KR20160103994A

KR20160103994A - 트랜스아미나제 및 그 응용

Info

Publication number: KR20160103994A
Application number: KR1020167017037A
Authority: KR
Inventors: 하오 홍; 펭 가오; 얀준 리; 얀 장; 샤오허 리
Original assignee: 아심켐 래보러토리즈 (톈진) 컴퍼니, 리미티드; 지린 아심켐 래보러토리즈 컴퍼니, 리미티드; 아심켐 래보러토리즈 (푸신) 컴퍼니, 리미티드; 아심켐 라이프 사이언스 (톈진) 컴퍼니, 리미티드; 톈진 아심켐 파마슈티컬 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2016-09-02
Also published as: CN104328094A; JP2016537992A; CN104328094B; EP3075847A1; EP3075847B1; US20170073713A1; EP3075847A4; WO2015078267A1; KR101910259B1; JP6367944B2; ES2734579T3; US10131926B2

Abstract

본 발명은 트랜스아미나제 및 그 응용을 제공한다. 상기 트랜스아미나제는 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열 혹은 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열과 최소한 80%의 동일성을 구비하고 혹은 하나 혹은 다수의 아미노산이 치환, 결핍 혹은 첨가되었고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 구비하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 고도의 입체선택성이란 그 중의 한 입체이성질체의 포함량이 다른 하나의 최소한 약 1.1배인 것을 말한다. 상기 트랜스아미나제에 의하면 키랄 순도가 높은 R구조 형태 키랄 아민을 합성시킬 수 있고 키랄 아민의 산업화 생산에 적용된다.

Description

트랜스아미나제 및 그 응용{TRANSAMINASE AND USE THEREOF}

본 발명은 키랄(chiral) 화합물의 합성 분야에 관한 것으로, 특히 트랜스아미나제(transaminase) 및 그 응용에 관한 것이다.

키랄 아민은 자연계에 널리 이용되었고 많은 중요한 생물 활성 분자의 구성유닛으로 천연 산물 및 키랄 약물 합성 시의 중요한 중간체이며 많은 키랄 아민은 중요한 키랄 보조제와 키랄 분리약제로도 사용되고 있다. 따라서 키랄 아민 화합물의 제조는 중요한 경제적 의미를 가지고 있다.

현재, 키랄 아민의 제조는 주로 화학 환원 방법에 의하여 프로키랄 케톤을 이용하여 광학 활성을 가지는 아민을 제조한다. Pd/C 및 퀴닌(quinine)의 촉매 작용에 의하여 프로키랄 케톤이 폼산(formic acid) 및 무기암모늄/유기 일차 아민과 반응하여 키랄 아민을 생성한다. 기타 연구자들은 루테늄(ruthenium) 배합물을 촉매로 하여 프로키랄 케톤의 비대칭 아민화 환원을 수행하여 키랄 아민을 얻고 있는데(Renat Kadyrov et al. Highly Enantioselective Hydrogen-Transfer Reductive Amination: Catalytic Asymmetric Synthesis of Primary Amines. Angewandte Chemie International Edition. 2003,42(44), 제5472~5474페이지), 이러한 반응에 있어서 금속 촉매는 아주 중요한 요소이고 금속 촉매에 대한 요구가 엄격하고 반응은 고압 조건하에서 수행되어야 하며 작업 기계에 대한 요구도 높고 이와 동시에 금속 촉매의 가격이 높고 환경에 대한 오염도 크다(Ohkuma T et al. Trans-RuH(eta1-BH4)(binap)(1, 2-diamine):a catalyst for asymmetric hydrogenation of simple ketones under base-free conditions. Journal of the American Chemical Society. 2002, 124(23), 제6508~6509페이지).

아미노전이효소(aminotransferase)는 트랜스아미나제로도 불리우고 하나의 아미노기와 카보닐기(carbonyl)의 교환과정에서 촉매 작용을 일으킨다. ω-트랜스아미나제는 트랜스아미나제중의 하나이지만 약간의 차이가 있다. ω-트랜스아미나제는 제１유의 효소를 말하고, 촉매 작용을 일으키는 아미노기 전이 반응중의 반응 기재 혹은 산물에 α-아미노산(amino acid)이 포함되지 않으면 그 효소를 ω-트랜스아미나제로 부를 수 있다. ω-트랜스아미나제는 케톤계 화합물을 원료로 하고 입체선택성의 아미노기 전이 작용에 의하여 키랄 아민을 효율적으로 생산할 수 있다. 기재의 가격이 상대적으로 저렴하고 산물의 순도가 높은 특징을 구비함으로 연구자들의 주목을 받고 있다. 그 잠재력을 충분히 발휘시켜 키랄 아민의 산업화 생산에 보급화할 것을 기대하고 있지만 그 효소의 연구 및 응용은 아직 적다.

키랄 아민 화합물 제조의 수요를 만족시키기 위하여 고도의 입체선택성을 구비한 R구조 형태 촉매 활성의 ω-트랜스아미나제에 대한 수요가 이 분야에 여전히 있다.

본 발명은 키랄 아민의 산업화 생산 수요를 만족시킬 수 있는 트랜스아미나제 및 그 응용을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 실현하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따르면, 트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체를 제공하는데, 그 트랜스아미나제의 아미노산 서열은 하기 서열(sequence)로부터 선택되는 서열을 포함한다: a) 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열, b) 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열과 최소한 80%의 동일성을 구비하고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 구비하는 아미노산 서열, 여기서, 아미노산 서열은 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열(nucleotide sequence)에 의하여 부호화된 아미노산 서열이 아니고, c) 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열에 하나 혹은 다수의 아미노산을 치환, 결핍 혹은 첨가함으로써 서열번호 2로부터 파생되었고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 구비하는 단백질, 여기서, 아미노산 서열은 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의하여 부호화된 아미노산 서열이 아니고, 그중 고도의 입체선택성이란 그 중의 한 입체이성질체의 포함량이 다른 하나의 최소한 약 1.1배인 것을 말한다.

그리고, 상기 트랜스아미나제의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 중의 제38위의 류신(leucine)을 아이소류신(isoleucine)으로 치환시킨 아미노산 서열이다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면 상기 트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드를 제공한다.

그리고, 상기 뉴클레오타이드의 서열은 하기 서열로부터 선택되는 서열을 포함한다: a) 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 최소한 80%의 동일성을 구비하고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드 서열, 여기서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 아니고, c) 엄격한 조건하에서 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 교잡하고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드 서열, 여기서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 아니고, 그중, 고도의 입체선택성이란 그 중의 한 입체이성질체의 포함량이 다른 하나의 최소한 약 1.1배인 것을 말한다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면 상기한 뉴클레오타이드가 유효하게 연결되어 있는 재조합 벡터(recombinant vector)를 제공한다.

그리고, 재조합 벡터는 pET22b-CM32 혹은 pET22b-CM33이다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면 상기한 재조합 벡터가 전환 혹은 트랜스펙팅된(transpected) 숙주세포(host cell)를 제공한다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면 케톤계(ketone) 화합물과, 상기 트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체와, 피리독살인산(pyridoxal phosphate)과, 아미노기 공여체(amino donor)를 반응계에서 반응시켜 키랄 아민을 얻는 키랄 아민의 합성 방법을 제공한다.

그리고, 상기 케톤계 화합물은

이고, 여기서, R₁과 R₂는 각각 독립적으로 C₁~C₈ 알킬기, C₅~C₁₀ 사이클로알킬기(cycloalkyl), C₅~C₁₀아릴기(aryl) 혹은 C₅~C₁₀ 헤테로아릴기(heteroaryl)이고, 혹은 R₁과 R₂는 카보닐기(carbonyl group)의 탄소와 협력하여 C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭(heterocyclic radical), C₅~C₁₀ 탄소환기(carbocyclic radical) 혹은 C₅~C₁₀ 헤테로아릴기를 형성하고, C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭기와 C₅~C₁₀ 헤테로아릴기 중의 헤테로원자는 각각 독립적으로 질소, 산소, 황으로부터 선택되는 최소한 한가지이며, C₅~C₁₀ 아릴기 중의 아릴기, C₅~C₁₀ 헤테로아릴기 중의 헤테로아릴기, C₅~C₁₀ 탄소환기 중의 탄소환기 혹은 C₅~C₁₀헤테로사이클릭기 중의 헤테로사이클릭기는 각각 독립적으로 치환되지 않았거나 혹은 할로겐(halogen), 알콕시(alkoxy)기 혹은 알킬기 중의 최소한 하나에 의하여 치환된 것이고, 케톤계 화합물

이

,

혹은

로부터 선택되는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 반응계에 용해촉진제(dissolution promoter)를 더 포함하고, 용해촉진제는 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 혹은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)이고, 여기서, 폴리에틸렌글리콜이 PEG-400인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 C₁~C₈ 알킬기는 C₁~C₈ 선형 알킬기이고, C₅~C₁₀ 헤테로아릴기는 피리딘기이(pyridine group)며, 알콕시기(alkoxy)는 C₁~C₆ 알콕시기이고, C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭기 중의 헤테로사이클릭기는 피페리딘(piperidine)이며, C₅~C₁₀ 아릴기 중의 아릴기, C₅~C₁₀ 헤테로아릴기 중의 헤테로아릴기, C₅~C₁₀ 탄소환기 중의 탄소환기 혹은 C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭기 중의 헤테로사이클릭기의 치환기는 각각 독립적으로 C₁~C₆ 선형 알킬기, C₁~C₆ 알콕시기이고, 아미노기 공여체는 아이소프로필 아민(isopropylamine) 혹은 D-알라닌(D-alanine)이다.

본 발명의 기술방안을 응용하면 고도의 입체선택성을 구비하는 R형 ω-트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체를 이용함으로써 키랄 순도가 높은 R구조 형태의 키랄 아민을 합성할 수 있고 키랄 아민의 산업화 생산에 응용될 수 있다.

본 출원의 일부분을 구성하는 도면은 본 발명을 더욱 이해시키기 위한 것이고 본 발명에 예시한 실시예 및 그 설명은 본 발명을 해석하는 것으로 본 발명을 부당하게 한정하는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 기재된 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)와 하이포모나스 넵투늄(Hyphomonas neptunium) 유래의 트랜스아미나제를 키랄 아민의 합성에 응용한 경우의 화학 반응을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시형태에 기재된 아스퍼질러스 테레우스와 하이포모나스 넵투늄 유래의 트랜스아미나제를 키랄 아민의 합성에 응용한 경우의 화학 반응 방정식이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 중의 효소 소화(enzyme digestion) 감정 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 중의 돌연변이 유전자가 PCR (Polymerase Chain Reaction) 를 거친 후의 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 4 중의 효소 소화 감정 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 실시예 4 중의 돌연변이 유전자가 PCR를 거친 후의 측정 결과를 나타낸 도이다.

여기서, 서로 충돌되지 않으면 본 발명 중의 실시예 및 실시예에 기재된 특징을 상호 결합할 수 있다. 아래 도면을 참조하고 실시예를 결합하여 본 발명을 설명한다.

정의

용어 "선택적/임의" 혹은 "선택적으로/임의로"는 그 다음에 기재된 사건 혹은 상황이 발생할 가능성이 있고 발생하지 않을 가능성도 있음을 표시하고, 이러한 기재는 해당 사건 혹은 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, 하기 정의에 의하여 "선택적으로 치환된 알킬기"는 "치환되지 않은 알킬기"(치환기에 의하여 치환되지 않은 알킬기) 혹은 "치환된 알킬기"(치환기에 의하여 치환된 알킬기)를 말한다.

본 출원서에 기재된 C1~Cn는 C1~C2, C1~C3, ……C1~Cn를 포함한다. 예를 들어, 상기 "C1~C4"기는 그 부분에 1~4개 탄소 원자를 포함함을 말하고, 즉 기(基)가 1개 탄소 원자, 2개 탄소 원자, 3개 탄소 원자 혹은 4개 탄소 원자를 포함함을 표시한다.

본 출원서에 있어서 단독 혹은 조합하여 사용하는 용어 "알킬기(alkyl)"는 선택적으로 치환된 선형 혹은 선택적으로 치환된 분기 지방족 탄화 수소계(aliphatic hydrocarbon)를 말한다. 본 출원서 중의 "알킬기"는 1~약 20개 탄소 원자를 포함하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 1~약 10개 탄소 원자를 구비하고, 1~약 8개 탄소 원자, 혹은 1~약 6개 탄소 원자, 혹은 1~약 4개 탄소 원자 혹은 1~약 3개 탄소 원자를 포함한다. 본 출원서에 있어서 단독 혹은 조합하여 사용하는 용어 "알콕시기"는 알킬기 에터기(alkyl ether group) (O-알킬기)를 말하고, 알콕시기의 비 한정성 실시예는 메톡실기(methoxy), 에톡시기(ethoxy), n-프로폭시기(n-propoxy), 아이소프로폭시기(isopropoxy), n-부톡시기(n-butoxy), 아이소부톡시기(isobutoxy), sec-부톡시기, tert-부톡시기 등을 포함한다.

본 출원서에 있어서 단독 혹은 조합되어 사용되는 용어 "할로겐화(halogenated)" 혹은 "할로겐 치환(halogen substituted)"은 선택적으로 치환된 기(예를 들어, 알킬기, 알켄일기(alkenyl), 알킨일기(alkynyl))의 하나 혹은 다수의 수소 원자가 불소, 염소, 브롬, 요오드 원자 혹은 그 조합으로 치환된 것을 말한다.

본 출원서에 있어서 단독 혹은 조합되어 사용되는 용어 "방향기/아릴기"는 선택적으로 치환된 방향히드로카빌기(aromatic hydrocarbyl)를 말하고, 6개~약 20개 환형 탄소 원자, 예를 들어 6~12개 혹은 6~10개 환형 탄소 원자를 가진다. 융합 방향족 환 혹은 비 융합 방향족 환일 수 있다.

본 출원서에 있어서 단독 혹은 조합되어 사용되는 용어 "헤테로아릴기"는 임의로 치환된 일가 헤테로아릴기를 말하고, 5~20개 골격이 환형인 원자, 예를 들어 5~12개 혹은 5~10개 골격이 환형인 원자를 가지고, 여기서, 하나 혹은 다수(예를 들어, 1~4개, 1~3개, 1~2개)의 환형 원자는 헤테로원자이고 상기 헤테로원자는 단독으로 산소, 질소, 황, 인, 규소, 셀렌, 주석으로부터 선택되는 헤테로원자이지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 기(基)의 환은 두개 인접한 O 혹은 S 원자는 포함하지 않는다. 헤테로아릴기는 1환식 헤테로아릴기((monocyclic heteroaryl)) 혹은 다환식 헤테로아릴기(예를 들어 2환식 헤테로아릴기, 3환식 헤테로아릴기 등)를 포함한다.

본 출원서에 있어서 단독 혹은 조합되어 사용되는 용어 "헤테로 고리(heterocycle)" 혹은 "헤테로사이클릭기(heterocyclic radical)"는 비 방향족 헤테로 고리를 말하고, 헤테로사이클로 알킬 기(heterocycloalkyl)와 헤테로사이클로 알켄일기(heterocycloalkenyl를 포함한다. 여기서, 하나 혹은 다수(예를 들어, 1~4개, 1~3개, 1~2개)의 환형 원자는 헤테로원자이고 예를 들어 산소, 질소 혹은 황 원자이다. 헤테로사이클릭은 1환식 헤테로사이클릭(monoheterocyclic radical) (헤테로사이클릭가 하나의 환을 구비함) 혹은 다환식 헤테로사이클릭(예를 들어, 2환식 헤테로사이클릭(헤테로사이클릭가 2개 환을 구비함), 3환식 헤테로사이클릭 등)를 포함한다.

본 출원서에 있어서 단독 혹은 조합되어 사용되는 용어 "탄소환기"는 비 방향족의 탄소환을 말하고, 사이클로알킬(cycloalkyl)와 사이클로알켄일(cycloalkenyl)기를 포함한다. 사이클로알킬는 1환식 사이클로알킬(monocyclic cycloalkyl) 혹은 다환식 사이클로알킬(polycyclic cycloalkyl)(예를 들어, 2, 3 혹은 4개 환을 구비하고, 예를 들어 2환식 사이클로알킬이다(dicyclic cycloalkyl))일 수 있고, 스파이럴 링(spiral ring) 혹은 브릿지 링(bridge ring)일 수 있다. 탄소환기는 3~20개 탄소 원자를 가질 수 있고 예를 들어 3~15개 환형 탄소 원자 혹은 3~10개 환형 탄소 원자 혹은 3~6개 환형 탄소 원자를 가질 수 있으며, 0, 1, 2 혹은 3개 이중결합 및/혹은 0, 1 혹은 2개 3중결합을 구비할 수 있다. 예를 들어, 3~8개 혹은 3~6개 환형 탄소 원자의 사이클로알킬을 구비한다.

"할로겐"은 불소, 염소, 브롬, 요오드를 말하고, 불소, 염소, 브롬을 말하는 것이 바람직하다. 시안기(cyano)는 "-CN"를 말하고 수산기는 "-OH"를 말하며 머캅토기(mercapto)는 "-SH"를 말하고 아미노기는 "-NH₂"를 말한다.

용어 "치환된"은 한 특정된 원자의 하나 혹은 그 이상의 수소가 지정된 기에 의하여 대체된 것을 말하고, 지정된 원자의 정상적인 원자가가 현재 상황에서 초과하지 않았으면 치환 후의 결과는 안정적인 화합물이다.

배경기술부분에 기재한 바와 같이 기존 기술에 있어서 ω-트랜스아미나제에는 여전히 키랄 아민 화합물 제조의 수요를 만족시킬 수 없는 문제가 존재하고 이러한 상황을 개선하기 위하여 본 발명에 있어서 R형 ω-트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체를 제공하는데, 이 R형 ω-트랜스아미나제의 아미노산 서열은 a) 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열, b) 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열과 최소한 80%의 동일성을 구비하고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 구비하는 아미노산 서열, 여기서, 아미노산 서열은 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의하여 부호화된 아미노산 서열이 아니고, c) 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열에 하나 혹은 다수의 아미노산가 치환, 결핍 혹은 첨가되었고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 구비하여 서열번호 2 혹은 4로부터 파생된의 단백질로부터 선택되는 서열을 포함하고, 고도의 입체선택성이란 그 중의 한 입체이성질체의 포함량이 다른 하나의 최소한 약 1.1배인 것을 말한다.

본 발명의 상기 R형 ω-트랜스아미나제는 고도의 R구조 형태 입체선택성을 구비하는 ω- 트랜스아미나제를 말하고 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 트랜스아미나제는 서열이 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 것과 같은 트랜스아미나제를 말한다. 상기 트랜스아미나제는 본 발명에 있어서 분자 생물학 기술을 이용하여 아스퍼질러스 테레우스와 하이포모나스 넵투늄으로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자 taAT와 taHN을 돌연변이시키고 분자를 개선시켜 트랜스아미나제를 얻는다.

상기 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열과 최소한 80%의 동일성을 구비하고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 구배하는 아미노산 서열이란 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열과 최소한, 예를 들어 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 혹은 99.7%의 동일성을 구비하고 또한 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열이 아닌 서열을 말한다. 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열 중의 트랜스아미나제의 촉매 활성에 핵심적 작용을 일으키는 아미노산 서열을 변화시키지 않고 유지하는 상황하에서 당업자라면 기타 비 활성위(位)의 아미노산 서열을 변경시켜 얻은 트랜스아미나제의 아미노산 서열로 하여금 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열과의 동일성이 최소한 80% 이상에 달하도록 할 수 있다. 이렇게 얻은 트랜스아미나제는 아미노산 서열이 서열번호 2 혹은 4인 트랜스아미나제와 동일한 트랜스아미나제 활성을 구비한다.

동일한 이유로 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열 중의 트랜스아미나제의 촉매 활성에 핵심적 작용을 일으키는 아미노산 서열을 변화시키지 않고 유지하는 상황하에서 상기 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열 중의 아미노산에 하나 혹은 다수의 아미노산의 치환, 결핍 혹은 첨가를 수행하면 서열번호 2 혹은 4로부터 파생된 단백질은 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 트랜스아미나제의 고도의 입체선택성을 유지할 수 있다. 여기서, 치환, 결핍 혹은 첨가를 수행하는 염기성기는 하나 혹은 다수의 염기성기일 수 있고, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 30개 혹은 50개 아미노산일 수 있고 예를 들어 보존 아미노산의 치환을 수행할 수 있고 여기서, 그 아미노산 서열은 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열이 아니다. "보존 아미노산의 대체"란 예를 들어 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr의 조합을 말한다.

여기서, 입체선택성이란 하나의 반응을 통하여 A와 B의 두 입체이성질체를 획득하였을 경우, A의 생산량이 B보다 많을 것을 말한다. 고도의 입체선택성이란 그 중의 한 입체이성질체의 포함량이 다른 하나의 최소한 약 1.1배임을 말하고, 예를 들어 최소한 약 1.2배, 최소한 약 1.3배, 최소한 약 1.4배, 최소한 약 1.5배, 최소한 약 2배, 최소한 약 3배, 최소한 약 4배, 최소한 약 5배, 최소한 약 10배, 최소한 약 15배, 최소한 약 20배, 최소한 약 30배, 최소한 약 40배, 최소한 약 50배, 최소한 약 70배, 최소한 약 90배, 최소한 약 100배일 수 있고 혹은 더욱 높을 수도 있다.

본 발명에 있어서 상기 R형 ω-트랜스아미나제의 수식물은 화학 수식물로, 예를 들어 아크릴화(acylation), 알킬화(alkylation), PEG화 산물(Polyethylene Glycolation)일 수 있고, 이러한 수식물이 상기 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 보류하고 있으면 된다. 상기 기능동등체는 R형ω-트랜스아미나제 활성을 실현할 수 있는 기타 폴리펩타이드(polypeptide) 파편을 말한다. 상기 기능 파편은 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 보류한 단백질 파편을 말한다. 상기 변이체는 하나 혹은 다수(몇 개)의 위치에서 하나 혹은 다수의 아미노산을 변경시킴으로써, 즉 치환, 삽입 및/혹은 결핍을 수행하여 모(parental) 단백질로부터 파생된 폴리펩타이드를 말한다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 있어서, 트랜스아미나제의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 중의 제38위의 류신이 아이소류신으로 치환된 아미노산 서열이고 이러한 성질이 유사한 아미노산의 대체를 통하여 대체된 후의 아미노산 서열을 가지는 트랜스아미나제가 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 구비하는 트랜스아미나제의 활성 및 고도의 입체선택성을 보류한다.

본 발명에서 얻은 상기 트랜스아미나제는 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제를 포함하여 키랄 순도가 높은 R구조 형태의 키랄 아민을 효율적으로 합성할 수 있고 키랄 아민의 합성 산업에 응용될 수 있다. 본 발명에 있어서 스플라이스(splice) 대상과 스프라이스 위치를 최적화하게 선택함으로써 획득되는 새로운 트랜스아미나제 변이체가 단백 접이에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 트랜스아미나제의 활성을 보류하여 높은 트랜스아미나제 활성을 가지게 되고 고도의 입체선택성을 구비하게 된다.

기타 전형적인 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드는 제공하는데 이 뉴클레오타이드에 의하여 상기 R형 ω-트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체의 부호화를 수행한다. 본 발명의 상기한 R형 ω-트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체의 뉴클레오타이드에 의한 부호화 규칙은 통상의 코돈 사용 테이블(codon usage table)에 부합된다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 있어서, 상기 뉴클레오타이드의 서열은 하기 서열로부터 선택되는 서열을 포함한다: a) 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 최소한 80%의 동일성을 구비하고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드 서열, 여기서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 아니고, c) 엄격한 조건하에서 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 교잡하고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드 서열, 여기서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 아니고, 고도의 입체선택성이란 그 중의 한 입체이성질체의 포함량이 다른 하나의 최소한 약 1.1배인 것을 말한다.

상기 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 최소한 80%의 동일성을 구비하고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어 최소한 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.8% 혹은 99.9%의 동일성을 구비하고, 그 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 아니다. 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 트랜스아미나제 촉매 활성에 핵심적 작용을 일으키는 뉴클레오타이드 서열을 변화시키지 않고 유지하는 상황하에서 당업자라면 기타 비 활성위(位)의 뉴클레오타이드 서열을 변경시켜 얻은 트랜스아미나제의 뉴클레오타이드 서열로 하여금 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과의 동일성이 최소한 80% 이상에 달하도록 할 수 있다. 이렇게 획득한 트랜스아미나제는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1 혹은 3인 트랜스아미나제와 동일한 트랜스아미나제 활성을 구비한다.

상기 엄격한 조건하에서 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 교잡하고 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 아니다. 동일하게 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 엄격한 조건하에서 그 서열과 교잡할 수 있고 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드 서열을 선택하면 이렇게 획득한 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 변이체 서열은 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1 혹은 3인 트랜스아미나제와 동일한 트랜스아미나제 활성을 구비한다.

여기서, 입체선택성이란 한 반응을 통하여 A와 B의 두 입체이성질체를 생성하였을 경우 A의 생산량이 B보다 많음을 말한다. 고도의 입체선택성이란 그 중의 한 입체이성질체의 포함량이 다른 하나의 최소한 약 1.1배임을 말하고, 예를 들어 최소한 약 1.2배, 최소한 약 1.3배, 최소한 약 1.4배, 최소한 약 1.5배, 최소한 약 2배, 최소한 약 3배, 최소한 약 4배, 최소한 약 5배, 최소한 약 10배, 최소한 약 15배, 최소한 약 20배, 최소한 약 30배, 최소한 약 40배, 최소한 약 50배, 최소한 약 70배, 최소한 약 90배, 최소한 약 100배일 수 있고 혹은 더 높을 수 있다.

한 예시적인 엄격한 조건으로 6 X SSC, 0.5% SDS의 용액을 이용하여 65℃에서 교잡시킨 후 2 X SSC, 0.1 % SDS와 1 X SSC, 0.1 % SDS를 이용하여 막을 한번씩 세척하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "동일성"은 이 분야의 통상의 공지된 의미를 가짐을 말하고, 당업자라면 서로 다른 서열 사이의 동일성을 측정하는 규칙, 표준을 이해할 수 있다. 본 발명에 있어서 서로 다른 수준의 동일성으로 한정된 서열은 동시에 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 활성을 구비하여야 한다. 당업자라면 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 활성을 이용하여 변이체 서열을 선택하는 방법 및 수단을 이해할 수 있다. 당업자라면 본 출원서에 공개된 내용으로부터 개시를 받아 이러한 변이체 서열을 간단하게 얻을 수 있다.

당업자라면 본 발명에 있어서 상기 아미노산 서열 혹은 폴리뉴클레오타이드를 한정할 때 "포함한다"를 이용하고 있지만 상기 아미노산 서열 혹은 뉴클레오타이드 서열의 양단에 그 기능과 관련되지 않는 기타 서열을 임의로 추가할 수 있음을 표시하는 것이 아님을 이해할 수 있다. 당업자라면 재조합 작업의 요구를 만족시키기 위하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 양단에 적합한 제한 효소(restriction endonuclease)의 제한효소 절단위치(restriction site)를 추가하거나 혹은 시작 코돈, 종료 코돈 등을 별도로 추가하여야 함으로 폐쇄식으로 상기 서열을 한정하면 이러한 상황을 커버할 수 없을 이해할 수 있다.

당업자라면 부호화된 아미노산을 변경시키지 않는 상황하에서 상기 뉴클레오타이드 서열 중의 하나 혹은 다수의 코돈을 동등의미의 것으로 대체할 수 있음을 이해할 수 있고, 예를 들어 CTT에 의하여 부호화된 류신(Leu)을 CTA, CTC 혹은 CTG로 대체할 수 있다. 대체된 코돈 수량은 하나 혹은 다수일 수 있고, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50개 코돈일 수 있다. 코돈 사용 테이블은 이 분야에 공지된 것이다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면 재조합 벡터(recombinant vector)를 제공하는데, 재조합 벡터에 상기한 임의의 한 뉴클레오타이드가 유효하게 연결되어 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 재조합 발견 벡터(recombinant expression vector)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 재조합 클론 벡터를 포함할 수도 있다. 재조합 벡터는 원핵 발견 벡터(prokaryotic expression vector) 혹은 진핵 발견 벡터(eukaryotic expression vector)일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 발견을 유도할 수 있는 재조합 원핵 발견 벡터이고, 예를 들어, pET22b 벡터와 같은 IPTG를 이용하여 유전자의 발견을 유도하는 pET 시리즈의 벡터이다. 본 발명에 있어서, 서열번호 1과 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 재조합 벡터가 pET22b-CM32와 pET22b-CM33인 것이 바람직하다. 여기서, "유효하게 연결되다"란 이러한 연결방식, 즉 폴리 뉴클레오타이드를 벡터의 적합한 위치에 위치시킴으로써 폴리 뉴클레오타이드가 정확하고 순조롭게 복제, 전사 및/혹은 번역되도록 하는 것을 말한다.

본 발명의 다른 일 측면에 있어서 숙주세포를 제공하는데, 숙주세포에 상기한 임의의 재조합 벡터가 전환 혹은 트랜스펙팅된다. 본 발명의 숙주세포는 원핵 숙주세포와 진핵 숙주세포를 포함하고, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 숙주세포는 원핵 숙주세포이고 예를 들어 대장균이고 대장균 DH5α(DE3)인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 다른 일 측면에 있어서 키랄 아민의 합성 방법을 제공하는데, 이 방법은 케톤계 화합물과, 상기 임의의 R형 ω-트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체와, 피리독살인산(pyridoxal phosphate)과, 아미노기 공여체를 반응계에서 반응시켜 키랄 아민을 얻는 것을 포함한다. 본 발명의 키랄 아민의 합성 방법에 의하면 이 분야의 통상의 생물 효소 촉매 반응을 통하여 키랄 화합물을 제조하는 방법에 기반하여 본 발명의 트랜스아미나제를 이용하며 반응계의 각종 반응 원료의 성분, 비율, 사용량, pH값, 온도, 반응 시간 등 파라미터를 적절하게 변경시킨다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 있어서, 상기 케톤계 화합물은

이고, 여기서, R₁과 R₂는 각각 독립적으로 C₁~C₈ 알킬기, C₅~C₁₀ 사이클로알킬기, C₅~C₁₀ 아릴기 혹은 C₅~C₁₀ 헤테로아릴기이고, 혹은 R₁과 R₂는 카보닐기의 탄소와 협력하여 C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭기, C₅~C₁₀ 탄소환기 혹은 C₅~C₁₀ 헤테로아릴기를 형성하고, C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭기와 C₅~C₁₀ 헤테로아릴기 중의 헤테로원자는 각각 독립적으로 질소, 산소, 황으로부터 선택되는 최소한 하나이고, C₅~C₁₀ 아릴기 중의 아릴기, C₅~C₁₀ 헤테로아릴기 중의 헤테로아릴기, C₅~C₁₀ 탄소환기 중의 탄소환기 혹은 C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭기 중의 헤테로사이클릭기는 각각 독립적으로 치환되지 않았거나 혹은 할로겐, 알콕시기 혹은 알킬기 중의 최소한 하나에 의하여 치환되었고, 케톤계 화합물

은

,

혹은

으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기 케톤계 화합물은 산업화된 원료 혹은 간단하게 제조할 수 있는 원료이고 가격이 저렴하여 대량 생산의 수요를 만족시킬 수 있다.

본 발명의 다른 한 바람직한 실시예에 있어서, 상기 반응계에 용해촉진제를 더 포함하고, 용해촉진제는 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 혹은 폴리에틸렌글리콜이고, 폴리에틸렌글리콜이 PEG-400인 것이 바람직하다. 용해촉진제는 반응이 순조롭게 수행되도록 상기 원료를 양호하게 용해시키는 작용을 일으키고 PEG-400의 용해 촉매 효과가 더욱 양호하다.

본 발명의 다른 한 바람직한 실시예에 있어서, 상기 C1~C8 알킬기는 C1~C8 선형 알킬기이고, C5~C10 헤테로아릴기는 피리딘기이며, 알콕시기는 C1~C6 알콕시기이고, C5~C10 헤테로사이클릭 중의 헤테로사이클릭은 피페리딘이며, C5~C10 아릴기 중의 아릴기, C5~C10 헤테로아릴기 중의 헤테로아릴기, C5~C10 탄소환 중의 탄소환 혹은 C5~C10 헤테로사이클릭 중의 헤테로사이클릭의 치환기는 각각 독립적으로 C1~C6 선형 알킬기, C1~C6 알콕시기이고, 아미노기 공여체는 아이소프로필 아민 혹은 D-알라닌이다. 상기 원료는 산업화된 원료 혹은 간단히 제조할 수 있는 원료이고 가격이 저렴하여 대량 생산의 수요를 만족시킬 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 있어서, 상기 반응계는 반응계의 pH 값을 7.0~9.5의 범위에 유지시키기 위하여 완충용액을 포함하고, 그리고/또는 케톤계 화합물과 용해촉진제의 사용량 비율은 1g/1㎖~15㎖이고, 그리고/또는 케톤계 화합물과 완충용액의 사용량 비율은 1g/15㎖~50㎖이며, 그리고/또는 케톤계 화합물과 피리독살인산(pyridoxal phosphate)의 사용량 비율은 1g/0.01g~0.1g이고, 그리고/또는 케톤계 화합물과 아미노기 공여체의 사용량 비율은 1eq/1eq~5eq이며, 그리고/또는 케톤계 화합물과 R형 ω-트랜스아미나제의 사용량 비율은 1g/0.2g~10g이고, 그리고/또는 반응계의 온도는 20~45℃이고 반응 시간은 12h~48h이며 및/혹은 완충용액은 인산염 완충용액 혹은 pH=9.3~9.5의 트리에탄올아민(triethanolamine) 완충용액이다.

본 발명의 다른 한 바람직한 실시예에 있어서, 상기 방법은 알카라인(alkaline)로 반응계를 pH≥10으로 조절하고 유기 용제를 이용하여 수상(水相) 중의 제품인 키랄 아민을 추출하는 공정을 포함하고, 알카라인은 수산화나트륨 혹은 수산화칼륨이고 유기 용제는 초산에틸(ethyl acetate), 메틸 삼차 부틸 에터 혹은 2-메틸테트라하이드로퓨란(2-Methyltetrahydrofuran)인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 한 전형적인 실시형태에 있어서, 상기한 임의의 합성 방법으로 합성되는 R형 키랄 아민을 제공한다. 본 발명의 상기 트랜스아미나제를 사용하여 제조한 R형 키랄 아민은 키랄 아민 순도가 높아 98%에 달한다.

아래 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명의 유익한 효과를 설명한다.

하기 설명에 있어서 특별한 설명이 없으면 통상의 방법으로 수행하는 것이고 사용되는 실험용의 재료 역시 특별한 설명이 없으면 상업화 회사로부터 쉽게 얻을 수 있는 것을 말한다.

실시예 1: 아스퍼질러스 테레우스와 하이포모나스 넵투늄으로부터 유래된 트랜스아미나제 AH-TACM33의 제조

본 발명의 트랜스아미나제 AH-TACM33의 제조 방법의 구체 단계는 하기와 같다:

(1) 템플레이트 구축:

생공생물공정(상해)유한회사에 위임하여 아스퍼질러스 테레우스와 하이포모나스 넵투늄으로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자 taAT(아스퍼질러스 테레우스)(뉴클레오타이드 서열은 서열목록에서 서열번호 5에 나타낸 유전자 서열이고, 아미노 서열은 서열번호 23에 나타낸 서열임)와 taHN(하이포모나스 넵투늄)(뉴클레오타이드 서열은 서열목록 중의 서열번호 6에 나타낸 유전자 서열이고, 아미노 서열은 서열번호 24에 나타냄)를 합성시키고,

합성된 taAT유전자와 taHN 유전자를 각각 벡터pUC57에 연결시켜 재조합 플라스미드 pUC-taAT와 pUC-taHN을 얻는다. 그 다음 NdeⅠ와 XhoⅠ 제한효소를 이용하여 재조합 플라스미드 pUC-taAT와 pUC-taHN에 동시에 효소 소화를 수행하고 젤(gel) 회수 처리를 통하여 순화 회수 파편 taAT와 taHN을 얻고 그것을 다음 PCR의 템플레이트로 하였다.

(2) 프라이머(primer)의 설계:

아스퍼질러스 테레우스로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자에 근거하여 설계한 특이성 프라이머는 아래와 같다:

taAT A: 5'-CCGCTCGAGGTTACGCTCGTTGTAGTCAATTTC-3' (서열번호 7)

taAT S: 5'-GGAATTCCATATGGCGTCTATGGACAAAG-3' (서열번호 8)

하이포모나스 넵투늄으로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자에 근거하여 설계한 특이성 프라이머는 아래와 같다:

taHN A: 5'-CCGCTCGAGCGGTGCATAGGTTACCGGTTC-3' (서열번호 9)

taHN S: 5'-GGAATTCCATATGCTGACCTTCCAAAAAGTACTGAC-3' (서열번호 10)

서로다른 위치에 근거하여 설계한 6쌍 프라이머는 각각:

CM31A: 5'-GAACTTCAGACCGCGGGTGACAATCAG-3' (서열번호 11)

CM31S: 5'- CACCCGCGGTCTGAAGTTCCTGC -3' (서열번호 12)

CM32A: 5'- CGGCGGAACACGACGAACGGTACG -3' (서열번호 13)

CM32S: 5'- TTCGTCGTACTCCGCCGGGCGCAC -3'(서열번호 14)

CM33A: 5'- TAGCCTGCGCCCTCGGTCAGGTGAG -3' (서열번호 15)

CM33S: 5'- GACCGAGGGCGCAGGCTACAATATC -3' (서열번호 16)

CM34A: 5'- CCCTTCAGACCACGCGTAACGATGATC -3' (서열번호 17)

CM34S: 5'- TTACGCGTGGTCTGAAGGGTGTGCGTG -3' (서열번호 18)

CM35A: 5'- CCAGGCGGAGTACGACGTACAGTACGAG -3' (서열번호 19)

CM35S: 5'- TACGTCGTGTTCCGCCTGGCGCAATC -3' (서열번호 20)

CM36A: 5'- GCCGCTGCCTTCCGTCGCGTTACC -3' (서열번호 21)

CM36S: 5'- GACGGAAGGCAGCGGCTTCAACATC -3' (서열번호 22)

(3) 새로운 트랜스아미나제의 획득:

아스퍼질러스 테레우스로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자에 기반하여 설계한 특이성 프라이머 taAT S(순방향 프라이머)와 상기 6쌍 프라이머 중의 3개 역방향 프라이머(CM31A, CM32A, CM33A) 중의 임의의 한 역방향 프라이머를 조합하여 아스퍼질러스 테레우스로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자의 파편을 확장시키고, 혹은 taHN A(역방향 프라이머)와 상기 6쌍 프라이머 중의 3개 순방향 프라이머(CM36S, CM35S, CM34S) 중의 임의의 하나와 조합하여 하이포모나스 넵투늄으로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자의 파편을 확장시킨다. 그 다음 상기 확장된 서로다른 출처를 가지는 두 파편을 정합시켜 개선된 트랜스아미나제 유전자를 얻는다.

동일하게 아스퍼질러스 테레우스로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자에 기반하여 설계한 특이성 프라이머 taAT A(역방향 프라이머)와 상기 6쌍 프라이머 중의 3개 순방향 프라이머(CM33S, CM32S, CM31S) 중의 임의의 한 순방향 프라이머를 조합하여 아스퍼질러스 테레우스로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자 파편을 확장시키고, 혹은 taHN S(순방향 프라이머)와 상기 6쌍 프라이머 중의 3개 역방향 프라이머(CM34A, CM35A, CM36A) 중의 임의의 하나와 조합하여 하이포모나스 넵투늄으로부터 유래된 트랜스아미나제 유전자 파편을 확장시킨다. 그 다음 상기 확장된 서로다른 출처를 가지는 두 파편을 정합시켜 개선된 트랜스아미나제 유전자를 얻는다.

구체적인 개선 과정을 taAT S 순방향 프라이머와 CM33A 역방향 프라이머에 의하여 확장된 파편과 taHN A 역방향 프라이머와 CM33S 순방향 프라이머에 의하여 확장된 파편을 정합시켜 얻은 트랜스아미나제 및 taAT S 순방향 프라이머와 CM32A 역방향 프라이머에 의하여 확장된 파편과 taHN A 역방향 프라이머와 CM32S 순방향 프라이머에 의하여 확장된 파편을 정합시켜 얻은 트랜스아미나제를 예로 상세하게 설명한다.

트랜스아미나제 AH-TACM33를 획득하는 과정은 하기와 같다:

① 파편 A의 획득: 상기 회수 파편 taAT를 PCR 템플레이트로 하고 taAT S와 CM33A를 프라이머하여 PCR 확장을 수행하여 산물에 젤 회수 처리를 수행하여 순화하면 파편 A이다.

② 파편 B의 획득: 상기 회수 파편 taHN을 PCR 템플레이트로 하고 taHN A와 CM33S를 프라이머로 하여 PCR 확장을 수행하여 산물에 젤 회수 처리를 수행하여 순화하면 파편 B이다.

③ 파편 CM33의 획득: 상기 획득한 파편 A와 파편 B를 각각 템플레이트 및 프라이머로 하고 PCR 확장을 5개 사이클 수행한 후 직접 PCR 체계에 프라이머 taAT S와 taHN A를 첨가하고 PCR 확장을 중첩시켜 산물에 젤 회수 처리를 수행하여 순화하면 파편 CM33이다.

PCR 체계: 파편 A 1㎕, 파편 B 1㎕, PCR MIX 5㎕, ddH₂O 4.5㎕:

PCR 프로그램: 95℃ 3min: (95℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 90s, 5개 사이클): 72℃ 1min:

체계에 프라이머 taAT S와 taHN A를 각각 0.2㎕ 첨가한다.

PCR 프로그램: 95℃ 3min;(95℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 90s, 30개 사이클): 72℃ 10min.

④ 재조합 플라스미드 pET22b-CM33의 획득: NdeⅠ와 XhoⅠ를 이용하여 상기 파편 CM33과 pET-22b(+)에 동시에 효소 소화(enzyme digestion)를 수행하고 T4 DNA 리가제(ligase)로 결찰(ligation) 반응시키며 결찰 산물을 대장균 DH5α 균주의 수용성 세포(competent cell)로 전환시키고 셰이커(shaker)로 회생시켜 암피실린(ampicillin) 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 배양접시에 도포하여 37℃의 배양용기에서 하룻밤 배양하였다. 상기 배양접시 상의 단일 콜로니(colony)를 선택하여 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 액체 배양기에 접종시켜 37℃, 180r/min에서 하룻밤 진동 배양하고, 플라스미드를 추출하여 PCR와 효소 소화 감정을 수행하였고 효소 소화 감정 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 pET22b-CM33 플라스미드를 NdeⅠ 효소와 XhoⅠ 효소의 두 효소 소화를 거친후의 감정 결과를 나타낸 것으로, 1은 pET22b 빈 벡터를 표시하고, 2는 DNA 분자 크기 마크를 표시하며(위로부터 아래로 각각 10000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3500bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp), 3은 pET22b-CM33-DH5α를 표시한다. 도 3에 도시한 바와 같이 효소 소화 후의 파편 크기는 1000bp 정도로 비교적 약한 밴드(band)가 목표 파편이고(목표 파편을 절단한 후의 플라스미드 밴드는 비교적 강하다), 이로 인하여 재조합 플라스미드 pET22b-CM33의 삽입 서열의 삽입 방향 및 크기가 정확함을 확정할 수 있다.

⑤ BL21/pET22b-CM33의 획득: 상기 획득한 재조합 플라스미드 pET22b-CM33를 직접 대장균BL21(DE3)으로 전화시키고 셰이커로 회생시켜 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 배양접시에 도포하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 상기 배양접시 상의 단일 콜로니를 선택하여 5㎖ 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 액체 배양기에 접종시켜 37℃, 180r/min 에서 하룻밤 배양하였다. 균액을 생공생물공정(상해)유한회사에 가져가서 서열을 측정하였고 유전자 서열을 측정하여 정확성이 검증된 후 BL21/pET22b-CM33라고 명명하였다.

여기서, 서열 측정결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 도시한 바와 같이 서열 측정 결과에 있어서 BL21/pET22b-CM33 플라스미드가 포함한 유전자 서열은 예상한 것과 완전히 일치하고 돌연변이된 염기(base)는 없었다. 서열 측정을 거쳐 정확함이 검증되면 그 재조합 플라스미드는 목표 플라스미트 서열이다.

⑥ AH-TACM33 트랜스아미나제의 제조: 상기 BL21/pET22b-CM33 균액을 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 액체 배양기에 접종시켜 37℃, 180r/min에서 OD600값이 0.6~0.8에 달하도록 진동 배양시키고 최종농도가 0.2mM에 달하도록 IPTG를 첨가하며, 배양액을 25℃에서 발견을 유도시키고 16h 유도시킨 후 균액을 꺼내어 12000r/min에서 10min 원심 처리를 수행하여 균체를 얻었다. 균체를 세포를 분쇄시키고 4℃, 12000r/min에서 20min 원심 처리를 수행하여 상청액을 획득하였는데 그것이 바로 제조된 트랜스아미나제 AH-TACM33이고 그 아미노산 서열은 서열번호4에 나타낸 바와 같고 대응되는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3에 나타낸 바와 같다.

실시예 2: AH-TACM33 트랜스아미나제의 활성 실험 1

반응병에 1g 주요 원료(N-BOC-피레리돈(N-Boc-3-piperidone), CAS: 79099-07-3)과 1㎖ 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 투입하고 원료를 분산시킨 후, 50㎖ 0.2 ㏖/ℓ의 빙욕 조건하에서 짙은 염산으로 pH를 9.3~9.5로 조절한 트리에탄올아민(triethanolamine) 완충용액, 0.765g 아이소프로필 아민(isopropylamine), 0.01g 피리독살인산(pyridoxal phosphate), 0.01g 상기 AH-TACM33 트랜스아미나제를 첨가하였고, 체계의 pH는 9.5이고 30℃의 항온에서 12h 교반하였다. 체계의 pH를 2N NaOH를 이용하여 10 이상으로 조절하고 초산에틸을 이용하여 두번 추출하여 유기상(有機相)을 건조, 여과, 농축시켜 조생성물을 얻었고(영어 명칭: (R)-1-N-Boc-3-aminopiperidine, CAS: 188111-79-7), 개스 크로마토그래피(GC, Gas Chromatography) 검증 결과, 전화율은 90%이고 e.e 값은 100%였다.

획득한 제품의 NMR(Nuclear Magnetic Resonance) 데이터는 1H-NMR(300MHz, CDCl3)δ 4.00-3.78(m, 2H), 3.80(m, 2H), 3.60(m, 1H), 1.90(m, 1H), 1.70(m, 1H), 1.60-1.40(m, 12H), 1.30(m, 1H)ppm이다.

실시예 3: AH-TACM33 트랜스아미나제의 활성 실험 2

반응병에 0.1g 주요 원료(2,4-dichloroacetophenone, CAS: 2234-16-4)와 1.5 ㎖ 폴리에틸렌글리콜 PEG-400를 투입하고 원료를 분산시킨 후, 23.5㎖ 인산염 완충용액(pH8.0), 0.031g 아이소프로필 아민, 0.0075g 피리독살인산, 0.02g 상기 AH-TACM33 트랜스아미나제를 첨가하고 체계의 pH는 8.0이고 45℃의 항온에서 20h 교반하였다. 체계의 pH를 2N NaOH를 이용하여 10 이상으로 조절하고 초산에틸을 이용하여 두번 추출하여 유기상을 건조, 여과, 농축시켜 조생성물([(R)-(+)-1-(2,4-dichlorophenyl)ethyl]amine)을 얻었고 GC 검증 결과, 전화율은 82%이고 e.e 값은 100%였다.

획득한 제품의 NMR 데이터는 1H NMR(400MHz, DMSO D6): δ=7.67 (d 1H), 7.60 (d, 1H), 7.47 (dd, 1H), 7.34(dd, 4H), 7.23-7.12(m, 6H), 4.84(s, 1H), 4.47 (quartet, 1H), 1.31(d, 3H)이다.

실시예 4: 아스퍼질러스 테레우스와 하이포모나스 넵투늄으로부터 유래된 트랜스아미나제 AH-TACM32의 제조

본 발명의 트랜스아미나제 AH-TACM32의 제조 방법은 하기 공정을 포함한다.

(1) 템플레이트의 구축:

실시예 1에 기재된 방법에 따라 재조합 플라스미드 pUC57-taAT와 pUC57-taHN을 획득하였다. NdeⅠ와 XhoⅠ의 제한효소를 이용하여 재조합 플라스미드 pUC57-taAT와 pUC57-taHN에 동시에 효소 소화를 수행하고 젤 회수 처리를 거쳐 순화하여 회수 파편 taAT와 taHN을 얻어 그 다음의 PCR의 템플레이트로 하였다.

(2) 프라이머의 설계:

실시예 1과 동일하다.

(3) 새로운 트랜스아미나제의 획득:

① 파편 E의 획득: 상기 회수 파편 taAT를 PCR 템플레이트로 하고 taAT S와 CM32A를 프라이머로 하여 PCR 확장을 수행하여 산물에 젤 회수 처리를 수행하여 순화하면 파편 E이다.

② 파편 F의 획득: 상기 회수 파편 taHN을 PCR 템플레이트로 하고 taHN A와 CM32S를 프라이머로 하여 PCR 확장을 수행하여 산물에 젤 회수 처리를 수행하여 순화하면 파편 F이다.

③ 파편 CM32의 획득: 상기 획득한 파편 E와 파편 F를 각각 템플레이트 및 프라이머로 하고 PCR 확장을 5개 사이클 수행한 후 직접 PCR 체계에 프라이머 taAT S와 taHN A를 첨가하고 PCR 확장을 중첩시켜 산물에 젤 회수 처리를 수행하여 순화하면 파편 CM32이다.

④ 재조합 플라스미드 pET22b-CM32의 획득: NdeⅠ와 XhoⅠ를 이용하여 상기 파편 CM32와 pET-22b(+)에 동시에 효소 소화를 수행하고 T4 DNA 리가제로 연결 반응시켜 연결 산물을 대장균 DH5α 균주의 수용성 세포로 전환시키며 셰이커(shaker)로 회생시켜 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 배양접시에 도포하여 37℃의 배양용기에서 하룻밤 배양하였다. 상기 배양접시 상의 단일 콜로니를 선택하여 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 액체 배양기에 접종시켜 37℃, 180r/min에서 하룻밤 진동 배양하고, 플라스미드를 추출하여 PCR와 효소 소화 감정을 수행하였고 효소 소화 감정 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 pET22b-CM32 플라스미드를 NdeⅠ 효소와 XhoⅠ 효소의 두 효소 소화를 거친후의 감정 결과를 나타낸 것으로, 1은 DNA 분자 크기 마크를 표시하며(위로부터 아래로 각각 10000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3500bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp), 2는 pET22b-CM32-DH5α를 표시하며 3은 pET22b 빈 벡터를 표시한다.

도 5에 도시한 바와 같이 효소 소화 후의 파편 크기는 1000bp 정도로 비교적 약한 밴드가 목표 파편이고(목표 파편을 절단한 후의 플라스미드 밴드는 비교적 강하다), 이로 인하여 재조합 플라스미드 pET22b-CM32의 삽입 서열의 삽입 방향 및 크기가 정확함을 확정할 수 있고 재조합 플라스미드 pET22b-CM32를 획득하였다.

⑤BL21/pET22b-CM32의 획득: 상기 획득한 재조합 플라스미드 pET22b-CM32를 직접 대장균BL21(DE3)으로 전화시키고 셰이커로 회생시켜 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 배양접시에 도포하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 상기 배양접시 상의 단일 콜로니를 선택하여 5㎖ 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 액체 배양기에 접종시켜 37℃, 180r/min 에서 하룻밤 배양하였다. 균액을 생공생물공정(상해)유한회사에 가져가서 서열을 측정하였고 유전자 서열을 측정하여 정확성이 검증된 후 BL21/pET22b-CM32로 명명하였다.

여기서, 서열 측정 결과는 도 6에 도시한 바와 같다. 도 6에 도시한 바와 같이 서열 측정 결과에 있어서 BL21/pET22b-CM32 플라스미드가 포함한 유전자 서열은 예상한 것과 완전히 일치하고 돌연변이된 염기는 없었다. 서열 측정을 거쳐 정확함이 검증되면 그 재조합 플라스미드는 목표 플라스미트 서열이다.

⑥AH-TACM32 트랜스아미나제의 제조: 상기 BL21/pET22b-CM32 균액을 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 액체 배양기에 접종시켜 37℃, 180r/min에서 OD600값이 0.6~0.8에 달하도록 진동 배양시키고 최종농도가 0.2mM에 달하도록 IPTG를 첨가하며, 배양액을 25℃에서 발견을 유도시키고 16h 유도시킨 후 균액을 꺼내어 12000r/min에서 10min 원심 처리를 수행하여 균체를 얻었다. 균체를 세포를 분쇄시키고 4℃, 12000r/min에서 20min 원심 처리를 수행하여 상청액을 획득하였는데 그것이 제조된 트랜스아미나제 AH-TACM32이고 그 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 바와 같고 대응되는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 나타낸 바와 같다.

실시예 5: AH-TACM32 트랜스아미나제의 활성 실험

반응병에 0.1g 주요 원료(2-acetonaphthone, CAS: 93-08-3)와 1㎖ 폴리에틸렌글리콜 PEG-400를 투입하고 원료를 분산시킨 후, 24㎖ 인산염 완충용액(pH는 7.0), 0.17g 아이소프로필 아민, 0.01g 피리독살인산, 0.004g의 상기 AH-TACM32 트랜스아미나제를 첨가하고 체계의 pH는 7.0이고 20℃의 항온에서 48h 교반하였다. 체계의 pH를 2N NaOH를 이용하여 10 이상으로 조절하였고 초산에틸을 이용하여 두번 추출하여 유기상(有機相)을 건조, 여과, 농축시켜 조생성물을 얻었고 GC를 통하여 검증하고, 전화율은 20%이고 e.e 값은 100%였다.

획득한 제품의 NMR 데이터는 1H NMR(400MHz, CDCl3)δ7.86-7.76(m, 4H), 7.52-7.41 (m, 3H), 4.29(q, J = 6.4Hz, 1H), 1.74(br s, 2H), 1.48(d, J = 6.4Hz, 3H)이다.

본 발명에 있어서 주요 원료로(2-acetonaphthone, CAS: 93-08-3) 트랜스아미나제 AH-TACM33의 트랜스아미나제 활성을 실험하였고, 주요 원료(N-BOC-3-피레리돈(N-Boc-3-piperidone), CAS: 79099-07-3)과 주요 원료(2,4- dichloroacetophenone, CAS: 2234-16-4)로 트랜스아미나제 AH-TACM32의 트랜스아미나제 활성을 확인하였는데 구체적인 방법은 상기 실시예와 동일하다.

실시예 6

아미노산 서열이 서열번호 2인 트랜스아미나제인 AH-TACM32에 기반하여 트랜스아미나제의 제38위의 류신을 부위 특이적 돌연변이시켜 류신을 아이소 류신으로 치환하여 서열이 서열번호 25인 트랜스아미나제를 얻었다.

이 트랜스아미나제에 효소활성 실험을 수행하고 검증하였고 검증 과정은 하기와 같다:

돌연변이체 균액을 100㎖ 암피실린 포함 최종농도가 50㎍/㎖인 LB 액체 배양기에 접종시켜 37℃, 180r/min에서 OD600값이 0.6~0.8에 달하도록 진동 배양시키고 최종농도가 0.2mM에 달하도록 IPTG를 첨가하며, 배양액을 25℃에서 발견을 유도시키고 이와동시에 IPTG 유도제를 첨가하지 않은 배양액을 음성 참조로 하였다. 16h 유도시킨 후 균액을 꺼내어 12000r/min에서 5min 원심 처리를 수행하여 균체를 수집하였다. 0.5g의 균체를 측정하여 2.5㎖ 0.1M 인산염 완충용액(pH8.0) 균체에서 재부유시켜 균체는 초음파 분쇄기를 이용하여 세포 분쇄시켰고 초음파 파라미터는 감지기 직경은 6mm이고 출력은 200W이며 2s 동작하고 6s 휴식하며 총 10min 수행하였고 초음파 처리 후에 4℃, 12000r/min에서 20min 원심 처리를 거쳐 초음파 상청액과 침전물을 획득하였고 상청액을 효소 활성의 증명 반응에 이용하였다.

반응병에 0.1g 주요 원료(아세토페논(acetophenone), CAS: 98-86-2)를 투입하고 원료를 13.5㎖ 0.1M 인산염 완충용액(pH8.0), 0.356g D-알라닌(D-alanine), 0.002g β-NAD+, 0.0192g 락토산 탈수소 효소(lactic dehydrogenase), 0.006g 글루코오스 탈수소 효소(glucose dehydrogenase), 0.432 글루코오스(glucose), 0.004g 피리독살인산, 2.5㎖ 서열이 서열번호 25인 R 구조 형태 Ω-트랜스아미나제에 분산시켰고 체계의 pH는 7.0이고 30℃의 항온에서 16h 교반하였다. 체계의 pH를 2N NaOH를 이용하여 10 이상으로 조절하였고 초산에틸을 이용하여 두번 추출하여 유기상을 건조, 여과, 농축시켜 조생성물(영어 명칭: (R)-1-phenethylamine，CAS: 3886-69-9)을 얻었고 개스 크로마토그래피(GC)로 검증하고, 전화율은 83%이고 e.e 값은 99.5%였다.

획득한 제품의 NMR 데이터는 1H NMR (CDCl3，400MHz，300 K)δ (ppm): 7.36-7.29(m，4H), 7.26-7.19(m，1H), 4.11(q，J = 6.6Hz，1H), 1.53 (bs，2H), 1.38(d，J = 6.6Hz，3H)이다.

상기 결과로부터 본 발명의 상기 실시예 중의 트랜스아미나제에 의하면 모두 유사한 수율 및 거울상이성질체(enantiomer) 순도를 얻을 수 있고 대응되는 R 구조 형태 키랄 아민을 얻을 수 있음을 알 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명의 상기 실시예에 의하면 하기와 같은 기술적 효과를 실현할 수 있다: 본 발명에 공개된 새로운 트랜스아미나제는 아미노기 공여체중의 아미노기의 프로키랄 케톤계 혹은 알데하이드(aldehyde)계로의 전이에서 촉매 작용을 일으키고 대응되는 R구조 형태의 키랄 아민을 생성하며 본 발명의 새로운 트랜스아미나제 합성 방법에 의하면 고순도의 목표 산물을 얻을 수 있고 획득한 제품의 광학 순도는 98% 이상에 안정되었다. 상기한 합성 방법에 이용되는 원료는 쉽게 얻을 수 있는 것이고 방법이 간단하고 화학 반응 조건이 온화하며 수율 및 거울상이성질체 순도가 높고 생산 전반에 있어서 작업이 간단하여 실행가능한 것이고 또한 오염이 낮은 합성 공정으로 키랄 아민을 제조하는 새로운 통로 및 방법을 제공하였다.

상기한 내용은 본 발명의 바람직한 실시예로, 본 발명을 한정하는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명에 여러 가지 변화를 가져올 수 있다. 본 발명의 정신과 원칙을 벗어나지 않는 범위 내에서 수행하는 모든 수정, 동등교체, 개량 등은 본 발명의 보호 범위에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> ASYMCHEM LABORATORIES (TIANJIN) CO., LTD ASYMCHEM LIFE SCIENCE (TIANJIN) CO., LTD TIANJIN ASYMCHEM PHARMACEUTICAL CO., LTD ASYMCHEM LABORATORIES (FUXIN) CO., LTD JILIN ASYMCHEM LABORATORIES CO.,LTD <120> TRANSAMINASE AND USE THEREOF <130> WO2015/078267 <140> PCT/CN2014/090080 <141> 2014-10-31 <160> 25 <170> PatentIn version 3.2 <210> SEQ ID NO.1 <211> 975 <212> DNA <213> Artificial design <400> 1 atggcgtcta tggacaaagt ttttgcaggt tacgcggccc gtcaagcgat cctggaatct 60 actgagacta ccaacccgtt cgcgaaaggt atcgcgtggg tagaaggtga actggttccg 120 ctggcggaag cacgcatccc gctgctggat cagggcttca tgcattccga cctgacgtat 180 gacgtgccgt ctgtgtggga tggccgcttc ttccgtctgg atgatcacat cactcgtctg 240 gaagcatcct gcactaaact gcgtctgcgc ctgcctctgc cgcgtgatca ggtgaaacag 300 atcctggttg aaatggttgc gaaatccggc attcgcgacg cgtttgtcga actgattgtc 360 acccgcggtc tgaagggtgt gcgtggcacc cgtccggaag acattgtaaa caacctgtac 420 atgttcgtgc agccgtacgt ctgggttatg gaaccggaca tgcagcgtgt tggcggcagc 480 gcagttgtag 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70 75 80 Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp 85 90 95 Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg 100 105 110 Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg 115 120 125 Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln 130 135 140 Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser 145 150 155 160 Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Thr Pro Pro Gly Ala Leu Asp 165 170 175 Pro Thr Ile Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Leu Met 180 185 190 Glu Ala Gly Asp Arg Asp Ser Phe Phe Pro Ile Leu Pro Asp Gly Asp 195 200 205 Gly Asn Ala Thr Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Ile Val Leu Val Arg Asn 210 215 220 Gly Glu Leu His Thr Pro Arg Arg Gly Val Leu Glu Gly Ile Thr Arg 225 230 235 240 Arg Thr Val Leu Glu Ile Ala Ala Ala Arg Gly Leu Lys Thr His Val 245 250 255 Thr Glu Ile Pro Ile Gln Ala Leu Tyr Glu Cys Asp Glu Leu Phe Met 260 265 270 Cys Ser Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Leu Val Leu Leu Asp Gly Asn 275 280 285 Ile Val Gly Asp Gly Thr Val Gly Pro Val Thr Arg Met Ile Trp Glu 290 295 300 Ala Tyr Trp Asp Leu His Asp Asp Pro Gln Leu Ser Glu Pro Val Thr 305 310 315 320 Tyr Ala Pro Leu Glu 325 <210> SEQ ID NO.3 <211> 975 <212> DNA <213> Artificial design <400> 3 atggcgtcta tggacaaagt ttttgcaggt tacgcggccc gtcaagcgat cctggaatct 60 actgagacta ccaacccgtt cgcgaaaggt atcgcgtggg tagaaggtga actggttccg 120 ctggcggaag cacgcatccc gctgctggat cagggcttca tgcattccga cctgacgtat 180 gacgtgccgt ctgtgtggga tggccgcttc ttccgtctgg atgatcacat cactcgtctg 240 gaagcatcct gcactaaact gcgtctgcgc ctgcctctgc cgcgtgatca ggtgaaacag 300 atcctggttg aaatggttgc gaaatccggc attcgcgacg cgtttgtcga actgattgtc 360 acccgcggtc tgaagggtgt gcgtggcacc cgtccggaag acattgtaaa caacctgtac 420 atgttcgtgc agccgtacgt ctgggttatg gaaccggaca tgcagcgtgt tggcggcagc 480 gcagttgtag cccgtaccgt tcgtcgtgtt ccgcctggcg caatcgaccc aactgttaaa 540 aatctgcagt ggggcgatct ggtacgcggt atgtttgaag ctgccgatcg tggtgctact 600 tatccgttcc tgacggatgg tgacgctcac ctgaccgagg gcgcaggcta caatatcgta 660 ctggtgcgta acggcgagct gcataccccg cgtcgtggcg ttctggaagg tattacccgt 720 cgtacggtgc tggagattgc agctgctcgc ggcctgaaaa ctcacgtcac cgaaatccca 780 atccaggccc tgtatgaatg cgacgaactg tttatgtgca gcaccgcggg cggtatcatg 840 ccactggtgc tgctggatgg caacattgta ggtgacggca ccgttggtcc ggtcacccgc 900 atgatttggg aagcgtactg ggacctgcac gacgacccgc agctgtctga accggtaacc 960 tatgcaccgc tcgag 975 <210> SEQ ID NO.4 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial design <400> 4 Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala 1 5 10 15 Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala 20 25 30 Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu 35 40 45 Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser 50 55 60 Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp 85 90 95 Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg 100 105 110 Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg 115 120 125 Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln 130 135 140 Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser 145 150 155 160 Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp 165 170 175 Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe 180 185 190 Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp 195 200 205 Ala His Leu Thr Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Ile Val Leu Val Arg Asn 210 215 220 Gly Glu Leu His Thr Pro Arg Arg Gly Val Leu Glu Gly Ile Thr Arg 225 230 235 240 Arg Thr Val Leu Glu Ile Ala Ala Ala Arg Gly Leu Lys Thr His Val 245 250 255 Thr Glu Ile Pro Ile Gln Ala Leu Tyr Glu Cys Asp Glu Leu Phe Met 260 265 270 Cys Ser Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Leu Val Leu Leu Asp Gly Asn 275 280 285 Ile Val Gly Asp Gly Thr Val Gly Pro Val Thr Arg Met Ile Trp Glu 290 295 300 Ala Tyr Trp Asp Leu His Asp Asp Pro Gln Leu Ser Glu Pro Val Thr 305 310 315 320 Tyr Ala Pro Leu Glu 325 <210> SEQ ID NO.5 <211> 981 <212> DNA <213> Aspergillus terreus <400> 5 atggcaagca tggataaagt ttttgcaggt tatgcagcac gtcaggcaat tctggaaagc 60 accgaaacca ccaatccgtt tgcaaaaggt attgcatggg ttgaaggtga actggttccg 120 ctggcagaag cacgtattcc gctgctggat cagggtttta tgcatagcga tctgacctat 180 gatgttccga gcgtttggga tggtcgtttt tttcgtctgg atgatcatat tacccgtctg 240 gaagcaagct gtaccaaact gcgtctgcgt ctgccgctgc ctcgtgatca ggttaaacaa 300 attctggttg aaatggttgc caaaagcggt attcgtgatg catttgttga actgattgtt 360 acccgtggtc tgaaaggtgt tcgtggcacc cgtccggaag atattgttaa taatctgtat 420 atgtttgtgc agccgtatgt ttgggttatg gaaccggata tgcagcgtgt tggtggtagc 480 gcagttgttg cacgtaccgt tcgtcgtgtt ccgccgggtg caattgatcc gaccgttaaa 540 aatctgcagt ggggtgatct ggttcgtggt atgtttgaag cagcagatcg tggtgcaacc 600 tatccgtttc tgaccgatgg tgatgcacat ctgaccgaag gtagcggctt taacattgtt 660 ctggttaaag atggcgtgct gtatacaccg gatcgtggtg ttctgcaggg tgttacccgt 720 aaaagcgtta ttaatgcagc agaagccttt ggtattgaag ttcgtgttga atttgttccg 780 gttgaactgg catatcgctg tgatgaaatc tttatgtgta ccaccgcagg cggtattatg 840 ccgattacca ccctggatgg tatgccggtt aatggtggtc agattggtcc gattaccaaa 900 aaaatctggg atggttattg ggccatgcat tatgatgcag catatagctt tgaaattgat 960 tataatgaac gcaatctcga g 981 <210> SEQ ID NO.6 <211> 969 <212> DNA <213> Hyphomonas neptunium <400> 6 atgctgacct ttcagaaagt tctgaccggt tttcagaccc gtgcagatgc acgtgcagaa 60 cgtaccgatg catttgcaga tggtattgca tggattgaaa atgaatttgt gccgattggc 120 aaagcacgta ttccgattct ggatcagggt tttctgcata gcgatctgac ctatgatgtt 180 ccggcagttt ggaatggtcg tatttttcgt ctggatgatc atctggatcg tctggaagtt 240 agctgtgcaa aaatgcgtct gccgctgccg attgcacgtc cggaactgcg tcgtctggtt 300 atggaactgg ttagccgtag cggtctgcgt gatgcctatg ttgaaattat tgttacccgt 360 ggcctgaaat ttctgcgtgg tgcacaggca gaagatatta ttccgaatct gtatctgatg 420 gccgttccgt atgtttggat tctgccgctg gaatatcaga atcatggtgc accggcagtt 480 gttacccgta ccgttcgtcg tacaccgccg ggtgcactgg atccgaccat caaaaatctg 540 cagtggggtg atctggttcg tggtctgatg gaagccggtg atcgtgatag cttttttccg 600 attctgccgg atggtgatgg taatgcaacc gaaggtgcag gctataacat tgttctggtt 660 cgtaatggcg aactgcatac accgcgtcgt ggtgttctgg aaggtattac ccgtcgtacc 720 gttctggaaa ttgcagcagc acgtggcctg aaaacacatg ttaccgaaat tccgattcag 780 gcactgtatg aatgtgatga actgtttatg tgtagcaccg caggcggtat tatgccgctg 840 gttctgctgg atggtaatat tgttggtgat ggcaccgttg gtccggttac ccgtatgatt 900 tgggaagcat attgggatct gcatgatgat ccgcagctga gcgaaccggt tacctatgca 960 ccgctcgag 969 <210> SEQ ID NO.7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 7 ccgctcgagg ttacgctcgt tgtagtcaat ttc 33 <210> SEQ ID NO.8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 8 ggaattccat atggcgtcta tggacaaag 29 <210> SEQ ID NO.9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 9 ccgctcgagc ggtgcatagg ttaccggttc 30 <210> SEQ ID NO.10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 10 ggaattccat atgctgacct tccaaaaagt actgac 36 <210> SEQ ID NO.11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 11 gaacttcaga ccgcgggtga caatcag 27 <210> SEQ ID NO.12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 12 cacccgcggt ctgaagttcc tgc 23 <210> SEQ ID NO.13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 13 cggcggaaca cgacgaacgg tacg 24 <210> SEQ ID NO.14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 14 ttcgtcgtac tccgccgggc gcac 24 <210> SEQ ID NO.15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 15 tagcctgcgc cctcggtcag gtgag 25 <210> SEQ ID NO.16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 16 gaccgagggc gcaggctaca atatc 25 <210> SEQ ID NO.17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 17 cccttcagac cacgcgtaac gatgatc 27 <210> SEQ ID NO.18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 18 ttacgcgtgg tctgaagggt gtgcgtg 27 <210> SEQ ID NO.19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 19 ccaggcggag tacgacgtac agtacgag 28 <210> SEQ ID NO.20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 20 tacgtcgtgt tccgcctggc gcaatc 26 <210> SEQ ID NO.21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 21 gccgctgcct tccgtcgcgt tacc 24 <210> SEQ ID NO.22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Synthesis <400> 22 gacggaaggc agcggcttca acatc 25 <210> SEQ ID NO.23 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial design <400> 23 Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala 1 5 10 15 Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala 20 25 30 Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu 35 40 45 Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser 50 55 60 Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp 85 90 95 Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg 100 105 110 Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg 115 120 125 Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln 130 135 140 Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser 145 150 155 160 Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp 165 170 175 Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe 180 185 190 Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp 195 200 205 Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp 210 215 220 Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg 225 230 235 240 Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val 245 250 255 Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met 260 265 270 Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met 275 280 285 Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp 290 295 300 Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp 305 310 315 320 Tyr Asn Glu Arg Asn Leu Glu 325 <210> SEQ ID NO.24 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial design <400> 24 Met Leu Thr Phe Gln Lys Val Leu Thr Gly Phe Gln Thr Arg Ala Asp 1 5 10 15 Ala Arg Ala Glu Arg Thr Asp Ala Phe Ala Asp Gly Ile Ala Trp Ile 20 25 30 Glu Asn Glu Phe Val Pro Ile Gly Lys Ala Arg Ile Pro Ile Leu Asp 35 40 45 Gln Gly Phe Leu His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ala Val Trp 50 55 60 Asn Gly Arg Ile Phe Arg Leu Asp Asp His Leu Asp Arg Leu Glu Val 65 70 75 80 Ser Cys Ala Lys Met Arg Leu Pro Leu Pro Ile Ala Arg Pro Glu Leu 85 90 95 Arg Arg Leu Val Met Glu Leu Val Ser Arg Ser Gly Leu Arg Asp Ala 100 105 110 Tyr Val Glu Ile Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Phe Leu Arg Gly Ala 115 120 125 Gln Ala Glu Asp Ile Ile Pro Asn Leu Tyr Leu Met Ala Val Pro Tyr 130 135 140 Val Trp Ile Leu Pro Leu Glu Tyr Gln Asn His Gly Ala Pro Ala Val 145 150 155 160 Val Thr Arg Thr Val Arg Arg Thr Pro Pro Gly Ala Leu Asp Pro Thr 165 170 175 Ile Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Leu Met Glu Ala 180 185 190 Gly Asp Arg Asp Ser Phe Phe Pro Ile Leu Pro Asp Gly Asp Gly Asn 195 200 205 Ala Thr Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Ile Val Leu Val Arg Asn Gly Glu 210 215 220 Leu His Thr Pro Arg Arg Gly Val Leu Glu Gly Ile Thr Arg Arg Thr 225 230 235 240 Val Leu Glu Ile Ala Ala Ala Arg Gly Leu Lys Thr His Val Thr Glu 245 250 255 Ile Pro Ile Gln Ala Leu Tyr Glu Cys Asp Glu Leu Phe Met Cys Ser 260 265 270 Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Leu Val Leu Leu Asp Gly Asn Ile Val 275 280 285 Gly Asp Gly Thr Val Gly Pro Val Thr Arg Met Ile Trp Glu Ala Tyr 290 295 300 Trp Asp Leu His Asp Asp Pro Gln Leu Ser Glu Pro Val Thr Tyr Ala 305 310 315 320 Pro Leu Glu <210> SEQ ID NO.25 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial design <400> 25 Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala 1 5 10 15 Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala 20 25 30 Trp Val Glu Gly Glu Ile Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu 35 40 45 Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser 50 55 60 Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp 85 90 95 Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg 100 105 110 Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg 115 120 125 Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln 130 135 140 Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser 145 150 155 160 Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Thr Pro Pro Gly Ala Leu Asp 165 170 175 Pro Thr Ile Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Leu Met 180 185 190 Glu Ala Gly Asp Arg Asp Ser Phe Phe Pro Ile Leu Pro Asp Gly Asp 195 200 205 Gly Asn Ala Thr Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Ile Val Leu Val Arg Asn 210 215 220 Gly Glu Leu His Thr Pro Arg Arg Gly Val Leu Glu Gly Ile Thr Arg 225 230 235 240 Arg Thr Val Leu Glu Ile Ala Ala Ala Arg Gly Leu Lys Thr His Val 245 250 255 Thr Glu Ile Pro Ile Gln Ala Leu Tyr Glu Cys Asp Glu Leu Phe Met 260 265 270 Cys Ser Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Leu Val Leu Leu Asp Gly Asn 275 280 285 Ile Val Gly Asp Gly Thr Val Gly Pro Val Thr Arg Met Ile Trp Glu 290 295 300 Ala Tyr Trp Asp Leu His Asp Asp Pro Gln Leu Ser Glu Pro Val Thr 305 310 315 320 Tyr Ala Pro Leu Glu 325

Claims

하기 a), b) 및 c)의 서열:
a) 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열,
b) 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열과 최소한 80%의 동일성을 구비하되, 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의하여 부호화된 아미노산 서열이 아니며, 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 구비하는 아미노산 서열,
c) 서열번호 2 혹은 4에 나타낸 아미노산 서열에 하나 혹은 다수의 아미노산을 치환, 결핍 혹은 첨가함으로써 서열번호 2 혹은 4로부터 파생되되, 상기 아미노산 서열이 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의하여 부호화된 아미노산 서열이 아니며 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제 활성을 구비하는 단백질
로부터 선택되는 하나의 서열을 포함하되;
고도의 입체선택성이란 그 중의 한 입체이성질체의 포함량이 다른 하나의 최소한 약 1.1배인 것을 말하는 것을 특징으로 하는 트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체.
제1항에 있어서,
상기 트랜스아미나제의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 중의 제38위의 류신을 아이소류신으로 치환시킨 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 트랜스아미나제.
제1항 혹은 제2항에 기재된 트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체의 부호화를 수행하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드.
제3항에 있어서,
상기 뉴클레오타이드의 서열은 하기 a), b) 및 c)의 서열:
a) 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열,
b) 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 최소한 80%의 동일성을 구비하되, 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 아니며, 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드 서열,
c) 엄격한 조건하에서 서열번호 1 혹은 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 교잡하되, 서열번호 5 혹은 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 아니며, 또한 고도의 입체선택성의 -R구조 형태 촉매 활성을 구비하는 ω-트랜스아미나제의 부호화를 수행하는 뉴클레오타이드 서열
로부터 선택되는 하나의 서열을 포함하되;
고도의 입체선택성이란 그 중의 한 입체이성질체의 포함량이 다른 하나의 최소한 약 1.1배인 것을 말하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드.
제3항 혹은 제4항에 기재된 뉴클레오타이드가 유효하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서,
pET22b-CM32 혹은 pET22b-CM33인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제5항 혹은 제6항에 기재된 재조합 벡터가 전환 혹은 트랜스펙팅된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
케톤계 화합물과, 제1항에 기재된 트랜스아미나제 혹은 그 수식물, 기능동등체, 기능 파편 혹은 변이체와, 피리독살인산과, 아미노기 공여체를 반응계에서 반응시켜 키랄 아민을 얻는 것을 특징으로 하는 키랄 아민의 합성 방법.
제8항에 있어서,
상기 케톤계 화합물은
이고, 여기서, R₁과 R₂는 각각 독립적으로 C₁~C₈ 알킬기, C₅~C₁₀ 사이클로알킬기, C₅~C₁₀ 아릴기 혹은 C₅~C₁₀ 헤테로아릴기이고, 혹은 R₁과 R₂는 카보닐기의 탄소와 협력하여 C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭기, C₅~C₁₀ 탄소환기 혹은 C₅~C₁₀ 헤테로아릴기를 형성하고, C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭기와 C₅~C₁₀ 헤테로아릴기 중의 헤테로원자는 각각 독립적으로 질소, 산소, 황으로부터 선택되는 최소한 한가지이며, C₅~C₁₀ 아릴기 중의 아릴기, C₅~C₁₀ 헤테로아릴기 중의 헤테로아릴기, C₅~C₁₀ 탄소환기 중의 탄소환기 혹은 C₅~C₁₀헤테로사이클릭기 중의 헤테로사이클릭기는 각각 독립적으로 치환되지 않았거나 혹은 할로겐, 알콕시기 혹은 알킬기 중의 최소한 하나에 의하여 치환된 것이고, 케톤계 화합물
이
,
혹은
로부터 선택되는 것이 바람직한 것을 특징으로 하는 키랄 아민의 합성 방법.
제8항 혹은 제9항에 있어서,
상기 반응계에 용해촉진제를 더 포함하되, 상기 용해촉진제는 다이메틸설폭사이드 혹은 폴리에틸렌글리콜이고, 폴리에틸렌글리콜이 PEG-400인 것이 바람직한 것을 특징으로 하는 키랄 아민의 합성 방법.
제9항에 있어서,
상기 C₁~C₈ 알킬기는 C₁~C₈ 선형 알킬기이고, C₅~C₁₀헤테로아릴기는 피리딘기이며, 알콕시기는 C₁~C₆ 알콕시기이고, C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭 중의 헤테로사이클릭은 피페리딘이며, C₅~C₁₀ 아릴기 중의 아릴기, C₅~C₁₀ 헤테로아릴기 중의 헤테로아릴기, C₅~C₁₀탄소환중의 탄소환 혹은 C₅~C₁₀ 헤테로사이클릭 중의 헤테로사이클릭의 치환기는 각각 독립적으로 C₁~C₆ 선형 알킬기, C₁~C₆ 알콕시기이고, 아미노기 공여체는 아이소프로필 아민 혹은 D-알라닌인 것을 특징으로 하는 키랄 아민의 합성 방법.