KR20010109347A

KR20010109347A - 글루코스 탈수소효소

Info

Publication number: KR20010109347A
Application number: KR1020017012840A
Authority: KR
Inventors: 고지 소데
Original assignee: 고지 소데
Priority date: 1999-04-08
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2001-12-08
Also published as: JP2000350588A; US20060099698A1; US7067295B1; CN1288242C; CN1350579A; CA2364565A1; IL145805A0; CN1576365A; WO2000061730A1; EP1167519A1; EP1167519A4; TW585917B

Abstract

본 발명은, 피롤로-퀴놀린 퀴논을 그의 조효소로 하는 수용성 글루코스 탈수소효소에 있어서, 특정 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소를 개시한다. 본 발명의 수용성 PQQGDH는 향상된 열안정성을 가진다.

Description

글루코스 탈수소효소{GLUCOSE DEHYDROGENASE}

혈중 글루코스는 당뇨병의 중요한 마커이다. 미생물을 이용한 발효 생산에 있어서, 공정을 모니터링하기 위하여 글루코스 수준을 분석한다. 종래의 글루코스 분석은 글루코스 옥시다제 (GOD) 또는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (G6PDH)를 이용한 효소적 방법을 기초로 하였다. 그러나, GOD를 기초로 하는 분석법은 글루코스 산화 반응에 의해 발생하는 과산화수소를 정량하기 위하여 카탈라제 또는 퍼옥시다제를 분석 시스템에 첨가할 필요가 있었다. G6PDH는 분광학적 글루코스 분석법에 사용되어 왔는데, 상기의 경우 반응 시스템에 조효소 NAD(P)를 첨가하여야 하였다.

본 발명은 향상된 열안정성을 갖는 개변형 수용성 PQQGDH를 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 개시

본 발명자는 효소적 글루코스 분석법에 사용되어 왔던 효소 대신 신규한 효소로서 안정성이 높은 PQQGDH가 유용하다는 것을 알아내었다. PQQGDH는 글루코스에 대한 고산화활성을 가지고, 전자 수용체로서 산소를 필요로 하지 않는 조효소- 결합형 효소이기 때문에 글루코스 센서의 인식 소자로서 유용하다.

PQQGDH는 글루코스를 산화시켜 글루코노락톤을 생성하는 반응을 촉매한다. PQQGDH로는 막결합형 효소 및 수용성 효소가 있다. 막결합형 PQQGDH는 분자량이 약 87 kDa인 단일 펩티드 단백질이며 다양한 그램 음성 박테리아에서 광범위하게 발견된다. 수용성 PQQGDH는 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus)의 여러 균주에서 동정되었으며 (Biosci. Biotech. Biochem. (1995), 59(8), 1548-1555), 그의 구조 유전자가 클로닝되어 아미노산 서열이 밝혀졌다 (Mol. Gen. Genet. (1989), 217: 430-436). 에이. 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH는 분자량이 약 50 kDa인 호모이량체이다.

최근, 한 네델란드 그룹은 수용성 PQQGDH의 X-선 결정 구조 분석을 행하여 상기 효소의 고차 구조를 밝혀내었다 (J. Mol. Biol., 289, 319-333 (1999), The crystal structure of the apo form of the soluble quinoprotein glucose dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus reveals a novel internal conserved sequence repeat; A. Oubrie 등, The EMBO Journal, 18(19) 5187-5194 (1999), Structure and mechanism of soluble quinoprotein glucose dehydrogenase, A. Oubrie 등, PNAS, 96(21), 11787-11791 (1999), Active-site structure of the soluble quinoprotein glucose dehydrogenase complexed with methylhydrazine; A covalent cofactor-inhibitor complex, A. Oubrie 등). 상기 논문에 의하면, 수용성 PQQGDH는 6개의 W-모티프로 구성된 β-프로펠러 단백질이다(도 7).

본 발명자는, 종래의 수용성 PQQGDH를 개량하여 그의 열안정성을 증가시킴으로써 임상 시험 또는 식품 분석에 응용할 수 있는 개변형 PQQGDH를 개발하기 위하여 예의연구를 수행한 결과, 수용성 PQQGDH의 특정 영역에 아미노산 변이를 도입함으로써 매우 높은 안정성을 갖는 효소를 수득하는 데 성공하였다.

따라서, 본 발명은 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH (이하, 야생형 PQQGDH로 칭함)의 세린 231 또는 글루타민 209 또는 글루타메이트 210 또는 아스파테이트 420 또는 알라닌 421에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 개변형 글루코스 탈수소효소를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "개변형 글루코스 탈수소효소"는 천연 글루코스 탈수소효소의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 글루코스 탈수소효소를 의미한다. 본원에서 아미노산 넘버링은 개시 메티오닌을 +1 위치로 하여 출발한다.

본 발명은 또한 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어진 아미노산 서열 중 잔기 48-53, 60-62, 69-71, 79-82, 91-101, 110-115, 127-135, 147-150, 161-169, 177-179, 186-221, 227-244, 250-255, 261-263, 271-275, 282-343, 349-377, 382-393, 400-403, 412-421, 427-432, 438-441 및 449-468에 의해 정의되는 영역들로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있으며, 아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH의 열안정성보다 더 큰 열안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 개변형 PQQGDH는 50℃에서의 10분 동안의 열처리 후 야생형 PQQGDH의 잔존 활성보다 10% 이상, 더 바람직하게는 20% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 30% 이상 더 큰 잔존 활성을 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 개변형 PQQGDH는 55℃에서의 열실활 반감기가 천연형 PQQGDH의 열실활 반감기보다 5분 이상, 더 바람직하게는 15분 이상 길다. 본 발명의 특히 바람직한 개변형 PQQGDH는 서열번호 1로 나타내어져 있는 아미노산 서열의 잔기 227-244, 186-221 또는 412-421에 의해 정의되는 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다. 본 발명의 훨씬 더 바람직한 개변형 PQQGDH는 서열 번호 1로 나타내어져 있는 아미노산 서열에 있어서, 세린 231이 라이신, 아스파라긴, 아스파테이트, 히스티딘, 메티오닌, 류신 및 시스테인으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되어 있거나, 글루타민 209가 라이신으로 치환되어 있거나, 글루타메이트 210이 라이신으로 치환되어 있거나, 아스파테이트 420이 라이신으로 치환되어 있거나, 알라닌 421이 아스파테이트로 치환되어 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명의 개변형 PQQGDH는 하기 서열:

Asn Leu Asp Gly Xaa231 Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser

[여기서, Xaa231은 Ser 이외의 천연 아미노산 잔기를 나타냄];

또는 하기 서열:

Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala GlnHis Thr Pro Thr Gln Xaa2O9 Xaa2lO Leu Asn Gly Lys Asp Tyr His Thr Tyr Met Gly

[여기서, Xaa2O9 및 Xaa2lO은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단, Xaa2O9가 Gln를 나타내는 경우, Xaa210은 Glu를 나타내지 않음];

또는 하기 서열:

Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Xaa420 Xaa421

[여기서, Xaa420 및 Xaa421은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단, Xaa420 이 Asp를 나타내는 경우, Xaa421 은 Ala를 나타내지 않음]

을 포함한다.

또한 본 발명은, 상기한 임의의 개변형 글루코스 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터 및 상기 유전자를 포함하는 형질전환체와, 본 발명의 개변형 글루코스 탈수소효소를 포함하는 글루코스 분석 키트 및 글루코스 센서를 제공한다.

본 발명의 개변형 PQQGDH의 효소 단백질은 높은 열안정성을 가지며, 글루코스에 대하여 높은 산화 활성을 가지므로 글루코스의 고감도 및 고선택적인 분석에 응용될 수 있다. 특히, 효소의 생산에 있어서, 제조/정제 동안 실활이 적으며 수율이 높고; 용액 중에서의 고 안정성 때문에 효소가 용이하게 보존될 수 있으며; 본 효소를 사용하여 실활이 적은 분석 키트 또는 효소 센서를 작성할 수 있고; 본 효소를 사용하여 작성한 분석 키트 또는 효소 센서의 열 안정성이 높아 보존성이 탁월하다는 잇점을 제공할 것으로 기대된다.

본 발명은 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소 (PQQGDH)의 제조 및 글루코스 분석에서의 그의 용도에 관한 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용되는 플라스미드 pGB2의 구조를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 개변형 효소를 코딩하는 돌연변이 유전자의 작성 방법을 나타낸다.

도 3은 본 발명의 개변형 효소의 열안정성을 나타낸다.

도 4는 본 발명의 개변형 효소의 기질 특이성을 나타낸다.

도 5는 본 발명의 개변형 PQQGDH를 사용한 글루코스 분석을 나타낸다.

도 6은 본 발명의 개변형 PQQGDH를 사용한 효소 센서의 보정 곡선을 나타낸다.

도 7은 수용성 GDH의 토폴로지를 나타낸다 (Oubrie 등, 도 4).

본 발명을 실시하기 위한 최량의 형태

개변형 PQQGDH의 구조

본 발명자는 수용성 PQQGDH를 코딩하는 유전자의 코딩 영역 내로 에러가 쉽게 일어나는 (error prone) PCR로 랜덤 돌연변이를 도입하여 아미노산 변이를 보유하는 수용성 PQQGDH의 라이브러리를 작제하였다. 상기 유전자로 이. 콜라이 (E. coli)를 형질전환시키고, 열처리 후의 PQQGDH의 잔존 활성에 대하여 스크리닝하여 열안정성이 향상된 PQQGDH를 발현하는 다수의 클론을 수득하였다.

상기 클론 중 하나의 뉴클레오티드의 서열을 분석해 본 결과, Ser 231 이 Cys로 변이되었음이 나타났다. 상기 아미노산 잔기를 다양한 다른 아미노산 잔기로 치환할 경우, 모든 경우에 있어서 야생형 수용성 PQQGDH의 열안정성보다 높은 열안정성을 가지는 돌연변이 효소가 수득되었다.

수용성 PQQGDH는 6개의 W-모티프로 구성된 β-프로펠러 단백질의 구조를 가진다. 본 발명에 있어서, 열안정성은 잔기 227-244 에 의해 정의되는 루프 영역 중 Ser 231 을 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 향상될 수 있음이 밝혀졌다. 이어서, 다른 루프 영역 내로 부위 특이적 돌연변이를 도입하여 열안정성의 향상을 시도하였다. 잔기 186-221에 의해 정의되는 루프 중 Gln2O9Lys 또는 Glu2lOLys 을 보유하거나 잔기 412-421에 의해 정의되는 루프 중 Asp42OLys 또는 Ala421Asp 을 보유하는 돌연변이 효소의 열안정성이 향상되었다.

이와 같이, 본 발명에 따르면 열안정성이 향상된 수용성 PQQGDH가 루프 영역 내로 적당한 변이를 도입함으로써 작제될 수 있음이 입증되었다. 이는, 수용성 PQQGDH에 있어서 W-모티프를 연결하는 루프 영역들 사이의 상호작용이 β-프로펠러 단백질의 구조의 안정화에 기여하기 때문인 것으로 생각된다. 상기에 나타낸 잔기 Ser231, Gln2O9, Gly2lO, Asp420 및 Ala421 은 단순히 예시적인 것이며 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 본 발명은, 루프 영역의 구조 유전자의 특정 부위에 변이를 도입함으로써 PQQGDH의 열안정성을 향상시킬 수 있음을 당 기술분야에서 처음으로 밝혀냄으로써, PQQGDH의 열안정성을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 개변형 PQQGDH 는 서열 번호 1로 나타내어진 야생형 PQQGDH의 아미노산 서열의 특정 영역에 아미노산 잔기의 변이를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이와 같이, 본 발명은 서열 번호 1에 나타내어진 아미노산 서열 중 잔기 48-53, 60-62, 69-71, 79-82, 91-101, 110-115, 127-135, 147-150, 161-169, 177-179, 186-221, 227-244, 250-255, 261-263, 271-275, 282-343, 349-377, 382-393, 400-403, 412-421, 427-432, 438-441 및 449-468 에 의해 정의되는 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소를 제공한다.

본 발명의 바람직한 개변형 PQQGDH에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어진 아미노산의 잔기 227-244, 186-221 또는 412-421 에 의해 정의되는 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다. 본 발명의 특히 바람직한 개변형 PQQGDH에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어진 아미노산 서열 중 세린 231 이 라이신, 아스파라긴, 아스파테이트, 히스티딘, 메티오닌, 류신 및 시스테인으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 치환되거나, 글루타민 209 가 라이신으로 치환되거나, 글루타메이트 210이 라이신으로 치환되거나, 아스파테이트 420이 라이신으로 치환되거나, 알라닌 421이 아스파테이트로 치환되어 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명의 개변형 PQQGDH는 하기 서열:

Asn Leu Asp Gly Xaa231 Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser

[여기서, Xaa231 은 Ser 이외의 천연 아미노산 잔기를 나타냄];

또는 하기 서열:

Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Xaa2O9 Xaa2lO Leu Asn Gly Lys Asp Tyr His Thr Tyr Met Gly

[여기서, Xaa2O9 및 Xaa21O 은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단,Xaa209 가 Gln을 나타내는 경우, Xaa 210 은 Glu 를 나타내지 않음];

또는 하기 서열:

Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Xaa420 Xaa421

[여기서, Xaa 420 및 Xaa421 은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단, Xaa420 이 Asp 를 나타내는 경우, Xaa 421 은 Ala 을 나타내지 않음]

을 포함한다.

본 발명의 개변형 글루코스 탈수소효소에 있어서, 글루코스 탈수소효소 활성을 보유하는 한 다른 아미노산 잔기가 부분적으로 결실 또는 치환될 수 있거나 다른 아미노산 잔기가 부가될 수 있다. 상기와 같은 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 위한 다양한 기법은 예를 들어 Sambrook 등의 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제2판, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 미국 뉴욕 소재]에 기술되어 있는 바와 같이 당 업계에 공지되어 있다. 당 업계의 숙련자는 상기와 같은 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 글루코스 탈수소효소가 소망하는 글루코스 탈수소효소 활성을 가지는지의 여부를 본원의 교시에 따라 용이하게 시험할 수 있다. 또한, 당 업계의 숙련자는 본원의 교시에 따라 다른 박테리아로부터 유래된 수용성 PQQGDH 중 루프 구조를 가지는 영역을 예상하고, 상기 영역의 아미노산 잔기를 치환하여 열안정성이 향상된 개변형 글루코스 탈수소효소를 수득할 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 단백질의 일차 구조를 배열하여 비교함으로써, 아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 PQQGDH 중 세린 231, 글루타민 209, 글루타메이트 210, 아스파테이트 420 또는 알라닌 421 에 상응하는 아미노산 잔기를 용이하게 동정하여, 상기와 같은 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 개변형 글루코스 탈수소효소를 수득할 수 있다. 이러한 개변형 글루코스 탈수소효소도 본 발명의 범위 이내에 있다.

개변형 PQQGDH의 제조 방법

아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래 야생형 수용성 PQQGDH 를 코딩하는 유전자의 서열은 서열번호 2 에 정의된다.

본 발명의 개변형 PQQGDH 를 코딩하는 유전자는 야생형 수용성 PQQGDH 를 코딩하는 유전자 내 상기 기재된 루프 영역에 생기는 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 치환될 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체함으로써 생성시킬 수 이다. 상기 위치 특이적 뉴클레오티드 서열 치환을 위한 다양한 기법은, 예를 들어, 문헌 [Sambrook 등, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2 판, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 미국 뉴욕 소재] 에 기재된 바와 같이 당 분야에 공지되어 있다. 이렇게 수득한 변이 유전자를 유전자 발현 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 에 삽입하여 적당한 숙주 (예를 들어, 이. 콜라이) 내로 형질전환시킨다. 다수의 외래 단백질 발현용 벡터/숙주 체계가 공지되어 있고, 박테리아, 효모 또는 배양 세포와 같은 다양한 숙주가 적합하다.

에러가 쉽게 일어나는 PCR 에 의해 랜덤 돌연변이를 표적 루프 영역 내에 도입시켜, 루프 영역에 변이를 수반하는 개변형 수용성 PQQGDH 의 유전자 라이브러리를 생성한다. 이러한 유전자를 이. 콜라이 내로 형질전환시켜, 각 클론에서 PQQGDH 의 열 안정성을 검색한다. 수용성 PQQGDH 은 이. 콜라이 에서 발현되는 경우 세포질 공간으로 분비되므로, 이. 콜라이 세포를 이용하여 효소 활성을 용이하게 분석할 수 있다. 상기 라이브러리를 60 -70 ℃ 에서 약 30 분 동안 가열한 후, 글루코스 및 PMS-DCIP 염료와 배합하여 잔여 PQQGDH 활성을 시각적으로 측정하여, 열 처리 후에도 잔여 활성을 나타내는 클론을 선별하여 뉴클레오티드 서열을 분석하고 변이를 확인한다.

이렇게 수득한, 개변형 PQQGDH 를 발현하는 형질전환 세포를 배양하고 원심분리 등의 수단으로 배양 배지로부터 회수한 후, 프렌치 프레스로 파열시키거나 삽투압적 쇼크를 주어 세포질 효소를 배지 중에 분비시킨다. 효소를 초원심분리하여 수용성 PQQGDH-함유 분획을 얻을 수 있다. 이와는 달리, 적당한 숙주/벡터 체계를 이용하여 발현 PQQGDH 를 배지 내로 분비시킬 수 있다. 생성 수용성 분획을 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, HPLC 등에 의해 정제하여, 본 발명의 개변형 PQQGDH 를 제조한다.

효소 활성의 분석 방법

본 발명의 PQQGDH 는 글루코스가 산화되어 글루코노락톤을 생성하는 반응을 촉매하는 조효소로서 PQQ 와 연합한다.

효소 활성은 산화환원 색소의 발색 반응을 이용하여, 글루코스의 PQQGDH-촉매 산화로 환원된 PQQ 의 양을 측정하여 정량할 수 있다. 적당한 발색 시약에는 예를 들어, PMS (페나진 메토술페이트)-DCIP (2,6-디클로로페놀린도페놀), 포타슘 페리시아나이드 및 페로센이 포함된다.

열 안정성

본 발명의 개변형 PQQGDH 의 열 안정성은 관심 효소를 고온 (예를 들어, 55℃) 에서 인큐베이션하고, 일정한 간격마다 일부분을 표본채집하여 효소 활성을 분석하여 시간 경과에 따른 효소 활성의 저하를 모니터링함으로써 평가할 수 있다. 전형적으로, 효소의 열 안정성은 열 실활 반감기, 즉, 효소 활성이 50% 로 감소되는데 필요한 시간 (t_1/2) 으로 표현된다. 이와는 달리, 열 안정성은 또한 주어진 기간 동안 효소를 열 처리한 후의 잔존 효소 활성으로 표현할 수도 있다 (열 처리 후의 활성 대 열 처리 전의 활성의 비).

본 발명의 개변형 PQQGDH 는 야생형 PQQGDH 에 비해 더 높은 열 안정성을 특징으로 한다. 따라서, 제조/정제 중에 더 적게 불활성화되면서 고수율로 효소를 제조할 수 있으며; 용액 중의 높은 안정성으로 인해 효소 보관이 용이하고; 더 적게 불활성화되면서 분석 키트나 효소 센서를 제조하는데 효소를 사용할 수 있고; 높은 열 안정성으로 인해 효소로 제조된 분석 키트 또는 효소 센서가 뛰어난 보관성을 갖는다는 이점을 갖는다.

글루코스 분석 키트

본 발명은 또한 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 를 함유하는 글루코스 분석 키트에 관한 것이다. 본 발명의 글루코스 분석 키트에는 분석을 1 회 이상 수행하기 충분한 양의 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 가 함유된다. 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 에 덧붙여, 키트에는 전형적으로 분석에 필요한 완충제, 매개체, 보정 곡선을 만들기 위한 표준 글루코스 용액 및 사용설명서가 포함된다. 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 는 동결건조 시약 또는 적당한 방부 용액 중의 용액과 같은 다양한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 는 바람직하게는 완전효소의 형태로 제공되지만, 또한 아포효소로서 제공되어 사용전에 완전효소로 전환될 수 있다.

글루코스 센서

본 발명은 또한 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 를 이용한 글루코스 센서에 관한 것이다. 적당한 전극에는 본 발명의 효소가, 교차결합제를 이용하여; 중합체 매트릭스에 봉입되어; 투석막에 코팅되어; 광-교차결합성 중합체, 유전성 중합체 또는 산화환원 중합체를 이용하여; 효소를 중합체 중에 고정시키거나, 페로센 또는 그의 유도체를 함유하는 전자 매개체로 전극상에 흡착시키거나; 또는 이들의 임의 조합으로 고정화된 탄소, 금, 백금 등의 전극이 포함된다. 본 발명의 개변형 PQQGDH 는 바람직하게는 전극 상에 완전효소의 형태로 고정화되지만, 아포효소로서 고정화되고 PQQ 를 분리층 또는 용액 중에 제공할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 개변형 PQQGDH 는 글루타르알데히드로 탄소 전극 상에 고정화된 후, 아민 함유 시약을 처리하여 글루타르알데히드를 차단시킨다.

글루코스 농도는 하기와 같이 측정할 수 있다. PQQ, CaCl₂및 매개체를 완충제를 함유하는 항온 셀에 첨가하고 일정 온도에서 유지하였다. 적당한 매개체에는, 예를 들어, 포타슘 페리시아나이드 및 페나진 메토술페이트가 포함된다. 본 발명의 개변형 PQQGDH 가 고정화된 전극을 대극 (예로, 백금 전극) 및 참조 전극 (예로, Ag/AgCl 전극) 과 함께 작용 전극으로 사용하였다. 일정한 전압을 탄소 전극에 주어 정상 전류에 도달한 후, 글루코스 함유 시료를 첨가하여 전류의 증가를 측정하였다. 시료 중 글루코스 농도는 표준 농도의 글루코스 용액으로 만들어진 보정 곡선으로부터 계산할 수 있다.

본원에 언급된 모든 특허 및 명세서의 개시는 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다. 본 특허 출원은 그 개시 전체가 본원에 참고문헌으로 포함되는 일본 특허 출원 1999-101143 및 2000-9152 를 우선권으로 한다.

하기 실시예로 본 발명이 보다 구체적으로 설명되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

변이 PQQGDH 유전자 라이브러리의 구축 및 검색:

아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래 PQQGDH 를 코딩하는 구조 유전자를 벡터 pTrc99A (Pharmacia) 의 다중클로닝 부위내로 삽입하여 플라스미드 pGB2 를 수득하였다 (도 1). 상기 플라스미드를 주형으로 사용하여 에러가 생기기 쉬운 PCR 로 코딩 부위내에 랜덤 돌연변이를 도입하였다. PCR 반응은 94℃ 3 분; 94℃ 3 분, 50℃ 2 분 및 72℃ 2 분으로 30 사이클; 72℃ 2 분, 마지막으로 72℃ 10 분의 조건 하에서, 표 1 에 나타낸 조성을 갖는 용액 중에서 수행하였다.

TaqDNA 폴리머라아제 (5U/㎕)	0.5 ㎕
주형 DNA	1.0 ㎕
전방 프라이머 ABF	4.0 ㎕
후방 프라이머 ABF	4.0 ㎕
10 x Taq 폴리머라아제 완충제	10.0 ㎕
1M β-머캅토에탄올	1.0 ㎕
DMSO	10.0 ㎕
5 mM MnCl₂	10.0 ㎕
10 mM dGTP	2.0 ㎕
2 mM dATP	2.0 ㎕
10 mM dCTP	2.0 ㎕
10 mM dTTP	2.0 ㎕
H₂O	51.5 ㎕
	100.0 ㎕

생성 변이 수용성 PQQGDH 라이브러리로 이. 콜라이를 형질전환시키고, 형성된 각 콜로니를 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 60℃ 에서 약 30 분 동안 가열한 후, 글루코스 및 PMS-DCIP 를 첨가하고 잔여 PQQGDH 활성을 시각적으로 평가하였다. 열 처리 후에도 PQQGDH 활성을 나타내는 다수의 클론을 수득하였다.

이러한 클론 중 하나를 무작위로 선택하여 뉴클레오티드 서열을 분석한 결과, 세린 231 이 시스테인으로 바뀌었음을 보였다.

실시예 2

개변형 PQQGDH 유전자의 구축:

서열번호 2 에 나타낸 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래 PQQGDH 의 구조 유전자를 기준으로, 플라스미드 pGB2 를 이용하여 도 2 에 나타낸 바와 같이 표준 방법에 따른 위치 특이적 변이화에 의해 세린 231, 글루타민 209, 아스파테이트 420 또는 알라닌 421 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 주어진 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었다. 표 2 는 변이화에 사용된 합성 올리고뉴클레오티드 표적 프라이머의 서열을 나타낸다. 표 2 에서, 예를 들어, "S231D" 는 세린 231 이 아스파테이트로 치환됨을 뜻한다.

S231D	5' -C CTT TGG AAT ATC TCC ATC AAG ATT TAA GC- 3'
S231H	5' -C CTT TGG AAT ATG TCC ATC AAG ATT TAA GC- 3'
S231K	5' -C CTT TGG AAT TTT TCC ATC AAG ATT TAA GC- 3'
S231L	5' -C CTT TGG AAT CAT TCC ATC AAG ATT TAA GC- 3'
S231M	5' -C CTT TGG AAT AGT TCC ATC AAG ATT TAA GC- 3'
S231N	5' -C CTT TGG AAT ATT TCC ATC AAG ATT TAA GC- 3'
I278F	5' -C AAT GAG GTT GAA TTC ATC GTC AGA G- 3'
Q209K	5' -C ACC ATT CAG TTC TTT TTG AGT TGG C- 3'
E210K	5' -C ACC ATT CAG TTT TTG TTG AGT TGG C- 3'
D420K	5' -A CAT CGG TAC AGC TTT ATC ATA AGT AG- 3'
A421D	5' -A CAT CGG TAC ATC GTC ATC ATA AGT AG- 3'

아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래 PQQGDH 를 코딩하는 유전자의 일부를 포함하는 KpnI-HindIII 단편을 벡터 플라스미드 pKF18k (Takara Shuzo Co., Ltd.) 내에 삽입하여 주형으로 사용하였다. 상기 주형의 50 fmol, Mutan^TM-Express Km Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) 에 들어있는 선별 프라이머 5 pmol 및 인산화된 표적 프라이머 50 pmol 을 키트에 들어있는 총 부피의 1/10 과 동일한 양 (20 ㎕) 의 어닐링 완충제와 함께 혼합하고, 혼합물을 100℃ 에서 3 분 동안 가열하여 플라스미드를 1 본쇄로 변성시켰다. 선별 프라이머는 pKF18k 의 카나마이신 내성 유전자 상의 이중 앰버 변이를 억제하는데 작용한다. 혼합물을 얼음 상에 5 분간 놔두어 프라이머를 어닐링시켰다. 상기 혼합물에 키트에 들어있는 증폭 완충제 3 ㎕, T4 DNA 리가아제 1 ㎕, T4 DNA 폴리머라아제 1 ㎕ 및 멸균수 5 ㎕ 을 첨가하여 상보쇄를 합성하였다.

합성쇄를 DNA 미스매치 보수-결핍주 이. 콜라이 BMH71-18mutS 내로 형질전환시키고 밤새 진탕배양하여 플라스미드를 증폭시켰다.

이어서, 플라스미드 복제물을 배양물에서 추출하여 이. 콜라이 MV1184 내로 형질전환시킨 후, 콜로니에서 추출하였다. 이러한 플라스미드를 서열분석하여, 목적한 변이의 도입을 확인하였다. 이러한 단편들로 플라스미드 pGB2A 상의 야생형 PQQGDH 를 코딩하는 유전자의 KpnI-HindIII 단편을 치환하여 개변형 PQQGDH 의 유전자를 구축하였다.

실시예 3

개변형 효소의 제조:

야생형 또는 각각의 개변형 PQQGDH 를 코딩하는 유전자를 이. 콜라이 발현 벡터 pTrc99A (Pharmacia) 의 멀티클로닝 부위에 삽입하고, 생성 플라스미드를 이. 콜라이 주 DH5α내로 형질전환시켰다. 형질전환체를 사카구치 (Sakaguchi) 플라스크 내 L 배지 (암피실린 50 ㎍/ml 함유) 450 ml 중에서 37℃ 에서 밤새 진탕배양하고, 1 mM CaCl₂및 500 μM PQQ 를 함유하는 L 배지 7 ℓ에 접종하였다. 배양 개시 약 3 시간 후, 이소프로필 티오갈락토시드를 최종 농도 0.3 mM 로 첨가하고, 배양을 1.5 시간 더 지속하였다. 배양 세포를 원심분리 (5,000 x g, 10 분, 4℃) 에 의해 배지에서 회수하고, 0.85% NaCl 용액으로 두 번 세척하였다. 수집한 세포를 프렌치 프레스로 파열시키고, 원심분리 (10,000 x g, 15 분, 4℃) 하여 파열되지 않은 세포를 제거하였다. 상청액을 초원심분리 (160,500 x g (40,000 r.p.m.), 90 분, 4℃) 하여 수용성 분획을 얻고, 조효소 시료로 후속 실시예에 사용하였다.

이렇게 수득한 수용성 분획을 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0) 에 대해 밤새 투석하였다. 투석된 시료를 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0) 로 평형화시킨 양이온 크로마토그래피 칼럼 TSKgel CM-TOYOPEARL 650M (Tosoh Corp.) 상에 흡착시켰다. 상기 칼럼을 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0) 750 ml 로 세척한 후, 5 ml/분의 유속으로 0-0.2 M NaCl 함유 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0) 로 효소를 용리시켰다. GDH 활성을 갖는 분획을 회수하여, 10 mM MOPS-NaOH 완충제 (pH 7.0) 에 대해 밤새 투석하였다. 이렇게 해서, 전기영동상으로 균일한 개변형 PQQGDH 단백질을 수득하였다. 이를 하기 실시예에서 정제된 효소 시료로 사용하였다.

실시예 4

효소 활성의 분석:

10 mM MOPS-NaOH 완충제 (pH 7.0) 중 PMS (페나진 메토술페이트)-DCIP (2,6-디클로로페놀린도페놀) 을 이용하여, 분광계로 600 nm 에서 DCIP 의 흡광도 변화를 모니터링하고, 효소의 반응율을 흡광도의 감소율로 표현하여 효소 활성을 분석하였다. 1 분 당 DCIP 1 μmol 을 환원시키는 효소 활성이 1 U 이었다. pH 7.0 에서 DCIP 의 몰 흡량 계수는 16.3 mM^-1이었다.

실시예 5

조효소 시료의 열 안정성 평가:

실시예 3 에서 수득한 개변형 PQQGDH 및 야생형의 조효소 시료 각각을 1 시간 이상 동안 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 완전 효소로 전환시킨 후,55℃ 에서 인큐베이션하였다. 일부분을 일정 간격마다 표본채집하여 얼음 상에서 급속 냉각하였다. 이러한 시료를 실시예 4 의 방법에 의해 효소 활성에 대해 분석하여, 활성을 50% 로 감소시키는데 필요한 시간 (t_1/2) 을 산정하였다.

결과를 표 3 에 나타낸다.

	t_1/2(분)
야생형	10
S231K	95
S231L	16
S231D	25
S231C	50
S231M	14
S231H	15
S231N	50
I278F	25
Q209K	40
E210K	40
D420K	20
A421D	80

본 발명의 모든 개변형 PQQGDH 는 55℃ 에서 야생형 PQQGDH 보다 긴 열 실활 반감기를 가지며, 야생형 PQQGDH 보다 높은 열 안정성을 가짐을 나타낸다.

실시예 6

정제 효소 시료의 열 안정성 평가:

실시예 3 에서 수득한 개변형 효소 S231K 및 야생형 효소의 정제 시료에 대해 실시예 5 에서와 동일한 방식으로 55℃ 에서의 열 실활 반감기를 측정하였다. 야생형 효소 및 개변형 효소 S231K 의 정제 시료는 각각, 5 분 및 41 분의 반감기를 가졌다.

이어서, 실시예 3 에서 수득한 개변형 효소 S231K 및 야생형 효소의 정제 시료 각각을 1 시간 이상 동안 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 완전 효소로 전환시켰다. 다음에, 각 시료를 주어진 온도에서, 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂를 함유하는 10 mM MOPS 완충제 (pH 7.0) 중에서 10 분 동안 인큐베이션한 후, 얼음 상에서 급속 냉각하였다. 이러한 시료를 실시예 4 의 방법에 의해 효소 활성에 대해 분석하여, 열 처리 전의 활성에 대한 잔여 활성을 측정하였다.

결과를 도 3 에 나타내었다. 개변형 효소 S231K 는 40-62.5℃ 의 다양한 온도에서 야생형 효소보다 높은 활성을 가졌다.

실시예 7

효소 활성의 평가:

실시예 3 에서 수득한 개변형 효소 S231K 의 조효소 시료를 1 시간 이상 동안 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 완전 효소로 전환시켰다. 187 ㎕ 분을 활성화제 (6 mM DCIP 48㎕, 600 mM PMS 8 ㎕ 및 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0) 16 ㎕ 로 제조) 3 ㎕ 및 다양한 농도의 글루코스 용액 10 ㎕ 과 배합하여, 실시예 4 에 나타낸 방법에 의해 실온에서 효소 활성을 분석하였다. 기질 농도 대 효소 활성을 플로팅하여, Km 및 Vmax 를 결정하였다. S231K 변종은 글루코스에 대해, 약 20 mM 의 Km 값 및 3300 U/mg 의 Vmax 값을 가졌다. 현재 보고된 글루코스에 대한 야생형 PQQGDH 의 Km 값은 측정 조건에 따라 2500-7000 U/mg 의 Vmax 값과 함께, 약 20 mM 이었다. 이러한 결과는 개변형 PQQGDH S231K 가 야생형 PQQGDH 에 비교되는 높은 활성을 가짐을 나타낸다.

실시예 8

기질 특이성의 평가:

다양한 개변형 효소의 조 시료를 기질 특이성에 대해 시험하였다. 시험된 기질은 글루코스, 2-데옥시-D-글루코스, 만노스, 알로스, 3-o-메틸-D-글루코스, 갈락토스, 자일로스, 락토스 및 말토스였고, 각 시료를 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 30 분 동안 각각의 기질 20 mM 과 함께 인큐베이션하여, 실시예 7 에서와 동일한 방식으로, 글루코스 활성에 대한 상대 활성을 측정하여 효소 활성을 분석하였다. 도 4 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모든 개변형 효소들은 야생형 효소와 유사한 기질 특이성을 나타내었다.

실시예 9

글루코스 분석:

개변형 PQQGDH 를 글루코스의 분석에 사용하였다. 개변형 효소 S231K 를 1 시간 이상 동안 1 μM PQQ 및 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 완전 효소로 전환시키고, 5 μM PQQ 및 10 mM CaCl₂뿐만 아니라 다양한 농도의 글루코스의 존재 하에서, 600 nm 에서 DCIP 의 흡광도 변화를 기준으로 하는 실시예 4 에 기재된 방법에 의해 효소 활성을 분석하였다. 도 5 에 나타낸 바와 같이, 개변형 PQQGDH S231K 는 5 mM - 50 mM 범위의 글루코스 분석에 사용할 수 있다.

실시예 10

효소 센서의 제조 및 평가:

개변형 효소 S231K 의 5 유닛을 카본 페이스트 20 mg 과 함께 동결건조하였다. 완전 혼합 후, 카본 페이스트 약 40 mg 으로 미리 채워지고 여과지 상에서 광을 낸 카본 페이스트 전극의 표면 상에만 혼합물을 적용하였다. 상기 전극을 1% 글루타르알데히드를 함유하는 10 mM MOPS 완충제 (pH 7.0) 중에서 실온에서 30 분 동안, 이어서 20 mM 라이신을 함유하는 10 mM MOPS 완충제 (pH 7.0) 중에서 실온에서 20 분 동안 처리하여 글루타르알데히드를 차단시켰다. 전극을 실온에서 1 시간 이상 동안 10 mM MOPS 완충제 (pH 7.0) 중에서 평형화시킨 후, 4℃ 에서 보관하였다.

이렇게 제조된 효소 센서를 사용하여 글루코스 농도를 측정하였다. 도 6 은 수득된 보정 곡선을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 개변형 PQQGDH 가 그 위에 고정화된 효소 센서는 1 mM - 12 mM 범위의 글루코스 분석에 사용할 수 있다.

본 발명의 개변형 PQQGDH 는 뛰어난 열 안정성을 가져서, 제조/정제 중에 더 적게 불활성화되면서 고수율로 효소를 제조할 수 있으며; 용액 중의 높은 안정성으로 인해 효소 보관이 용이하고; 실활이 적으면서 분석 키트나 효소 센서를 제조하는데 효소를 사용할 수 있고; 높은 열 안정성으로 인해 효소로 제조된 분석 키트 또는 효소 센서가 뛰어난 보관성을 갖는다는 이점을 제공할 것으로 기대된다.

Claims

피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 유래의 수용성 PQQGDH의 세린 231 에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 글루타민 209 에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 글루타메이트 210 에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 아스파테이트 420 에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 유래의 수용성 PQQGDH의 알라닌 421 에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 개변형 글루코스 탈수소효소.
피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 잔기 48-53, 60-62, 69-71, 79-82, 91-101, 110-115, 127-135, 147-150, 161-169, 177-179, 186-221, 227-244, 250-255, 261-263, 271-275, 282-343, 349-377, 382-393, 400-403, 412-421, 427-432, 438-441 및 449-468에 의해 정의되는 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있으며, 아시네토박터 칼코아세티쿠스로부터 유래된 수용성 글루코스 탈수소효소의 열안정성보다 더 큰 열안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제3항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 잔기 227-244에 의해 정의되는 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제7항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 세린 231이 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제3항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 잔기 186-221에 의해 정의되는 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제9항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 글루타민 209에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제9항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 글루타메이트 210에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제3항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 잔기 412-421에 의해 정의되는 영역에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제12항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 아스파테이트 420에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
제12항에 있어서, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열 중 알라닌 421에 상응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 개변형 글루코스 탈수소효소.
하기 서열:

Asn Leu Asp Gly Xaa231 Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser

[여기서, Xaa231은 Ser 이외의 천연 아미노산 잔기를 나타냄];

을 포함하며, 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소.
하기 서열:

Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Xaa2O9 Xaa2lO Leu Asn Gly Lys Asp Tyr His Thr Tyr Met Gly

[여기서, Xaa2O9 및 Xaa2lO은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단, Xaa2O9가 Gln를 나타내는 경우, Xaa210은 Glu를 나타내지 않음];

을 포함하며, 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소.
하기 서열:

Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Xaa420 Xaa421

[여기서, Xaa420 및 Xaa421은 임의의 천연 아미노산 잔기를 나타내되, 단, Xaa420 이 Asp를 나타내는 경우, Xaa421 은 Ala를 나타내지 않음]

을 포함하며, 피롤로-퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 개변형 글루코스 탈수소효소를 코딩하는 유전자.
제18항의 유전자를 포함하는 벡터.
제18항의 유전자를 포함하는 형질전환체.
제20항에 있어서, 유전자가 주 염색체 내로 통합되어 있는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 개변형 글루코스 탈수소효소를 포함하는 글루코스 분석 키트.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 개변형 글루코스 탈수소효소를 포함하는 글루코스 센서.