KR20040014655A - 효소 개변 방법 및 산화 환원 효소 변이체 - Google Patents

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KR20040014655A KR10-2004-7000031A KR20047000031A KR20040014655A KR 20040014655 A KR20040014655 A KR 20040014655A KR 20047000031 A KR20047000031 A KR 20047000031A KR 20040014655 A KR20040014655 A KR 20040014655A
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Abstract

본 발명은 산화 환원 효소의 보효소 의존성을 변환하는 효소 개변 방법을 개발하고, 이 효소 개변 방법을 이용함으로써 NADH를 보효소로서 이용할 수 있는 신규 카르보닐 환원 효소 변이체를 제공한다. 또한, 카르보닐 환원 효소 변이체에 의한 광학 활성 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르의 효소적인 제조 방법의 제공도 과제로 한다.
카르보닐 화합물을 부제적으로 환원하여 광학 활성 알코올을 생성하는 카르보닐 환원 효소의 보효소 의존성이 변환되도록 효소 자체를 개변하는 방법, 이 방법으로 얻어진 보효소 의존성이 NADPH로부터 NADH로 변환된 카르보닐 환원 효소, 이 효소 변이체를 코딩하는 DNA, 이 DNA를 갖는 플라스미드, 이 플라스미드로 형질 전환된 형질 전환 세포, 및 이 효소 변이체 및(또는) 이 형질 전환 세포를 이용하는 광학 활성 알코올의 제조 방법이 제공된다.

Description

효소 개변 방법 및 산화 환원 효소 변이체 {Method of Modifying Enzyme and Oxidoreductase Variant}
광학 활성인 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르는 의약품 등의 중간체로 이용되는 화합물이고, 광학적으로 순수한 대장체를 어떻게 제조하는가가 산업상 중요한 과제로 되어 있다. 그 때문에, 4-할로아세토아세트산에스테르 등의 카르보닐 화합물을 부제적으로 환원하는 CRD 효소를 이용하여, (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르 등의 광학 활성 알코올을 제조하기 위한 공정 개발이 활발히 행해지고 있다.
4-할로아세토아세트산에스테르로부터 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르를 생성하는 CRD 효소로서, 3α-히드록시스테로이드 탈수소 효소(일본 특허 공개 (평)1-277494), 글리세롤 탈수소 효소[Tetrahedron Lett. 29, 2453-2454(1988)], 슈도모나스ㆍ에스피 PED(Pseudomonas sp. PED) 유래의 알코올 탈수소 효소[J. 0rg. Chem. 57, 1526-1532(1992)], 칸디다ㆍ마세도니엔시스(Candida macedoniensis) 유래의 케토판토텐산에스테르 환원 효소[Arch. Biochem. Biophys. 294, 469-474(1992)], 게오트리컴ㆍ칸디덤(Geotrichum candidum) 유래의 4-클로로아세토아세트산 에틸에스테르 환원 효소[Enzyme Microb. Technol. 14, 731-738(1992)], 클루이베로마이세스ㆍ락티스(Kluyveromyces lactis) 유래의 카르보닐 환원 효소(일본 특허 출원 (평)9-357969), 클루이베로마이세스ㆍ아에스튜아리이(Kluyveromyces aestuarii) 유래의 카르보닐 환원 효소(일본 특허 공개 (평)2000-236883) 등이 보고되어 있다.
이들 효소 중에는 환원 반응 뿐 아니라 산화(탈수소) 반응도 행하는 것도 있고, 생성물인 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르의 광학 순도, 축적 농도가 낮다는 등의 문제가 있는 경우가 많았다. 본 발명자의 일부들이 보고하고 있는 칸디다ㆍ매그놀리아에(Candida magnoliae) 유래의 CRD 효소(이하, CMCRD 효소라 함)에 의해, 처음으로 실용적인 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르의 제조법이 제공되었다(WO98/35025). 이 CMCRD 효소는 열안정성, 유기 용제 내성이 우수하면서 효소 활성의 크기도 만족할 만한 것이다. 그러나, 보효소로서 NADPH를 이용하는 환원 효소이기 때문에, 보다 저가인 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르 제조법을 확립하기 위해서는, 고가이면서 화학적으로 불안정한 NADPH 대신에 저가이면서 화학적으로 안정한 다른 보효소, 예를 들면 NADH를 이용할 수 있는 것이 바람직하다고 생각된다.
일반적으로 산화 환원 효소를 이용한 광학 활성 알코올류의 제조에 있어서는, 산화 환원 효소가 이용하는 보효소의 효율적인 재생도 또한 중요한 과제이다. 예를 들면, β-니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산(이하, NADP라 함)이나 β-니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드(이하, NAD라 함) 등의 피리딘디뉴클레오티드 보효소를 재생하는 방법으로서, 예를 들면 글루코오스 탈수소 효소(이하, GDH라 함), 포름산 탈수소 효소(이하, FDH라 함), 알코올 탈수소 효소, 아미노산 탈수소 효소, 유기산 탈수소 효소(말산 탈수소 효소 등) 등을 포함하는 미생물, 그의 처리물, 및 부분 정제 또는 정제 효소를 이용하는 방법이 알려져 있다. 여기서, 예를 들면 GDH에는 NADP를 재생할 수 있는 것과 NAD를 재생할 수 있는 것이 있고, FDH는 NAD밖에 재생할 수 없는 등, 보효소의 종류에 따라서 그것을 재생하는 효소의 조합에는 어느 정도의 제한이 있다.
즉, CMCRD 효소와 같은 우수한 물성(안정성, 용제 내성, 산화 내성), 비활성을 갖는 효소의 보효소 의존성을, 상기 보효소를 재생하는 효소의 보효소 의존성으로 최적화하는 것이 가능해지면, 광학 활성 알코올 등의 제조에서의 공정의 최적화가 용이해지고, 보다 효율적인 제조 방법을 제공할 수 있다고 생각된다. 우수한물성, 비활성을 가지면서 원하는 기질 특이성 및 보효소 의존성을 갖는 효소를 스크리닝하는 것은 방대한 노동력을 요구하지만, 이미 알려져 있는 우수한 효소의 보효소 의존성, 기질 특이성 등의 기능을 자유자재로 제어할 수 있다면, 신속하면서 효율적인 제조 방법의 개량 및 확립이 가능해진다.
지금까지도 효소의 기질 특이성이나 보효소 의존성을 개변하려고 하는 시도가 행해지고 있고, 산화 환원 효소의 보효소 의존성을 변환시킨 예로서, 바실루스ㆍ스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래의 락트산 탈수소 효소[Biochem. Biophys. Res. Commun. 166, 667-672(1990)], 대장균 유래의 글루타티온 환원 효소[Nature, 343, 38-43(1990)], 대장균 유래의 이소시트르산 탈수소 효소[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11666-11670(1995)], 서머스ㆍ서모필러스 (Thermus thermophilus) 유래의 이소프로필 말산 탈수소 효소[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12171-12176(1996)], 슈도모나스ㆍ메발로니이(Pesudomonas mevalonii) 유래의 HMG-CoA 리덕타제[Biochemistry, 55, 11945-11950(1996)], 서모악티노마이세스ㆍ인터메디우스(Thermoactinomyces intermedius) 유래의 류신 탈수소 효소[Protein. Eng. 10, 687-690(1997)], 슈도모나스ㆍ플루오레센스 (Pesudomonas fluorescens) 유래의 p-히드록시 벤조산 히드록실라아제[J. Mol. Biol. 292, 87-96(1999)] 등의 효소에 관한 것에 대하여 보고되어 있다.
그러나, 이들 보고예의 대부분은 아미노산 서열로부터 얻어지는 서열 유사성의 정보를 중심으로 한 시행 착오적인 아미노산 변이에 의해 행해지고 있다. 일반적으로, 효소가 갖는 기능 및 물리 화학적 성질은 입체 구조와 밀접한 관계를 가지고 있기 때문에, 아미노산 서열로부터 얻어지는 정보를 중심으로 한 시행 착오적인 아미노산 변이 방법은, 반응성을 엄밀하게 제어하는 것과 같은 개변을 효소에 실시하는 경우에는, 매우 비효율적인 방법이라고 하지 않을 수 없다.
효소의 입체 구조에 기초를 둔 합리적인 아미노산 변이의 설계를 제창하고 있는 효소 개변의 보고예도 있지만, 원하는 보효소 의존성을 갖는 유사 효소의 보효소 결합 부위로 대체하고(키메라 효소를 제조하는 방법), 결합에 관여하는 잔기를 그의 입체 구조로부터 추정하며, 치환하는 아미노산 잔기종의 선택에 있어서는 유사 효소와의 아미노산 서열의 유사성을 참고로 하여 행하는 방법이 채용되고 있는 경우가 많다. 이러한 예에서는, 치환하는 아미노산 잔기를 선택하는 지표는 설계자의 경험 및 주관에 의해 좌우된다.
또한, 특정 각 아미노산 잔기의 기여를 객관적인 지표에 기초하여 어림하는 것은 행해지지 않아, 참으로 합리적인 효소 개변 설계라고 말할 수는 없다. 그 때문에, 얻어진 변이체가 원하는 기능을 가지지 않거나 또는 불충분한 경우에는 시행 착오의 실험을 반복할 필요가 생겨, 매우 효율이 나쁘다고 생각된다.
이러한 기술적인 문제로 인해, 종래의 개변 방법에서는 보효소 의존성에 변화가 보이지만, 얻어진 개변 효소가 실용적으로 충분한 효소 활성을 가지지 않거나, 예를 들면 NADP와 NAD 두가지 모두를 보효소로서 이용할 수 있는 변이체가 얻어져, 보효소 의존성을 엄밀하게 제어할 수 없는 등의 과제가 남아 있고, 공업 이용에 사용되는 실용적인 개변 효소의 취득은 달성하지 못하였다. 이들 과제를 해결하기 위해서 유효한 합리적인 효소 개변 설계법, 보다 바람직하게는 객관적인 자동 설계 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 산화 환원 효소의 보효소 의존성의 개변법, 특히 카르보닐 화합물을 부제적으로(asymmetrically) 환원하여 광학 활성 알코올을 생성하는 활성을 갖는 효소(이하, CRD 효소라 함)의 보효소 의존성의 개변법, 보효소 의존성이 환원형 β-니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산(이하, NADPH라 함)으로부터 환원형 β-니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드(이하, NADH라 함)로의 변환인 효소 개변법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 개변법에 의해 얻어지는 NADH 의존성을 갖는 CRD 효소 변이체, 이 효소 변이체를 코딩하는 DNA, 이 DNA를 갖는 플라스미드, 이 플라스미드로 형질 전환된 형질 전환 세포, 상기 효소의 제조 방법, 및 상기 효소 또는 상기 형질 전환 세포를 이용하는 광학 활성 알코올의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1은 CMCRD 효소-NADP 복합체의 입체 구조 모델의 모식도. 단, N 말단 영역인 위치 1 내지 17의 잔기를 제외한다.
도 2는 CMCRD 효소 변이체 S1M1의 pH 프로필.
도 3은 CMCRD 효소 변이체 S1M1의 온도 안정성.
도 4는 CMCRD 효소 변이체 S1M1의 유기 용제 내성.
도 5는 CMCRD 효소 변이체 S1M4의 pH 프로필.
도 6은 CMCRD 효소 변이체 S1M4의 온도 안정성.
도 7은 CMCRD 효소 변이체 S1M4의 유기 용제 내성.
<발명을 실시하기 위한 최선의 양태>
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서 중에서 「산화 환원 효소」란, 산화 환원 반응을 촉매하는 효소로서, 산화 환원 반응의 전자(수소) 공여체로서 예를 들면 NADP, NAD 등의 피리딘디뉴클레오티드 보효소, 유비퀴논 등의 퀴논류, 글루타티온 등의 디술피드 화합물, 시토크롬류, 프테리딘 화합물, 산소, 과산화 수소 등을 이용하는 효소를 말한다. 본 명세서 중에서 「카르보닐 환원 효소」란, 카르보닐 화합물을 부제적으로 환원하여 광학 활성 알코올을 생성하는 활성을 갖는 효소(CRD 효소)를 말한다.
본 명세서에서 아미노산, 펩티드, 단백질은 하기에 나타내는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(CBN)에서 채용된 약호를 사용하여 표시된다. 또한, 특별히 명시하지 않는 한 펩티드 및 단백질의 아미노산 잔기의 서열은 좌단으로부터 우단에 걸쳐 N 말단에서 C 말단이 되도록, 또한 N 말단이 1번이 되도록 표시된다. 아미노산 잔기의 관계는 "-"에 의해 표시된다. 예를 들면, Ala-Gly-Leu과 같이 표시된다. 동일한 아미노산 잔기가 연속되는 경우에는, 예를 들면 (Ala)3으로 표시되고, 이것은 Ala-Ala-Ala과 동의이다.
A=Ala=알라닌, C=Cys=시스테인, D=Asp=아스파라긴산, E=Glu=글루타민산, F=Phe=페닐알라닌, G=Gly=글리신, H=His=히스티딘, I=Ile=이소류신, K=Lys=리신, L=Leu=류신, M=Met=메티오닌, N=Asn=아스파라긴, P=Pro=프로인, Q=Gln=글루타민, R=Arg=아르기닌, S=Ser=세린 , T=Thr=트레오닌, V=Val=발린, W=Trp=트립토판, Y=Tyr=티로신, B=Asx=Asp 또는 Asn, Z=Glx=Glu 또는 GIn, X=Xaa=임의의 아미노산.
본 발명에 의해 제조되거나 고려되는 CRD 효소 변이체를 기술하는 데에 있어서, 참조를 용이하게 하기 위해서 (원래의 아미노산;위치;치환된 아미노산)의 명명법을 적용한다. 따라서, 위치 64에 있어서 티로신의 아스파라긴산으로의 치환은 Tyr64Asp 또는 Y64D로 표시된다. 다중 변이에 대해서는, 슬래쉬 기호("/")에 의해 나눔으로써 표기한다. 예를 들면 S41A/Y64D란, 위치 41의 세린을 알라닌으로, 또한 위치 64의 티로신을 아스파라긴산으로 치환하는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 효소의「변이체」란, 원래 효소의 아미노산 서열의 아미노산이 적어도 1개 이상 치환, 부가 또는 결실, 또는 수식된 아미노산 서열을 가지고, 원래 효소의 활성 중 적어도 일부를 보유하는 개변된 효소를 말한다.
본 명세서 중에서 변이체의 설계에 이용되는 아미노산 변이로서는, 아미노산의 치환 이외에 아미노산의 부가, 결실 또는 수식도 또한 들 수 있다. 아미노산의 치환이란, 원래의 펩티드를 1개 이상, 예를 들면 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산으로 치환하는 것을 말한다. 아미노산의 부가란, 원래의 펩티드 쇄에 1개 이상, 예를 들면 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산을 부가하는 것을 말한다. 아미노산의 결실이란, 원래의 펩티드로부터 1개 이상, 예를 들면, 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산을 결실시키는 것을 말한다.
이하, 변이체를 생성하기 위한 단백질의 아미노산의 변이에 대하여 설명한다. 아미노산의 치환 등을 실시하는 방법은, 화학 합성 또는 유전자 공학을 이용하는 기술에서 아미노산을 코딩하는 DNA 서열의 코돈을 변화시키는 것을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 변이체 분자의 「설계 방법」 또는 「분자 설계 방법」이란, 변이 전의 단백질 또는 폴리펩티드 분자(예를 들면, 천연형 분자)의 아미노산 서열 및 입체 구조를 해석함으로써 각 아미노산이 어떠한 특성(예를 들면, 촉매 활성, 다른 분자와의 상호 작용 등)을 담당하는 가를 예측하고, 원하는 특성의 개변(예를 들면, 촉매 활성의 향상, 단백질 안정성의 향상 등)을 가져오기 위해 적절한 아미노산 변이를 산출하는 것을 말한다. 이 설계 방법은 바람직하게는 컴퓨터를 사용하여 행해진다. 이러한 설계 방법에서 사용되는 컴퓨터 프로그램의 예로서는, 변이 도입 모델링을 위한 프로그램으로서 Swiss-PDBViewer(Swiss Institute of Bioinformatics(SIB), ExPASy Molecular Biology Server(http://www.expasy.ch/ 로부터 입수 가능함)), 단백질의 에너지 극소화, 분자 동력학 계산을 포함하는 구조 최적화를 위한 프로그램으로서 AMBER[D. A. Pearlman et al., AMBER4.1, University of California, San Francsico, 1995], PRESTO[Morikami K. et al., Comput. Chem., 16, 243-248(1992)], 최적 아미노산 변이를 산출하는 프로그램으로서 Shrike[일본 특허 출원 (평)11-368498: 일본 특허 공개 2001-184381] 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 산화 환원 효소의 보효소 의존성을 변환하는 효소 개변 방법에 대하여, CMCRD 효소를 예로 하여 하기에 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명이 특히 하기에 상술하는 CMCRD 효소로 한정되지 않고, 동일한 방법을 이용하면 CRD 효소를 비롯한 다양한 산화 환원 효소에 적용할 수 있는 것은, 당업자에는 자명하다.
그런데, CMCRD 효소의 입체 구조에 관하여, X선 결정 구조 해석을 비롯한 구조 해석 등의 실험은 행해져 있지 않고, 그의 입체 구조는 미지이다. 본 발명의 효소 개변 방법은 효소의 입체 구조를 이용함으로써 보다 효율적인 효소 변이체의 분자 설계를 달성하고 있다. 따라서, 우선 야생형 CMCRD 효소와 보효소 분자가 결합된 복합체의 입체 구조를 얻을 필요가 있기 때문에, 본 발명에서는 분자 모델링에 의한 CMCRD 효소의 입체 구조 예측 및 모델링을 행한다.
CMCRD 효소와 보효소와의 복합체의 입체 구조는 이하의 순서로 구축할 수 있다.
(1 단계) CMCRD 효소의 아미노산 서열을 기초로, 아미노산 서열 상동성을 가지면서 입체 구조가 단백질 데이타 뱅크(PDB)에 등록되어 있는 효소와의 다중 아미노산 서열 배열(alignment)을, 프로그램 ClustalX[Thompson, J. D. et al. Nucleic Acid Res. 22, 4673-80(1994)]에 의해 제조한다. 분자 모델링에 이용하는 CMCRD 효소와 아미노산 서열 상동성을 갖는 단백질은, PDB에 등록된 단백질의 아미노산 서열을 대상으로 프로그램 FASTA[Perason W. R. et al., Genomics, 46, 24-36(1997)]나 BLAST[Altschul, Stephen F. et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402(1997)]를 이용한 아미노산 서열 상동성의 검색을 행함으로써 선택할 수 있다. 다중 아미노산 서열 배열에 이용하는, 입체 구조가 이미 알려진 단백질로서는, CMCRD 효소의 아미노산 서열과 적어도 상동성 스코어(프로그램 BLAST에서의 E값)이1x10-5이하, 보다 바람직하게는 E값이 1×10-10이하인 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, PDB 코드가 1AE1, 2AE2, 1FMC, 1CYD, 1HDC, 1YBV, 1BDB, 1EDO인 단백질을 사용할 수 있다.
(2 단계) 다음으로 이들 입체 구조가 이미 알려진 단백질의 3차원 배열(입체 구조 배열)을 프로그램 MAPS[G. Lu, J. Appl. Cryst.(2000), 33: 176-183]에 의해 행하고, 먼저 아미노산 서열만으로부터 얻어진 다중 배열을 입체 구조의 유사성에 기초하여 수정하고, 분자 모델링에 이용하는 최종 다중 서열 배열을 얻을 수 있다. 서열 배열 수정은 입체 구조의 유사성을 기초로 하여 α-헬릭스나 β-시트 등의 2차 구조에 삽입이나 결실이 들어가지 않도록 실시하는 것이 바람직하다.
(3 단계) 얻어진 서열 배열에 기초하여 삽입, 결실 부위가 가능한 한 적고 입체 구조의 유사성이 높은 것으로 추정되는 단백질을 분자 모델링의 주형 단백질로서 선택할 수 있다. 예를 들면, PDB 코드가 1AE1, 2AE2, 1FMC, 1CYD, 1HDC, 1YBV, 1BDB, 1EDO 등의 효소, 보다 바람직하게는 1YBV, 1EDO 및 1FMC의 입체 구조를 주형으로서 이용할 수 있다. 이들 주형 단백질을 3차원 그래픽스 프로그램 Swiss PDB-Viewer로 표시하고, 2 단계에서 얻은 서열 배열에 따라서 CMCRD 효소의 아미노산 서열에 아미노산 잔기의 치환을 행할 수 있다.
(4 단계) 삽입, 결실 부위에 대해서는, PDB로부터 최적인 유사 부분 구조를 검색하여, 그 부분 구조에 치환함으로써 입체 구조 모델을 구축할 수 있다. 삽입, 결실 부위의 분자 모델링은 PDB에 등록되어 있는 고분해능의 입체 구조, 바람직하게는 분해능 2.0 Å 이하의 단백질의 입체 구조에 대하여, 삽입, 결실 부위의 주변을 포함하는 주형 단백질의 주쇄의 부분 구조에 가장 적합하는 부분 구조를 탐색함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 주형 단백질의 주쇄의 부분 구조의 원자 좌표에 대하여, 최소 제곱 중첩(least-square superposition) 조작을 행한 경우의 최소 제곱 편차(RMSD, root mean standard deviation)가 2.0 Å 이하가 되는 단백질의 부분 구조를 사용할 수 있다.
(5 단계) CMCRD 효소에 결합할 수 있는 보효소 NADP의 구조에 대해서는, s 효소의 입체 구조 상에서 NADP 분자를 수용 가능한 체적을 갖는 공간, 즉 크레프트부를 동정, 또한 크레프트부에 존재하는 아미노산 잔기군과 NADP 분자의 상호 작용을 동정함으로써 NADP의 원자 좌표를 결정할 수 있다.
NADP의 원자 좌표를 결정하는 방법으로서, 예를 들면 상기 입체 구조와 유사한 단백질 중에서 NADP를 결합하고 있는 것, PDB 코드, 1AE1, 2AE2, 1CYD, 1YBV 및 1EDO를 선택하고, 바람직하게는 1YBV를 선택하여 이 NADP의 원자 좌표를 대용하는 방법을 들 수 있다. 또한, 보효소가 결합하지 않은 CMCRD 효소만의 입체 구조 모델을 구축한 후, Autodock[(Oxrord Molecular), Guex, N 및 Peitsch, M.C. (1997)] 등의 분자 도킹 프로그램을 이용하고, 구조 에너지 등을 지표로 NADP 분자를 수용 가능한 체적을 갖는 공간, 즉 크레프트부의 동정, 크레프트부에 존재하는 아미노산 잔기군과 NADP 분자의 상호 작용을 동시에 동정하여 NADP 분자의 원자 좌표를 결정할 수 있다. 이들 방법에 의해 CMCDR 효소-NADP 복합체의 입체 구조 모델을 구축할 수 있다.
(6 단계) 최종적으로 구축한 입체 구조 모델은 에너지 극소화 계산 및 분자 동력학 계산에 의해 구조 최적화를 행할 수 있다. 구조 최적화 프로그램으로서는, 프로그램 AMBER, PRESTO 등을 이용할 수 있다.
상기 입체 구조 예측, 모델링의 방법을 적용함으로써, CMCRD 효소의 아미노산 서열과 30 ％ 이상, 보다 바람직하게는 50 ％ 이상, 또한 보다 바람직하게는 70 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CMCRD 효소의 효소 개변 방법에 사용하는 입체 구조 모델을 구축할 수 있다.
다음으로 CMCRD 효소의 활성 부위(촉매 부위 및 결합 부위)의 특정, 상기 활성 부위 근방에서 보효소 분자와 상호 작용하는 아미노산 잔기의 특정을 이하의 방법에 의해 행할 수 있다.
야생형 CMCRD 효소-보효소 복합체의 입체 구조 모델 및 유사 효소의 다중 서열 배열로부터, 아미노산 서열의 보존성이 높은 보효소(NAD 및(또는) NADP) 결합에 관여하는 공통 아미노산 서열, NAD(NADP) 결합 모티브를 발견하였다. CMCRD 효소 및 유사 CRD 효소의 공통 아미노산 서열은 (Gly 또는 Ala)-(Xaa)3-(Gly, Ala 또는 Thr)-(Ile 또는 Leu)-(Gly, Ala 또는 Ser)-(Xaa)10-(Gly 또는 Asn)일 수 있다. 또한, 3차원 그래픽스를 이용하여, 복합체의 입체 구조 상에서 이 공통 아미노산 서열을 포함하는 영역에 근접하는 영역, 바꾸어 말하면 효소와 보효소의 결합에 중요한 영역을 동정할 수 있다. 효소와 보효소의 결합에 중요한 영역으로 변이를 도입함으로써 보효소 의존성을 개변할 수 있다. 이와 같이 하여 선택된 부위로서,CMCRD 효소의 아미노산 잔기 위치 40 내지 69, 위치 87 내지 92 및 위치 225 내지 228, 보다 바람직하게는 위치 40 내지 69를 들 수 있다. 또한, 보다 바람직하게는 아미노산 잔기 위치 41 내지 43, 위치 47, 위치 63 내지 66, 위치 69를 선택 부위로서 들 수 있다. 또한, 거리를 지표로 하여, 보효소 분자와 상호 작용하는 아미노산 잔기를 선택하는 것도 가능하다. 예를 들면, 보효소 결합 부위로부터 12 Å 이내, 보다 바람직하게는 8 Å 이내의 거리를 지표로 하여, 변이를 도입하는 부위를 선택하는 것도 가능하다.
다음으로, 동정된 선택 영역에 존재하는 아미노산 잔기 중에서 보효소 NADP 또는 NADPH의 결합에 대한 기여가 큰 아미노산 잔기를, 구조 에너지 계산에 의한 보효소 분자와의 비결합 상호 작용의 평가, 정전 상호 작용에 주목한 정전 포텐셜 계산 등에 의해 동정된다. 예를 들면, 이하에 나타내는 정전 포텐셜 계산에 의해서, 보효소 NADP 또는 NADPH의 결합에 대한 선택 영역의 각 아미노산 잔기의 기여를 짐작할 수 있다.
우선, CMCRD 효소-NADP 복합체 구조에 있어서, NADP의 2' 인산 잔기(NAD의 경우, 이 인산 잔기는 존재하지 않음)의 인 원자의 위치에 -1의 음 전하만(그 밖의 모든 원자의 점 전하(point charge)는 0임)을 두고, 이 전하가 만드는 정전 포텐셜을 구한다(정전 포텐셜 계산[나카무라 등, (1987), J. Phys. Soc. Jpn. 56, 1609-1622]. 다음으로, 구한 정전 포텐셜에 대하여, 모든 아미노산 잔기의 원자에 점 전하를 제공하고, NADP의 2' 인산 이외의 모든 잔기의 인산 잔기에 놓인 -1의 전하에 대한 정전적인 기여를 계산한다. 이 계산에 의해, 각 아미노산 잔기의 NADP의결합 안정화의 크기를 구할 수 있다. 예를 들면, Ser42, Tyr64, Asn65, Ser66은 NADP의 2' 인산 잔기에 대하여 양의 정전장을 형성하여, NADP와의 결합의 안정화에 기여하는 것으로 추정할 수 있다.
이들 NADP 결합의 안정화에 기여하는 것으로 추정된 잔기를 NAD 결합에 적합한 아미노산으로 치환하면, CMCRD 효소의 보효소 의존성을 변환하는 것이 가능해진다. 아미노산 치환의 후보는 상기 잔기 부위에 대하여, CMCRD 효소-NADP 복합체 및 CMCRD 효소-NAD 복합체 구조 모델에 대하여 예를 들면 프로그램 Shrike(일본 특허 출원 (평)11-368498: 일본 특허 공개 2001-184381)를 이용한 계산기 스크리닝에 의해 행할 수 있다. 계산 변이 실험에서는, NADP에 대한 결합 에너지와 NAD에 대한 결합 에너지의 차이, 및 아미노산 치환에 따른 효소의 (열)안정성의 지표인 변성 자유 에너지를 지표로 아미노산 변이 후보를 산출할 수 있다. 또한, 입체 구조가 이미 알려진 CRD 효소의 보효소 결합 부위의 다중 아미노산 서열 배열도 아미노산 치환을 위한 참고로 이용할 수 있다.
본 발명의 효소 개변 방법에 따르면, CRD 효소에 조합되는 보효소 재생에 사용되는 효소의 보효소 의존성도 또한 개변할 수 있다. 또한, 고려되는 분자를 보효소로부터 기질로 바꾸면, 동일한 설계 방법을 적용함으로써 CRD 효소의 기질 특이성의 변환도 또한 가능해지는 것은 분명하다.
CMCRD 효소에 있어서, 본 방법에 의해 설계한 아미노산 치환 잔기 후보 중, NAD에 대한 결합이 강해진다고 추정된 각 부위에서의 변이 후보는,
- 위치 41에 있어서 A, G 또는 S;
- 위치 42에 있어서 A, G, S, T, R 또는 K;
- 위치 43에 있어서 A, G, S, T, Q, R 또는 K;
- 위치 64에 있어서 D;
- 위치 47에 있어서 A, S, T, Y, L, Q, E, R 또는 K;
- 위치 63에 있어서 A, S, L, I, V, M, F, W, C, T, S, N 또는 G;
- 위치 65에 있어서 L, I, V, M, F, W, A, C, S 또는 T;
- 위치 66에 있어서 L, I, V, A, C, S, T, N, Q, R 또는 K;
- 위치 69에 있어서 A, E, D 또는 S이다.
바람직하게는 S41A, S42A, S42R, S43Q, S43G, S43R, W63I, W63L, W63V, W63F, W63M, Y64D, N65I, N65V, S66N, S66L, Y47R, A69E를 변이 후보로서 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 CRD 효소 변이체로서 상기 단수의 변이를 조합한 변이체가 설계될 수 있다.
본 발명에서의 바람직한 CMCRD 효소 변이체로서, 천연의 CMCRD 효소로부터 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들의 조합에 의해 얻어지는 다음 변이체를 들 수 있다.
ㆍ CMCRD 효소 변이체 S41A/S42A/S43Q/W63I/Y64D/N65I/S66N.
ㆍ CMCRD 효소 변이체 S41A/S42A/S43Q/W63I/Y64D/N65V/S66L.
ㆍ CMCRD 효소 변이체 S41A/S42A/S43G/W63I/Y64D/N65I/S66L.
ㆍ CMCRD 효소 변이체 S41A/S42A/S43R/W63I/Y64D/N65I/S66N.
ㆍ CMCRD 효소 변이체 S41A/S42A/S43Q/Y47R/W63I/Y64D/N65I/S66N.
ㆍ CMCRD 효소 변이체 S41A/S42A/S43R/Y47R/W63I/Y64D/N65I/S66N.
ㆍ CMCRD 효소 변이체 S41A/S42R/W63I/Y64D/N65I/S66N.
ㆍ CMCRD 효소 변이체 S41A/S42R/Y47R/W63I/Y64D/N65I/S66N.
ㆍ CMCRD 효소 변이체 S41A/S42A/S43Q/W63I/Y64D/N65I/S66N/A69E.
이상의 방법에 의해 얻어지는 본 발명의 CRD 효소 변이체는 이하의 (1) 내지 (3)의 이화학적 성질을 갖는다:
(1) 작용:
NADH를 보효소로 하고, 4-클로로아세토아세트산에틸에 작용하여 (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸을 생성하고,
(2) 기질 특이성:
ㆍ 4-클로로아세토아세트산에틸에 대하여 강한 활성을 나타내고, 아세토아세트산에틸에는 실질적으로 활성을 나타내지 않으며,
ㆍ 4-클로로아세토아세트산에스테르에 대하여 강한 활성을 나타내지만, 4-할로-3-히드록시부티르산에스테르에 대하여 실질적으로 탈수소 효소 활성을 가지지 않고, 또한
(3) 보효소 의존성:
보효소로서 NADH를 제공한 경우에 강한 활성을 나타내지만, NADPH를 제공한 경우에는 실질적으로 활성을 나타내지 않는다.
하나의 실시 양태에 있어서, 상기 CRD 효소 변이체는 부가적으로 다음 이화학적 성질 (4) 내지 (7)을 더 갖는다:
(4) 바람직한 pH: pH 4.0 내지 7.0,
(5) 열안정성: pH 7.0에서 30 분간 처리하였을 때에 45 ℃까지 안정하고(45 ℃에서 30 분 처리하였을 때에 75 ％ 이상의 효소 활성을 유지하고 있음),
(6) 유기 용제 내성: 아세트산에틸, 아세트산부틸 또는 디이소프로필에테르에서 pH 7.0, 25 ℃, 30 분간 처리하였을 때, 적어도 85 ％의 효소 활성을 유지하고 있고, 또한
(7) 분자량: 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드-폴리아크릴아미드 전기 영동 분석에서 약 32,000.
본 발명의 CRD 효소 변이체는,
a) CRD 효소에 대하여 코딩하는 유전자에 1 이상의 변이, 바람직하게는 상기 변이를 도입하고,
b) 공정 a)에서 얻은 변이 유전자를 클로닝 벡터에 클론화하고,
c) 공정 b)에서 얻은 재조합 벡터로 숙주주를 형질 전환하여,
d) 공정 c)와 같이 형질 전환된 숙주주를 적절한 배지에서 배양하고, 마지막으로
e) 이렇게 해서 얻은 CRD 효소 변이체를 분리, 정제하는 것을 포함하는 방법으로 상기 변이체를 제조할 수 있다.
유전자에의 변이의 도입은 특별히 한정되지 않지만, 부위 특이적 변이법 등의 공지된 시험관내 변이 기술 중 하나를 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면 상기 CMCRD 효소 변이체의 경우, 변이 도입은 이하와 같이 행할 수 있다. 도입되어야할 아미노산 변이는 모두 야생형 CMCRD 효소 유전자 길이 약 170 bp의 제한 효소 EcoO109I-EcoO109I 부위 사이에 존재한다. 따라서, 이 부위에 상당하는 변이 도입된 DNA 단편을 합성하고, 야생형 CMCRD 효소의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pNTS1(W098/35025)의 EcoO109I-EcoO109I 부위를 상기 DNA 단편으로 치환함으로써 변이를 도입할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진, 서열 1 내지 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 합성, pUC18의 PstI 사이트에 서브클로닝한 플라스미드 pUCSYN181 내지 pUCSYN189를 사용하여 대장균 JM109 또는 HB101을 형질 전환할 수 있다. 목적하는 DNA 단편은, 얻어진 형질 전환체로부터 플라스미드를 회수하여 EcoO109I로 소화한 후 분취용 폴리아크릴아미드 전기 영동으로 단리할 수 있다. 한편, 플라스미드 pNTS1을 EcoO109I로 소화한 후, 분취용 아가로오스 겔 전기 이동에 의해 약 3.2 kb의 DNA 단편을 회수할 수 있다. 양(兩) DNA 단편을 결합함으로써 pNTS1의 EcoO109I-EcoO109I 부위에 변이 유전자를 삽입한 재조합 플라스미드 pNTS1M1, pNTS1M2, pNTS1M3, pNTS1M4, pNTS1M5, pNTS1M6, pNTS1M7, pNTS1M8 및 pNTS1M9를 구축할 수 있다. 도입되는 아미노산 변이는, 재조합 플라스미드에 대하여 PCR에 의해 변이 부위를 포함하는 DNA 단편을 제조하고, 염기 서열을 확인함으로써 행할 수 있다. CMCRD 효소 유전자는 플라스미드 pNTS1의 NdeI-EcoRI 부위에 삽입되어 있기 때문에, NdeI 사이트 상류의 염기 서열을 갖는 프라이머가 염기 서열 해석용 DNA 단편의 제조에 바람직하게 사용될 수 있다.
얻어진 CRD 효소 유전자를 갖는 재조합 플라스미드는 통상법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 숙주 세포로서는 특별히 한정되지 않고, 세균, 효모, 사상균, 식물 세포, 동물 세포 등이 사용되지만, 대장균의 사용이 특히 바람직하다. 숙주에의 플라스미드의 도입은 당업자에게 주지된 방법, 예를 들면 적격 상태인 숙주 세포와 재조합 플라스미드를 혼합하는 공정을 포함하는 방법, 핼퍼ㆍ플라스미드를 이용하여 접합 전달에 의해 이입하는 공정을 포함하는 방법 등을 들 수 있다. 예를 들면, 대장균 JM109 또는 HB101을, 상기 플라스미드로 형질 전환하여 CRD 효소 변이체를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 4-클로로아세토아세트산에스테르에 대한 환원 활성은 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 4-클로로아세토아세트산에스테르에 대한 환원 활성 측정법: 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 6.5), NADH 또는 NADPH-0.167 mM, 4-클로로아세토아세트산에틸-1 mM 및 효소를 포함하는 반응액 중 30 ℃에서 반응시키고, NADH 또는 NADPH의 감소에 따른 340 nm의 흡광도의 감소를 측정한다. 1 U은 1 분간에 1 μmol의 NADH 또는 NADPH의 감소를 촉매하는 효소량으로 한다. 한편, 보효소로서 NADH 또는 NADPH를 이용할 수 없는 경우에는, 이 조건에서는 340 nm에서의 흡광도의 감소는 약간밖에 관찰되지 않는다. 또한, 단백질의 정량은 바이오라드사 제조 단백질 분석 키트를 이용한 색소 결합법에 의해 행한다.
본 발명의 효소 개변 방법을 이용하여, 보효소로서 NADH를 제공할 때에 높은 효소 활성을 나타내지만, NADPH를 제공할 때에는 전혀 효소 활성을 나타내지 않는, 즉, 보효소로서 NADH를 엄격히 인식하여 이용하는 것을 특징으로 하는 CRD 효소 변이체를 얻을 수 있다.
상기 CRD 효소 변이체는 4-클로로아세토아세트산에스테르에 대하여 높은 환원 활성을 갖는 한편, 4-할로-3-히드록시부티르산에스테르의 어떤 광학 이성체에 대해서도 실질적으로 탈수소 효소 활성(즉, 산화 활성)을 나타내지 않는다. 탈수소 효소 활성을 실질적으로 나타내지 않는 것은, 기질이 되는 4-할로-3-히드록시부티르산에스테르에 NAD 존재하에서 접촉시켰을 때에, NADH의 증감에 따른 340 nm의 흡광도의 단위 시간 당 변화율이 4-클로로아세토아세트산에스테르를 100으로 하는 상대 활성으로서 5 ％ 이하, 보다 바람직하게는 1 ％ 이하인 경우에 탈수소 효소 활성을 실질적으로 나타내지 않는다고 할 수 있다.
또한, 상기 CRD 효소 변이체는 아세토아세트산에스테르에 대한 환원 효소 활성을 실질적으로 나타내지 않는다. 이들 효소 활성의 지표에 대해서도 앞서 서술한 것과 동일하게, 4-클로로아세토아세트산에스테르를 100으로 하는 상대 활성으로서 5 ％ 이하, 보다 바람직하게는 1 ％ 이하인 경우에 탈수소 효소 활성 또는 환원 효소 활성을 실질적으로 나타내지 않는다고 할 수 있다.
본 발명에 있어서, CRD 효소 변이체의 효소 활성 및 보효소 의존성의 해석은, 예를 들면 상기 효소를 코딩하는 DNA가 도입된 형질 전환체를 이용하여 다음과 같이 하여 행할 수 있다. 일례로서, 형질 전환체가 재조합 대장균 HB101(pNTS1M1)인 경우에는, 50 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 적절한 조성의 배지, 바람직하게는 LB 배지 및 2×YT 배지, 보다 바람직하게는 2×YT 배지에서 배양할 수 있다. 원심 분리 등에 의해 균을 집균한 후, 적절한 pH를 나타내는 완충액, 예를 들면 10 내지 100 mM 인산 완충액 pH 6 내지 8, 10 내지 100 mM 트리스 완충액 pH 6 내지 8, 보다 바람직하게는 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에 현탁시키고, 초음파 파쇄에 의해무세포 추출액을 제조할 수 있다. 무세포 추출액 중의 CMCRD 효소 활성을 상기 측정법에 의해 행하고, 동일한 방법으로 제조한 야생형 CMCRD 효소 유전자를 갖는 플라스미드로 형질 전환한 대장균 HB101(pNTS1)의 활성을 측정하여, 이들을 비교한다. 예를 들면, 상기 CMCRD 효소 변이체는 보효소로서 NADH를 이용하여 4-클로로아세토아세트산에스테르의 환원 반응을 행하고, 보효소로서 NADPH를 이용한 경우, 전혀 환원 활성을 나타내지 않는다. 이로부터, 목적하는 보효소 의존성의 변환(반전)에 성공한 것을 확인할 수 있다.
얻어진 배양물로부터의 효소의 추출 및 정제를 위해서는, 당업자가 통상 이용할 수 있는 효소의 추출 정제법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 배양액으로부터 균체를 원심 분리한 후, 균체를 적당한 완충액 중에 현탁시키고, 이 균체를 유리 비드, 초음파 등의 물리적 방법, 효소 등의 생화학적 방법 등을 이용하여 파쇄 또는 용해시키고, 또한 원심 분리에 의해 상기 용액 중의 고형물을 제거함으로써 효소의 조효소액을 얻을 수 있다. 상기 조효소액을 당업자가 통상 이용하는 방법, 예를 들면 황산암모늄 침전, 투석, 크로마토그래피를 단독으로 또는 조합하여 이용함으로써 더욱 정제할 수 있다. 크로마토그래피는 소수 크로마토그래피(예를 들면, 페닐세파로오스), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, DEAE 세파로오스), 겔 여과 등의 각종 크로마토그래피를 단독으로 또는 조합하여 이용함으로써 본 발명의 CRD 효소 변이체를 얻을 수 있다.
본 발명에서는, 상기 CRD 효소 변이체를 이용하여 케톤을 환원함으로써 알코올을 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 CRD 효소 변이체는, NADPH에 비해 저가이면서 안정한 NADH를 보효소로서 이용할 수 있기 때문에 공업적인 이용에서 유리하다. 효소 분자, 그의 처리물, 효소 분자를 포함하는 배양물, 또는 효소를 생성하는 미생물 등의 형질 전환체를 살아있는 상태로 반응 용액과 접촉시킴으로써 목적하는 효소 반응을 행하게 할 수 있다. 또한, 효소와 반응 용액의 접촉 형태는 이들 구체예로 한정되는 것은 아니다. 반응 용액은, 기질이나 효소 반응에 필요한 보효소인 NADH를 효소 활성의 발현에 바람직한 환경을 제공하는 적당한 용매에 용해시킨 것이다. 본 발명에서의 CRD 효소 변이체를 포함하는 미생물의 처리물에는, 구체적으로는 계면활성제나 톨루엔 등의 유기 용매 처리에 의해 세포막의 투과성을 변화시킨 미생물, 또는 유리 비드, 초음파나 효소 처리에 의해 균체를 파쇄한 무세포 추출액이나 그것을 부분 정제한 것 등이 포함된다.
본 발명에 의한 알코올의 제조 방법에서의 원료가 되는 케톤으로서는, 인접하는 디케톤을 갖는 2,3-부탄디온이나 4-할로아세토아세트산에스테르 유도체가 바람직하게 사용된다. 4-할로아세토아세트산에스테르 유도체의 할로겐으로서는 브롬, 염소, 요오드를 들 수 있고, 특히 염소가 바람직하게 사용된다. 에스테르로서는 메틸에스테르, 에틸에스테르, 프로필에스테르, 이소프로필에스테르, 부틸에스테르, 옥틸에스테르, 벤질에스테르 등의 직쇄, 분지쇄, 방향족 치환을 포함하는 알코올 에스테르를 들 수 있지만, 에틸에스테르가 가장 바람직하게 사용된다. 4-할로아세토아세트산에스테르 유도체로서는, 2위치에 직쇄 또는 분지쇄를 포함하는 알킬기, 염소, 브롬, 요오드 등의 할로겐을 포함하는 유도체 등을 들 수 있다.
광학 활성 알코올의 일종인 광학 활성 4-할로-3-히드록시부티르산에스테르는, 예를 들면 이하와 같이 하여 취득된다. 기질로서는, 하기 화학식 1로 표시되는 4-할로아세토아세트산에스테르가 사용될 수 있다. R3이 알킬기인 경우, R3은 예를 들면 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기 및 이소프로필기 등이다. R3이 아릴기인 경우, R3은 예를 들면 페닐기 또는 톨릴기 등이다. 이들 R3이 치환된 아릴기인 경우, R3은 예를 들면 플루오로페닐기, 클로로페닐기 등이다.
식 중, R1은 할로겐 원자이고, R2는 수소이고, R3은 치환되거나 비치환된 알킬기 또는 아릴기를 나타낸다.
바람직하게는 R1이 염소 또는 브롬이고, R3이 탄소수 1 내지 4의 알킬기이다. 보다 바람직하게는, 상기 기질이 4-클로로아세토아세트산메틸, 4-클로로아세토아세트산에틸, 4-브로모아세토아세트산메틸 또는 4-브로모아세토아세트산에틸이다. 또한, 상기 기질로서 4-요오드아세토아세트산에틸, 4-히드록시아세토아세트산에틸, 2-클로로-3-옥소부티르산에틸, 2-메틸-3-옥소부티르산에틸, 4-아지도아세토아세트산에틸 등도 사용할 수 있다.
상기 4-할로아세토아세트산에스테르는, 예를 들면 일본 특허 공개 (소)61-146191에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면 4-할로아세토아세트산에스테르는, 디케텐을 출발 원료로 하여 이것에 할로겐을 반응시켜 4-할로아세토아세트산할라이드로 만든 후, 이것에 알코올을 작용시키는 방법, 또는 아세토아세트산에스테르를 출발 원료로 하여 아세토아세트산에스테르의 4위치를 직접 할로겐화하는 방법 등에 의해 제조된다.
반응은 수 중 또는 물에 용해되기 어려운 유기 용매, 예를 들면 아세트산에틸, 아세트산부틸, 톨루엔, 클로로포름, n-헥산 등의 유기 용매 중, 또는 수성 매체와의 2상계 등의 적당한 용매 중에, 기질 4-할로아세토아세트산에스테르, 보효소 NADH 및 상기 형질 전환 미생물의 배양물 또는 그의 처리물 등을 첨가하고, pH 조정하에 교반함으로써 행할 수 있다. 반응은 온도 10 ℃ 내지 70 ℃, pH 4 내지 10에서 행한다. 또한, 기질의 투입 농도는 0.1 ％ 내지 90 ％(w/v)이지만, 기질을 연속적으로 첨가할 수 있다. 반응은 배치 방식 또는 연속 방식으로 행할 수 있다. 본 발명의 반응은 고정화 효소, 막 반응기 등을 이용하여 행하는 것도 가능하다.
여기서, 미생물의 처리물 등이란, 예를 들면 조 추출액, 배양 균체, 동결 건조 생물체, 아세톤 건조 생물체 또는 이들 균체의 분쇄물 등을 의미한다. 또한, 이들은 효소 자체 또는 균체 그대로 공지된 수단으로 고정화하여 사용할 수 있다. 고정화는 당업자에게 주지된 방법(예를 들면, 가교법, 물리적 흡착법, 포괄법(inclusion) 등)으로 행할 수 있다.
이들 환원 반응에 수반하여 NADH로부터 생성하는 NAD의 NADH로의 재생은, 미생물이 갖는 NAD 환원능(해당계, 메틸로트로프(methylotroph)의 C1 화합물 동화 경로 등)을 이용하여 행할 수 있다. 이들 NAD 환원능은 반응계에 글루코오스나 에탄올, 포름산 등을 첨가함으로써 증강하는 것이 가능하다. 또한, NAD로부터 NADH를 생성하는 능력을 갖는 미생물이나 그의 처리물, 효소를 반응계에 첨가함으로써도 행할 수 있다. 예를 들면, GDH, FDH, 알코올 탈수소 효소, 아미노산 탈수소 효소 또는 유기산 탈수소 효소(말산 탈수소 효소 등) 등의 부분 정제 또는 정제 효소, 이들 효소를 포함하는 미생물 및 그의 처리물을 이용하여 NADH의 재생을 행할 수 있다.
하나의 실시 양태에 있어서, 고가인 보효소의 사용량을 대폭 감소시키기 위한 대표적인 NADH 재생계로서는, 예를 들면 GDH 및 글루코오스를 이용하는 방법을 들 수 있다. 반응 조건은 사용되는 효소, 미생물 또는 그의 처리물, 기질 농도 등에 따라 다르지만, 기질 농도는 약 0.1 내지 90 중량%, 반응 온도는 10 내지 50 ℃, pH는 4 내지 8, 반응 시간은 1 내지 60 시간이다.
CRD 효소 변이체 유전자 및 이 효소가 의존하는 보효소를 재생하는 능력을 갖는 효소(예를 들면, GDH나 FDH)의 유전자를 동일한 숙주 미생물내에 도입한 형질 전환 미생물의 배양물 또는 그의 처리물 등을 이용하여 동일한 반응을 행하면, 별도로 보효소의 재생에 필요한 효소원을 제조할 필요가 없기 때문에, 보다 저비용으로 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르를 제조할 수 있다.
반응에서 생긴 4-할로-3-히드록시부티르산에스테르는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들면, 4-할로-3-히드록시부티르산에스테르는, 미생물을 이용한 경우 등에는 필요에 따라 원심 분리, 여과 등의 처리를 실시하여 균체 등의 현탁물을 제거하고, 계속해서 아세트산에틸, 톨루엔 등의 유기 용매로 추출하며 황산나트륨 등의 탈수제로 탈수하고, 유기 용매를 감압하에 제거하며 감압 증류 또는 크로마토그래피 등(예를 들면, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피)의 처리를 행함으로써 정제할 수 있다.
4-할로-3-히드록시부티르산에스테르는 가스 크로마토그래피로 정량될 수 있다. 예를 들면, 4-클로로-3-히드록시부티르산에틸의 정량은 PEG-20 M Chromosorb WAWDMCS 10 ％ 80/100 메쉬(지엘 사이언스사 제조)를 충전한 유리 컬럼(ID 3 mm×1 m)을 사용하여 150 ℃에서 크로마토그래피를 행하고, FID에 의해 검출함으로써 행할 수 있다.
(S)-4-할로-3-히드록시부티르산에틸의 광학 순도의 측정은 광학 분리 컬럼 CHIRALCEL OB(다이셀 가가꾸사 제조)를 이용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 행할 수 있다.
이상과 같이, 본 발명에 따르면, CMCRD 효소 변이체의 대량 생산이 가능하다. 또한, 이 효소 변이체를 이용함으로써 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르를 비롯한 광학 활성 알코올의 우수한 제조법이 제공된다.
본 발명은 상술한 바와 같은 과제를 해결하기 위한, 산화 환원 효소의 보효소 의존성을 변환하는 합리적인 효소 개변 방법의 제공을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 개변 방법에 의해 NADH를 보효소로서 이용할 수 있는 CRD 효소 변이체, 이 CRD 효소 변이체를 코딩하는 DNA 및 이것을 도입한 재조합체를 제공하고, 이들을 이용한 광학 활성 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 산화 환원 효소의 보효소 의존성을 변환하는 효소 개변 방법을 새롭게 개발하고, 이 효소 개변 방법에 의해 NADH를 보효소로서 이용할 수 있는 CRD 효소 변이체의 제조에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 산화 환원 효소의 보효소 의존성을 변환시키기 위한 효소 개변 방법으로서, 상기 산화 환원 효소의 미리 선택된 부위의 단수 또는 복수의 임의의 아미노산 잔기를 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들을 조합함으로써 보효소 분자의 결합 에너지의 크기를 제어하는 것을 특징으로 하는 효소 개변 방법에 관한 것이다.
그의 바람직한 실시 양태로서는, 산화 환원 효소의 활성 부위를 특정하는 공정과, 상기 활성 부위 근방에서 보효소 분자와 상호 작용하는 아미노산 잔기를 결정하는 공정과, 상기 결정 잔기에 대하여 보효소 분자의 결합 에너지의 크기를 제어하기 위한 변이 처리를 행하는 공정을 포함하는 상기 효소 개변 방법에 관한 것이다.
더욱 바람직한 실시 양태로서는, 상기 활성 부위를 특정하는 공정에서 분자 모델링법에 의한 입체 구조 예측을 행하고, 보효소 분자를 수용하기 위해서 가능한 체적을 갖는 크레프트(cleft)부를 검색하며, 유사 효소 단백질과의 아미노산 서열 비교를 행하여 상기 크레프트부를 구성하는 아미노산 잔기 중에서 효소와 보효소 분자의 결합에 중요하다고 추정되는 아미노산 잔기를 추출하는 처리를 더 포함하는 상기 효소 개변 방법에 관한 것이다.
다른 바람직한 실시 양태로서는, 산화 환원 효소가 보효소 분자로서 피리딘뉴클레오티드 보효소를 이용하는 산화 환원 효소인 상기 효소 개변 방법에 관한 것이다.
또다른 바람직한 실시 양태로서는, 산화 환원 효소가 카르보닐 환원 효소인 상기 효소 개변 방법에 대하여, 특히 바람직하게는 칸디다ㆍ매그놀리아에(Candida magnoliae) IFO 0705 유래의 카르보닐 환원 효소인 상기 효소 개변 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 야생형 카르보닐 환원 효소로부터 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들의 조합에 의해 얻어지고, 다음에 나타내는 이화학적 성질을 갖는 카르보닐 환원 효소 변이체:
(1) 작용:
NADH를 보효소로 하고, 4-클로로아세토아세트산에틸에 작용하여 (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸을 생성한다,
(2) 기질 특이성:
ㆍ 4-클로로아세토아세트산에틸에 대하여 강한 활성을 나타내고, 아세토아세트산에틸에는 실질적으로 활성을 나타내지 않으며,
ㆍ 4-클로로아세토아세트산에스테르에 대하여 강한 활성을 나타내지만, 4-할로-3-히드록시부티르산에스테르에 대하여 실질적으로 탈수소 효소 활성을 가지지 않고, 또한
(3) 보효소 의존성:
보효소로서, NADH를 제공한 경우에 강한 활성을 나타내지만, NADPH를 제공한 경우에 실질적으로 활성을 나타내지 않는다.
에 대하여, 바람직하게는 또한 이하의 (4) 내지 (7)의 이화학적 성질을 갖는 카르보닐 환원 효소 변이체:
(4) 바람직한 pH: pH 4.0 내지 7.0,
(5) 열안정성: pH 7.0에서 30 분간 처리하였을 때에 45 ℃까지 안정하고,
(6) 유기 용제 내성: 아세트산에틸, 아세트산부틸 또는 디이소프로필에테르에서 pH 7.0, 25 ℃, 30 분간 처리하였을 때, 적어도 85 ％의 효소 활성을 유지하고 있고, 또한
(7) 분자량: 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 전기 영동 분석에서 약 32,000에 대하여, 더욱 바람직하게는 상기 야생형 카르보닐 환원 효소가 칸디다ㆍ매그놀리아에 IFO 0705 유래의 카르보닐 환원 효소인 카르보닐 환원 효소 변이체에관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 효소 개변 방법에 의해 얻어진 산화 환원 효소 변이체, 그 효소 변이체를 코딩하는 DNA, 그 DNA를 갖는 플라스미드, 그 플라스미드에 의해 형질 전환된 형질 전환 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 형질 전환 세포를 배양ㆍ증식시키는 공정을 포함하는 카르보닐 환원 효소 변이체의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 효소 변이체와, 이 효소 변이체가 의존하는 보효소를 재생하는 능력을 갖는 효소 및(또는) 그의 변이체와, 카르보닐 화합물을 반응시키는 공정, 및 생성된 광학 활성 알코올을 채취하는 공정을 포함하는 광학 활성 알코올의 제조 방법에 관한 것이다.
이하의 실시예에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명을 예시할 목적으로 제공되는 것으로, 전혀 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
<실시예 1> 칸디다ㆍ매그놀리아에 IFO 0705 유래의 CRD 효소의 입체 구조 모델링
칸디다ㆍ매그놀리아에 IFO 0705 유래의 CRD 효소(CMCRD 효소)의 아미노산 서열(W098/35025)을 기초로, 단백질 데이타 뱅크(PDB)에 등록되어 있는 입체 구조가이미 알려진 환원 효소(PDB 코드: 1AE1, 2AE2, 1FMC, 1CYD, 1HDC, 1YBV, 1BDB)와의 다중 아미노산 서열 배열을, 프로그램 ClustalX[Thompson, J. D. et al. Nucleic Acid Res. 22, 4673-80(1994)]에 의해 제조하였다. 다음으로 이들 구조가 이미 알려진 환원 효소의 3차원 배열(입체 구조 배열)을 프로그램 MAPS[G. Lu, J. Appl. Cryst. (2000), 33:176-183]에 의해 행하여 입체 구조가 유사한 부분의 아미노산 서열과의 대응을 조사하였다. 상기 아미노산 서열만으로부터 얻어진 다중배열을 이 입체 구조 정보에 기초하여 수정하고, 모델링에 사용되는 최종 다중 서열 배열을 얻었다. 수정은 입체 구조 정보를 기초로 하여 α-헬릭스나 β-시트 등의 2차 구조에 삽입이나 결실이 들어가지 않도록 행하였다. 얻어진 배열에 기초하여, 기초가 되는 입체 구조에 l1YBV와 1FMC 2개의 효소의 입체 구조를 선택하여 3차원 그래픽스 프로그램 Swiss PDB-Viewer(Swiss Institute of Bioinformatics(SIB), ExPASy Molecular Biology Server(http://www.expasy.ch/로부터 입수 가능)) 상에서 아미노산 잔기의 치환을 행하고, 삽입, 결실 부위에 대해서는 PDB로부터 최적인 유사 부분 구조를 검색하여, 그 부분 구조에 치환함으로써 원자 좌표를 구축하였다. 보효소 NADP의 원자 좌표에 대해서는, 1YBV의 NADP의 원자 좌표를 대용함으로써 구축하였다. 최종적으로 구축한 입체 구조 모델은 에너지 극소화 계산 및 분자 동력학 계산에 의해 구조 최적화를 행하였다. 이하, 분자 모델링의 상세한 순서를 나타낸다.
(1) 1YBV의 위치 14-215의 아미노산 서열(CMCRD 효소의 위치 18 내지 227에 대응함)을 CMCRD 효소의 서열로 Swiss PDB-Viwer로 아미노산 치환을 행하였다. 아미노산 측쇄의 입체 구조에 대해서는, 주변 잔기와의 접촉이 없는 것을 Swiss PDB-Viwer가 보유하는 로타머 라이브러리(Rotamer Library)로부터 그래픽스 상에서 선택하였다.
(2) 프로그램 MAPS로써 1FMC의 입체 구조를 1YBV의 입체 구조에 최소 제곱 중첩 조작을 행하였다.
(3) 1FMC의 위치 197 내지 249의 아미노산 서열(CMCRD 효소의 위치 228 내지 279에 대응)을 CMCRD 효소의 아미노산 서열로 Swiss PDB-Viwer로 아미노산 치환을 행하였다. 아미노산 치환에 있어서는, 근방 잔기와의 입체 장해를 고려하여 Swiss PDB-Viewer가 내장하고 있는 아미노산 측쇄의 입체 구조 데이타베이스(로타머 라이브러리)로부터, 가장 접촉 에너지가 적은 측쇄 입체 구조를 선택하였다.
(4) CMCRD 효소의 C 말단 영역(위치 280 내지 283)은 1HDC의 C 말단 영역(위치 242 내지 245)의 주쇄 구조를 이용하여, CMCRD 효소의 아미노산 서열로 Swiss PDB-Viwer로 아미노산 치환을 행하였다.
(5) 다음으로, 하기 부위에서의 삽입, 결실 부위의 모델링을 행하였다. 삽입, 결실은 PDB로부터 최적인 유사 부분 구조를 검색하여, 그 부분 구조로 치환함으로써 주쇄 원자 좌표를 구축하였다.
ㆍ CMCRD 효소의 위치 64 내지 65 사이에서의 1 잔기의 결실
ㆍ CMCRD 효소의 위치 119 내지 138의 2 잔기의 결실
ㆍ CMCRD 효소의 위치 154 내지 171에서의 7 잔기의 삽입
ㆍ CMCRD 효소의 위치 181 내지 190에서의 1 잔기의 삽입
ㆍ CMCRD 효소의 위치 207 내지 215에서의 1 잔기의 결실
ㆍ CMCRD 효소의 위치 233 내지 234에서의 1 잔기의 결실
(6) 삽입, 결실을 끝낸 1YBV로부터 모델링한 CMCRD 효소의 전반 부분, 1FMC로부터의 CMCRD 효소의 후반 부분, 1HDC로부터의 C 말단 영역의 원자 좌표를 합함으로써 초기 입체 구조 모델을 구축하였다.
(7) 재차 모든 잔기에 대하여, 아미노산 측쇄의 입체 구조를 체크하여 입체 장해 등을 제거하였다.
(8) 최종적으로는, 프로그램 AMBER 4.1[D. A. Pearlman et al., AMBER 4.1, University of California, San Francsico, 1995)]을 이용하여, CMCRD 효소(위치 14 내지 283)와 NADPH 복합체를 수 중에서의 에너지 극소화 계산 및 분자 동력학 계산에 의해 모델의 구조 최적화를 행하고, 이것을 분자 설계에 사용하였다. 도 1에 CMCRD 효소-NADP 복합체의 입체 구조를 모식도로 나타내었다.
<실시예 2> CRD 효소 변이체의 설계
실시예 1에서 얻은 야생형 CMCRD 효소(NADPH 의존)의 입체 구조 모델 및 유사 효소의 입체 구조로부터, 보효소 결합 영역에서 NAD(NADP) 결합 모티브(Gly-(X)3-Gly-(Ile/Leu)-Gly-(X)10-Gly)을 동정하였다. 또한, 이 결합 루프 상에 존재하는 아미노산 잔기 중에서, NADP의 결합에 대한 기여가 큰 아미노산 잔기를 정전 포텐셜 계산에 의해 이하의 순서로 동정하였다. 우선, CMCRD 효소-NADP 복합체 구조에 있어서, NADP의 2' 인산 잔기의 인 원자 위치에 -1의 음전하만(그 밖의 모든 원자의 점 전하는 0임)을 두고, 이 전하가 만드는 정전 포텐셜을 구하였다. 다음으로, 구한 정전 포텐셜에 대하여 모든 아미노산 잔기의 원자에 점 전하를 제공하고, NADP의 2' 인산 이외의 모든 잔기의 인산 잔기에 있는 -1의 전하에 대한 정전적인 기여를 계산하였다. 음의 기여가 큰 순서로 재배열하여 상위, 하위 각각 5 번째까지를 표 1에 나타내었다.
Ser42, Tyr64, Asn65, Ser66은 NADP의 2' 인산 잔기에 대하여 양의 정전장을 만들기 때문에, NADP와의 결합을 안정화하는 데 기여하는 것으로 추정되었다. 이들 잔기를 NAD 결합에 적합한 아미노산으로 치환하면, CMCRD 효소의 보효소 의존성을 변환하는 것이 가능해진다. 아미노산 치환의 후보는 상기 부위에 대하여, CMCRD 효소-NADP 복합체 구조 모델에 대하여 프로그램 Shrike(일본 특허 공개 2001-184381)를 이용한 계산기 스크리닝에 의해 행하였다. 계산 변이 실험에서는, NADP에 대한 결합 에너지와 NAD에 대한 결합 에너지의 차, 및 아미노산 치환에 따른 효소의 (열)안정성의 지표인 변성 자유 에너지를 지표로 아미노산 변이 후보를 산출하였다. 또한, 하기 표 2에 나타내는, 입체 구조가 이미 알려진 카르보닐 환원 효소의 보효소 결합 부위의 다중 아미노산 서열 배열도 아미노산 치환을 위한 참고로 이용하였다.
본 방법에 의해 설계한 아미노산 치환 잔기 후보 중, NAD에 대한 결합이 강해진다고 추정된 상위의 것은 S41A, S42A 또는 S42R, S43Q, S43G 또는 S43R, W63I, W63L, W63V, W63F 또는 W63M, Y64D, N65I 또는 N65V, S66N 또는 S66L, Y47R, A69E 등이다. 이들 아미노산 치환 잔기 후보의 Cα 탄소 원자 위치는, CMCRD 효소-NADP복합체 구조에 있어서 보효소 분자 NADP의 2' 인산 잔기의 인 원자로부터, 각각 S41에서는 6.9 Å, S42에서는 5.1 Å, S43에서는 6.1 Å, Y47에서는 9.2 Å, W63에서는 8.3 Å, Y64에서는 5.1 Å, N65에서는 4.5 Å, S66에서는 4.3 Å, A69에서는 8.0 Å의 거리이고, 모두 보효소 분자로부터 12 Å 이내의 거리에 있는 아미노산 잔기이다. 최종적으로 이들 변이를 조합한 S41A/S42A/S43Q/W63I/Y64D/N65I/S66N 변이체(S1M1), S41A/S42A/S43Q/W63I/Y64D/N65V/S66L 변이체(S1M2), S41A/S42A/S43G/W63I/Y64D/N65I/S66L 변이체(S1M3), S41A/S42A/S43R/W63I/Y64D/N65I/S66N 변이체(S1M4), S41A/S42A/S43Q/Y47R/W63I/Y64D/N65I/S66N 변이체(S1M5), S41A/S42A/S43R/Y47R/W63I/Y64D/N65I/S66N 변이체(S1M6), S41A/S42R/W63I/Y64D/N65I/S66N 변이체(S1M7), S41A/S42R/Y47R/W63l/Y64D/N65I/S66N 변이체(S1M8), S41A/S42A/S43Q/W63I/Y64D/N65I/S66N/A69E 변이체(S1M9)를 설계하였다.
ID는 단백질 데이타 뱅크(PDB)의 등록 번호를 나타낸다. 상단 4종의 카르보닐 환원 효소는 NAD 의존성, CMCRD 효소를 포함하는 하단 5종의 카르보닐 환원 효소는 NADP 의존성의 효소이다.
<실시예 3> CRD 효소 변이체의 제조
서열 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 합성, pUC18의 PstI 사이트에 서브클로닝한 플라스미드 pUCSYN181(다까라 슈조사 제조) 0.2 ㎍을 이용하여 대장균 JM109(다까라 슈조사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 FlexiPrep(파마시아사 제조)를 이용하여 플라스미드를 회수하고, EcoO109I로 소화한 후, 분취용 폴리아크릴아미드 전기 영동으로 167 bp의 DNA 단편을 단리하였다. 한편, 플라스미드 pNTS1(WO098/35025)를 EcoO109I로 소화한 후, 분취용 아가로오스 겔 전기 이동에 의해 약 3.2 kb의 DNA 단편을 회수하여 BAP 처리를 행하였다. 양 DNA 단편을 다까라 결합 키트(Takara ligation Kit) Ver.2(다까라 슈조사 제조)를 이용하여 결합함으로써, pNTS1의 EcoO109I-EcoO109I 부위에 변이 유전자를 삽입한 재조합 플라스미드 pNTS1M1을 얻었다. 이 플라스미드를 이용하여 대장균 HB101(다까라 슈조사 제조)를 형질 전환시켜 대장균 HB101(pNTS1M1)을 얻었다. 동일하게, 서열 2 내지 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 DNA를 이용하여 pNTS1의 EcoO109I-EcoO109I 부위 변이 유전자를 삽입한 플라스미드를 제조하고, 각각으로부터 재조합 대장균 HB101(pNTS1M2), HB101(pNTS1M3), HB101(pNTS1M4), HB101(pNTS1M5), HB101(pNTS1M6), HB101(pNTS1M7), HB101(pNTS1M8) 및 HB101(pNTS1M9)을 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 형질 전환체 중 대장균 HB10l(pNTS1M1), HB101(pNTS1M2) 및 HB101(pNTS1M3)은 각각 기탁 번호 FERM P-18388, FERM P-18389 및 FERM P-18390으로서, 2001년 6월 22일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 도 1쪼메 1반지 주오 다이 6)에 기탁되고, FERM P-18388에 대해서는 2002년 5월 27일자로 FERM BP-8059로서 부다페스트 조약에 기초하는 기탁으로 이관되어 있다. 또한, 대장균 HB101(pNTS1M4) 및 HB101(pNTS1M6)은 각각 기탁 번호 FERM P-18647 및 FERM P-18648로서, 2001년 12월 4일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 도 1쪼메 1반지 주오 다이 6)에 기탁되고, FERM P-18647에 대해서는 2002년 5월 27일자로 FERM BP-8060으로서 부타페스트 조약에 기초하는 기탁으로 이관되어 있다.
도입된 아미노산 변이는, 재조합 플라스미드에 대하여 NdeI 사이트 상류의 염기 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 변이 부위를 포함하는 DNA 단편을 제조하고, ABI373A DNA 시퀀서(어플라이드 바이오시스템사 제조)를 이용하여 염기 서열을 확인하였다.
<실시예 4> 재조합 대장균에서의 CMCRD 효소 변이체의 발현
실시예 3에서 얻은 재조합 대장균 HB101(pNTS1M1), HB101(pNTS1M2), HB101(pNTS1M3), HB10l(pNTS1M4), HB101(pNTS1M5), HB101(pNTS1M6), HB101(pNTS1M7), HB101(pNTS1M8) 및 HB101(pNTS1M9)을, 각각 50 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 2×YT 배지에서 배양하고, 집균한 후 0.1 M 인산 완충액(pH 6.5)에 현탁시키고 초음파 파쇄에 의해 무세포 추출액을 얻었다. 이 무세포 추출액의 CMCRD 효소 활성을 이하와 같이 측정하였다. 효소 활성의 측정은 0.1 M 인산 완충액(pH 6.5)에, 기질 4-클로로아세토아세트산에틸 1 mM, 보효소 NADH 또는 NADPH 0.167 mM 및 효소를 첨가하여 30 ℃에서 파장 340 nm의 흡광도의 감소를 측정함으로써 행하였다. 이 반응 조건에 있어서, 1 분간에 1 ㎛ol의 NADH(NADPH)를 NAD+(NADP+)로 산화하는 효소 활성을 1 unit으로 정의하였다. 이와 같이 측정한 무세포 추출액 중의 CMCRD 효소 활성을 비활성(추출액에 포함되는 단백질 1 mg 당의 효소 활성)으로서 나타내고, 동일한 방법으로 제조한 야생형 CMCRD 효소 유전자를 갖는 플라스미드로 형질 전환한 대장균 HB101(pNTS1)의 활성에 대해서도 동일하게 비교하였다. 이들의 결과를 하기 표 3에 나타낸다. 얻어진 CMCRD 효소 변이체는 모두 NADH를 보효소로 하고, 4-클로로아세토아세트산에틸을 환원하는 효소 활성을 가지고 있었다. 한편, NADPH를 보효소로 하는 경우에는, 상기 측정 조건에서 측정한 것은 모두 환원 활성을 전혀 나타내지 않았다. 이로부터, 본 발명의 효소 개변 방법에 의해 CMCRD 효소의 보효소 의존성의 변환이 달성된 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> CRD 효소 변이체 S1M1의 정제
실시예 4에서 얻은 재조합 대장균 중 대장균 HB101(pNTS1M1)을 50 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 2 L의 2×YT 배지(박토트립톤 16 g, 박토이스트 엑기스 10 g, 식염 5 g/L)에서 배양하고, 원심 분리에 의해 균체를 제조하였다. 얻어진 습균체(wet microbial cell)를 10 mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5), 100 μM FOIPAN(FOI, 오노 야꾸힝 고교사 제조)에 현탁하고, 초음파 파쇄 후 원심 분리에 의해 균체 잔사를 제거하여 무세포 추출액을 얻었다. 이 상청에 황산암모늄을 40 ％ 포화가 될 때까지 첨가하여 이것을 용해시키고, 생성된 침전을 원심 분리에 의해 제거하였다. 이 상청에 황산암모늄을 70 ％ 포화가 될 때까지 더 첨가하여 용해시키고, 생긴 침전을 원심 분리에 의해 모았다. 이 침전을 10 mM 트리스염산 완충액(pH 7.5)에 용해시키고(45 ㎖), 이것을 100 μM FOI를 포함하는 10 mM 트리스염산 완충액(pH 7.5)에 대하여 투석하였다. 이것을 동일한 완충액으로 미리 평형화시킨 DEAE-세파로스(파마시아사 제조)컬럼(3.2×22 cm, 175 ㎖)에 걸어 효소 변이체를 흡착시킨 후, 동일한 완충액 약 600 ㎖로 컬럼을 세정하였다. 동일한 완충액을 사용하여 식염(0 내지 0.2 M까지)의 선형 구배에 의해 활성 분획을 용출시켰다. 활성 분획 250 ㎖를 모아, 이것에 황산암모늄을 70 ％ 포화가 될 때까지 첨가하여 용해시키고, 생긴 침전을 원심 분리에 의해 모았다. 이 침전을, 4 M 식염을 포함하는 10 mM 트리스염산 완충액(pH 7.5)에 용해시키고(30 ㎖), 동일한 완충액으로 미리 평형화시킨 페닐-세파로오스(파마시아사 제조) 컬럼(3×20 cm, 160 ㎖)에 걸어 효소 변이체를 흡착시켰다. 동일한 완충액(약 300 ㎖)으로 세정한 후, 10 mM트리스염산 완충액(pH 7.5)을 이용하여 식염(4 M에서 0 M까지) 및 에틸렌글리콜(0 ％에서 50 ％(w/v)까지)의 선형 구배에 의해 활성 분획을 용출시켰다. 활성 분획(약 220 ㎖)을 모으고, 한외 여과막 YM-10(아미콘사 제조)으로써 0.2 M 식염을 포함하는 10 mM 트리스염산 완충액(pH 7.5)으로 완충액을 교환한 후, 9 ㎖까지 농축시켜 정제 효소 변이체 표품(약 280 mg)을 얻었다. 폴리아크릴아미드 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 순도를 해석한 결과, 단일 밴드이었다. 또한, 단백질의 정량은 바이오라드사 제조 단백질 분석 키트를 이용한 색소 결합법에 의해 행하였다. 정제 효소 S1M1의 비활성은 약 3 U/mg이었다.
<실시예 6> CMCRD 효소 변이체의 성질의 측정
실시예 5에서 얻은 CMCRD 효소 변이체(S1M1)의 효소학적 성질에 대하여 검토하였다.
효소 활성의 측정은 실시예 3에 기재된 측정 조건을 이용하여 행하였다.
(1) 작용: NADH를 보효소로 하고, 4-클로로아세토아세트산에틸에 작용하여 광학 순도 99 ％ e.e. 이상의 (S)-4-히드록시부티르산에틸을 생성하였다. 산화형 β-니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)에 의존한 (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸 탈수소 효소 활성은, NAD+를 0.33 내지 3 mM, (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸을 2 내지 20 mM, pH를 7.0 및 8.0로 변화시키고, 파장 340 nm의 흡광도의 증가를 측정함으로써 행하였지만, 탈수소 효소 활성은 전혀 확인되지 않았다.
(2) pH 프로필: 완충액으로서 인산칼륨 완충액을 사용하고, pH 5.0 내지 8.0의 범위에서 상기 방법으로 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸에 작용하는 바람직한 pH는 5.0 부근이고, 산성측에서 보다 높은 효소 활성을 나타내었다(도 2).
(4) 바람직한 작용 온도: 20 ℃ 내지 60 ℃의 온도에서 1 분간의, 4-클로로아세토아세트산에틸을 기질로 한 경우의 본원 발명의 효소 활성을 측정하여 바람직한 작용 온도를 구하였다. 그 결과, 바람직한 온도는 40 ℃ 내지 55 ℃이었다.
(5) 열안정성: 본 효소를 pH 7.0에서 30 ℃, 35 ℃, 40 ℃, 45 ℃, 50 ℃, 55 ℃ 및 60 ℃의 온도에서 30 분간 방치한 후, 4-클로로아세토아세트산에틸의 환원 활성을 측정하였다. 결과는 미처리의 활성을 100으로 한 잔존 활성으로 나타내고, 도 3에 나타내었다. 본 발명에 의한 카르보닐 환원 효소는 40 ℃까지 85 ％, 45 ℃까지 75 ％ 이상의 잔존 활성을 나타내었다.
(6) 분자량
효소의 분자량의 측정은 TSK-G3000SW 컬럼을 이용하고, 용리액으로서 0.1 M Na2SO4, 0.05 ％ NaN3을 포함하는 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)을 이용한 경우, 약 76,000이었다. 효소의 서브유닛의 분자량은 2 ％(v/v)의 2-머캅토에탄올 존재하에 10 ％ SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기 영동하고, 표준 단백질의 상대 이동도로부터 산출함으로써 결정하였다. 그 결과, 본 효소의 서브유닛의 분자량은 약 32,000이었다.
(7) 유기 용매 내성: 본 효소 변이체가 용해되어 있는 pH 7.0의 인산칼륨 완충액에 등량의 아세트산에틸, 아세트산부틸 또는 디이소프로필에테르를 첨가하여, 25 ℃에서 30 분간 진탕한 후 원심 분리를 행하고, 수상 중의 효소의 잔존 활성을, 4-클로로아세토아세트산에틸을 기질로 하여 측정하였다. 그 결과, 아세트산에틸을 첨가한 경우에는 89 ％, 아세트산부틸을 첨가한 경우에는 94 ％, 디이소프로필에테르의 경우에는 100 ％의 활성이 잔존하고 있었다(도 4).
<실시예 7> CMCRD 효소 변이체 유전자를 도입한 재조합 대장균에 의한 4-할로아세토아세트산에스테르로부터의 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르의 합성
실시예 3에서 얻은 재조합 대장균 HB101(pNTS1M1)을, 500 ㎖ 용량 사까구찌(sakaguchi) 플라스크(4개) 중에서 멸균한 100 ㎖의 2×YT 배지에 접종하여 37 ℃에서 44 시간 진탕 배양하고, 원심 분리에 의해 균체를 제조하였다. 얻어진 습균체를 25 ㎖의 10 mM 인산 완충액(pH 6.5)에 현탁시키고 초음파 파쇄하여 효소액을 얻었다. 효소액 10 ㎖에 글루코오스 탈수소 효소(GDH, 아마노 엔자임사 제조) 용액 10 ㎖, 글루코오스 7.1 g, NAD+ 3.2 mg, 4-클로로아세토아세트산에틸 5 g을 첨가하고, 이온 교환수 5 ㎖, 아세트산부틸 25 ㎖를 첨가하여 총량 50 ㎖로 제조하였다. 5 M의 수산화나트륨 수용액으로 pH 6.5로 만들고, 30 ℃에서 교반하면서 5.5 시간 반응을 행하였다. 반응 종료 후, 반응액을 아세트산에틸로 추출하고, 탈용제한 후 추출물을 분석한 결과, 전환율 98 ％로 99％ e.e. 이상의 (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸이 생성되었다.
4-클로로-3-히드록시부티르산에틸의 정량은 가스 크로마토그래피에 의해 행하였다. PEG-20 M Chromosorb WAW DMCS 10 ％ 80/100 메쉬(지엘 사이언스사 제조)를 충전한 유리 컬럼(ID 3 mm×1 m)을 이용하여 150 ℃에서 크로마토그래피를 행하고, 검출은 FID에 의해 행하였다. (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸의 광학 순도의 측정은 광학 분리 컬럼 CHIRALCEL OB(0.46×25 cm)(다이셀 가가꾸사 제조)을 사용한 HPLC에 의해 행하였다. 이동상으로서 헥산:이소프로판올=9:1의 혼합용매를 이용하고, 이동상의 유속은 0.8 ㎖/분으로 크로마토그래피를 행하였다. 검출은 215 nm의 흡광도를 측정함으로써 행하였다.
<실시예 8> CRD 효소 변이체 S1M4의 정제
실시예 4에 있어서 효소 활성이 높았던 대장균 HB101(pNTS1M4)을 50 ㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 500 ㎖의 2×YT 배지(박토트립톤 16 g, 박토이스트 엑기스 10 g, 식염 5 g/L)에서 배양하고, 원심 분리에 의해 균체를 제조하였다. 얻어진 습균체로부터 실시예 5와 동일한 순서에 의해 정제 효소 변이체 표품을 얻었다. 정제 효소는 폴리아크릴아미드 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 순도를 해석한 결과, 단일 밴드였다. 또한, 단백질의 정량은 바이오라드사 제조 단백질 분석 키트를 이용한 색소 결합법에 의해 행하였다. 정제 효소 S1M4의 비활성은 약 10 U/mg이었다.
<실시예 9> CMCRD 효소 변이체의 성질의 측정(2)
실시예 8에서 얻은 CMCRD 효소 변이체(S1M4)의 효소학적 성질에 대하여 검토하였다.
효소 활성의 측정은 실시예 3에 기재된 측정 조건을 이용하여 행하였다.
(1) 작용: NADH를 보효소로 하고, 4-클로로아세토아세트산에틸에 작용하여 광학 순도 99 ％ e.e. 이상의 (S)-4-히드록시부티르산에틸을 생성하였다. 산화형β-니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)에 의존한 (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸 탈수소 효소 활성은, NAD+를 0.33 내지 3 mM, (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸을 2 내지 20 mM, pH를 7.0 및 8.0로 변화시키고, 파장 340 nm의 흡광도의 증가를 측정함으로써 행하였지만, 탈수소 효소 활성은 전혀 확인되지 않았다.
(2) pH 프로필: 완충액으로서 인산칼륨 완충액을 사용하여 pH 5.0 내지 8.0의 범위에서 상기 방법으로 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸에 작용하는 바람직한 pH는 5.0 부근이고, CMCRD 효소 변이체(S1M1)와 같이 산성측에서 보다 높은 효소 활성을 나타내었다(도 5).
(4) 바람직한 작용 온도: 20 ℃ 내지 60 ℃의 온도에서 1 분간의, 4-클로로아세토아세트산에틸을 기질로 한 경우의 본원 발명의 효소의 활성을 측정하여 바람직한 작용 온도를 구하였다. 그 결과, CMCRD 효소 변이체(S1M1)와 동일하게 바람직한 온도는 40 ℃ 내지 55 ℃이었다.
(5) 열안정성: 본 효소를 pH 7.0에서 30 ℃, 35 ℃, 40 ℃, 45 ℃, 50 ℃, 55 ℃ 및 60 ℃의 온도에서 30 분간 방치한 후, 4-클로로아세토아세트산에틸의 환원 활성을 측정하였다. 결과는 미처리의 활성을 100으로 한 잔존 활성으로 나타내고, 도 6에 나타내었다. 본 발명에 의한 카르보닐 환원 효소는 CMCRD 효소 변이체(S1M1)와 같이 45 ℃까지 75 ％ 이상의 잔존 활성을 나타내었다.
(6) 분자량:
효소의 분자량의 측정은 TSK-G3000SW 컬럼을 이용하고, 용리액으로서 0.1 MNa2SO4, 0.05 ％ NaN3을 포함하는 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)을 이용한 경우, 약 76,000이었다. 효소의 서브유닛의 분자량은 2 ％(v/v)의 2-머캅토에탄올 존재하에 10 ％ SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기 영동하고, 표준 단백질의 상대 이동도로부터 산출함으로써 결정하였다. 그 결과, 본 효소의 서브유닛의 분자량은 약 32,000이었다.
(7) 유기 용매 내성: 본 효소 변이체가 용해되어 있는 pH 7.0의 인산칼륨 완충액에 등량의 아세트산에틸, 아세트산부틸 또는 디이소프로필에테르를 첨가하여, 25 ℃에서 30 분간 진탕한 후 원심 분리를 행하고, 수상 중의 효소의 잔존 활성을, 4-클로로아세토아세트산에틸을 기질로 하여 측정하였다. 그 결과, 아세트산에틸을 첨가한 경우에는 84 ％, 아세트산부틸을 첨가한 경우에는 103 ％, 디이소프로필에테르의 경우에는 106 ％의 활성이 잔존하고 있고, CMCRD 효소 변이체(S1M1)와 동등한 유기 용매 내성을 나타내었다(도 7).
보효소의 결합 에너지를 제어하는 것을 특징으로 하는 산화 환원 효소의 효소 개변 방법, 공업 생산에 유리한 NADH 의존성의 카르보닐 환원 효소 변이체 및 이들을 코딩하는 DNA, 이 DNA를 갖는 플라스미드, 이 플라스미드로 형질 전환된 형질 전환 세포, 및 이 효소 변이체 및(또는) 이 형질 전환 세포를 이용하는 광학 활성 알코올의 제조 방법이 제공되었다. 또한, 본 효소 개변 방법은 본 발명의 카르보닐 환원 효소와 유사한 효소군의 보효소 의존성의 변환에 중요하게 응용될 수 있는 것은 분명하다.
또한, 본건 명세서는 본건 출원의 우선권 기초 출원인 일본 특허 출원 2001-200417호 및 일본 특허 출원 2002-006303호의 명세서 및(또는) 도면에 기재된 내용을 인용에 의해 포함한다.

Claims (45)

  1. 산화 환원 효소의 보효소 의존성을 변환시키기 위한 효소 개변 방법으로서, 상기 산화 환원 효소의 미리 선택된 부위의 단수 또는 복수의 임의의 아미노산 잔기를 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들을 조합함으로써 보효소 분자의 결합 에너지의 크기를 제어하는 것을 특징으로 하는 효소 개변 방법.
  2. 제1항에 있어서, 산화 환원 효소의 활성 부위를 특정하는 공정, 상기 활성 부위 근방에서 보효소 분자와 상호 작용하는 아미노산 잔기를 결정하는 공정, 및 상기 결정 잔기에 대하여 보효소 분자의 결합 에너지의 크기를 제어하기 위한 변이 처리를 행하는 공정을 포함하는 효소 개변 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 활성 부위를 특정하는 공정에서, 분자 모델링법에 의한 입체 구조 예측을 행하고, 보효소 분자를 수용하기 위해서 가능한 체적을 갖는 크레프트(cleft)부를 검색하고, 또한 유사 효소 단백질과의 아미노산 서열 비교를 행하고, 상기 크레프트부를 구성하는 아미노산 잔기 중에서 효소와 보효소 분자의 결합에 중요하다고 추정되는 아미노산 잔기를 추출하는 처리를 더 포함하는 효소 개변 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 보효소 분자와 상호 작용하는 아미노산 잔기를 결정하는 공정이, 보효소 분자로부터 12 Å 이내의 거리에 존재하는 아미노산 잔기를 선택하는 처리인 효소 개변 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 효소가 보효소 분자로서 피리딘뉴클레오티드 보효소를 이용하는 산화 환원 효소인 효소 개변 방법.
  6. 제5항에 있어서, 산화 환원 효소가 보효소 분자와 결합하기 위해서 필요한 공통 아미노산 서열로서 (Gly 또는 Ala)-(Xaa)3-(Gly, Ala 또는 Thr)-(Ile 또는 Leu)-(Gly, Ala 또는 Ser)-(Xaa)10-(Gly 또는 Asn)을 갖는 산화 환원 효소인 효소 개변 방법.
  7. 제6항에 있어서, 보효소 분자와 상호 작용하는 아미노산 잔기를 결정하는 공정이, 상기 공통 아미노산 서열과 그의 N 말단측 및 C 말단측 각 15 잔기로 이루어지는 영역, 보다 바람직하게는 상기 공통 아미노산 서열과 C 말단측 15 잔기로 이루어지는 영역으로부터 아미노산 잔기를 선택하는 처리를 더 포함하는 효소 개변 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 효소 개변 방법에 의해 얻어진 산화 환원 효소 변이체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 효소가 칸디다ㆍ매그놀리아에(Candida magnoliae) IFO 0705 유래의 카르보닐 환원 효소인 효소 개변 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 효소의 아미노산 잔기 위치 40 내지 69, 위치 87 내지 92 및 위치 225 내지 228에 있어서 아미노산을 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들을 조합시키는 것을 특징으로 하는 효소 개변 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 효소의 아미노산 잔기 위치 41 내지 43, 위치 47, 위치 63 내지 66, 위치 69에 있어서 아미노산을 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들을 조합시키는 것을 특징으로 하는 효소 개변 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 효소 개변 방법을 이용함으로써 보효소 의존성이 변환된 카르보닐 환원 효소 변이체.
  13. 야생형 카르보닐 환원 효소로부터 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들의 조합에 의해 얻어지고, 다음에 나타내는 이화학적 성질을 갖는 카르보닐 환원 효소 변이체.
    (1) 작용:
    환원형 β-니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드를 보효소로 하고, 4-클로로아세토아세트산에틸에 작용시켜 (S)-4-클로로-3-히드록시부티르산에틸을 생성하고,
    (2) 기질 특이성:
    ㆍ 4-클로로아세토아세트산에틸에 대하여 강한 활성을 나타내고, 아세토아세트산에틸에는 실질적으로 활성을 나타내지 않고,
    ㆍ 4-클로로아세토아세트산에스테르에 대하여 강한 활성을 나타내지만, 4-할로-3-히드록시부티르산에스테르에 대하여 실질적으로 탈수소 효소 활성을 가지지 않고,
    (3) 보효소 의존성:
    보효소로서 환원형 β-니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드를 공급한 경우에 강한 활성을 나타내지만, 환원형 β-니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산을 제공한 경우에는 실질적으로 활성을 나타내지 않는다.
  14. 제13항에 있어서, 이하의 (4) 내지 (7)의 이화학적 성질을 더 갖는 카르보닐 환원 효소 변이체.
    (4) 바람직한 pH: pH 4.0 내지 7.0,
    (5) 열안정성: pH 7.0에서 30 분간 처리하였을 때에 45 ℃까지 안정하고,
    (6) 유기 용제 내성: 아세트산에틸, 아세트산부틸 또는 디이소프로필에테르에서 pH 7.0, 25 ℃, 30 분간 처리하였을 때, 적어도 85 ％의 효소 활성을 유지하고,
    (7) 분자량: 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 전기 영동 분석에서 약 32,000.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 야생형 카르보닐 환원 효소가 칸디다ㆍ매그놀리아에 IFO 0705 유래의 카르보닐 환원 효소인 카르보닐 환원 효소 변이체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 변이체가 야생형 카르보닐 환원 효소로부터 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 결실 또는 이들의 조합에 의해 얻어지고, 또한 위치 41에 있어서 알라닌 잔기(A), 글리신 잔기(G) 또는 세린 잔기(S)를 보유하며; 위치 42에 있어서 알라닌 잔기(A), 글리신 잔기(G), 세린 잔기(S), 트레오닌 잔기(T), 아르기닌 잔기(R) 또는 리신 잔기(K)를 보유하고: 위치 43에 있어서 알라닌 잔기(A), 글리신 잔기(G), 세린 잔기(S), 트레오닌 잔기(T), 글루타민 잔기(Q), 아르기닌 잔기(R) 또는 리신 잔기(K)를 보유하며; 위치 64에 있어서 아스파라긴산 잔기(D)를 보유하는 것을 특징으로 하는 효소 변이체.
  17. 제16항에 있어서, 부가적으로, 위치 47에 있어서 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 류신(L), 글루타민(Q), 글루타민산(E), 아르기닌(R) 및 리신(K)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 더 보유하는 것을 특징으로 하는 효소 변이체.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 부가적으로, 위치 63에 있어서 알라닌(A), 세린(S), 류신(L), 이소류신(I), 발린(V), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 시스테인(C), 트레오닌(T), 세린(S), 아스파라긴(N) 및 글리신(G)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 더 보유하는 것을 특징으로 하는 효소 변이체.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적으로, 위치 65에 있어서 류신(L), 이소류신(I), 발린(V), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 알라닌(A), 시스테인(C), 세린(S) 및 트레오닌(T)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 더 보유하는 것을 특징으로 하는 효소 변이체.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적으로, 위치 66에 있어서 류신(L), 이소류신(I), 발린(V), 알라닌(A), 시스테인(C), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R) 및 리신(K)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 더 보유하는 것을 특징으로 하는 효소 변이체.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적으로, 위치 69에 있어서 알라닌(A), 글루타민산(E), 아스파라긴산(D) 및 세린(S)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 더 보유하는 것을 특징으로 하는 효소 변이체.
  22. 제16항에 있어서, 다음의 변이: S41A, S42A, S43Q, W63I, Y64D, N65I, S66N이 도입되어 있는 효소 변이체.
  23. 제16항에 있어서, 다음의 변이: S41A, S42A, S43Q, W63I, Y64D, N65V, S66L이 도입되어 있는 효소 변이체.
  24. 제16항에 있어서, 다음의 변이: S41A, S42A, S43G, W63I, Y64D, N65I, S66L이 도입되어 있는 효소 변이체.
  25. 제16항에 있어서, 다음의 변이: S41A, S42A, S43R, W63I, Y64D, N65I, S66N이 도입되어 있는 효소 변이체.
  26. 제16항에 있어서, 다음의 변이: S41A, S42A, S43Q, Y47R, W63I, Y64D, N65I, S66N이 도입되어 있는 효소 변이체.
  27. 제16항에 있어서, 다음의 변이: S41A, S42A, S43R, Y47R, W63I, Y64D, N65I, S66N이 도입되어 있는 효소 변이체.
  28. 제16항에 있어서, 다음의 변이: S41A, S42R, W63I, Y64D, N65I, S66N이 도입되어 있는 효소 변이체.
  29. 제16항에 있어서, 다음의 변이: S41A, S42R, Y47R, W63I, Y64D, N65I, S66N이 도입되어 있는 효소 변이체.
  30. 제16항에 있어서, 다음의 변이: S41A, S42A, S43Q, W63I, Y64D, N65I, S66N, A69E가 도입되어 있는 효소 변이체.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 기재된 효소 변이체를 코딩하는 DNA.
  32. 제31항에 기재된 DNA를 갖는 플라스미드.
  33. 제32항에 있어서, 상기 플라스미드가 pNTS1M1, pNTS1M2, pNTS1M3, pNTS1M4, pNTS1M5, pNTS1M6, pNTST17, pNTS1M8 및 pNTS1M9인 플라스미드.
  34. 제33항에 기재된 플라스미드에 의해 형질 전환된 형질 전환 세포.
  35. 제34항에 있어서, 상기 형질 전환 세포가 대장균인 형질 전환 세포.
  36. 제35항에 있어서, 상기 형질 전환 세포가 E. coli HB101(pNTS1M1), E. coli HB101(pNTS1M2), E. coli HB101(pNTS1M3), E. coli HB101(pNTS1M4), E. coliHB101(pNTS1M5), E. coli HB101(pNTS1M6), E. coli HB101(pNTS1M7), E. coli HB101(pNTS1M8) 및 E. coli HB101(pNTS1M9)인 형질 전환 세포.
  37. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 형질 전환 세포를 배양ㆍ증식시키는 공정을 포함하는 카르보닐 환원 효소 변이체의 제조 방법.
  38. 하기 화학식 1로 표시되는 4-할로아세토아세트산에스테르와 제9항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 효소 변이체, 또는 이 효소 변이체의 생산능을 갖는 미생물의 배양물 또는 그의 처리물을 반응시키는 공정을 포함하는, 하기 화학식 2로 표시되는 (S)-4-할로-3-히드록시부티르산에스테르의 제조 방법.
    <화학식 1>
    식 중, R1은 할로겐 원자이고, R2는 수소이고, R3은 치환되거나 비치환된 알킬기 또는 아릴기를 나타낸다.
    <화학식 2>
    식 중, R1은 할로겐 원자이고, R2는 수소이고, R3은 치환되거나 비치환된 알킬기 또는 아릴기를 나타낸다
  39. 제38항에 있어서, 상기 할로겐 원자가 염소 또는 브롬이고, 상기 R3이 탄소수 1 내지 4의 알킬기인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 4-할로아세토아세트산에스테르가 4-클로로아세토아세트산메틸, 4-클로로아세토아세트산에틸, 4-브로모아세토아세트산메틸 또는 4-브로모아세토아세트산에틸인 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환 세포인 방법.
  42. 제12항 내지 제30항 중 어느 한 항에 기재된 효소 변이체, 이 효소 변이체가 의존하는 보효소를 재생하는 능력을 갖는 효소 및(또는) 그의 변이체와 카르보닐화합물을 반응시키는 공정, 및 생성된 광학 활성 알코올을 채취하는 공정을 포함하는, 광학 활성 알코올의 제조 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 보효소를 재생하는 능력을 갖는 효소가 글루코오스 탈수소 효소 및 그의 변이체인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 보효소를 재생하는 능력을 갖는 효소가 포름산 탈수소 효소 및 그의 변이체인 방법.
  45. 제12항 내지 제30항 중 어느 한 항에 기재된 효소 변이체를 코딩하는 DNA 및 상기 효소 변이체가 의존하는 보효소를 재생하는 능력을 갖는 효소를 코딩하는 DNA를 갖는 플라스미드로 형질 전환된 형질 전환 세포와 카르보닐 화합물을 반응시키는 공정, 및 생성된 광학 활성 알코올을 채취하는 공정을 포함하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014133291A1 (ko) * 2013-02-26 2014-09-04 주식회사 아미노로직스 (2rs)-아미노-(3s)-히드록시-부티르산 또는 이의 유도체의 제조방법

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7132267B2 (en) 2002-08-09 2006-11-07 Codexis, Inc. Enzymatic processes for the production of 4-substituted 3-hydroxybutyric acid derivatives and vicinal cyano, hydroxy substituted carboxylic acid esters
EP1537222B1 (en) 2002-08-09 2011-03-09 Codexis, Inc. Enzymatic processes for the production of 4-substituted 3-hydroxybutyric acid derivatives
WO2005017135A1 (en) * 2003-08-11 2005-02-24 Codexis, Inc. Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides
JPWO2006043555A1 (ja) * 2004-10-19 2008-05-22 株式会社カネカ 生体高分子生成のための還元酵素変異体
EP2357248A1 (en) * 2005-07-20 2011-08-17 Kaneka Corporation Method for producing optically active 2-(N-substituted aminomethyl)-3-hydroxybutyric acid ester
US8273558B2 (en) 2005-10-26 2012-09-25 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US8945899B2 (en) 2007-12-20 2015-02-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Ketol-acid reductoisomerase using NADH
US20080293086A1 (en) * 2006-09-18 2008-11-27 Cobalt Technologies, Inc. A Delaware Corporation Real time monitoring of microbial enzymatic pathways
KR20090083900A (ko) 2006-10-02 2009-08-04 코덱시스, 인코포레이티드 입체이성질체적으로 순수한 스타틴 및 이의 합성 중간체 제조용 조성물 및 제조 방법
BRPI0808600A2 (pt) 2007-04-18 2018-12-26 Du Pont "método para a conversão de acetolactato em dihidroxi-isovalerato, método para a produção de isobutanol, célula hospedeira recombinante e método para a identificação e isolameno de uma construção genética"
US20090081715A1 (en) * 2007-09-07 2009-03-26 Cobalt Technologies, Inc., A Delaware Corporation Engineered Light-Emitting Reporter Genes
EP2222841B1 (en) 2007-12-20 2015-08-26 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Ketol-acid reductoisomerase using nadh
WO2009120806A2 (en) * 2008-03-25 2009-10-01 Cobalt Technologies, Inc. Expression of oxidoreductases to increase volumetric productivity
GB2459756B (en) 2008-04-09 2012-04-04 Cobalt Technologies Inc Enhanced ABE fermentation with high yielding butanol tolerant Clostridium strains
BRPI1010056A2 (pt) 2009-06-26 2017-06-27 Cobalt Tech Inc processo para produção de bioproduto e sistema para a produção de bioproduto
EP2527436B1 (en) 2010-01-20 2016-12-14 Kaneka Corporation Nadh oxidase mutant having improved stability and use thereof
BR112013024328A2 (pt) 2011-03-24 2020-08-25 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc. Células hospedeiras recombinantes, métodos para produzir isobutanol, composiçãofermentativa, métodos para produzir uma célula hospedeira recombinante, para reduzir oueliminar a conversão de isobutiraldeído, polipeptídeos, polinucleqtídeo, método paraconverter acetolactato, leveduras recombinantes, métodos para produzir butanol, paraaumentar a atividade e para aumentar a produtividade da enzima karl
EP2728001A4 (en) 2011-06-28 2015-05-27 Kaneka Corp METHOD FOR MODIFYING ENZYME FUNCTIONS AND ENZYME VARIANT THEREFOR
EP2847326A2 (en) 2012-05-11 2015-03-18 Butamax Advanced Biofuels LLC Ketol-acid reductoisomerase enzymes and methods of use
CA2886157A1 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Polypeptides with ketol-acid reductoisomerase activity
CN109852592B (zh) * 2019-01-14 2022-05-31 中国科学院成都生物研究所 耐热性提高的羰基还原酶突变体
CN109852593B (zh) * 2019-03-28 2020-10-20 洛阳华荣生物技术有限公司 一种重组酮还原酶及在制备r-3-羟基丁酸及其盐中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE280218T1 (de) * 1997-02-07 2004-11-15 Kaneka Corp Neue carbonyl-reduktase, gene welche diese kodieren und methoden zu deren verwendung
DE19812004A1 (de) * 1998-03-19 1999-09-30 Forschungszentrum Juelich Gmbh Dehydrogenasen mit verbesserter NAD-Abhängigkeit, deren Herstellung und Verwendung

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014133291A1 (ko) * 2013-02-26 2014-09-04 주식회사 아미노로직스 (2rs)-아미노-(3s)-히드록시-부티르산 또는 이의 유도체의 제조방법
KR101446551B1 (ko) * 2013-02-26 2014-10-06 주식회사 아미노로직스 (2rs)-아미노-(3s)-히드록시-부티르산 또는 이의 유도체의 제조방법
US9862978B2 (en) 2013-02-26 2018-01-09 Aminologics Co. Ltd. Method for preparing (2RS)-amino-(3S)-hydroxy-butyric acid and its derivatives

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