JP6826315B2 - Fad依存型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Description
D−グルコース + 電子受容体(酸化型) →
D−グルコノ−δ−ラクトン + 電子受容体(還元型)
すなわち、グルコースを酸化することによって生じる電子の流れを測定することにより、グルコースの定量を可能にしている。これまでに血糖測定に用いられているGDHとしては、反応に要する補酵素の違いから、ニコチンアミド依存型、ピロロキノリンキノン(本明細書ではPQQとも記載する。)依存型、フラビンアデニンジヌクレオチド(本明細書ではFADとも記載する。)依存型の3種類が知られている。ニコチンアミド依存型としてはバチルス属由来のものが市販されているが、補酵素を含んだホロ酵素の状態で精製することができないため、センサを作製するにあたって補酵素となるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(本明細書ではNADとも記載する。)などを加えなければならない。この煩雑さ及び補酵素となるNAD等が高価であることが問題点として挙げられる。一方、PQQ依存型GDHはホロ酵素での提供が可能であり、また比活性が高くグルコースに対する十分な応答シグナルを得られるという利点がある一方で、基質特異性の厳密さに欠け、マルトース等のグルコース以外の糖類にも反応してしまう点が問題視されている。これらの問題点をクリアしうるものとして、FAD依存型GDHが浸透しつつある。
項1.
SDS−PAGEにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の60%を超える分子量分布で見た場合に50kDa以内である、FAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
項2.
以下のいずれか1種より選ばれる微生物に由来する、項1に記載のFAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、モナスカス(Monascus)属、フサリウム(Fusarium)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属、シゾサッカロマイセス(Sygosaccharomyces)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、シゾフィリウム(Schizophyllum)属、ムコール(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属、コレトトリチウム(Colletotrichium)属、シルシネラ(Circinella)属、アースリニウム(Arthrininm)属
項3.
項1または2に記載のFAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
項4.
項1または2に記載のFAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼまたは項3に記載のグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する方法。
本発明の実施形態の一つは、SDS−PAGEにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の60%を超える分子量分布で見た場合に50kDa以内である、FADGDHである。
(1)SDS−PAGEを、Nu−PAGE 4−12% Bis−Tris Gel(Invitrogen社製)を用い、分子量がそれぞれ50、60、70、80、90、100、120、160および220kDaのラダーを持つ分子量マーカー(BenchMarkTM Protein Ladder)を適用して、実行する。
(2)前記(1)のSDS−PAGEの結果で示されたバンドの濃淡をスキャンして、横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットする。スキャンおよびプロットにはGel Pro analyzer(日本ローパー製)を用いる。
(3)前記(2)でプロットした結果から、バンドの濃さの相対値が最大値の60%を超える分子量範囲を読み取る。
(4)本発明における分子量分布は、前記(3)で読み取った分子量範囲を含む最少の分子量の幅を、前記(1)で使用した分子量マーカーのラダーで設定されている各分子量で区切って表す。例えば、前記(3)で読み取った分子量範囲が75−85kDaであれば分子量分布は70−90kDaとなり、85−105kDaであれば分子量分布は80−120kDaとなる。
(A)アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、モナスカス属、フサリウム属、サッカロマイセス属、ピキア属、キャンディダ属、シゾサッカロマイセス属、クリプトコッカス属、シゾフィリウム属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属およびアースリニウム属。
(B)アスペルギルス属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、アースリニウム属およびペニシリウム属
(1)SDS−PAGEを、Nu−PAGE 4−12% Bis−Tris Gel(Invitrogen社製)を用い、分子量がそれぞれ50、60、70、80、90、100、120、160および220kDaのラダーを持つ分子量マーカー(BenchMarkTM Protein Ladder)を適用して、実行する。
(2)前記(1)のSDS−PAGEの結果で示されたバンドの濃淡をスキャンして、横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットする。スキャンおよびプロットにはGel Pro analyzer(日本ローパー製)を用いる。
(5)前記(2)でプロットした結果から、バンドの相対的な濃さが最も高い分子量を読み取る。
(6)前記(5)で読み取った分子量範囲を含む最少の分子量の幅を、前記(1)で使用した分子量マーカーのラダーで設定されている各分子量で区切って表す。例えば、前記(5)で読み取ったバンドの相対的な濃さが最も高い分子量が76kDaであれば、その分子量の幅は70−80kDaとなる。
(7)前記(6)で表した分子量の幅の中心値(その幅の上限値と下限値とを足して2で割った値)を分子量とする。
本発明の実施形態の一つは、前記のFADGDHを含むグルコースセンサである。
本発明の実施形態の一つは、前記のFADGDHまたは前記のグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する方法である。グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のFADGDHを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のFADGDHを用いてグルコースの濃度又は量が測定可能である限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のFADGDHを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体(例えば、DCPIP)の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。グルコース濃度又は量の測定が可能である限り、試料に添加する酵素の量は特に制限されない。
前記の本発明のFADGDH(SDS−PAGEにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の60%を超える分子量分布で見た場合に50kDa以内である、FADGDH)を製造する方法は特に限定されない。
例えば、公知の、タンパク質に付加する糖鎖の構造を改変制御できる技術を用いることにより、分子量の均一性を高めることができる。そのような技術を以下に例示する。
糖鎖の生合成は、まず小胞体(ER)で始まり、その後ゴルジ体でさらに糖鎖の修飾が起こる。このうちERで生成する糖鎖は真菌も哺乳類細胞も基本的には同じであることが判明している。その糖鎖は8分子のマンノース(Man)と2分子のNアセチルグルコサミン(GlcNAc)からなるコア構造(Man8GlcNAc2)が構成されている。このコア構造糖鎖を持つタンパク質はゴルジ体に輸送されて、種々の修飾を受ける。
微生物のoch1遺伝子の機能を低下させるための、より好ましい手段は、och1遺伝子に相当するDNAを破壊することである。
(a)配列番号1のアミノ酸配列と68%以上(好ましくは70%以上、さらに好ましくは75%以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNA
(b)配列番号2のDNA配列と68%以上(好ましくは70%以上、さらに好ましくは75%以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)の同一性を有するDNA
(c)配列番号1のアミノ酸配列と70%以上(好ましくは73%以上、さらに好ましくは74%以上、さらに好ましくは75%以上、さらに好ましくは76%以上)の同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNA
(d)配列番号2のDNA配列と70%以上(好ましくは73%以上、さらに好ましくは74%以上、さらに好ましくは75%以上、さらに好ましくは76%以上)の同一性を有するDNA
(e)BLASTによる相同性検索において、配列番号2に対する同一性が73%以上(好ましくは74%以上、さらに好ましくは76%以上、さらに好ましくは99%以上、)の値を有するアミノ酸配列をコードするDNA
アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、モナスカス属、フサリウム属、サッカロマイセス属、ピキア属、キャンディダ属、シゾサッカロマイセス属、クリプトコッカス属、シゾフィリウム属、ムコール属、アブシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、アースリニウム属。
その手段の一つは、前記och1遺伝子に相当するDNAを破壊することである。この方法は、用いようとする微生物のoch1遺伝子配列が特定されている場合に適している。ここで破壊とは、och1遺伝子に相当するDNA配列の全部または一部を除去するか、前記DNA配列の少なくとも1箇所に変異を加えるか、または、前記DNA配列の両端以外の少なくとも1箇所に任意のDNA配列を挿入すること等によって、その機能を低減若しくは完全に停止させることを言う。
例えば、形質転換体を用いる場合、och1遺伝子を破壊する方法としては、DNAの相同組換えを用いる方法が一般的であり、形質転換に用いるマーカー遺伝子に、目的とする遺伝子の上流非翻訳領域と下流翻訳領域を連結させた遺伝子破壊カセットを構築し、宿主微生物を形質転換することによって、och1遺伝子の上流と下流で相同組換えを起こさせ、och1のORF部分を除去することにより遺伝子の機能を低下させることが可能である。
また、遺伝子破壊カセットをoch1のORF内部で転写が終結するように構築し、目的遺伝子の位置に遺伝子破壊カセットを挿入することにより、遺伝子の機能を停止させることも可能である。
この方法では、用いようとする微生物に対して、変異剤処理や、紫外線、エックス線またはガンマ線の照射などの物理的処理によって、突然変異を起こす頻度を高めてもよいが、天然に生じるバリアントであっても構わない。
この方法は、用いようとする微生物にoch1遺伝子の働きに該当する機能が認められるものの、och1遺伝子配列が特定されていない場合に適している。
この方法では、目的の遺伝子によって転写されるmRNAの相補鎖となるDNA若しくはRNAを微生物に導入、若しくは微生物内で転写させることによって、mRNAと二重鎖を形成することによってmRNAを不安定化させ、また、mRNAからペプチドへの翻訳を抑制することによって、och1の発現を低下させることが可能である。
この方法は、遺伝子の相同組換え効率が低い微生物において、ターゲティングによる目的遺伝子の破壊が困難な場合に有効である。
アスペルギルス・オリゼ由来och1糖鎖合成関連遺伝子の選抜は、糖鎖合成関連遺伝子がよく研究されている、酵母サッカロマイセス・セレビシエ(cerevisiae)の遺伝子情報から相同性が高い配列を選抜することにより行った。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸を配列番号1に、och1をコードすると想定されるDNA配列を配列番号2に示す。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸配列情報を元に、同じアスペルギルス属においてホモロジー検索を行った結果、アスペルギルス・ニガーとは73%、アスペルギルス・フミガタスとは77%、アスペルギルス・ニードランスとは70%の同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が存在しており、これら遺伝子群はアスペルギルス属において高度に保存されていると考えられる。図1に、各アスペルギルス属のoch1オルソログのアミノ酸配列の同一性の比較を示す。
アスペルギルス・オリゼのoch1遺伝子破壊カセットは以下のようにして構築した。アスペルギルス・オリゼのゲノムDNAをテンプレートとして、配列番号9と配列番号10に示すプライマーでPCRを行い、アスペルギルス・オリゼのoch1遺伝子を含み、遺伝子の上流2kbpから遺伝子の下流2kbpまでの領域を増幅した。増幅したPCR産物は、Target−clone Plus(東洋紡社製)を用いてTAクローニングし、pTA2ベクターに挿入した。作製されたベクターはpTAooch1±2Kとした。
つづいて、och1遺伝子のORF部分を取り除くため、pTAooch1±2Kをテンプレートに配列番号11と配列番号12に示すプライマーでinverse PCRを行った。得られたベクターはpTAooch1±2K−ORFとした。続いて、マーカー遺伝子を挿入するため、pUSAベクターから制限酵素XbaIと制限酵素SbfIによってsCマーカー部分を切り出し、制限酵素NheIとSbfIで消化したpTAooch1±2K−ORFに挿入した。得られたベクターをpTΔAooch1−sCを作製した。
2.で得られたベクターpTΔAooch1−sCをQiafilter plasmid Midi kit(QIAGEN社製)を用いて大量に調製し、麹菌への形質転換に用いた。組換え宿主には麹菌アスペルギルス・オリゼ NS4株を使用し、形質転換の手法は、プロトプラスト−PEG法によって行った。遺伝子破壊の原理については図2に示す。得られた形質転換体の中からoch1遺伝子破壊株を、PCRによって確認して選抜した。
アスペルギルス・オリゼ由来のFADGDH遺伝子の発現は以下のようにして行った。麹菌Aspergillus oryzaeのゲノムDNAからniaDを含む領域を配列番号13のプライマーと配列番号14のプライマーによって増幅し、東洋紡社製のTarget clone plusによってTAクローニングしpTNとした。次に、Aspergillus oryzaeのゲノムDNAから配列番号15のプライマーと配列番号16のプライマーによって、Translation elongation factor1αと予測される遺伝子の翻訳開始点から上流1kbpをPCRによって増幅し、さらに、Aspergillus oryzaeのゲノムDNAから配列番号17のプライマーと配列番号18のプライマーによって、AmyBターミネーターの領域をPCRによって増幅した。pTNについては配列番号19のプライマーと配列番号20のプライマーでPCRを行うことにより、プラスミドを増幅した。上述の通り作製した3つのPCR産物を、In−Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社)を用いて融合させ、niaDマーカーとEF1プロモーター、AmyBターミネーターを含む発現ベクターpTNEを作製した。
つづいて、アスペルギルス・オリゼ由来のFADGDHについては国際公開公報WO2009/119728に記載の配列、すなわち、アスペルギルス・オリゼTI株のcDNAからクローニングされた配列にG163R+V551Cの変異を導入した配列を使用した。FADGDHをコードするアミノ酸配列を配列番号21にDNA配列を配列番号22にそれぞれ示す。アスペルギルス・オリゼ由来のFADGDHを配列番号23のプライマーと配列番号24のプライマーによって増幅し、得られたPCR産物を制限酵素SpeIによって消化し、同じくSpeIによって消化されたpTNEのEF1プロモーターの下流に順方向に遺伝子を挿入した。得られたベクターをpTNE−AomFADGDHとした。pTNE−AomFADGDHのベクターマップを図3に示す。pTNE−AomFADGDHをΔoch1株及びNS4株に形質転換を行った。得られた形質転換体をDP培地で培養し、最も高い生産性を示す形質転換体を選抜した。
4.で得られた形質転換体を滅菌した60mLのDP液体培地/500ml坂口フラスコに植菌し、30℃下で2日間振とう培養して前培養液とした。次に、7.0LのYPM培地(5%酵母エキス、2%大豆ペプトン、5%マルトース)/10L容ジャーファーメンターに前培養液を植菌し、培養温度35℃、攪拌速度400rpm、通気量6.0L/分、管内圧0.2MPaの条件で3日間培養した。その後、培養液を濾布で濾過し、濾過液を回収した。
濾過液を分画分子量30,000のUF膜(ミリポア(株)製)を用いて濃縮し、濃縮液に連続してリン酸緩衝液(50mM、pH6.0)を添加することによってバッファーを置換した。続いて、濃縮液に硫酸アンモニウムを40%(w/v)徐々に添加して、室温で30分間攪拌した後、ろ過助剤を用いて余分な沈殿を除去した。次に、予め40%(w/v)の硫酸アンモニウムを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で平衡化した200mLのPSセファロースFastFlow(GEヘルスケア製)カラムに濾過液をチャージし、50mMリン酸緩衝液(pH6.0)に段階的に置換してタンパク質を溶出させた。そして、溶出された画分を分画分子量10,000の中空糸膜(スペクトラムラボラトリーズ製)で濃縮し、濃縮液に連続してリン酸緩衝液(50M,pH6.0)を添加することによってバッファーを置換した。続いて、50mMリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化したDEAEセファロースFast Flow(GEヘルスケア製)カラム酵素液を通液し、精製酵素を得た。宿主をΔoch1として発現されたFADGDHをΔoch1−AomFADGDH、宿主をNS4株として発現されたFADGDHをAomFADGDHとした。得られたAomFADGDHとΔoch1−AomFADGDHとをSDS−PAGEに供し、分子量を観察した。SDS−PAGEはNu−PAGE 4−12% Bis−Tris Gel(Invitrogen社製)を使用した。分子量がそれぞれ50、60、70、80、90、100、120、160および220kDaのラダーを持つ分子量マーカー(BenchMarkTM Protein Ladder)を用いてSDS−PAGEを行った結果を図4に示す。さらに、図4で示されたバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットしたのが図7(AomFADGDH)および図8(Δoch1−AomFADGDH)である。
このように、本発明の生産方法により得られたFADGDHは、その分子量が野生型のものに比べて、75÷110×100=68.2(%)にまで減少していた。また、FADGDHのポリペプチド鎖部分のみの分子量は60kDaであるから、糖鎖含量は、野生型の{(110−60)÷110}×100=45.5(%)から{(75−60)÷75}×100=20.0(%)に減少していた(野生型の44.0%)。
まず、グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液(pH=7.0)を作製した。
1mM クエン酸ナトリウム(pH7.0)
50mM フェリシアン化カリウム
0.4mg/ml FADGDH
まず、0.5%のCMC(カルボキシメチルセルロース)5μLを3電極を上記溶液5μLを、3電極を有するディスポーサブルチップ(DEP−CHIP、バイオデバイステクノロジーズ社製)の作用極・対極・参照極上に滴下し、50℃10分の加温処理を行って乾燥させた。続いて、上記組成液5μLをCMCを固定化した箇所に滴下し、50℃10分の加温処理を行って、センサチップとした。このセンサチップを専用ソケットを介してポテンショ/ガルバノスタットに接続し、電極上の組成物に0〜300mg/dlの標準グルコース溶液5μLを添加して+0.3Vの電圧を印加して電流値をモニタリングし、印加後3秒時点の電流値を応答値とした。グルコース標準液の濃度と応答値の関係を図5に示す。
測定の結果、AomFADGDHは100mg/dlから200mg/dlでの応答値がΔoch1−AomFADGDHと比較して高いが、300mg/dlでは応答値がΔoch1−AomFADGDHより低く、高濃度での応答において課題があることが判明した。一方で、Δoch1−AomFADGDHは300mg/dlまでグルコースの濃度に応じて応答値が直線的に上昇しており、高濃度での測定に有利であることが判明した。
続いて、他の微生物由来のFADGDHについても糖鎖含量低減の効果を確認するため、アスペルギルス・テレウス由来のFADGDHについても同様に効果を検証した。アスペルギルス・テレウス由来のFADGDHは国際公開公報WO2004/058958及びWO2006/101239にその配列情報及び特性が開示されている。特許記載のアスペルギルス・テレウス由来FADGDHのcDNA配列全長を人工的に合成し、さらにpTNEベクターに遺伝子を挿入することでpTNE−AtFADGDHを得た。得られたプラスミドをAspergillus oryzae NS4株及びΔoch1に形質転換し、得られた形質転換体の中から最も高いFADGDH活性をしめす形質転換体を選抜し、FADGDHの精製に用いた。形質転換体の培養及び精製は2.で示すとおりに行った。宿主をΔoch1として発現されたFADGDHをΔoch1−AtFADGDH、宿主をNS4株として発現されたFADGDHをAtFADGDHとした。得られたAtFADGDHとΔoch1−AtFADGDHとをSDS−PAGEに供し、分子量を観察した。SDS−PAGEはNu−PAGE 4−12% Bis−Tris Gel(Invitrogen社製)を使用した。分子量マーカー(BenchMarkTM Protein Ladder))を用いてSDS−PAGEを行った結果を図6に示す。さらに、図6で示されたバンドの濃淡をスキャンして横軸に分子量、縦軸にバンドの相対的な濃さをプロットしたのが図9(AtFADGDH)および図10(Δoch1−AtFADGDH)である。
このように、本発明の生産方法により得られたFADGDHは、その分子量が野生型のものに比べて、85÷140×100=60.7(%)にまで減少していた。また、FADGDHのポリペプチド鎖部分のみの分子量は60kDaであるから、糖鎖含量は、野生型の{(140−60)÷140}×100=57.1(%)から{(85−60)÷85}×100=29.4(%)に減少していた(野生型の51.5%)。
Claims (6)
- SDS−PAGEにより観察される分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の60%を超える分子量分布で見た場合に50kDa以内であり、分子量が85〜100kDaであり、アスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物に由来し、och1遺伝子が破壊された又はoch1遺伝子の機能が低下したアスペルギルス属に属する微生物を宿主として得られる、FAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
- FAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼの由来微生物が、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus orizae)またはアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)である、請求項1に記載のFAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
- 前記分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の60%を超える分子量分布で見た場合に40kDa以内である、請求項1又は2に記載のFAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
- 前記分子量分布の幅が、バンドの濃さの相対値が最大値の60%を超える分子量分布で見た場合に30kDa以内である、請求項1〜3のいずれかに記載のFAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のFAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のFAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼまたは請求項5に記載のグルコースセンサを用いてグルコース濃度を測定する方法。
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