除此之外，与实施例13同样地进行，合成腙化合物14～16。

[表1]

2.甲臜化合物14～16的合成

如下添加各试剂、各溶剂，除此之外，与实施例13同样地进行，合成腙化合物14～16的合成。

[表2]

化合物，合成四唑

化合物14～16。

实施例17：四唑

化合物17的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物17)。

四唑

化合物17

1.腙化合物17的合成

使4-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠(Disodium 4-Formylbenzene- 1,3-disulfonate)(东京化成工业株式会社制)1.38g(4.46mmol)和6-肼基[1,3]二氧代[4,5-f][1,3]苯并噻唑(Matrix Scientific公司制)0.98g (4.46mmol)溶解于DMF10mL和RO水10mL的混合液中。在该溶解液中加入乙酸256μL，在水浴(60℃)中搅拌2小时。在加热搅拌结束后，除去溶剂而得到残渣。用二乙醚将该残渣搅拌1小时，清洗后，滤出沉淀。使该沉淀干燥，得到腙化合物17。

2.甲臜化合物17的合成

将1.81g上述1.的腙化合物17溶解于RO水15mL和DMF15mL的混合液中，制备腙化合物17溶液。使对茴香胺-3-磺酸(p-anisidin-3-sulfonic acid)(东京化成工业株式会社制)0.528g悬浮于RO水8.18mL，进一步加入10N的NaOH 260μL使其溶解。将该溶液保持在0℃，加入9.6N的 HCl 560μL，加入亚硝酸钠溶液(将0.194g溶解至1mL：和光纯药)，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙化合物17溶液中。滴加结束后，加入10N的NaOH600μL，在-20℃下搅拌。其后，除去该溶液的溶剂，使其干燥，得到甲臜化合物17。

3.甲臜化合物17的纯化和四唑

化合物17的合成

在上述2.的甲臜化合物17中加入RO水15mL，制备甲臜化合物17 溶液。在一次性色谱柱(大小：20cm×5cm)中填充柱色谱用填充剂(Nacalai Tesque株式会社制，COSMOSIL40C₁₈-PREP)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统，将甲臜化合物17溶液纯化，采取红色馏分。除去该馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇15mL、9.6N的HCl 250μL、15％亚硝酸乙酯 (CH₃CH₂NO₂)-乙醇溶液5mL，在室温遮光下搅拌72小时。

4.四唑

化合物17的纯化·回收

将上述3.中得到的溶液进行减压干固，得到残渣。在该残渣中加入 RO水15mL进行溶解。将该溶液设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI 公司制，商品名：Sepacore)，采取含有四唑

化合物17的橙色的馏分。将该馏分进行减压干固而得到含有四唑

化合物17的纯化物。在该纯化物中加入甲醇5mL进行溶解。其后，边搅拌边加入二乙醚，使四唑

化合物17沉淀。将该液进行离心分离，除去上清液。使残留的沉淀(四唑

化合物17)干燥，得到四唑

化合物17(620mg，收率：26质量％，UPLC 的纯度分析结果96.1％)。

实施例18：四唑

化合物18的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物18)。

四唑

化合物18

1.腙化合物18的合成

将4-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠(Disodium 4-Formylbenzene- 1,3-disulfonate)(东京化成工业株式会社制)1.27g(4.11mmol)和2-肼基 -5,6-二甲氧基-1,3-苯并噻唑(Matrix Scientific公司制)0.966g(4.11mmol) 加入到DMF10mL和RO水10mL的混合液中使其溶解。在该溶解液中加入乙酸236μL，在水浴(60℃)上搅拌2小时。在加热搅拌结束后，进行减压干固，得到残渣。用二乙醚对该残渣进行搅拌清洗后，分离提取沉淀。使该沉淀干燥而得到腙化合物18。

2.甲臜化合物18的合成

将1.81g甲臜化合物18加入到RO水15mL和DMF15mL的混合液中进行溶解。使对茴香胺-3-磺酸(p-anisidin-3-sulfonic acid)(东京化成工业株式会社制)0.528g悬浮于RO水8.18mL后，向其中加入10N的NaOH 260μL使其溶解。将该溶液保持在0℃，加入9.6N的HCl560μL，滴加亚硝酸钠溶液(将0.194g溶解至1mL：和光纯药)，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙溶液中。滴加结束后，滴加10N的NaOH 600μL，在-20℃下搅拌1小时，得到甲臜化合物18溶液。将该甲臜化合物18溶液进行减压干固而得到残渣。用异丙醇清洗该残渣后，滤出沉淀。使该沉淀干燥，得到甲臜化合物18。

3.甲臜化合物18的纯化和四唑

化合物18的合成

将上述2.的甲臜化合物18加入到RO水15mL中使其溶解，制备甲臜化合物18溶液。在一次性色谱柱(20cm×5cm)中填充COSMOSIL 40C₁₈-PREP(Nacalai Tesque)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI 公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统，采取含有甲臜化合物18溶液的馏分。除去该馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇100mL、 15％亚硝酸乙酯-乙醇溶液(东京化成工业株式会社制)20mL、9.6N的 HCl 0.5mL，在室温遮光下搅拌48小时，得到含有四唑

化合物18的溶液。

4.四唑

化合物18的回收

将上述3.中得到的溶液进行减压干固，得到四唑

化合物18的粗纯化物。在该粗纯化物中加入RO水15mL使其溶解。将该溶液设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统，将四唑

化合物18纯化。将采取的馏分溶液进行减压干固而得到残渣。使该残渣悬浮于甲醇10mL。并且，边搅拌边加入二乙醚100mL，使四唑

化合物18沉淀。对该液体进行离心分离而除去上清液，对沉淀进行清洗。使残留的沉淀(四唑

化合物18)干燥(收量：1.2g，收率： 51％，UPLC的纯度分析99.2％)。

实施例19：四唑

化合物19的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物19)。

四唑

化合物19

1.腙化合物19的合成

使4-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠(Disodium 4-Formylbenzene- 1,3-disulfonate)(东京化成工业株式会社制)1.27g(4.11mmol)和2-肼基 -6,7-二氢[1,4]二氧代[2,3-f][1,3]苯并噻唑(Matrix Scientific公司制) 0.976g(4.11mmol)溶解于DMF10mL和RO水10mL的混合液中。在该溶液中加入乙酸236μL，在水浴(60℃)中加热搅拌2小时。在加热搅拌结束后，进行减压干固，得到残渣。在该残渣中加入二乙醚搅拌清洗1小时后，通过离心分离对沉淀进行分离提取。其后，在减压下干燥一晩，得到腙化合物19。

2.甲臜化合物19的合成

使1.81g腙化合物19溶解于RO水10mL和DMF10mL的混合液中，制备腙化合物19溶液。使对茴香胺-3-磺酸(p-anisidin-3-sulfonic acid)(东京化成工业株式会社制)0.528g悬浮于RO水8.18mL。在该悬浮液中加入10N的NaOH 260μL使其溶解。将该溶液保持在0℃，加入9.6N的HCl 560μL，滴加亚硝酸钠溶液(将0.194g溶解至1mL)，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙化合物19溶液中。滴加结束后，加入 10N的NaOH 600μL，在-20℃下搅拌1小时，得到含有甲臜化合物19的溶液。对该溶液进行减压干固，得到残渣。用异丙醇清洗该残渣后，滤出沉淀。使该沉淀干燥，得到甲臜化合物19。

3.甲臜化合物19的纯化和四唑

化合物19的合成

在上述2.的甲臜化合物19中加入RO水15mL使其溶解，制备甲臜化合物19溶液。在一次性色谱柱(20cm×5cm)中填充COSMOSIL 40C₁₈-PREP(Nacalai Tesque)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI 公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统，将甲臜化合物19溶液纯化。将采取的红色的馏分的溶剂进行减压干固而得到残渣。在该残渣中加入甲醇100mL、15％亚硝酸乙酯-乙醇溶液(东京化成工业株式会社制) 20mL、9.6N的HCl 0.5mL，在室温遮光下搅拌48小时。

4，四唑

化合物19的回收

将上述3.中得到的溶液进行减压干固，得到残渣。在含有该四唑

化合物19的残渣中加入RO水15mL，使其溶解。将该溶液用Sepacore分离提取系统纯化。对回收的馏分进行减压干固，得到含有四唑

化合物19 的残渣。在该残渣中加入甲醇5mL使其溶解。边搅拌边在该溶液中加入二乙醚100mL，使四唑

化合物19沉淀。将其进行离心分离而除去上清液，对沉淀进行清洗。将残留的沉淀(四唑

化合物19)干燥，得到四唑

化合物19(收量：0.93g，收率：40质量％，UPLC的纯度分析96.4％)。

实施例20：四唑

化合物20的合成

根据以下的方法，合成具有下述结构的化合物(四唑

化合物20)。

四唑

化合物20

1.腙化合物20的合成

使4-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠(Disodium 4-Formylbenzene- 1,3-disulfonate)(东京化成工业株式会社制)1.38g(4.46mmol)和(6-乙氧基-苯并噻唑-2-基)-肼(MatrixScientific公司制)0.98g(4.46mmol)溶解于DMF10mL和RO水10mL的混合液中，制备腙化合物20溶液。在该溶液中加入乙酸256μL，在水浴(60℃)中加热搅拌2小时。在加热搅拌结束后，除去溶剂而得到残渣。在该残渣中加入100mL的二乙醚搅拌1 小时后，进行离心分离对沉淀进行分离提取。在通风柜中放置2小时，其后，在减压下干燥一晚，得到腙化合物20。

2.甲臜化合物20的合成

使1.81g腙化合物20溶解于RO水15mL和DMF15mL的混合液中，制备腙化合物20溶液。另外，使对茴香胺-3-磺酸(p-anisidin-3-sulfonic acid)(东京化成工业株式会社制)0.528g悬浮于RO水8.18mL，加入10N 的NaOH 260μL使其溶解。将该溶液保持在0℃，加入9.6N的HCl 560μL (白浊，加入亚硝酸时溶解)，滴加亚硝酸钠溶液(将0.194g溶解至1mL)，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙化合物20溶液中。滴加结束后，滴加10N的NaOH 600μL，在-20℃下搅拌1小时，得到甲臜化合物20溶液。用蒸发器除去该甲臜化合物20溶液的溶剂。用异丙醇清洗得到的残渣后，滤出沉淀。使该沉淀干燥，得到甲臜化合物20。

3.甲臜化合物20的纯化和四唑

化合物20的合成

使上述2.的甲臜化合物20溶解于RO水15mL中，制备甲臜化合物 20溶液。在一次性色谱柱(大小：20cm×5cm)中填充柱色谱用填充剂(Nacalai Tesque株式会社制，COSMOSIL40C₁₈-PREP)，并设置于色谱柱分离提取系统(日本BUCHI公司制，商品名：Sepacore)。使用该色谱柱系统采取含有甲臜化合物20溶液的馏分。除去该馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇100mL、15％亚硝酸乙酯-乙醇溶液(东京化成工业株式会社制)20mL、9.6N的HCl0.5mL，在室温遮光下搅拌48小时。

4.四唑

化合物20的回收

对上述3.的溶液进行减压干固，得到四唑

化合物20的粗纯化物。在该粗纯化物中加入RO水15mL，使其溶解，将该溶液用Sepacore分离提取系统纯化。除去回收的馏分溶液的溶剂，得到含有四唑

化合物20 的残渣。使该残渣溶解于甲醇5mL中。其后，边搅拌边加入二乙醚，使四唑

化合物20沉淀。对其进行离心分离，清洗沉淀后，对沉淀进行分离提取。将该沉淀干燥，得到四唑

化合物20(收量：1.4g收率：60％， UPLC的纯度分析结果100.0％)。

对于上述实施例1～20中得到的四唑

化合物1～20和下述结构的比较化合物1～5(比较例1～5)，根据下述方法，评价极大吸收波长(λmax)、螯合速度、灵敏度和水溶性，将结果示于下述表3。

(螯合速度和极大吸收波长(λmax)的评价)

以各甲臜化合物的终浓度成为50～200mM的方式加入10mM的 MOPS水溶液，制作100μL试样。此时，任一试样均为红褐色。另外制作 1M的镍离子水溶液。

在上述试样中加入制作的镍离子水溶液10μL，边快速搅拌，边观察色调变化。在添加镍水溶液后，记录通过目视观察确认到显色的时间，上述时间为1分钟以内时将螯合速度评价为“○”，上述时间超过1分钟时将螯合速度评价为“×”。应予说明，在比较例2、5中，没有观察到色调变化，因此判断没有形成螯合物，在表3中表示为“没有螯合”。

用分光光度计测定各化合物的甲臜水溶液与镍水溶液的混合溶液的光谱(测定样品池长度：10mm)(n＝1)。基于各光谱，求出各化合物的甲臜的极大吸收波长(λmax)(nm)。将各结果示于表3。作为一个例子，将甲臜化合物1与镍离子的螯合物的光谱示于图1。由图1可知甲臜化合物1与镍离子的螯合物的极大吸收波长(λmax)为630nm。

另外，在图19中示出由四唑

化合物1、13～18生成的甲臜的Ni²⁺螯合物的光谱。将极大吸收波长处的吸光度设为100％。q＝2且具有4- 甲氧基-5-磺基苯基的甲臜化合物17或18的极大吸收波长向更长的波长侧移动。

(灵敏度的评价)

在各化合物0.02mmol中加入RO水75μL和0.5M的MOPS溶液 (pH7.2)100μL进行溶解，制备试样。作为对照，在2-苯并噻唑基-3-(4- 羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺基乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑

(WST-4)11.6mg中加入RO水85μL和0.5M的MOPS溶液(pH7.2)100μL 进行溶解，制备对照试样。

另外地，在以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶 (GDH-FAD)(东洋纺公司制，编号：GLD-351)7mg中加入RO水100μL 进行溶解，制备GDH溶液。另外，在1-甲氧基-5-甲基酚嗪

硫酸甲酯盐 (m-PMS)(株式会社同仁化学研究所制)3.5mg中加入RO水200μL进行溶解，制备s-PMS溶液。在氯化镍129mg中加入RO水1mL进行溶解，制备镍溶液。

在各试样175μL中分别加入上述制备的GDH溶液10μL、m-PMS溶液5μL和镍溶液10μL，制成反应溶液。另外，在对照试样175μL中加入上述制备的GDH溶液10μL和m-PMS溶液5μL和RO水10μL，制成对照反应溶液。

在125mg/dL、250mg/dL和1000mg/dL浓度的葡萄糖水溶液10μL中分别加入反应溶液各40μL进行显色，用分光光度计(测定样品池长度：50μm)测定光谱(n＝1)。在各光谱中，测定在上述求出的各化合物的极大吸收波长(λmax)处的吸光度，将显色溶液中的葡萄糖浓度和吸光度分别作为横轴和纵轴，进行绘图，求出斜率(斜率_sample)。

在125mg/dL、250mg/dL和1000mg/dL浓度的葡萄糖溶液10μL 中分别加入对照反应溶液各40μL进行显色，用分光光度计(测定样品池长：50μm)测定光谱(n＝1)。在各光谱中，测定在WST-4的测定波长(λmax) 即650nm处的吸光度，将葡萄糖浓度和吸光度分别作为横轴和纵轴，进行绘图，求出斜率(斜率_WST-4)。

上述求出的斜率_sample除以斜率_WST-4而得的值(斜率_sample/斜率_WST-4) 为2以上时将灵敏度评价为“◎”，上述斜率_sample/斜率_WST-4为1.5以上且小于2时将灵敏度评价为“○”，上述斜率_sample/斜率_WST-4大于1且小于1.5时将灵敏度评价为“△”，上述斜率_sample/斜率_WST-4为1以下时将灵敏度评价为“×”。作为一个例子，将四唑

化合物1和WST-4的曲线图示于图2。图2是表示与四唑

化合物1和WST-4相关的葡萄糖浓度和生成甲臜的吸光度的关系的图表。由图2可知化合物1和WST-4的斜率分别为0.0063和0.0026，因此斜率_sample/斜率_WST-4约为2.4。应予说明，斜率是各化合物的显色强度的指标。因此，斜率_sample除以斜率_WST-4而得的值(斜率_sample/斜率_WST-4)大于1倍时，表示与作为公知的显色试剂的 WST-4相比，在长波长侧的显色高。

(水溶性的评价)

将各化合物以水溶液中的化合物的浓度成为200mM的量加入到RO 水100μL、0.5M的MOPS溶液(pH7.2)100μL中。搅拌5分钟之后，通过目视观察来确认沉淀物。另外，将各化合物以水溶液中的化合物的浓度成为100mM的量加入到RO水100μL、0.5M的MOPS溶液(pH7.2)100μL 中。搅拌5分钟之后，通过目视观察来确认沉淀物。并且，另外将各化合物以水溶液中的化合物的浓度成为20mM的量加入到RO水100μL、0.5M 的MOPS溶液(pH7.2)100μL中。搅拌5分钟之后，通过目视观察来确认沉淀物。在200mM的水溶液中没有沉淀物时将溶解性评价为◎。在 200mM的水溶液中观察到沉淀物但在100mM的水溶液中没有沉淀物时将溶解性评价为○。在100mM的水溶液中观察到沉淀物但在20mM的水溶液中没有沉淀物时，将溶解性评价为“△”。在20mM的水溶液中也发现沉淀物时，将溶解性评价为“×”。

(稳定性的评价)

在各化合物0.02mmol中加入RO水75μL和0.5M的MOPS溶液 (pH7.2)100μL进行溶解，制成试样。

在该试样175μL中与上述(灵敏度的评价)同样地加入制备的GDH 溶液10μL、m-PMS溶液5μL和镍溶液10μL，制作测定溶液。

作为对照，在2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2- 磺基乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑

(WST-4)11.6mg中加入RO水 85μL和0.5M的MOPS溶液(pH7.2)100μL进行溶解，制备对照试样。在对照试样175μL中加入上述制备的GDH溶液10μL和m-PMS溶液5μL 和RO水10μL，制作对照反应溶液。

在测定溶液制作时(0时)、以及制作1小时、2小时和6小时后，用分光光度计(测定样品池长度：50μm)测定上述制备的测定溶液的光谱 (n＝1)。在各光谱中，测定在上述求出的各化合物的极大吸收波长(λmax) 处的吸光度。将测定溶液制作时(0时)以及制作6小时后的吸光度分别设为Abs_0h和Abs_6h。6小时后的吸光度减去测定溶液制作时(0时)的吸光度的值除以测定时间而得的值[(Abs_6h－Abs_0h)/6]为0.01以下时，将稳定性评价为“◎”，上述值大于0.01且为0.05以下时将稳定性评价为“○”，上述值大于0.05且为0.1以下时将稳定性评价为“△”，上述值大于0.1时评价为“×”。作为一个例子，将四唑

化合物1的稳定性评价结果示于图3。在图3中，还一并示出测定溶液制作1小时后、2小时后和24小时后的吸光度。由图3可知化合物1的[(Abs_6h－Abs_0h)/6]约为0.008，因此稳定性为◎。应予说明，对照反应溶液的[(Abs_6h－Abs_0h) /6]约为0.01。

[表3-1]

[表3-2]

[表3-3]

由上述表3的结果可知通过使用实施例的四唑

盐，能够以良好的灵敏度迅速地测定血糖值。

此外，由实施例的四唑

盐产生的甲臜与镍离子的螯合物显示出600nm以上的极大吸收波长(λmax)。因此，认为即便对于全血样品，也能够以高灵敏度准确地测定血糖值等生物成分浓度。

如表3所示，本发明的四唑

盐显示良好的水溶性。根据上述结果，推测由本发明的四唑

盐生成的甲臜和该甲臜与过渡金属离子的螯合物也显示与本发明的四唑

盐同样良好的水溶性。

应予说明，满足(1)m＝2且p＝1，(2)m＝1且n＝0，或者(3) R¹为羟基，此时，磺基(SO^3-)和羟基位于2,4位或4,6位，或者(4)p ＝0且至少一个R²为羧基中的任一条件的四唑

盐1～3、5、7～20显示更良好的水溶性，满足(1)m＝2且p＝1，或者(4)p＝0且至少一个 R²为羧基的实施例1～3、8～20显示特别良好的水溶性。

另一方面，将实施例2的苯并噻唑基的烷氧基变更为吸电子性的硝基的四唑

盐即比较例2的化合物没有形成甲臜与过渡金属离子的螯合物。因此，可知用烷氧基取代存在于四唑环的2位的苯并噻唑基在维持由四唑

盐产生的甲臜的与过渡金属化合物螯合的能力且使极大吸收波长向长波长侧移动方面非常重要。

(评价例1：利用血糖仪传感器的评价)

1.涂布液的制备

在14.5mg实施例1的四唑

化合物1中加入RO水75μL和0.5M的 MOPS溶液(pH7.2)100μL进行溶解，制备试样。作为对照，在2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺基乙基氨基甲酰基)苯基] -2H-四唑

(WST-4)11.6mg中加入RO水85μL和0.5M的MOPS溶液 (pH7.2)100μL进行溶解，制备对照试样。

另外地，在葡萄糖脱氢酶(GDH-FAD)(东洋纺株式会社制，编号： GLD-351)7mg中加入RO水100μL进行溶解，制备GDH溶液。另外，在1-甲氧基-5-甲基酚嗪

硫酸甲酯盐(m-PMS)(株式会社同仁化学研究所制)3.5mg中加入RO水200μL进行溶解，制备s-PMS溶液。在氯化镍 129mg中加入RO水1mL进行溶解，制备镍溶液。

在试样中加入上述制备的GDH溶液10μL、s-PMS溶液5μL、镍溶液 10μL，制作涂布液。另外，在对照试样中加入上述制备的GDH溶液10μL 和s-PMS溶液5μL，制作对照涂布液。

2.试剂带的制作

将上述中得到的涂布液涂布在PET膜上而制作试剂带1。涂布面积为 1.5mm×75mm(总涂布量5.6μL)。将该试剂带1在长度方向切断，制成试剂片2(1.5mm×3mm)。

3.血糖仪传感器的组装

沿着成为血糖仪传感器的一面的PET膜5的两端，设置厚度50μm的双面胶带作为隔离件。接下来，以试剂片2的试剂涂布面朝下的方式将试剂片2载置于双面胶带4上，组装血糖仪传感器。图4是表示血糖仪传感器的组装的示意图。在图4中，切断试剂带1而得到试剂片2后，将该试剂片2以试剂涂布面3朝下的方式设置在配置于PET膜5的两端的双面胶带4上。其后，如图4 那样在双面胶带的剩余粘接部设置PET膜7。此时，在双面胶带之间形成流路6。

在制作的血糖仪传感器的流路入口点涂全血样品(Ht40，100mg/dL) (血细胞比容值40％，葡萄糖浓度100mg/dL)。全血样品(Ht40，100mg /dL)如下制作：在加入了肝素的采血管中采取全血，测定该全血样品的血细胞比容值，适当地加入预先分离得到的血浆，或者取出全血样品的血浆以全血样品的血细胞比容值成为Ht40的方式调节。另外在这些全血样品中适当地添加高浓度葡萄糖溶液(40g/dL)，制作全血样品(Ht40， 100mg/dL)。在将检测样品点涂于试剂部9秒后，使用纤维分光光度计测定光谱。利用在使用各化合物的血糖仪传感器中测定的光谱测定极大吸收波长处的吸光度。将测定全血样品(Ht40，100mg/dL)时的吸光度设为Abs_BG100。

另外，作为对照，使用血糖值为0mg/dL的检测样品(Ht40，0mg /dL)，同样地测定光谱，将各化合物(化合物1和WST-4)的在极大吸收波长处的吸光度设为Abs_BG0。其中，血糖值为0mg/dL的检测样品 (Ht40，0mg/dL)如下制作。在全血样品(Ht40，100mg/dL)1mL中添加0.1mg的葡萄糖氧化酶(东洋纺株式会社制GLO-201)。添加后在室温下放置5分钟，制作全血样品(Ht40，0mg/dL)。

将求出各化合物的ΔAbs＝Abs_BG100－Abs_BG0的结果示于图5。

如图5所示，在使用实施例1中的四唑

化合物1的血糖仪传感器中，具有为WST-4(650nm)的3倍左右的显色。因此，可知含有本发明的四唑

盐的生物成分浓度测定试剂即便在使用全血样品的情况下，也能够以良好的灵敏度检测生物成分。

另外，与全血样品(Ht40，100mg/dL)同样地制作全血样品(Ht40， 400mg/dL)(血细胞比容值40％，葡萄糖浓度400mg/dL)。并且，另外制作葡萄糖水溶液(100mg/dL)和葡萄糖水溶液(400mg/dL)。对这些样品同样地利用使用了实施例1中的四唑

化合物1的血糖仪传感器，在反应开始9秒后用分光光度计测定光谱。将结果示于图6A 和图 6B 。应予说明，图6A是表示使全血样品作用于使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器时的光谱的图。另外，图6B是表示使葡萄糖水溶液作用于使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器时的光谱的图。

如图6 A 和图 6B 所示，在使用了实施例1中的四唑

化合物1的血糖仪传感器中，全血和葡萄糖水溶液这两者的吸光度大于0.2。因此，得知即便在使用全血样品的情况下，由于血液成分中的着色成分产生的噪音小，所以能够以良好的灵敏度检测生物成分。

此外，制作葡萄糖水溶液(800mg/dL)。

对于制作的全血样品(Ht40，0mg/dL)、全血样品(Ht40，100mg /dL)、全血样品(Ht40，400mg/dL)、葡萄糖水溶液(100mg/dL)、葡萄糖水溶液(400mg/dL)、葡萄糖水溶液(800mg/dL)的各试样，求出利用使用了实施例1中的四唑

化合物1的血糖仪传感器测定时的距反应开始的时间与630nm处的吸光度的关系。将结果示于图7。应予说明，图7A是表示在使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器上点涂全血样品时的距反应开始的时间与630nm处的吸光度的关系的图。图7B是表示使葡萄糖溶液作用于使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器时的距反应开始的时间与630nm处的吸光度的关系的图。

如图7A 和图 7B 所示，在使用了实施例1中的四唑

化合物1的血糖仪传感器中，全血和葡萄糖水这两者用5秒完成显色，显色速度、灵敏度均良好。因此可知含有本发明的四唑

盐的生物成分浓度测定试剂即便在使用全血样品的情况下，也能够以良好的灵敏度迅速地检测生物成分。

此外，图8A 和图 8B 中示出表示用血糖仪传感器测定全血样品(Ht40)和葡萄糖水溶液时的葡萄糖浓度与甲臜和Ni²⁺的螯合物在极大吸收波长处的吸光度的关系的图表。吸光度的测定是在反应开始9秒后进行的。应予说明，图8A是表示使全血样品作用于使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器时的葡萄糖浓度与甲臜和Ni²⁺的螯合物的吸光度的关系的图表。图8B是使葡萄糖水溶液作用于使用了四唑

化合物1的血糖仪传感器时的葡萄糖浓度与甲臜和Ni²⁺的螯合物的吸光度的关系的图表。

如图8A 和图 8B 所示，吸光度与血糖值显示出线性关系(比例关系)。因此，认为利用吸光度能够准确地测定血糖值。

综上可知，在生物试样中添加本发明的四唑

盐、氧化还原酶和过渡金属化合物，测定显色量，基于该显色量制作校正曲线，由此能够准确地算出生物试样中的生物成分的浓度。

(评价例2：利用血糖仪传感器的评价)

1.乙酸镍、DSB20mM溶液的制备

添加0.5M乙酸镍溶液0.6mL、RO水0.4mL、DSB(苯-1,3-二磺酸) 8.7mg，制作乙酸镍·DSB溶液。

2.涂布液的制备

在乙酸镍·DSB溶液87μL中加入1N的NaOH溶液4.7μL、RO水 30.3μL、各四唑

盐(化合物17～20、化合物1)4.8mg，进行混合。进一步在该溶液中加入甲醇4μL、GDH-FAD1.7mg。对该溶液进行离心分离，将上清液作为涂布液。

3.试剂片的制作

通过喷墨方式将上述得到的涂布液涂布在PET膜上而制作试剂带。将该试剂带在长度方向切断(1.5mm×3mm)，制成试剂片2。

4.血糖仪传感器的组装

图13A是表示血糖仪传感器的组装的示意图。在图13A中，得到试剂片2后，将试剂片2以试剂涂布面3朝下的方式设置在PET膜5上，组装血糖仪传感器。在图13A中，将试剂片2以试剂涂布面3朝下的方式设置在配置于PET膜5的两端的作为隔离件的双面胶带4上后，进一步将与PET膜5相同的形状的PET膜7边按压边贴附在试剂片2上，由此得到内表面的血液流路为阶梯形状的测定芯片。图13B是测定芯片的纵向或横向的截面图。在此，作为图13B所示的流路部的流路长度(L1)、流路宽度(W)、流路厚度(t1)和相当于试剂涂布部的试剂部(测定部)的流路长度(L2)、流路宽度(W)、流路厚度(t2)，采用下述表的尺寸。在图13B中，芯片的流路由配置有试剂涂布面的试剂部和在流路上没有配置试剂涂布面的流路即流路部构成。

[表4]

应予说明，作为流路部的与芯片厚度方向正交的方向(流路长边方向) 的长度L1，没有特别限制，可根据目的适当地选择，但优选为5～10mm。其中，若长度L1较长，则在向成分测定装置安装(插入)容易的方面和干扰光向光学测定部的进入减少的方面有利。若长度L1较短，则在能够减少检测样品量方面有利。因此，可以从向成分测定装置的安装(插入)的容易性、干扰光的影响和检测样品量的平衡考虑来决定长度L1的上限和下限。作为试剂部的流路的与芯片厚度方向正交的方向(流路长边方向) 的长度L2，没有特别限制，可根据目的适当地选择，但优选为1～4mm。其中，若长度L2较长，则在长度方较大取得照射斑点的面积，在能够以良好的精度测定的方面有利，若较短，则在能够减少检测样品量的方面有利。因此，从测定精度和检测样品量的平衡考虑来决定长度L2的上限和下限。

4.制作的传感器的评价

在制作的含有各四唑

盐的传感器上点涂葡萄糖水(n＝3)或者全血 (n＝5)，使用纤维分光光度计，确认空白光谱、显色光谱、显色时间过程(time course)。测定650nm的吸光度作为显色色素的吸光度。

图14中示出在传感器上点涂葡萄糖浓度0mg/dL的水时的空白的光谱，图15中示出从点涂葡萄糖浓度400mg/dL的葡萄糖水的传感器的吸光度光谱减去点涂葡萄糖浓度0mg/dL的水的吸光度光谱(图14)而得的差分的光谱(表示葡萄糖的净显色量)。

在本发明的四唑

化合物中，针对在苯并噻唑(benzothiazole)环6 位(或者5,6位)取代的烷氧基的各种取代基，测定净显色量的时间过程 (测定波长650nm)。作为反映来自血液样品的噪音成分的校正波长，也测定了900nm处的吸光度。显色量的时间过程由将测定波长650nm处的反应开始15秒后的吸光度设为100％时的各时间的比例％表示。应予说明，“净显色量”是指在相同的血细胞比容值的血液中，由所希望的血糖值(例如800mg/mL)的血液与血糖值测定试剂反应时的吸光度减去血糖值0mg /dL的血液与血糖值测定试剂反应时的吸光度而得的净显色量。为了排除显色以外的光学误差，显色量的计算中使用的吸光度采用由650nm的吸光度减去用于校正光学误差的900nm的吸光度而得的值。650nm的吸光度包括来自葡萄糖的显色量和来自血细胞的散射光所致的噪音。900nm 的吸光度反映了散射光所致的650nm的噪音的量。图16中示出使用了葡萄糖水溶液(800mg/dL)时的吸光度光谱，图17中示出使用了全血样品(Ht40，800mg/dL)(血细胞比容值40％，葡萄糖浓度800mg/dL) 时的吸光度光谱。根据这些结果，确认了用各种烷氧基取代了化合物1的苯并噻唑环的6位或者5,6位的化合物17、化合物18、化合物19、化合物20均能够用作葡萄糖测定试剂。应予说明，评价例1、2均是考虑了透过光测定中的样品池长度的影响而评价的。

(评价例3：摩尔吸光系数的推算)

与上述螯合速度和极大吸收波长(λmax)的评价栏中记载的步骤同样地进行，使用实施例1中的四唑

化合物1，制作测定溶液。

使用图13A 和图 13B 的血糖仪传感器进行摩尔吸光系数的推算。此时，假定四唑

化合物1与葡萄糖以1:1(摩尔)进行反应。将点涂的葡萄糖水中含有的β葡萄糖的浓度(mol/L)设为x，将点涂了葡萄糖水的血糖仪传感器在630nm的吸光度被换算成以1cm表示时的数值设为y，此时的直线的斜率由摩尔吸光系数表示(以葡萄糖分子量180.16、溶液中的β葡萄糖比62％计算)。

图18中示出将β葡萄糖的浓度(mol/L)设为x、将显色的甲臜和 Ni²⁺的螯合物在λmax＝635nm处的吸光度被换算成以1cm表示时的数值 (abs/cm)设为y时的图表。根据图表推算显色的甲臜与Ni²⁺的螯合物在λmax＝635nm的摩尔吸光系数为ε＝22594L/mol·cm。

本申请基于在2016年9月14日申请的日本专利申请号2016-179911 号，以参照的方式整体引入其公开内容。

符号说明

1 试剂带、

2 试剂片、

3 试剂涂布面、

4 双面胶带、

5 PET膜、

6 流路、

7 PET膜、

10 血糖仪、

12 测定用芯片、

14 测定部、

16 装置主体、

18 芯片主体部、

20 空洞部、

20a 前端口部、

20b 基端口部、

22 长边、

22a 上侧长边、

22b 下侧长边、

24 短边、

24a 前端边、

24b 基端边、

26 试剂、

28 测定对象部、

30 板片、

32 隔离件、

40 壳体、

42 控制部、

44 箱体部、

46 测光部、

48 电源按钮、

50 操作按钮、

52 显示器、

54 弹出杆、

56 弹出针、

56a 棒部、

56b 接受部、

58 插入口、

58a 插入开口部、

59 测定用孔部、

60 芯片安装部、

60a 凸缘部、

62 壁部、

64 元件收容空间、

66 导光部、

68 发光元件、

70 发光部、

72 受光元件、

74 受光部、

76 螺旋弹簧。

Claims

1.下述式(1)表示的2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2H-四唑

盐，

式(1)中，R¹为选自氢原子、羟基、甲氧基和乙氧基中的任一个，R²为选自硝基、-OR⁴和羧基中的任一个，R³为氢原子、甲基或者乙基，至少一个为甲基或者乙基，R⁴为甲基或者乙基，m为与四唑骨架的5位的苯基键合的磺基即-SO₃ ^-的个数，m为2，四唑骨架的5位的苯基为磺基即-SO₃ ^-存在于2位和4位的苯基，n为与四唑骨架的3位的苯基键合的R²的个数，n为0～2的整数，p为与四唑骨架的3位的苯基键合的磺基即-SO₃ ^-的个数，p为0或者1，n+p为1以上，q为1或者2，q为2时，各OR³邻接配置，此时，各OR³可以相互形成环，X表示氢原子或者碱金属。

2.根据权利要求1所述的四唑