JP2023521972A - 速度論的光学分割のためのカルボキシエステラーゼポリペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、天然に存在する野生型カルボキシエステラーゼ酵素と比較して特性の改善を有する操作されたカルボキシエステラーゼ酵素、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を加水分解反応において使用する方法を提供する。本発明は、配列番号４～５３６の偶数配列から選択されるポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
Description
本出願は、２０２０年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／００８，０６１号に基づく優先権を主張しており、この米国仮特許出願は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
配列表、表またはコンピュータープログラムへの言及
配列表、表またはコンピュータープログラムへの言及
ＣＸ２－２０６ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔというファイル名として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してコンピューター可読形式（ＣＲＦ）で３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１の下で本明細書と同時に提出された配列表は、参照により本明細書に援用されれる。配列表の電子コピーは、８００キロバイトのファイルサイズで、２０２１年４月５日に作成された。
発明の分野
発明の分野
本発明は、天然に存在する野生型（ＷＴ）カルボキシエステラーゼ酵素と比較して非ネイティブの特性の改善を有する操作されたカルボキシエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を加水分解反応に適用する方法を提供する。
発明の背景
カルボキシエステラーゼおよびリパーゼは、工業的プロセス条件で医薬化合物および中間体を効率的に生成するために有用であり得る各種の反応が可能である。酵素の機能および酵素の基質範囲は、酵素活性部位が１つまたは複数のアミノ酸突然変異を介していくつかの異なる化学反応を触媒することができることが観察されているように、多くの場合順応的である（Ｒａｕｗｅｒｄｉｎｋ ａｎｄ Ｋａｚｌｕａｓｋａｓ， ＡＣＳ Ｃａｔ．， ５： ６１５３－６１７６ ［２０１５］を参照されたい）。
カルボキシエステラーゼおよびリパーゼは、工業的プロセス条件で医薬化合物および中間体を効率的に生成するために有用であり得る各種の反応が可能である。酵素の機能および酵素の基質範囲は、酵素活性部位が１つまたは複数のアミノ酸突然変異を介していくつかの異なる化学反応を触媒することができることが観察されているように、多くの場合順応的である（Ｒａｕｗｅｒｄｉｎｋ ａｎｄ Ｋａｚｌｕａｓｋａｓ， ＡＣＳ Ｃａｔ．， ５： ６１５３－６１７６ ［２０１５］を参照されたい）。
例えば、リパーゼは、脂肪酸エステルの加水分解のために工業的スケールでの適用が見出されており、エステルのアミド化のためにも用いられている（Ｓｅｅｍ Ｆａｂｅｒ， Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｉｎ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ［２０１１］；およびＫａｌｋｏｔｅ， ｅｔ ａｌ．， Ａｓｉａｎ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２： ２７９－２８３ ［２００７］）。リパーゼのように、カルボキシエステラーゼは、ラセミエステル基質の対応するキラル酸への転換を含む所望の転換のためのヒドロラーゼとして作用し得る。
［０００６］
工業的プロセス条件は、多くの場合、試薬を利用し、非常に毒性であり得る廃棄物を作り出す。反応混合物からの廃棄物の除去は、面倒で費用がかかるプロセスでもあり得る。他方で、酵素的転換は、化学的合成プロセスからいくつかのステップを除去し得、毒性の試薬についての必要性を取り除き、対応するより少ない廃棄生成物を生成し得る。酵素はまた、ラセミ基質の速度論的光学分割を可能にして、鏡像体過剰率のキラル生成物を生成し得る。しかしながら、天然に存在する野生型酵素は、工業的プロセス条件での効率的なキラル転換のために最適化できないことがある。そのため、特性の改善を有するカルボキシエステラーゼが、工業的プロセス条件下で医薬化合物および中間体の効率的で毒性が低い生成を可能にするために望まれている。
［０００６］
工業的プロセス条件は、多くの場合、試薬を利用し、非常に毒性であり得る廃棄物を作り出す。反応混合物からの廃棄物の除去は、面倒で費用がかかるプロセスでもあり得る。他方で、酵素的転換は、化学的合成プロセスからいくつかのステップを除去し得、毒性の試薬についての必要性を取り除き、対応するより少ない廃棄生成物を生成し得る。酵素はまた、ラセミ基質の速度論的光学分割を可能にして、鏡像体過剰率のキラル生成物を生成し得る。しかしながら、天然に存在する野生型酵素は、工業的プロセス条件での効率的なキラル転換のために最適化できないことがある。そのため、特性の改善を有するカルボキシエステラーゼが、工業的プロセス条件下で医薬化合物および中間体の効率的で毒性が低い生成を可能にするために望まれている。
Ｒａｕｗｅｒｄｉｎｋ ａｎｄ Ｋａｚｌｕａｓｋａｓ， ＡＣＳ Ｃａｔ．， ５： ６１５３－６１７６ ［２０１５］
Ｓｅｅｍ Ｆａｂｅｒ， Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｉｎ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ［２０１１］
Ｋａｌｋｏｔｅ， ｅｔ ａｌ．， Ａｓｉａｎ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２： ２７９－２８３ ［２００７］
発明の要旨
本発明は、天然に存在する野生型（ＷＴ）カルボキシエステラーゼ酵素と比較して非ネイティブの特性の改善を有する操作されたカルボキシエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を加水分解反応に適用する方法を提供する。
本発明は、天然に存在する野生型（ＷＴ）カルボキシエステラーゼ酵素と比較して非ネイティブの特性の改善を有する操作されたカルボキシエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を加水分解反応に適用する方法を提供する。
本発明は、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、それらのポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットは、置換を、３／４／６／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、３／６／９／１０／７０／９９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／１０７、３／８／９／１０／１１／７０、３／８／９／１０／１１／７０／２２９、３／８／９／１０／１３／７０／８２／１０７、３／８／９／１０／１３／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／８２、３／８／９／１０／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／２２９、３／９／１０／１１／１３／８２、３／９／１０／１１／７０／８２／１０７、３／９／１０／１１／７０／２２９、３／９／１０／７０／８２、３／９／１１、３／９／１１／７０／８２／１８０、４／６／８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／６／９／１０／７０／８２／２２９、４／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／６５／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／８／９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、６／９／１０／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、６／９／１０／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、８／９／１０、８／９／１０／１１／１３／７０、８／９／１０／１１／１３／７０／８２、８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、８／９／１０／１１／４３／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／７０、８／９／１０／１１／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／７０／２２９、８／９／１０／７０、８／９／１０／７０／８２／２２９、９／１０、９／１０／１１／１２／４９／５１／７０／７３／８２／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／４９／７０／７３／８２／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２００、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／１１／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／７０／８２／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／３５／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／６５／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１９６／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、９／１０／１１／４０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５４／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／７０／８２／１１０／１８０／１９２／２１９、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１８０／１９２、９／１０／１１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／５４／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０、９／１０／１１／７０／７１／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０／１９２／２００、９／１０／１１／７０／７３／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２、９／１０／１１／７０／８２／８７／１１０／１８０／２１９、９／１０／１１／７０／８２／１００／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１０７、９／１０／１１／７０／８２／１０８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８７／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／１０７、９／１０／１２／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／５４／７０／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１２／７０／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１３／７０、９／１０／１３／７０／８２、９／１０／１３／７０／２２９、９／１０／１３／２０７、９／１０／１７、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２００／２１９、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／４９／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１７／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１７／５１／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／１７／７０／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１７／７０／１０４／１６０／１６５、９／１０／１７／７０／１３９／１６０／１６５、９／１０／２６、９／１０／２９／７０、９／１０／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３７、９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３９、９／１０／３９／１８６、９／１０／４１、９／１０／４５／７０、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２１９、９／１０／４９／５１／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／７０／８２／１８０／２２５、９／１０／４９／５４／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／７３／８２／８７／１０８／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２２５、９／１０／５１／５４／７０／８２／８７／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／７０／８２／１１０／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０／２００、９／１０／５４／７０／８２／１８０、９／１０／６２、９／１０／７０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０
／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。一部の追加の実施形態では、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットは、３Ｒ／４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／９９Ｒ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／１３Ｅ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、４Ｒ／６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ａ／９Ｃ／１０Ｉ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／４３Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、９Ａ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１２Ｐ／５１Ｄ／７０Ｗ／７３Ｍ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｃ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｖ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ａ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２２５Ｓ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／１９２Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｃ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｖ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｑ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１９６Ｅ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／４０Ｖ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｐ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｖ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｈ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ａ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１００Ｓ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｒ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８７Ｖ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／１０７Ｆ、９Ｃ／１０Ｉ／１２Ｐ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ
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８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｉ／Ｄ１３Ｅ／Ｖ８２Ｑ、Ｓ３Ｒ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｔ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ、Ｓ３Ｒ
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Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ／Ａ２１９Ｄ、およびＭ１１Ｌ／Ｄ３６Ｓ／Ｙ２０６Ｆ／Ｍ２０８
Ａから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。
／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。一部の追加の実施形態では、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットは、３Ｒ／４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／９９Ｒ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／１３Ｅ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、４Ｒ／６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ａ／９Ｃ／１０Ｉ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／４３Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、９Ａ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１２Ｐ／５１Ｄ／７０Ｗ／７３Ｍ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｃ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｖ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ａ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２２５Ｓ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／１９２Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｃ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｖ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｑ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１９６Ｅ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／４０Ｖ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｐ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｖ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｈ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ａ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１００Ｓ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｒ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８７Ｖ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／１０７Ｆ、９Ｃ／１０Ｉ／１２Ｐ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ
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８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｉ／Ｄ１３Ｅ／Ｖ８２Ｑ、Ｓ３Ｒ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｔ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ、Ｓ３Ｒ
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／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ｔ２００Ｈ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｑ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ａ１０４Ｍ／Ｓ１６０Ｅ／Ｇ１６５Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｒ１３９Ｈ／Ｓ１６０Ｇ／Ｇ１６５Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２６Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２６Ｔ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｗ２９Ｇ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ３６Ｎ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｇ３７Ｐ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｓ３８Ｙ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ３９Ａ／Ａ１８６Ｔ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ３９Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ４１Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ４１Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ４１Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｐ４５Ｒ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｐ４５Ｔ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｇ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｇ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｇ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ６２Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｋ９２Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ９９Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ９９Ｒ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ａ１０７Ｆ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ａ１５６Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｇ１６５Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ８８Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ９０Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ９６Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１０７Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ１１０Ｖ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１１１Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１１２Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１３３Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１３３Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１７８Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１８５Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１８６Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１９６Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１９６Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１９６Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ２１１Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２２６Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２２６Ｗ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｎ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｇ／Ｌ１２Ｓ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｇ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｇ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｒ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｌ１２Ｐ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ａ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｌ１２Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ／Ａ２１９Ｄ、およびＭ１１Ｌ／Ｄ３６Ｓ／Ｙ２０６Ｆ／Ｍ２０８
Ａから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。
本発明は、配列番号８２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、それらのポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号８２を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
本発明は、配列番号２６８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２６８を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
本発明は、配列番号５３６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号５３６を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
本発明は、配列番号２～５３６の偶数配列から選択される配列またはその機能的断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼであって、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２～５３６の偶数配列から選択される配列を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
本発明は、配列番号４～５３６の偶数配列から選択されるポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
本発明は、配列番号２の野生型Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓカルボキシエステラーゼと比較して少なくとも１つの特性の改善を示す操作されたカルボキシエステラーゼをさらに提供する。一部の実施形態では、特性の改善は、加水分解活性の改善、速度論的光学分割、溶媒耐性、熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、ｐＨ安定性、位置立体選択性、立体選択性、エナンチオ選択性、基質範囲、および／または基質の低減もしくは生成物の阻害、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼを産生する細菌宿主細胞に対する毒性の低減から選択される。
本発明は、本明細書に提供される操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチド配列が、制御配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結している、ポリヌクレオチド配列をさらに提供する。一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されたものである。
本発明は、本明細書に提供される操作されたカルボキシエステラーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。加えて、本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つ発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞も提供する。
本発明は、操作されたカルボキシエステラーゼを宿主細胞において産生させる方法であって、少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼが産生されるように適切な条件下で培養するステップを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼを培養物および／または宿主細胞から回収するステップをさらに含む。一部の追加の実施形態では、方法は、少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼを精製するステップをさらに含む。
発明の記載
本発明は、天然に存在する野生型（ＷＴ）カルボキシエステラーゼ酵素と比較して非ネイティブの特性の改善を有する操作されたカルボキシエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を加水分解反応に適用する方法を提供する。
定義
本発明は、天然に存在する野生型（ＷＴ）カルボキシエステラーゼ酵素と比較して非ネイティブの特性の改善を有する操作されたカルボキシエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）、ならびに操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を加水分解反応に適用する方法を提供する。
定義
本発明への言及において、他に具体的に定義されない限り、本明細書の記載において使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。本明細書で言及される全ての米国特許および公開された米国特許出願は、そのような特許および特許出願内に開示される全ての配列を含んで、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。他に指示されない限り、本発明の実施は、分子生物学、発酵、微生物学、および関連する分野で一般に使用される従来の技法を含み、これは、当業者に周知である。本明細書で他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。実際に、本発明は、これらが、それらが使用される文脈に応じて変わり得るので、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことが意図される。本明細書に提供される見出しは、本発明のさまざまな態様または実施形態の限定ではない。
それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下記に定義する。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。そのため、本明細書に開示されるあらゆる数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が本明細書に全て明示的に書かれているかのように、そのようなより広い数値範囲内にあるあらゆるより狭い数値範囲を包含することが意図される。本明細書に開示されるあらゆる最大（または最小）の数値限定は、そのようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書に明示的に書かれているかのように、あらゆるより低い（またはより高い）数値限定を含むことも意図される。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同族語は、それらの包含的な意味において使用される（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびその対応する同族語と同等）。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。そのため、例えば、１つの「宿主細胞」（ａ ”ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ”）への言及は、複数のそのような宿主細胞を含む。
他に指示されない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’の方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に左から右に書かれる。
本明細書に提供される見出しは、全体として本明細書への参照によってなされ得る本発明のさまざまな態様または実施形態の限定ではない。したがって、下記に定義される用語は、全体として本明細書を参照することによって、より完全に定義される。
本明細書で使用される場合、「カルボキシエステラーゼ」は、有機酸およびアルコールの形成をもたらすカルボキシエステルの加水分解に対する触媒活性を天然で有する酵素として定義される。
本明細書で使用される場合、「アミド化」またはアミド合成は、アミド結合を作成するプロセスを指し、カルボキサミド（有機アミド）をもたらす。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質付化、ミリストイル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書において互換的に使用される。この定義内には、Ｄ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸、ならびにＤ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸の混合物が含まれる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、全体的にリボヌクレオシドで構成されていてもよく（すなわち、ＲＮＡ）、全体的に２’デオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよく（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオシドおよび２’デオキシリボヌクレオシドの混合物であってもよい。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル連結を介して一緒に連結されており、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的な連結を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよく、あるいは一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含んでいてもよい。また、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）で構成されるが、これは、１つまたは複数の修飾核酸塩基および／または合成核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含んでいてもよい。本発明の一実施形態では、そのような修飾核酸塩基または合成核酸塩基は、コード核酸塩基である。
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」、「野生型」および「ＷＴ」は、天然に見出される形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離され得、人為的操作によって意図的に改変されていない、生物中に存在する配列である。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」または「操作された」または「組換え」は、（例えば、細胞、核酸、またはポリペプチド）に関して本発明で使用される場合、そうでなければ天然に存在しないであろう様式で改変されているか、または合成材料からおよび／もしくは組換え技法を使用する操作によって生成および／もしくは誘導されているがそれらと同一である、材料、またはその材料の天然もしくはネイティブな形態に対応する材料を指す。非限定的な例としては、とりわけ、ネイティブな（非組換え）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異なるレベルで発現されるネイティブな遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」、「同一性パーセント」および「同一パーセント」は、ポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間の比較を指し、比較ウィンドウにわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントについて参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基が一致した位置の数を得るためにギャップを伴ってアライメントされる位置の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割ること、およびその結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。最適なアライメントおよび配列同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用して行われる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０ ［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３８９－３４０２ ［１９７７］を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に入手可能である。
簡潔には、ＢＬＡＳＴ分析は、データベース配列内の同じ長さのワードとアライメントされた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たすクエリ配列内の短いワードの長さを特定することによって、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．、上記）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、累積アライメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基のペアについての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（一致しない残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列について、スコアリング行列を使用して、累積スコアが算出される。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下するか、１つもしくは複数の負のスコア残基アライメントの蓄積に起因して、累積スコアが０もしくはそれ未満になるか、またはいずれかの配列の末端に達したら、各方向へのワードヒットの伸長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５ ［１９８９］を参照されたい）。
２つの配列についての同一性パーセントを提供する際にＢＬＡＳＴと同様に機能する多数の他のアルゴリズムが利用可能であり、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアライメントは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ ［１９８１］の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ ［１９７０］の相同性アライメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ ［１９８８］の類似性についての検索法によって；および／またはこれらのアルゴリズムのコンピュータ制御のインプリメンテーションによって［ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ］）、または当技術分野で一般に公知の方法を使用する視覚的検査によって実施することができる。加えて、配列アライメントおよび配列同一性パーセントの決定は、提供されるデフォルトパラメーターを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、別の配列と比較される定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、または全長の核酸またはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列間で類似する配列（すなわち、完全な配列の一部分）を含み得る、および（２）２つの配列間で相違する配列をさらに含み得るので、２つの（またはそれよりも多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を特定および比較することによって行われる。「参照配列」という用語は、野生型配列に限定することが意図されるのではなく、操作または変更された配列を含み得る。例えば、一部の実施形態では、「参照配列」は、事前に操作されたアミノ酸配列または変更されたアミノ酸配列であり得る。
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、ここで、配列は、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較ウィンドウ中の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウは、２０個よりも長い連続残基であり得、必要に応じて、３０、４０、５０、１００個、またはそれよりも長いウィンドウを含む。
本明細書で使用される場合、「に対応する」、「を基準に」または「と比べて」は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合に特定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号位置によってよりもむし参照配列に関して指定される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えば操作されたカルボキシエステラーゼのアミノ酸配列は、２つの配列間の残基の一致を最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列にアライメントされ得る。これらの場合では、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それがアライメントされる参照配列に関して行われる。本明細書で使用される場合、下記にさらに記載される残基位置、例えば「Ｘｎ」への言及は、他に具体的に示されない限り、「に対応する残基」への言及と解釈されるべきである。そのため、例えば、「Ｘ９４」は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号２、４、１０、２６、または４２）の９４位の任意のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される場合、「立体選択性」は、別の立体異性体または別の立体異性体セットよりもある立体異性体の化学反応または酵素反応における優先的な形成を指す。立体選択性は、立体異性体の形成が別のものよりも好ましい場合に部分的であり得、またはそれは、１つの立体異性体のみが形成される場合には完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性は、両方のエナンチオマーの合計における一方のエナンチオマーの割合（典型的には、パーセンテージとして報告される）であるエナンチオ選択性と称される。あるいは、それは、一般に、式［メジャーなエナンチオマー－マイナーなエナンチオマー］／［メジャーなエナンチオマー＋マイナーなエナンチオマー］に従ってそれらから算出される鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）として（典型的にはパーセンテージとして）当技術分野で報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、２つのジアステレオマーの混合物における一方のジアステレオマーの割合（典型的には、パーセンテージとして報告される）であるジアステレオ選択性と称され、あるいは一般にジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の種類である。立体選択性は、単一の立体異性体に限定されず、立体異性体のセットについて記載され得ることも理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「エナンチオ特異性」または「Ｅ値」は、別の立体異性体よりもある立体異性体の化学反応または酵素反応における優先的な変換を指すが、ｅｅは、化合物のエナンチオマー純度を指す。速度論的光学分割では、Ｅ値は、基質および酵素の濃度と独立しており、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ， １９９７， ２１：５５９－５７１に記載されるように、方程式ｌｎ［（１－ｅｅｓ）／（１＋ｅｅｓ／ｅｅｐ）］／ｌｎ［（１＋ｅｅｓ）／（１＋ｅｅｓ／ｅｅｐ）］を使用することによって、基質の％ｅｅおよび生成物の％ｅｅから決定することができる。
本明細書で使用される場合、「高度に立体選択的」または「高度にエナンチオ選択的」は、少なくとも約７５％の立体異性体過剰率で、基質をその対応するキラル酸生成物に変換することができる化学反応または酵素反応を指す。
本明細書で使用される場合、「酵素活性の増加」および「活性の増加」は、操作された酵素の特性の改善を指し、これは、参照酵素と比較して、比活性（例えば、生成した生成物／時間／タンパク質の重量）の増加、または生成物への基質の変換パーセント（例えば、特定の量のカルボキシエステラーゼを使用して特定の時間での出発量の基質の生成物への変換パーセント）の増加によって表すことができる。酵素活性を決定するための例示的な方法を、実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素特性を含む酵素活性に関する任意の特性が影響を受けてもよく、その変化は、酵素活性の増加をもたらし得る。カルボキシエステラーゼ活性は、基質または生成物濃度の変化などのカルボキシエステラーゼを測定するために使用される標準的なアッセイのいずれか１つによって測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書にさらに詳細に記載されるように、酵素の定義された調製、設定条件下での定義されたアッセイ、および１つまたは複数の定義された基質を使用して行われる。一般に、細胞溶解物中の酵素が比較される場合、細胞の数およびアッセイされるタンパク質の量が決定されるだけでなく、同一の発現系および同一の宿主細胞を使用して、宿主細胞によって産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小化する。
本明細書で使用される場合、「変換」は、対応する生成物への基質の酵素的転換を指す。
本明細書で使用される場合、「変換パーセント」は、特定された条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。そのため、例えば、カルボキシエステラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、生成物への基質の「変換パーセント」として表すことができる。
本明細書で使用される場合、「位置特異性」は、他の異性体も理論的に可能である場合に、１つの構造異性体が独占的に生成する化学反応を指す。
本明細書で使用される場合、「熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）」および「熱に対して安定（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｌｅ）」は、互換的に使用され、一定期間（例えば、０．５～２４時間）、一連の温度条件（例えば、４０～８０℃）に曝露した場合に、未処理酵素と比較して、不活化に対する抵抗性を有し、したがって、温度の上昇への曝露後にある特定のレベルの残留活性（例えば、６０％超～８０％）を保持するポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「溶媒に対して安定」は、未処理酵素と比較して、一定期間（例えば、０．５～２４時間）、異なる濃度（例えば、５～９９％）の溶媒（例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルなど）への曝露後に同様の活性（例えば、６０％超～８０％）を維持するポリペプチドの能力を指す。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸の差異」および「残基の差異」は、ポリペプチド配列のある位置におけるアミノ酸残基の、参照配列内の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた差異を指す。アミノ酸の差異の位置は、本明細書では、一般に、「Ｘｎ」と称され、ここで、ｎは、残基の差異が基づく参照配列内の対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較したＸ４０位の残基の差異」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチドの位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。したがって、参照ポリペプチドである配列番号２の４０位がヒスチジンである場合、「配列番号２と比較したＸ４０位における残基の差異」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチドの位置におけるヒスチジン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書ではほとんどの場合、ある位置における特定のアミノ酸残基の差異は、「ＸｎＹ」と表され、ここで、「Ｘｎ」は、上記の通り対応する位置を指定し、「Ｙ」は操作されたポリペプチド内に見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドと異なる残基）の一文字識別子である。一部の場合では、本発明は、従来の表示法「ＡｎＢ」によって示される特定のアミノ酸の差異も提供し、ここで、Ａは参照配列内の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列内の残基の位置番号であり、Ｂは操作されたポリペプチドの配列内の残基置換の一文字識別子である。一部の場合では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を含み得、これは、参照配列と比べて残基の差異が存在する特定の位置の一覧によって示される。一部の実施形態では、ポリペプチドの特定の残基位置に１つよりも多くのアミノ酸が使用され得る場合、使用され得る種々のアミノ酸残基は、「／」で区切られる（例えば、Ｘ１９２Ａ／Ｇ）。本発明は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれかまたは両方を含む少なくとも１つのアミノ酸の差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。本発明の配列表に含まれる特定の組換え炭酸脱水酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、開始メチオニン（Ｍ）残基を含む（すなわち、Ｍは、残基の１位を表す）。しかしながら、当業者は、この開始メチオニン残基が、生物学的プロセシング機構、例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系によって除去されて、開始メチオニン残基を欠くが他は酵素の特性を保持する成熟タンパク質が作成され得ることを理解する。その結果として、「Ｘｎ位の配列番号２と比べたアミノ酸残基の差異」という用語は、本明細書で使用される場合、開始メチオニンを欠くようにプロセシングされた参照配列内の「Ｘｎ」位または対応する位置（例えば、（Ｘ－１）ｎ位）を指し得る。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という語句は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指し、したがって、典型的には、同じまたは類似の定義されたアミノ酸クラス内のアミノ酸によるポリペプチド内のアミノ酸の置換を含む。例として限定されないが、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換され、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）で置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され、ならびに／または疎水性もしくは親水性のアミノ酸は、それぞれ別の疎水性もしくは親水性のアミノ酸で置き換えられる。特に、本明細書に提供される詳細な発明を考慮して、任意のアミノ酸または残基の適当な分類は当業者には明らかである。例示的な保存的置換は、表１に提供される。
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」という語句は、著しく異なる側鎖の特性を有するアミノ酸によるポリペプチド内のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された群内よりもむしろ定義された群間のアミノ酸を使用し得、（ａ）置換（例えば、グリシンに対してプロリン）の領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさに影響を与える。例として限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸、小さなアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変を指す。欠失は、酵素活性を保持し、および／または操作された酵素の特性の改善を保持しながら、１個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、２個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、５個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、または２０個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、ポリペプチドを作り上げるアミノ酸の総数の最大で１０％、またはアミノ酸の総数の最大で２０％の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とし得る。さまざまな実施形態では、欠失は、連続セグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドへの１個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変を指す。一部の実施形態では、改善された操作されたカルボキシエステラーゼ酵素は、天然に存在するカルボキシエステラーゼポリペプチドへの１個または複数のアミノ酸の挿入、および操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドへの１個または複数のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分においてであり得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対してであり得る。挿入は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知であるように、融合タンパク質を含む。挿入は、天然に存在するポリペプチド内のアミノ酸の連続セグメントであり得るか、または１個もしくは複数のアミノ酸によって分離され得る。
「アミノ酸置換セット」または「置換セット」という用語は、参照配列と比較して、ポリペプチド配列内の一群のアミノ酸置換を指す。置換セットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれよりも多くのアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、置換セットは、実施例に提供される表に含まれるバリアントカルボキシエステラーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
本明細書で使用される場合、「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が配列内の対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。断片は、典型的には、全長カルボキシエステラーゼポリペプチド、例えば、配列番号４のポリペプチドの約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％を有し得る。一部の実施形態では、断片は、「生物学的に活性」である（すなわち、全長配列と同じ酵素活性を示す）。
本明細書で互換的に使用される「機能的断片」または「生物学的に活性な断片」は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端の欠失、ならびに／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、それが比較される配列（例えば、本発明の全長の操作されたＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ酵素）内の対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持する、ポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、それに天然に付随する他の混入物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から取り出されたか、または精製されたポリペプチドを包含する。改善されたカルボキシエステラーゼ酵素は、細胞内に存在していてもよく、細胞培地中に存在していてもよく、またはさまざまな形態、例えば、溶解物もしくは単離された調製物で調製されてもよい。そのため、一部の実施形態では、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が存在する優先的な種である（すなわち、モル基準または重量基準で、それが、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも多量である）組成物を指し、一般に、目的の種が、モルまたは重量％で存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋な操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド組成物は、モルまたは重量パーセントで、組成物中の全ての高分子種の約６０％もしくはそれよりも多く、約７０％もしくはそれよりも多く、約８０％もしくはそれよりも多く、約９０％もしくはそれよりも多く、約９１％もしくはそれよりも多く、および約９２％もしくはそれよりも多く、約９３％もしくはそれよりも多く、約９４％もしくはそれよりも多く、約９５％もしくはそれよりも多く、約９６％もしくはそれよりも多く、約９７％もしくはそれよりも多く、約９８％もしくはそれよりも多く、または約９９％を構成する。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種と見なされない。一部の実施形態では、単離された改善されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合に、「異種」という用語は、生物（例えば、野生型生物）によって通常は発現および分泌されない配列を指す。一部の実施形態では、この用語は、通常は天然に見出されるものと互いに同じ関係で見出されないか、またはその発現のレベルもしくは細胞もしくは構造中の他の核酸もしくは他の分子との物理的関係が通常は天然に見出されないように、組換え的に操作された、２つまたはそれよりも多くの部分配列を含む配列を包含する。例えば、天然に見出されない様式で配置された関係がない遺伝子由来の２つまたはそれよりも多くの配列を有する異種核酸は、典型的には、組換え的に産生される（例えば、発現カセット、例えばベクターに挿入されたプロモーター配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された本発明の核酸オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））。一部の実施形態では、「異種ポリヌクレオチド」は、実験室技法によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室操作に付され、次いで、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」は、コードされるタンパク質が目的の生物中で効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを、特定の生物において優先的に使用されるものに変化させることを指す。一部の実施形態では、カルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化され得る。
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現のために必要または有利である全ての成分を含むと本明細書で定義される。各制御配列は、目的のポリヌクレオチドに対してネイティブまたは外来性であり得る。そのような制御配列としては、限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された」は、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドと比べてある位置に適当に配置される（すなわち、機能的な関係）構成として本明細書で定義される。
本明細書で使用される場合、「適切な反応条件」は、本発明のカルボキシエステラーゼポリペプチドが、基質化合物を生成物化合物に変換（例えば、別の化合物へのある化合物の変換）することができる生体触媒反応溶液における条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「適切な反応条件」は、本発明に提供され、実施例によって例示される。
本明細書で使用される場合、「負荷」、例えば、「化合物負荷」、「酵素負荷」または「基質負荷」は、反応の開始の際の反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスの文脈における「基質」は、生体触媒によって作用する化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスの文脈における「生成物」は、生体触媒の作用から生じる化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「平衡化」は、化学反応または酵素反応の進行する速度定数および逆の速度定数によって決定されるような、立体異性体の相互変換を含む化学反応または酵素反応（例えば、２つの種ＡおよびＢの相互変換）において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖状または分枝状のいずれかの、包含的に１～１８個の炭素原子、より好ましくは、包含的に１～８個の炭素原子、最も好ましくは、包含的に１～６個の炭素原子の飽和炭化水素基を指す。特定の数の炭素原子を有するアルキルは、括弧内に表される（例えば、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルは、１～４個の炭素原子のアルキルを指す）。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有するが、必要に応じて１つよりも多くの二重結合を含有する、直鎖状または分枝状のいずれかの包含的に２～１２個の炭素原子の基を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも１つ三重結合を含有するが、必要に応じて１つよりも多くの三重結合を含有し、およびさらに必要に応じて１つまたは複数の二重結合部分を含有する、直鎖状または分枝状のいずれかの包含的に２～１２個の炭素原子の基を指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、および「ヘテロアルキニル」は、１個または複数の炭素原子が、それぞれ独立して、同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基で置き換えられている、本明細書で定義されるアルキル、アルケニル、およびアルキニルを指す。炭素原子を置き換えることができるヘテロ原子および／またはヘテロ原子基としては、限定されるものではないが、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｏ－、－ＮＲα－、－ＰＨ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）ＮＲα－、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲα－など、およびそれらの組合せが挙げられ、ここで、各Ｒαは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される。
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、基－ＯＲβを指し、ここで、Ｒβは、本明細書でも定義される必要に応じて置換されたアルキル基を含む上記で定義されるようなアルキル基である。
本明細書で使用される場合、「アリール」は、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する、包含的に６～１２個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基を指す。例示的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「アミノ」は、基－ＮＨ２を指す。置換アミノは、基－ＮＨＲδ、ＮＲδＲδ、およびＮＲδＲδＲδを指し、ここで、各Ｒδは、置換または無置換アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから独立して選択される。典型的なアミノ基としては、限定されるものではないが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル－オキシ－スルファミノなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「オキソ」は、＝Ｏを指す。
本明細書で使用される場合、「オキシ」は、二価の基－Ｏ－を指し、これは、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成するためのさまざまな置換基を有していてもよい。
本明細書で使用される場合、「カルボキシ」は、－ＣＯＯＨを指す。
本明細書で使用される場合、「カルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）－を指し、これは、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステル、およびケトンを含む異なるカルボニル基を形成する各種の置換基を有していてもよい。
本明細書で使用される場合、「アルキルオキシカルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）ＯＲεを指し、ここで、Ｒεは、必要に応じて置換され得る本明細書で定義されるアルキル基である。
本明細書で使用される場合、「アミノカルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指す。置換アミノカルボニルは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲδＲδを指し、ここで、アミノ基ＮＲδＲδは、本明細書で定義される通りである。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」および「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」は、－ＯＨを指す。
本明細書で使用される場合、「シアノ」は、－ＣＮを指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環内に、包含的に１～１０個の炭素原子、ならびに酸素、窒素および硫黄から選択される包含的に１～４個のヘテロ原子の芳香族複素環式基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジルまたはフリル）、または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有し得る。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキル」は、ヘテロアリールで置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール－アルキル基）を指し、好ましくは、アルキル部分に包含的に１～６個の炭素原子、およびヘテロアリール部分に包含的に５～１２個の環原子を有する。そのようなヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどによって例示される。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルケニル」は、ヘテロアリールで置換されたアルケニル（すなわち、ヘテロアリール－アルケニル基）を指し、好ましくは、アルケニル部分に包含的に２～６個の炭素原子、およびヘテロアリール部分に包含的に５～１２個の環原子を有する。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキニル」は、ヘテロアリールで置換されたアルキニル（すなわち、ヘテロアリール－アルキニル基）を指し、好ましくは、アルキニル部分に包含的に２～６個の炭素原子、およびヘテロアリール部分に包含的に５～１２個の環原子を有する。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ環」、「複素環式」、および互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、環内に、単環または複数の縮合環、包含的に２～１０個の炭素環原子、および窒素、硫黄または酸素から選択される包含的に１～４個のヘテロ環原子を有する飽和または不飽和の基を指す。そのような複素環式基は、単環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）、または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフラン、またはキヌクリジニル）を有し得る。ヘテロ環の例としては、限定されるものではないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「員環」は、任意の環状構造を包含することを意味する。「員」という用語に先行する数は、環を構成する骨格原子の数を表す。そのため、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピラン、およびチオピランは、６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フラン、およびチオフェンは、５員環である。
他に規定されない限り、前述の基において水素が占める位置は、限定されるものではないが、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ヘテロ環、（ヘテロ環）オキシ、および（ヘテロ環）アルキルによって例示される置換基でさらに置換され得、好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。開放原子価がこれらの置換基上に存在する場合、それらは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロ環基でさらに置換され得、これらの開放原子価が炭素上に存在する場合、それらは、ハロゲンによって、ならびに酸素、窒素または硫黄結合置換基によってさらに置換され得、複数のそのような開放原子価が存在する場合、これらの基は、結合の直接形成によって、または新しいヘテロ原子、好ましくは、酸素、窒素、もしくは硫黄への結合の形成によってのいずれかで、環を形成するように接続され得ることが理解される。置換基による水素の置き換えが、許容されない不安定性を本発明の分子に導入せず、そうでなければ化学的に妥当であるという条件で、上記の置換が行うことができることがさらに理解される。
本明細書で使用される場合、「必要に応じた」および「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が発生してもよく、または発生しなくてもよいこと、ならびにその記載が、事象または状況が発生する場合、およびそれが発生しない場合を含むことを意味する。当業者は、１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有すると記載される任意の分子に関して、立体的に実用的なおよび／または合成的に実現可能な化合物のみが含まれることを意味することを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「必要に応じて置換された」は、用語または一連の化学基における全てのその後の修飾因子を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語では、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は、置換されてもよく、または置換されてなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール」について、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基は、他のものとは独立して、置換されてもよく、または置換されてなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「保護基」は、分子中の反応性官能基に付着させた場合に、官能基の反応性を遮蔽、低減または防止する原子の基を指す。典型的には、保護基は、合成の過程の間に、所望により選択的に除去されてもよい。保護基の例は、当技術分野で周知である。保護基を有し得る官能基としては、限定されるものではないが、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシ基が挙げられる。代表的なアミノ保護基としては、限定されるものではないが、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（「ＣＢＺ」）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）、トリメチルシリル（「ＴＭＳ」）、２－トリメチルシリル－エタンスルホニル（「ＳＥＳ」）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、ニトロ－ベラトリルオキシカルボニル（「ＮＶＯＣ」）などが挙げられる。代表的なヒドロキシル保護基としては、限定されるものではないが、ヒドロキシル基がアシル化されているもの（例えば、メチルおよびエチルエステル、アセテートもしくはプロピオネート基、またはグリコールエステル）、またはアルキル化されているもの、例えば、ベンジルおよびトリチルエーテル、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル（例えば、ＴＭＳまたはＴＩＰＰＳ基）、およびアリルエーテルが挙げられる。他の保護基は、本明細書に述べられる参考文献に見ることができる。
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド
本発明は、加水分解反応に有用なカルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチド（本明細書において「操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド」とも称される）を提供する。したがって、一態様では、本発明は、下記のスキーム１および２に示されるように、基質化合物を生成物化合物に変換することができるカルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたペプチドを提供する。さらに、本発明は、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む関連ベクターおよび宿主細胞、操作されたポリペプチドを作製するための方法、ならびに適切な反応条件を含む操作されたポリペプチドを使用するための方法を提供する。
本発明の操作されたポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの野生型カルボキシエステラーゼポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ番号ＷＰ＿０１１０３８６０６．１；配列番号２）と比較して酵素特性の改善（例えば、エナンチオ選択性の増加およびラセミ基質の速度論的光学分割の増加）を有するように操作された天然に存在しないカルボキシエステラーゼである。配列番号２の野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドは、水の分子（Ｈ２Ｏ）を使用してエステル基質を対応する酸およびアルコール生成物に加水分解するアルファ－ベータヒドロラーゼである。一部の実施形態では、本明細書に提供されるさまざまな操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、本明細書に提供される他の操作された参照カルボキシエステラーゼポリペプチドと比較して酵素特性の改善を示す。
化合物（１）は、抗血栓療法の標的である第ＸＩａ因子の阻害剤の合成における中間体である（米国特許第９，４５３，０１８号に開示される通り）。
カルボキシエステラーゼは、工業的プロセス条件で医薬化合物および中間体を効率的に生成するために有用である各種の反応が可能である。カルボキシエステラーゼおよびリパーゼは、エステルの対応する酸への転換を含む所望の転換のためのヒドロラーゼとして作用し得る。１つの所望の反応は、化合物（１）の生成における中間体である化合物（３ａ）を生成するための化合物（２ａ）の転換（スキーム１に従う）である。
化合物（２ａ）のＲ－２エステルは、Ｓ－２エナンチオマーである化合物（２ｂ）とのラセミ混合物で存在する。したがって、酵素は、Ｒ－２酸である化合物（３ａ）またはＲ－２エステルである化合物（２ａ）（これは、次いで、加水分解されて、化合物（３ａ）を生成し得る）のいずれかを生成する速度論的光学分割が可能であり、高い鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）が非常に望ましい。ある方法、Ｅｖａｎｓオキサゾリドン誘導体のアルキル化は、所望されない化合物（３ｂ）のＳ－２エナンチオマーに対して、８６％の鏡像体過剰率で、化合物（３ａ）の所望のＲ－２キラル中心を設置する。しかしながら、化合物（３ｂ）に対して、鏡像体過剰率が増加して化合物（３ａ）を生成する改善された方法が、収率を改善するために必要である。
工業的プロセス条件下で、ラセミエステル基質は、化合物（２ａ）および化合物（２ｂ）の混合物として存在する。スキーム２によれば、化合物（２ａ）に対する立体選択性を有する改善されたカルボキシエステラーゼは、基質の化合物（２ｂ）を未反応のままにしながら、化合物（３ａ）の所望の生成物について高い鏡像体過剰率で示される。そのため、この速度論的光学分割反応は、ラセミ基質に起因して、５０％の最大収率を有する。マイナー生成物エナンチオマー（化合物３ｂ）は示されない。結果として、Ｒ－選択的酵素（Ｅ＞２００）を用いる反応は、反応の終了時に、ほとんどが所望の酸（３ａ）および未反応のエステル（２ｂ）を生じる。
本発明は、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、それらのポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットは、置換を、３／４／６／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、３／６／９／１０／７０／９９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／１０７、３／８／９／１０／１１／７０、３／８／９／１０／１１／７０／２２９、３／８／９／１０／１３／７０／８２／１０７、３／８／９／１０／１３／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／８２、３／８／９／１０／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／２２９、３／９／１０／１１／１３／８２、３／９／１０／１１／７０／８２／１０７、３／９／１０／１１／７０／２２９、３／９／１０／７０／８２、３／９／１１、３／９／１１／７０／８２／１８０、４／６／８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／６／９／１０／７０／８２／２２９、４／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／６５／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／８／９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、６／９／１０／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、６／９／１０／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、８／９／１０、８／９／１０／１１／１３／７０、８／９／１０／１１／１３／７０／８２、８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、８／９／１０／１１／４３／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／７０、８／９／１０／１１／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／７０／２２９、８／９／１０／７０、８／９／１０／７０／８２／２２９、９／１０、９／１０／１１／１２／４９／５１／７０／７３／８２／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／４９／７０／７３／８２／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２００、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／１１／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／７０／８２／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／３５／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／６５／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１９６／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、９／１０／１１／４０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５４／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／７０／８２／１１０／１８０／１９２／２１９、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１８０／１９２、９／１０／１１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／５４／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０、９／１０／１１／７０／７１／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０／１９２／２００、９／１０／１１／７０／７３／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２、９／１０／１１／７０／８２／８７／１１０／１８０／２１９、９／１０／１１／７０／８２／１００／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１０７、９／１０／１１／７０／８２／１０８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８７／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／１０７、９／１０／１２／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／５４／７０／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１２／７０／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１３／７０、９／１０／１３／７０／８２、９／１０／１３／７０／２２９、９／１０／１３／２０７、９／１０／１７、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２００／２１９、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／４９／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１７／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１７／５１／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／１７／７０／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１７／７０／１０４／１６０／１６５、９／１０／１７／７０／１３９／１６０／１６５、９／１０／２６、９／１０／２９／７０、９／１０／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３７、９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３９、９／１０／３９／１８６、９／１０／４１、９／１０／４５／７０、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２１９、９／１０／４９／５１／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／７０／８２／１８０／２２５、９／１０／４９／５４／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／７３／８２／８７／１０８／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２２５、９／１０／５１／５４／７０／８２／８７／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／７０／８２／１１０／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０／２００、９／１０／５４／７０／８２／１８０、９／１０／６２、９／１０／７０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０
／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。一部の追加の実施形態では、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットは、３Ｒ／４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／９９Ｒ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／１３Ｅ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、４Ｒ／６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ａ／９Ｃ／１０Ｉ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／４３Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、９Ａ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１２Ｐ／５１Ｄ／７０Ｗ／７３Ｍ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｃ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｖ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ａ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２２５Ｓ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／１９２Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｃ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｖ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｑ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１９６Ｅ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／４０Ｖ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｐ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｖ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｈ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ａ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１００Ｓ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｒ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８７Ｖ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／１０７Ｆ、９Ｃ／１０Ｉ／１２Ｐ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ
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８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｉ／Ｄ１３Ｅ／Ｖ８２Ｑ、Ｓ３Ｒ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｔ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ、Ｓ３Ｒ
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Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ／Ａ２１９Ｄ、およびＭ１１Ｌ／Ｄ３６Ｓ／Ｙ２０６Ｆ／Ｍ２０８
Ａから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。
／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。一部の追加の実施形態では、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットは、３Ｒ／４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／９９Ｒ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／１３Ｅ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、４Ｒ／６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ａ／９Ｃ／１０Ｉ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／４３Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、９Ａ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１２Ｐ／５１Ｄ／７０Ｗ／７３Ｍ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｃ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｖ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ａ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２２５Ｓ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／１９２Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｃ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｖ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｑ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１９６Ｅ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／４０Ｖ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｐ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｖ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｈ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ａ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１００Ｓ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｒ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８７Ｖ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／１０７Ｆ、９Ｃ／１０Ｉ／１２Ｐ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ
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８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｉ／Ｄ１３Ｅ／Ｖ８２Ｑ、Ｓ３Ｒ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｔ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ、Ｓ３Ｒ
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／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ｔ２００Ｈ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｑ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ａ１０４Ｍ／Ｓ１６０Ｅ／Ｇ１６５Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｒ１３９Ｈ／Ｓ１６０Ｇ／Ｇ１６５Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２６Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２６Ｔ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｗ２９Ｇ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ３６Ｎ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｇ３７Ｐ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｓ３８Ｙ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ３９Ａ／Ａ１８６Ｔ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ３９Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ４１Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ４１Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ４１Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｐ４５Ｒ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｐ４５Ｔ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｇ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｇ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｇ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ６２Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｋ９２Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ９９Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ９９Ｒ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ａ１０７Ｆ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ａ１５６Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｇ１６５Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ８８Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ９０Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ９６Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１０７Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ１１０Ｖ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１１１Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１１２Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１３３Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１３３Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１７８Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１８５Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１８６Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１９６Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１９６Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１９６Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ２１１Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２２６Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２２６Ｗ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｎ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｇ／Ｌ１２Ｓ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｇ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｇ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｒ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｌ１２Ｐ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ａ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｌ１２Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ／Ａ２１９Ｄ、およびＭ１１Ｌ／Ｄ３６Ｓ／Ｙ２０６Ｆ／Ｍ２０８
Ａから選択される置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。
本発明は、配列番号８２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、それらのポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号８２を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
本発明は、配列番号２６８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２６８を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
本発明は、配列番号５３６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号５３６を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
本発明は、配列番号２～５３６の偶数配列から選択される配列またはその機能的断片に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼであって、ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２～５３６の偶数配列から選択される配列を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
本発明は、配列番号４～５３６の偶数配列から選択されるポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼも提供する。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、天然に存在する野生型Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓカルボキシエステラーゼ（配列番号２）と比較して、これらの酵素の活性の機能性および活性の範囲を広げる改変された特性を保有する。カルボキシエステラーゼ特性の改善としては、限定されるものではないが、溶媒安定性、酵素活性、速度論的光学分割、エナンチオ選択性、位置特異性、立体選択性、宿主細胞毒性の低減、熱安定性（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、ｐＨ安定性、基質範囲、および／または基質の低減もしくは生成物の阻害が挙げられる。
提示されるカルボキシエステラーゼバリアントの特性の改善は、Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの参照カルボキシエステラーゼ配列または別の参照の操作されたポリペプチド、例えば、配列番号２の配列と比較して、特異的な残基位置に残基の差異を含有する操作されたポリペプチドに関する。一部の実施形態では、残基の差異は、以下のアミノ酸位：Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ７０、Ｘ８２、Ｘ１８０、Ｘ２００、およびＸ２１４の少なくとも１つに存在する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される操作されたカルボキシエステラーゼは、同じ反応条件下の野生型ポリペプチドまたは別の参照ポリペプチドと比較して、酵素活性の増加を示すとして特徴付けられる。操作されたカルボキシエステラーゼは、野生型または参照カルボキシエステラーゼと比較して、化合物（３ｂ）よりも化合物（３ａ）のｅ．ｅ．の増加によって示されるエナンチオ選択性の増加が可能である。一部の実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、Ｅ－値の増加によって測定されるように、エナンチオ特異性が増加している。一部の実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、野生型または参照カルボキシエステラーゼと比較して、さまざまなｐＨレベル（例えば、ｐＨ９．０）を伴う条件下で活性を維持するか、または活性を増加させる。一部の実施形態では、活性の増加および／またはエナンチオ特異性の増加を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２、８２、２６８、および／または５３６の参照配列に対して少なくとも８０％、８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きく同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、適切な反応条件下、野生型カルボキシエステラーゼ（例えば、配列番号２）または参照の操作されたカルボキシエステラーゼ（配列番号８２、２６８、および５３６）の活性と比べて、少なくとも約１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１５０倍、５００倍、またはそれよりも大きい、基質化合物を生成物に変換するための生体触媒活性の改善が可能である。一部の実施形態では、酵素活性のこれらの改善は、熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、立体選択性、立体特異性、位置特異性、エナンチオ選択性、溶媒安定性、ｐＨ安定性、および／もしくは基質結合、または基質の低減および／もしくは生成物阻害の関連する増加にまで及んだ。
一部の実施形態では、本発明は、機能的カルボキシエステラーゼ活性および／またはその操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドの特性の改善を保持する本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドのいずれかの断片を含む操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドも提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、カルボキシエステラーゼ活性を有する（例えば、適切な反応条件下で基質を生成物に変換することができる）ポリペプチド断片であって、断片が、本発明の操作されたポリペプチド、例えば、配列番号２～５３６の偶数の配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチドの全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％を含む、ポリペプチド断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド配列、例えば、配列番号２～５３６の偶数の配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列のいずれか１つと比較して、少なくとも１つの欠失、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列を含む。そのため、本発明の操作された操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドのそれぞれのおよびあらゆる実施形態について、アミノ酸配列は、カルボキシエステラーゼポリペプチドの１個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、２個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、３個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、４個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、５個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、６個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、８個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、または２０個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、アミノ酸の総数の最大で１０％、アミノ酸の総数の最大で１０％、アミノ酸の総数の最大で２０％、またはアミノ酸の総数の最大で３０％の欠失、付加、および／または置換を含むことができ、ここで、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼの関連する機能的活性および／または特性の改善は維持されている。一部の実施形態では、欠失、付加、および／または置換は、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、１～５０、１～５５、または１～６０個のアミノ酸残基の付加および／または置換を含むことができる。一部の実施形態では、欠失、付加、および／または置換の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０個のアミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、欠失、付加、および／または置換は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５または３０個のアミノ酸残基の欠失、付加、および／または置換を含むことができる。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチド配列、例えば、配列番号２～５３６の偶数の配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列のいずれか１つと比較して挿入を含むアミノ酸配列を有する操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを提供する。そのため、本発明のカルボキシエステラーゼポリペプチドのそれぞれのおよびあらゆる実施形態について、挿入は、１個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、２個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、３個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、４個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、５個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、６個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、８個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多くのアミノ酸、または２０個もしくはそれよりも多くのアミノ酸を含むことができ、ここで、本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼの関連する機能的活性および／または特性の改善は維持されている。挿入は、カルボキシエステラーゼポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端または内部部分へのものであり得る。
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが他のポリペプチド、例えば、一例として限定されないが、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属に結合するためのＨｉｓタグ）、および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）に融合されている融合ポリペプチドの形態である。そのため、本明細書に記載される操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドへの融合を伴って、または伴わずに使用することができる。
本明細書に記載される操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、遺伝的にコードされるアミノ酸に限定されない。そのため、遺伝的にコードされるアミノ酸に加えて、本明細書に記載されるポリペプチドは、全体的または部分的に、天然に存在するアミノ酸および／または合成非コードアミノ酸のいずれかから構成されていてもよい。本明細書に記載されるポリペプチドを構成し得るある特定の一般に遭遇する非コードアミノ酸としては、限定されるものではないが、遺伝子によりコードされるアミノ酸のＤ－立体異性体；２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ－アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ－ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２－クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３－フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４－フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２－ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３－ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４－ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２－メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３－メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４－メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２－ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３－ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４－ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２－シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４－アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４－ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４－アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド－２－イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド－３－イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド－４－イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト－１－イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト－２－イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アウスリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３－ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３－アミノ－５－フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；β－２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）－ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリシン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン－３－カルボン酸（ＡＣＡ）；１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）が挙げられる。本明細書に記載されるポリペプチドを構成し得るさらなる非コードアミノ酸は、当業者には明らかであろう。これらのアミノ酸は、Ｌ－またはＤ－配置のいずれかであり得る。
当業者は、側鎖保護基を持つアミノ酸または残基も、本明細書に記載されるポリペプチドを構成し得ることを認識するであろう。この場合に、芳香族カテゴリーに属するそのような保護されたアミノ酸の非限定的な例としては（保護基を括弧内に列挙した）、限定されるものではないが、Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ－ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ－δ－キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ－ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ－ベンジル）、およびＴｙｒ（Ｏ－ベンジル）が挙げられる。
本明細書に記載されるポリペプチドを構成し得るコンフォメーション的に拘束されている非コードアミノ酸としては、限定されるものではないが、Ｎ－メチルアミノ酸（Ｌ－配置）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４－カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン－３－カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸が挙げられる。
当業者に明らかであるように、前述の残基位置および各残基位置についての特定のアミノ酸残基を、個々にまたはさまざまな組合せで使用して、とりわけ、酵素活性、基質／生成物優先性、エナンチオ選択性、立体選択性、基質／生成物耐性、ならびに高温、溶媒、および／またはｐＨなどのさまざまな条件下での安定性を含む所望の特性の改善を有するカルボキシエステラーゼポリペプチドを合成することができる。
本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、ある特定の工業的に関連する条件下で、目的の基質の目的の生成物への効率的な加水分解のために配列番号２の定向進化によって作成されたものであり、参照カルボキシエステラーゼポリペプチドと比較して１つまたは複数の残基の差異を有する。これらの残基の差異は、さまざまな酵素特性の改善、特に、活性およびエナンチオ選択性の増加に関連する。一部の追加の実施形態では、バリアントカルボキシエステラーゼは、立体選択性の増加、安定性の増加、ならびに基質および／または生成物濃度の増加への耐性（例えば、生成物阻害の減少）も示した。したがって、一部の実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、野生型Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓカルボキシエステラーゼポリペプチド（例えば、配列番号２）の活性と比べて少なくとも約１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、またはそれよりも大きく増加した活性で、基質化合物を生成物に変換することができる。一部の実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、約４８時間、約３６時間、約２４時間、またはさらにより短い時間の反応時間で、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、または少なくとも約５０％の変換パーセントで、基質を生成物に変換することができ、ここで、化合物（２ａ）および（２ｂ）のラセミ基質の化合物（３ａ）への最大変換は、５０％である。一部の実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな鏡像体過剰率で、基質を生成物に変換することができる。
一部の実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、参照ポリペプチド（例えば、配列番号２）の基質耐性と比べて基質の存在に対する耐性の増加を伴って、基質を生成物に変換することができる。したがって、一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、約７２時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間、またはさらにより短い時間の反応時間で、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、または少なくとも約５０％の変換パーセントで、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約７５ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌの基質負荷濃度の存在下で、基質を生成物に変換することができ、ここで、化合物（２ａ）および（２ｂ）のラセミ基質の化合物（３ａ）への最大変換は、５０％である。
操作されたポリペプチドの上記に記載される特性の改善を決定することができる一部の適切な反応条件は、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、緩衝剤、共溶媒、ｐＨ、ならびに／または温度および反応時間を含む条件に関して、本明細書に提供される。一部の実施形態では、適切な反応条件は、下記および実施例に記載されるアッセイ条件を含む。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、固体支持体、例えば、膜、樹脂、固体担体、または他の固相材料上に提供することができる。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそれらの共重合体およびグラフトなどの有機ポリマーから構成され得る。固体支持体はまた、無機物、例えば、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金属、例えば、金もしくは白金であり得る。固体支持体の形状は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤または非膨潤特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、くぼみ、もしくは他のコンテナ、容器、特徴または場所の形態で構成され得る。
一部の実施形態では、カルボキシエステラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、それらが参照ポリペプチド（例えば、配列番号２）と比べてそれらの特性の改善の少なくとも一部を保持するように、固体支持体上に結合または固定化される。そのような実施形態では、固定化されたポリペプチドは、基質化合物の所望の生成物への生体触媒変換を容易にすることができ、反応が完了した後、容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定化されたビーズを保持することによって）、次いで、その後の反応において再利用またはリサイクルされる。そのような固定化酵素プロセスは、さらなる効率およびコストの低減を可能にする。したがって、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを使用する方法のいずれかは、固体支持体上に結合または固定化された同じカルボキシエステラーゼポリペプチドを使用して行うことができることがさらに企図される。
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、非共有結合的または共有結合的に結合され得る。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素のコンジュゲーションおよび固定化のためのさまざまな方法は、当技術分野で周知である。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素のコンジュゲーションおよび固定化のための他の方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４２： ８９５－８９８ ［２００７］；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ７６： ８４３－８５１ ［２００７］；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔ． Ｂ： Ｅｎｚ．， ６３： ３９－４４ ［２０１０］；Ｔｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃ． Ｒｅｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐ．， オンライン公開： ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；およびＭａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １８：６２９－３４ ［２００２］などを参照されたい）。本発明の操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを固定化するために有用な固体支持体としては、限定されるものではないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢ共重合体、もしくはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂が挙げられる。本発明の操作されたカルボキシエステラーゼを固定化するために有用な例示的な固体支持体としては、限定されるものではないが、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ、ならびに以下の異なる種類のＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９、およびＥＸＥ１２０を含むＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が挙げられる。
一部の実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドは、ポリペプチドが位置的に別個の場所に配置されているアレイの形態で提供され得る。一部の実施形態では、位置的に別個の場所は、９６ウェルプレートなどの固体支持体中のウェルである。複数の支持体は、試薬のロボット送達、または検出方法および／もしくは機器によってアドレス可能なさまざまな場所で、アレイ上に構成され得る。そのようなアレイを使用して、ポリペプチドによる変換のために各種の基質化合物を試験することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される操作されたポリペプチドは、キットの形態で提供することができる。キット中のポリペプチドは、個々に、または複数のポリペプチドとして存在し得る。キットは、酵素反応を行うための試薬、ポリペプチドの活性を評価するための基質、および生成物を検出するための試薬をさらに含むことができる。キットは、試薬ディスペンサー、およびキットの使用説明書を含むこともできる。一部の実施形態では、本発明のキットは、異なるアドレス可能な位置に複数の異なる操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを含むアレイを含み、ここで、異なるポリペプチドは、少なくとも１つの異なる酵素特性の改善をそれぞれ有する参照配列の異なるバリアントである。複数の操作されたポリペプチドを含むそのようなアレイおよびそれらの使用方法は公知である（例えば、ＷＯ２００９／００８９０８Ａ２号を参照されたい）。
操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド
操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド
別の態様では、本発明は、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結されて、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドが作出され得る。操作されたカルボキシエステラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、適当な宿主細胞に導入して、対応するカルボキシエステラーゼポリペプチドを発現させることができる。
さまざまなアミノ酸に対応するコドンの知識のために、タンパク質配列の利用性は、対象をコードすることができる全てのポリヌクレオチドの記載を提供する。同じアミノ酸が代替または同義コドンによってコードされる遺伝子コードの縮重は、極めて多数の核酸を作製することを可能にし、それらの全ては、本明細書に開示される改善されたカルボキシエステラーゼ酵素をコードする。そのため、特定のアミノ酸配列が特定されたら、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で、１つまたは複数のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができる。これに関して、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せを選択することによって作製することができるポリヌクレオチドのそれぞれのおよびあらゆる可能な変形形態を具体的に企図し、全てのそのような変形形態は、実施例における表中に提示されるアミノ酸配列を含む本明細書に開示される任意のポリペプチドについて具体的に開示されると見なされるべきである。さまざまな実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生される宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌において遺伝子を発現させるために使用され、酵母において使用される好ましいコドンは、酵母における発現のために使用され、哺乳動物において使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞における発現のために使用される。例として、配列番号１のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化されているが、他にもＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの天然に存在するカルボキシエステラーゼをコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２～５３６の偶数の配列識別子から選択されるアミノ酸配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１～５３５の奇数の配列識別子に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を含むポリヌクレオチド配列から選択される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号１～５３５の奇数の配列識別子を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、ヌクレオチドレベルで、操作されたカルボキシエステラーゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対して約８０％またはそれよりも大きな配列同一性、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれよりも大きな配列同一性を有する。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチドは、配列番号１を含むが、一部の他の実施形態では、参照ポリヌクレオチドは、配列番号８１を含む。一部のさらなる実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号２８５を含む。一部のさらなる実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号５３５を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼ配列は、実施例に記載されるように、有益であると特定された位置を含む配列を含む。
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きな配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片をコードし、操作されたカルボキシエステラーゼは、そのポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、置換を、３／４／６／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、３／６／９／１０／７０／９９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／１０７、３／８／９／１０／１１／７０、３／８／９／１０／１１／７０／２２９、３／８／９／１０／１３／７０／８２／１０７、３／８／９／１０／１３／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／８２、３／８／９／１０／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／２２９、３／９／１０／１１／１３／８２、３／９／１０／１１／７０／８２／１０７、３／９／１０／１１／７０／２２９、３／９／１０／７０／８２、３／９／１１、３／９／１１／７０／８２／１８０、４／６／８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／６／９／１０／７０／８２／２２９、４／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／６５／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／８／９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、６／９／１０／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、６／９／１０／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、８／９／１０、８／９／１０／１１／１３／７０、８／９／１０／１１／１３／７０／８２、８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、８／９／１０／１１／４３／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／７０、８／９／１０／１１／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／７０／２２９、８／９／１０／７０、８／９／１０／７０／８２／２２９、９／１０、９／１０／１１／１２／４９／５１／７０／７３／８２／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／４９／７０／７３／８２／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２００、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／１１／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／７０／８２／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／３５／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／６５／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１９６／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、９／１０／１１／４０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５４／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／７０／８２／１１０／１８０／１９２／２１９、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１８０／１９２、９／１０／１１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／５４／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０、９／１０／１１／７０／７１／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０／１９２／２００、９／１０／１１／７０／７３／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２、９／１０／１１／７０／８２／８７／１１０／１８０／２１９、９／１０／１１／７０／８２／１００／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１０７、９／１０／１１／７０／８２／１０８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８７／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／１０７、９／１０／１２／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／５４／７０／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１２／７０／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１３／７０、９／１０／１３／７０／８２、９／１０／１３／７０／２２９、９／１０／１３／２０７、９／１０／１７、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２００／２１９、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／４９／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１７／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１７／５１／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／１７／７０／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１７／７０／１０４／１６０／１６５、９／１０／１７／７０／１３９／１６０／１６５、９／１０／２６、９／１０／２９／７０、９／１０／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３７、９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３９、９／１０／３９／１８６、９／１０／４１、９／１０／４５／７０、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２１９、９／１０／４９／５１／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／７０／８２／１８０／２２５、９／１０／４９／５４／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／７３／８２／８７／１０８／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２２５、９／１０／５１／５４／７０／８２／８７／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／７０／８２／１１０／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０／２００、９／１０／５４／７０／
８２／１８０、９／１０／６２、９／１０／７０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含む少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、３Ｒ／４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／９９Ｒ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／１３Ｅ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、４Ｒ／６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ａ／９Ｃ／１０Ｉ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／４３Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、９Ａ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１２Ｐ／５１Ｄ／７０Ｗ／７３Ｍ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｃ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｖ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ａ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２２５Ｓ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／１９２Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｃ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｖ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｑ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１９６Ｅ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／４０Ｖ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｐ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｖ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｈ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ａ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１００Ｓ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｒ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８７Ｖ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ、
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Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ１３Ｅ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ
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Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｌ１２Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７
０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ／Ａ２１９Ｄ、およびＭ１１Ｌ／Ｄ３６Ｓ／Ｙ２０６Ｆ／Ｍ２０８Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含む少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸は、配列番号２を基準に番号付けされる。
８２／１８０、９／１０／６２、９／１０／７０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含む少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、ポリペプチド配列のアミノ酸の位置は、配列番号２を基準に番号付けされる。一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、３Ｒ／４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／９９Ｒ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、３Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／１３Ｅ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、３Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ、３Ｒ／９Ｃ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、４Ｒ／６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、４Ｒ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、６Ｐ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ａ／９Ｃ／１０Ｉ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／１３Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／４３Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０７Ｆ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／２２９Ｍ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ、８Ｇ／９Ｃ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／２２９Ｍ、９Ａ／１０Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１２Ｐ／５１Ｄ／７０Ｗ／７３Ｍ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｃ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｈ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／１７Ｖ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ａ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２２５Ｓ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１８０Ｌ／１９２Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｅ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｃ／４９Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／１７Ｖ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／５４Ｓ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１０８Ｈ／１１０Ｍ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５１Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１１０Ｍ／１８０Ｌ／１９２Ｍ／２１９Ｈ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／８７Ｐ／１０８Ｈ／１８０Ｌ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｇ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｑ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３５Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／６５Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１９６Ｅ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／３６Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／４０Ｖ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｄ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｐ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／５４Ｓ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｖ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｈ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７１Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｌ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｍ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／７３Ｒ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ａ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１００Ｓ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１０８Ｒ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１４８Ｌ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｉ／７０Ｗ／８７Ｖ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３６Ｎ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／２００Ａ／２１４Ｗ／２２９Ｍ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／３８Ｙ／７０Ｗ／８２Ｑ／１８０Ｌ／１８６Ｆ／２００Ａ／２１４Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ、９Ｃ／１０Ｉ／１１Ｔ／７０Ｗ／８２Ｑ、
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Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ１３Ｅ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ／Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｓ３Ｒ／Ｒ８Ｇ
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Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｃ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ｔ２００Ｈ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｈ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｑ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ａ１０４Ｍ／Ｓ１６０Ｅ／Ｇ１６５Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｖ／Ｎ７０Ｗ／Ｒ１３９Ｈ／Ｓ１６０Ｇ／Ｇ１６５Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１７Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２６Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２６Ｔ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｗ２９Ｇ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ３６Ｎ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｇ３７Ｐ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｓ３８Ｙ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ３９Ａ／Ａ１８６Ｔ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｄ３９Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ４１Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ４１Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ４１Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｐ４５Ｒ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｐ４５Ｔ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｇ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｇ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｇ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ６２Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ８７Ｐ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ａ１０７Ｆ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ／Ａ２１９Ｈ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｋ９２Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ９９Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ９９Ｒ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ａ１０７Ｆ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ａ１５６Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｇ１６５Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｔ２２９Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ８８Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ９０Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ９６Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１０７Ｆ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ１１０Ｖ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１１１Ｍ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１１２Ｇ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１３３Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１３３Ｗ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１７８Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ１８５Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１８６Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１９６Ｑ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１９６Ｒ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ１９６Ｓ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ｑ２１１Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２２６Ｅ、Ｗ９Ｃ／Ｍ１０Ｉ／Ａ２２６Ｗ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｒ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ａ／Ｖ２１４Ｗ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｎ／Ｒ４９Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｅ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｇ／Ｌ１２Ｓ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｇ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｐ１８０Ｌ／Ｔ２００Ｈ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｇ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｍ１１Ｒ／Ｌ１２Ｐ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｌ１２Ｐ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ８２Ａ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｌ１２Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ２２５Ｓ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｒ４９Ｓ／Ｑ５１Ｄ／Ａ５４Ｓ／Ｎ７０Ｗ／Ｖ７３Ｍ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ／Ｑ１９２Ｍ、Ｗ９Ｔ／Ｍ１０Ｉ／Ｎ７
０Ｗ／Ｖ７３Ｌ／Ｖ８２Ｑ／Ｎ１０８Ｈ／Ｑ１１０Ｍ／Ｍ１４８Ｌ／Ｐ１８０Ｌ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ、Ｍ１１Ｌ／Ｑ２４Ｔ／Ａ２１９Ｄ、およびＭ１１Ｌ／Ｄ３６Ｓ／Ｙ２０６Ｆ／Ｍ２０８Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含む少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードし、アミノ酸は、配列番号２を基準に番号付けされる。
改善されたカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するための各種の方法で操作さていてもよい。ベクターへのその挿入の前の単離されたポリヌクレオチドの操作が、発現ベクターに応じて、望ましくあり得るか、または必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技法は、当技術分野で周知である。
細菌宿主細胞について、本発明の核酸構築物の転写を指示するための適切なプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５： ３７２７－３７３１ ［１９７８］を参照されたい）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２１－２５ ［１９８３］を参照されたい）が挙げられる。さらなる適切なプロモーターは、当業者に公知である。
糸状菌宿主細胞について、本発明の核酸構築物の転写を指示するための適切なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼについての遺伝子から得られるプロモーター（ＷＯ９６／００７８７号）、ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにその突然変異体、切断型、およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
酵母宿主では、有用なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来のもの、ならびに酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーター（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８ ［１９９２］を参照されたい）が挙げられる。
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列である、適切な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結される。選択される宿主細胞において機能的である任意のターミネーターが、本発明において使用され得る。
例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものであり得る。
酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られるものであり得、ならびに当技術分野で公知の酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターであり得る（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、上記を参照されたい）。
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である、適切なリーダー配列であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結される。選択される宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列が使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適当なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
制御配列はまた、核酸配列の３’末端に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された配列であって、転写される場合に、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列であってもよい。選択される宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子由来であり得、ならびに当技術分野で公知の酵母宿主細胞のためのさらなる有用なポリアデニル化配列であり得る（例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １５：５９８３－５９９０ ［１９９５］を参照されたい）。
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に方向づける、シグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は、翻訳リーディングフレームにおいて、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を固有に含有していてもよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有していてもよい。コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含有しない場合、外来性シグナルペプチドコード領域が必要とされ得る。
あるいは、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード領域を単に置き換えてもよい。しかしながら、発現したポリペプチドを選択される宿主細胞の分泌経路に方向づける任意のシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域、ならびに当技術分野で公知のさらなるシグナルペプチドである（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ５７： １０９－１３７ ［１９９３］を参照されたい）。
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子由来であり得、ならびにさらなる有用なシグナルペプチドコード領域であり得る（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２、上記を参照されたい）。
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってもよい。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合では、チモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に、不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子から得られ得る（ＷＯ９５／３３８３６号）。
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域が両方ともポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
宿主細胞の成長に関連して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することも望ましくあり得る。調節系の例は、調節性化合物の存在を含む化学的または物理的な刺激に応答して、遺伝子の発現のオンまたはオフを引き起こすものである。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらとしては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合では、本発明のカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結される。
そのため、一部の実施形態では、本発明は、それらが導入される宿主の種類に応じて、操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、ならびに１つまたは複数の発現調節領域、例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製開始点などを含む組換え発現ベクターも対象とする。上記に記載されるさまざまな核酸および制御配列は、一緒に接続されて、そのような部位においてポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターを生成してもよい。あるいは、本発明の核酸配列は、発現のための適当なベクターに核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を挿入することによって発現されてもよい。発現ベクターの作出では、コード配列は、コード配列が発現のための適当な制御配列と作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されるように、ベクター中に位置する。
組換え発現ベクターは、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよく、これは、組換えＤＮＡ手順に好都合に付され得、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであってもよい。
発現ベクターは、その複製が染色体複製とは独立している、自律複製性ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクター）であってもよい（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有していてもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。さらにまた、宿主細胞のゲノムまたはトランスポゾンに導入される全ＤＮＡを一緒に含有する、単一のベクターもしくはプラスミド、または２つもしくはそれよりも多くのベクターもしくはプラスミドが使用されてもよい。
本発明の発現ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択マーカーを含有する。選択マーカーは、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などを提供する遺伝子であり得る。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。
糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、限定されるものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞における使用のための実施形態としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。
本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組み込み、またはゲノムとは独立した細胞におけるベクターの自律複製を可能にするエレメントを含有することができる。宿主細胞のゲノムへの組み込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同組換えもしくは非相同組換えによるゲノムへのベクターの組み込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依拠し得る。
あるいは、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによって組み込みを指示するためのさらなる核酸配列を含有していてもよい。さらなる核酸配列は、ベクターが染色体の正確な場所で宿主細胞のゲノムに組み込まれるのを可能にする。正確な場所での組み込みの可能性を増加させるために、組み込みエレメントは、好ましくは、相同組換えの確率を増強するために対応する標的配列と高度に相同である十分な数の核酸、例えば、１００～１０，０００塩基対、好ましくは、４００～１０，０００塩基対、最も好ましくは、８００～１０，０００塩基対を含有しなければならない。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であってもよい。さらにまた、組み込みエレメントは、非コード核酸配列またはコード核酸配列であってもよい。他方で、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
自律複製のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自律的に複製するのを可能にする複製開始点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）をさらに含んでいてもよい。細菌複製開始点の非限定的な例は、Ｐ１５Ａ ｏｒｉ、またはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７の複製開始点（このプラスミドはＰ１５Ａ ｏｒｉを有する）、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、もしくはｐＴＡ１０６０である。酵母宿主細胞における使用のための複製開始点の例は、２ミクロン複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組合せ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組合せである。複製開始点は、宿主細胞においてその機能する温度感受性にする突然変異を有するものであってもよい（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１４３３ ［１９７８］を参照されたい）。
１つよりも多くのコピーの本発明の核酸配列を、遺伝子産物の産生を増加させるために、宿主細胞に挿入してもよい。核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つのさらなるコピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことによって、または増幅可能な選択マーカー遺伝子を核酸配列と共に含めることによって得ることができ、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーおよびそれにより核酸配列のさらなるコピーを含有する細胞は、細胞を適当な選択可能な作用剤の存在下で培養することによって選択することができる。
本発明における使用のための発現ベクターの多くは市販されている。適切な商業的な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ＣＭＶプロモーター、および哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位、およびｐＢＲ３２２複製開始点、およびＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーを含む、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ発現ベクター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。他の市販の適切な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（－）およびｐＢＫ－ＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはｐＰｏｌｙに由来するプラスミドが挙げられる（Ｌａｔｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５７：１９３－２０１ ［１９８７］を参照されたい）。
当業者は、酵素の産生時に、特に、使用される細胞系および酵素の特定のアミノ酸配列に応じて、翻訳後修飾が起こり得ることを認識するであろう。例えば、そのような翻訳後修飾としては、ある特定のリーダー配列の切断、さまざまなグリコシル化およびリン酸化パターンでのさまざまな糖部分の付加、脱アミド化、酸化、ジスルフィド結合スクランブル、異性化、Ｃ末端リシンクリッピング、ならびにＮ末端グルタミン環化が挙げられ得る。本発明は、１つまたは複数の翻訳後修飾に付されたか、またはそれを受けた、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素の使用を包含する。そのため、本発明の操作されたカルボキシエステラーゼは、例えば本明細書に記載される、翻訳後修飾を受けたものを含む。
脱アミド化は、アスパラギン（Ｎ）を、イソアスパラギン酸（イソアスパルテート）およびアスパラギン酸（アスパルテート）（Ｄ）に、およそ３：１の比で主に変換する酵素反応である。したがって、この脱アミド化反応は、イソアスパルテートへのアスパルテート（Ｄ）の異性化に関する。アスパラギンの脱アミド化およびアスパルテートの異性化は両方とも、中間体のスクシンイミドを含む。非常に低い程度で、脱アミド化は、同様の様式で、グルタミン残基で起こり得る。
酸化は、産生および貯蔵の間に（すなわち、酸化条件の存在下で）起こり得、反応性酸素種によって直接的に、または酸化ストレスの二次副生成物との反応によって間接的に誘導される、タンパク質の共有結合的改変をもたらす。酸化は、主にメチオニン残基で発生するが、トリプトファンおよび遊離システイン残基で起こることもある。
ジスルフィド結合スクランブルは、産生の間および基本的な貯蔵条件で起こり得る。ある特定の状況下で、ジスルフィド結合は、壊れるか、または不正確に形成されて、不対システイン残基（－ＳＨ）をもたらし得る。これらの遊離（不対）スルフヒドリル（－ＳＨ）は、シャッフリングを促進し得る。
操作されたカルボキシエステラーゼにおけるＮ末端グルタミン（Ｑ）およびグルタメート（グルタミン酸）（Ｅ）は、環化を介してピログルタメート（ｐＧｌｕ）を形成する可能性がある。ほとんどのｐＧｌｕ形成は、製造において発生するが、これは、処理および貯蔵条件のｐＨおよび温度に応じて、非酵素的に形成され得る。
Ｃ末端リシンクリッピングは、カルボキシペプチダーゼによって触媒される酵素反応であり、酵素において一般に観察される。このプロセスの変形形態は、組換え宿主細胞由来の酵素からのリシンの除去を含む。
本発明では、上記に記載される翻訳後修飾および一次アミノ酸配列の変化は、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素の活性の有意な変化をもたらさない。
カルボキシエステラーゼポリペプチドの発現のための宿主細胞
カルボキシエステラーゼポリペプチドの発現のための宿主細胞
別の態様では、本発明は、本発明の改善されたカルボキシエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、宿主細胞におけるカルボキシエステラーゼ酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結されている、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるカルボキシエステラーゼポリペプチドの発現における使用のための宿主細胞は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｏｒ細胞、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記に記載される宿主細胞のために適当な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。
カルボキシエステラーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知のさまざまな方法によって細胞に導入することができる。技法としては、とりわけ、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのさまざまな方法は、当業者には明らかである。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０は、本発明において使用される宿主株であるが、本発明がこの特定の宿主株に限定されることは意図されない。発現ベクターは、改善されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを、ｌａｃＩリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結されたプラスミドｐＣＫ１１０９００に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結することによって作出された。発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製開始点、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有していた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０中に対象ポリヌクレオチドを含有する細胞は、細胞をクロラムフェニコール選択に付すことによって単離することができる。
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを作製する方法
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドを作製する方法
一部の実施形態では、本発明の改善されたカルボキシエステラーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、加水分解反応を触媒する天然に存在するカルボキシエステラーゼ酵素は、Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓから得られる（またはそれに由来する）。一部の実施形態では、親ポリヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞におけるカルボキシエステラーゼの発現を増強するようにコドン最適化される。例示として、Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの野生型カルボキシエステラーゼポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列を、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１１０３８６０６．１）で入手可能なＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓカルボキシエステラーゼ配列の公知のポリペプチド配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから構築した。配列番号１として指定された親ポリヌクレオチド配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化し、コドン最適化されたポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、カルボキシエステラーゼ遺伝子の発現を、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下に置いた。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて活性カルボキシエステラーゼを発現するクローンを、特定し、遺伝子を配列決定して、それらの同一性を確認した。配列番号１として指定されたコドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、元の野生型カルボキシエステラーゼから進化させた操作されたカルボキシエステラーゼのほとんどの実験およびライブラリー構築のための開始点として利用された親配列であった。
一部の実施形態では、操作されたカルボキシエステラーゼは、上記で議論されるように、天然に存在するカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチドまたは天然に存在するカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化バージョンを突然変異誘発および／または定向進化法に付すことによって得られる。突然変異誘発は、ランダム変異誘発および部位特異的突然変異誘発を含む当技術分野で公知の技法のいずれかに従って行われ得る。定向進化は、シャッフリングを含む、改善されたプロモーターバリアントについてスクリーニングするための当技術分野で公知の技法のいずれかを用いて行うことができる。突然変異誘発および定向進化法は当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号、同第９，６６５，６９４号、同第９，６８４，７７１号、および全ての関連非米国対応特許；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２５４（２）：１５７－７８ ［１９９７］；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５７：３６９－７４ ［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， １９：４２３－４６２ ［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：１１９３－１２０１ ［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２３７：１－７ ［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ３８：８７９－８８７ ［１９８４］；Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４：３１５－３２３ ［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ３：２８４－２９０ ［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １７：２５９－２６４ ［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：２８８－２９１ ［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １５：４３６－４３８ ［１９９７］；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９４：４５０４－４５０９ ［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４：３１５－３１９ ［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３７０：３８９－３９１ ［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１０７４７－１０７５１ ［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５号；ＷＯ９７／００７８号；ＷＯ９７／３５９６６号；ＷＯ９８／２７２３０号；ＷＯ００／４２６５１号；ＷＯ０１／７５７６７号；ならびにＷＯ２００９／１５２３３６号を参照されたい）。さまざまな方法が当技術分野における使用されるように、本発明は、任意の特定の方法に限定されることを意図するものではない。
一部の実施形態では、所望の改善された酵素特性が熱安定性（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）である場合、酵素活性は、酵素調製物を定義された温度に付し、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後に測定され得る。次いで、カルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、配列決定して、ヌクレオチド配列の変化を特定し（存在する場合）、これを使用して、宿主細胞において酵素を発現させる。
操作されたポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法に従って、標準的な固相法によって調製することができる。一部の実施形態では、最大で約１００塩基の断片を、個々に合成し、次いで、接続して（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法によって）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、化学的合成によって調製することができる（例えば、典型的には、自動合成方法において実施されるので、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．， ２２：１８５９－６９ ［１９８１］によって記載される古典的なホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３：８０１－０５ ［１９８４］によって記載される方法を使用して）。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、合成され（例えば、自動ＤＮＡ合成機において）、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、適当なベクターにクローニングされる。加えて、本質的に任意の核酸は、各種の商業的供給源のいずれかから入手することができる（例えば、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ． Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、およびその他多くの供給源）。
宿主細胞において発現された操作されたカルボキシエステラーゼ酵素は、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製のための周知の技法のいずれか１つまたは複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌からのタンパク質の溶解および高効率での抽出のための適切な溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で市販されている。
カルボキシエステラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、一部分では、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような因子に依存し、当業者には明らかである。
一部の実施形態では、親和性技法が、改善されたカルボキシエステラーゼ酵素を単離するために使用されてもよい。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、カルボキシエステラーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用され得る。抗体の産生のために、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含むさまざまな宿主動物が、カルボキシエステラーゼによる注射によって免疫されてもよい。カルボキシエステラーゼポリペプチドは、側鎖官能基によって、または側鎖官能基に付着したリンカーによって、ＢＳＡなどの適切な担体に付着させることができる。限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むさまざまなアジュバントが、免疫学的応答を増加させるために、宿主種に応じて使用されてもよい。
カルボキシエステラーゼは、調製され、酵素を発現する細胞の形態で、粗製抽出物として、または単離されたもしくは精製された調製物として使用されてもよい。カルボキシエステラーゼは、粉末形態（例えば、アセトン粉末）で凍結乾燥物として調製されてもよく、または酵素溶液として調製されてもよい。一部の実施形態では、カルボキシエステラーゼは、実質的に純粋な調製物の形態であり得る。
一部の実施形態では、カルボキシエステラーゼポリペプチドは、固体基質に付着させ得る。基質は、固相、表面、および／または膜であり得る。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそれらの共重合体およびグラフトなどの有機ポリマーから構成され得る。固体支持体はまた、無機物、例えば、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金属、例えば、金もしくは白金であり得る。基質の形状は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤または非膨潤特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、くぼみ、もしくは他のコンテナ、容器、特徴または場所の形態で構成され得る。複数の支持体は、試薬のロボット送達、または検出方法および／もしくは機器によってアドレス可能なさまざまな場所で、アレイ上に構成され得る。
操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を使用する方法
操作されたカルボキシエステラーゼ酵素を使用する方法
操作されたカルボキシエステラーゼ酵素および／もしくは必要に応じた補助因子再生酵素をコードする遺伝子で形質転換された全細胞、またはその細胞抽出物および／もしくは溶解物は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）または半固体（例えば、粗ペースト）を含む各種の異なる形態で用いられ得る。
細胞抽出物または細胞溶解物は、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）、それに続く凍結乾燥前の脱塩手順（例えば、限外濾過、透析など）によって部分的に精製されてもよい。細胞調製物のいずかは、例えば、グルタルアルデヒドなどの公知の架橋剤を使用する架橋、または固相（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃなど）への固定化によって安定化され得る。
固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）、溶液、エマルジョン、懸濁液などを含む各種の異なる形態で反応に提供されてもよい。反応物は、当業者に公知である方法および機器を使用して、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液を、小アリコートで－８０℃で凍結し、次いで、事前に冷やされた凍結乾燥チャンバーに添加し、それに続いて真空を適用することができる。試料からの水の除去後、温度を、典型的には、２時間で４℃に上昇させた後、真空を解除し、凍結乾燥試料を回収する。
反応の過程の間、反応混合物のｐＨは変化し得る。反応混合物のｐＨは、所望のｐＨで、または所望のｐＨ範囲内で維持され得る。これは、反応の過程の前および／またはその間に、酸または塩基の添加によって行われてもよい。あるいは、ｐＨは、緩衝剤を使用することによって制御されてもよい。したがって、一部の実施形態では、反応条件は、緩衝剤を含む。所望のｐＨ範囲を維持するための適切な緩衝剤は、当技術分野で公知であり、例として限定されないが、ホウ酸塩、リン酸塩、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、酢酸塩、トリエタノールアミン、および２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール（トリス）などが挙げられる。一部の実施形態では、緩衝剤は、トリスである。プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は、約０．０１～約０．４Ｍ、０．０５～約０．４Ｍ、０．１～約０．３Ｍ、または約０．１～約０．２Ｍの緩衝剤（例えば、トリス）濃度を含む。一部の実施形態では、反応条件は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．３、または０．４Ｍの緩衝剤（例えば、トリス）濃度を含む。
プロセスの実施形態では、反応条件は、適切なｐＨを含み得る。所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲は、酸もしくは塩基、適当な緩衝剤、または緩衝物および酸または塩基の添加の組合せの使用によって維持することができる。反応混合物のｐＨは、反応の過程の前および／またはその間に制御することができる。一部の実施形態では、適切な反応条件は、約４～約１０のｐＨ、約５～約１０のｐＨ、約５～約９のｐＨ、約６～約９のｐＨ、約６～約８のｐＨの溶液を含む。一部の実施形態では、反応条件は、約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０のｐＨの溶液を含む。
本明細書のプロセスの実施形態では、適切な温度を、例えば、より高い温度での反応速度の増加、および反応時間の間の酵素の活性を考慮して、反応条件のために使用することができる。したがって、一部の実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃～約６０℃、約１０℃～約５５℃、約１５℃～約６０℃、約２０℃～約６０℃、約２０℃～約５５℃、約２５℃～約５５℃、または約３０℃～約５０℃の温度を含む。一部の実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、または６０℃の温度を含む。一部の実施形態では、酵素反応の間の温度は、反応の過程全体にわたって特定の温度で維持することができる。一部の実施形態では、酵素反応の間の温度は、反応の過程の間、温度プロファイルにわたって調整することができる。
一部の実施形態では、反応条件は、反応を安定化または増強するための界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、非イオン性、カチオン性、アニオン性、および／または両親媒性の界面活性剤を含み得る。例示的な界面活性剤としては、例として限定されないが、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、ポリオキシエチレン－ステアリルアミン、臭化セチルトリメチルアンモニウム、オレイルアミド硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－ソルビタンモノステアレート、ヘキサデシルジメチルアミンなどが挙げられる。反応を安定化または増強し得る任意の界面活性が用いられ得る。反応に用いられる界面活性剤の濃度は、一般に、０．１～５０ｍｇ／ｍｌ、特に、１～２０ｍｇ／ｍｌであり得る。
一部の実施形態では、反応条件は、消泡剤を含むことができ、これは、反応溶液が混合または拡散される場合などに、反応溶液中での泡の形成を低減または防止するのを助ける。消泡剤としては、非極性油（例えば、ミネラル、シリコーンなど）、極性油（例えば、脂肪酸、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルサルフェートなど）、および疎水性（例えば、シリカ、ポリエチレンなどで処理される）が挙げられ、その一部は、界面活性剤としても機能する。例示的な消泡剤としては、Ｙ－３０（登録商標）（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ポリグリコール共重合体、オキシ／エトキシル化アルコール、およびポリジメチルシロキサンが挙げられる。一部の実施形態では、消泡剤は、約０．００１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、または約０．１％（ｖ／ｖ）～約２％（ｖ／ｖ）で存在し得る。一部の実施形態では、消泡剤は、反応を促進するために所望により、約０．００１％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、もしくは約５％（ｖ／ｖ）、またはそれよりも多く存在し得る。
加水分解反応において使用される反応物の量は、一般に、所望の生成物の量、および付随して、用いられるカルボキシエステラーゼ基質の量に応じて変わる。以下のガイドラインを使用して、カルボキシエステラーゼおよび／またはアミンの量を決定することができる。一般に、エステル基質は、約２ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌのカルボキシエステラーゼを使用して、約５～２００グラム／リットルの濃度で用いることができる。
当業者は、これらの量を変えて、それらを所望の生産性のレベルおよび生成のスケールに合わせる方法を容易に理解するであろう。
反応物の添加順序は重要ではない。反応物は、溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）に同時に一緒に添加されてもよく、または代わりに、反応物の一部が別々に添加され、一部は異なる時点で一緒に添加されてもよい。例えば、カルボキシエステラーゼおよびカルボキシエステラーゼ基質は、最初に溶媒に添加されてもよい。
水性共溶媒系が使用される場合の混合効率の改善のために、カルボキシエステラーゼは、最初に、水相に添加および混合されてもよい。次いで、有機相を、添加および混合し、それに続いて、カルボキシエステラーゼ基質を添加してもよい。あるいは、カルボキシエステラーゼ基質は、水相への添加前に、有機相中で事前混合されていてもよい。
本明細書に記載されるカルボキシエステラーゼ触媒加水分解反応を行うための適切な条件としては、限定されるものではないが、実験ｐＨおよび温度で、操作されたカルボキシエステラーゼ酵素および基質を接触させること、ならびに例えば本明細書に提供される実施例に記載される方法を使用して、生成物を検出することを含む、ルーチンの実験によって容易に最適化することができる多種多様な条件が挙げられる。
加水分解反応は、一般に、基質のカップリングの本質的な完了またはほぼ完了が得られるまで、進行させることが可能である。酸形成（生成物）は、基質および／または生成物を検出することによって、公知の方法を使用してモニターすることができる。適切な方法としては、限定されるものではないが、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。反応混合物中で生じた酸生成物の変換収率は、一般に、約４０％超であり、約４５％超であってもよく、約４６％超であってもよく、約４７％超であってもよく、４８％超であってもよく、多くの場合、約４９％超であり、ここで、化合物（２ａ）および（２ｂ）のラセミ基質の化合物（３ａ）への最大変換は、５０％である。
本発明のさまざまな特長および実施形態を、以下の代表的な実施例に例示し、これは、例示であり、限定することを意図するものではない。
下記の実験の開示では、以下の略号を適用する：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；℃（摂氏温度）；ＲＴ（室温）；ＭＷＤ（多波長検出器）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＲＰ－ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）；ＦＩＯＰ（陽性対照に対する改善倍率）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＬＢ（ルリアブロス）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＭｅＣＮ（アセトニトリル）；ＴＥｏＡ（トリエタノールアミン）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）； Ｄａｉｃｅｌ（Ｄａｉｃｅｌ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．の部門、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの部門、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；ならびにＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒｅｎｃｅ、ＣＡ）；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
（実施例１）
ｐＣＫ１１０９００における操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドのＨＴＰ産生
（実施例１）
ｐＣＫ１１０９００における操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドのＨＴＰ産生
エステラーゼ活性を有するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ由来のポリペプチド（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）を、ｐＣＫ１１０９００ベクター系にクローニングし（例えば、米国特許番号第９，７１４，４３７号を参照されたく、これは、その全体がここに参照により本明細書に組み込まれる）、その後、ｌａｃプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｆｈｕＡにおいて発現させた。
９６ウェルフォーマットで、単一コロニーを選び、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する１８０μＬのＬＢ中、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％の湿度で成長させた。終夜の成長後、２０μＬの成長した培養物を、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを有する３８０μＬのＴＢを含有する深型ウェルプレートに移した。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍ、および８５％の湿度で成長させた。培養物の光学密度（ＯＤ６００）が０．６～０．８に達したら、エステラーゼ遺伝子の発現を、１ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧの添加によって誘導した。誘導後、成長を、１８～２０時間継続した。細胞を、４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心分離によって採取し、培地を廃棄した。細胞ペレットを、使用できる状態になるまで、－８０℃で貯蔵した。アッセイを行う前に、細胞ペレットを、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍＬの硫酸ポリミキシンＢ ＰＭＢＳ、０．０４単位のＤＮＡｓｅ、および５０ｍＭのトリス－ＨＣＬ、ｐＨ７．５を含有する４００μＬの溶解緩衝液に再懸濁させた。プレートを、室温で、マイクロタイタープレート振とう機において、中速の振とうで２時間かき混ぜた。次いで、プレートを、４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、清澄化された上清を、下記に記載するＨＴＰアッセイ反応において使用した。
（実施例２）
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドの振とうフラスコ産生
（実施例２）
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドの振とうフラスコ産生
振とうフラスコ手順を使用して、二次スクリーニングアッセイに有用であり、かつ／または本明細書に記載の生体触媒プロセスに使用される、操作されたエステラーゼポリペプチド振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）を作成することができる。酵素の振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）調製により、ＨＴＰアッセイにおいて使用される細胞溶解物と比較して、より純粋な操作された酵素の調製物（例えば、総タンパク質の最大で３０％まで）がもたらされ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。培養を開始するために、目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一コロニーを、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭおよび１％のグルコースを有する５ｍＬのＬＢに接種した。培養物を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、３０℃のインキュベーター中で終夜（少なくとも１６時間）成長させた。成長した培養物を、１Ｌの振とうフラスコ中、０．０５の最終ＯＤ６００まで、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを有する２５０ｍＬのＴＢに希釈した。２５０ｍＬの培養物を、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで、２５０ｒｐｍ、３０℃で成長させた。
エステラーゼ遺伝子の発現を、１ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧの添加によって誘導し、成長を、さらに１８～２０時間継続した。細胞を、事前に秤量した遠心分離ボトルに培養物を移すことによって採取し、次いで、７，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、残った細胞ペレットを秤量した。一部の実施形態では、細胞を、使用できる状態になるまで、－８０℃で貯蔵した。溶解のために、細胞ペレットを、６ｍＬの冷ＴＥｏＡに再懸濁させた。再懸濁された細胞を、１１０ＬのＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）プロセッサーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して溶解した。細胞片を、１０，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間の遠心分離によって除去した。当技術分野で公知の標準的な方法を使用して、清澄化された溶解物を収集し、－８０℃で凍結し、次いで、凍結乾燥した。凍結した清澄化された溶解物の凍結乾燥により、粗製の操作されたポリペプチドを含む乾燥振とうフラスコ粉末がもたらされる。
（実施例３）
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドの産生：発酵手順
（実施例３）
操作されたカルボキシエステラーゼポリペプチドの産生：発酵手順
通気され、かき混ぜられた１５Ｌの発酵槽において、０．８８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、０．９８ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム；１２．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、６．２５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、６．２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ－１５４酵母抽出物、０．０８３ｇ／Ｌのクエン酸鉄アンモニウム、ならびに２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸銅七水和物、０．１ｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム四水和物および０．０２ｇ／Ｌの四ホウ酸ナトリウム十水和物を含有する８．３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液を含有する６．０Ｌの成長培地を、３０℃の温度にした。発酵槽に、目的のエステラーゼ遺伝子を有するプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０の指数増殖後期培養物を接種し、実施例２に記載されるように、振とうフラスコ中、０．５～２．０の開始ＯＤ６００まで成長させた。発酵槽を、５００～１，５００ｒｐｍでかき混ぜ、空気を、１．０～１５．０Ｌ／分で発酵容器に供給して、３０％またはそれよりも高い飽和溶存酸素レベルを維持した。
培養物のｐＨを、２０％ｖ／ｖの水酸化アンモニウムの添加によって、７．０で制御した。培養物の成長を、５００ｇ／Ｌのセレロース、１２ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、および１０．４ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物を含有する供給溶液の添加によって維持した。培養物が５０のＯＤ６００に達した後、ケトレダクターゼの発現を、１ｍＭの最終濃度へのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。培養物を、さらに１４時間成長させた。次いで、培養物を、４℃に冷やし、採取まで４℃で維持した。細胞を、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ１２ＢＰ遠心分離機において、５，０００Ｇ、４℃で４０分間の遠心分離によって採取した。採取された細胞は、その後の下流の回収プロセスにおいて直接使用したか、またはそのような使用まで、４℃で貯蔵した。
細胞ペレットを、湿潤した細胞ペーストの各体積まで、２体積の１００ｍＭのトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液、ｐＨ６．８に、４℃で再懸濁させた。１２，０００ｐｓｉの圧力を使用して、２段階でホモジナイズするバルブアセンブリーが取り付けられたホモジナイザーに懸濁液を通過させることによって、細胞内エステラーゼを細胞から放出させた。細胞ホモジネートを、破壊の直後に４℃に冷却した。１０％ｗ／ｖのポリエチレンイミン、ｐＨ７．２の溶液を、０．５％ｗ／ｖの最終濃度まで、溶解物に添加し、３０分間撹拌した。得られた懸濁液を、標準的な実験室遠心分離機における５，０００Ｇでの３０分間の遠心分離によって清澄化した。澄明な懸濁液を、デカンテーションし、３０Ｋｄの分子量カットオフを有するセルロース限外濾過膜を使用して、１０倍濃縮した。最終濃縮物を、浅型容器に分注し、－２０℃で凍結し、粉末に凍結乾燥した。エステラーゼ粉末を、－８０℃で貯蔵した。
（実施例４）
化合物（３ａ）についてのエナンチオ特異性（Ｅ）の改善についての配列番号２に由来する操作されたポリペプチドのＨＴＰスクリーニング
（実施例４）
化合物（３ａ）についてのエナンチオ特異性（Ｅ）の改善についての配列番号２に由来する操作されたポリペプチドのＨＴＰスクリーニング
配列番号２のエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号１）を使用して、表４－１の操作されたポリペプチドを作出した。これらのポリペプチドは、所望の条件下でエステラーゼ活性および／または選択性の改善、例えば、出発のポリペプチド（配列番号２）と比較して、エステル基質の化合物（２ａおよび２ｂラセミ体）からの酸生成物（３ａ）の形成の改善を呈した。偶数の配列識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドを、実施例８に記載されるＨＴＰアッセイおよび分析方法（方法８．４）と一緒に下記に記載されるようにして、配列番号２の「骨格」アミノ酸配列から作出した。
定向進化を、配列番号１に記載されるポリヌクレオチドで開始した。操作されたポリヌクレオチドのライブラリーを、さまざまな周知の技法（例えば、飽和突然変異誘発、事前に特定された有益なアミノ酸の差異の組換え）を使用して作成し、化合物（３ａ）を生成するポリペプチドの能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。
ＨＴＰ酵素アッセイを、１００μＬの総反応体積／ウェルで、９６ウェルの浅型ウェル（３００μＬ体積）において行った。反応は、５０μＬの溶解物（実施例１に記載）、１０％のＤＭＳＯ、５０ｇ／Ｌの基質（化合物（２ａ）および（２ｂ）のラセミ混合物）、２００ｍＭのトリエタノールアミン（ＴＥｏＡ）緩衝液、ｐＨ７．５を含有していた。反応プレートを、ヒートシールし、６００ｒｐｍ、３０℃で１８時間振とうした。プレートを、ヒートシールで密封し、６００ｒｐｍで、２インチのスローＫｕｈｎｅｒにおいてインキュベートした。反応プレートを、１５０μＬのアセトニトリルでクエンチし、１０分間混合し、次いで、実施例８の方法８．４に記載されるキラルＨＰＬＣに流した。４つの分析物（Ｒ－エステル（２ａ）、Ｓ－エステル（２ｂ）、Ｒ－酸（３ａ）、Ｓ－酸（３ｂ））全てのピーク面積を、キラルＨＰＬＣから決定して、変換％およびエナンチオ特異性（Ｅ値）を算出した。変換％は、式（Ｒ－酸（３ａ）＋Ｓ－酸（３ｂ））／（Ｒ－エステル（２ａ）＋Ｓ－エステル（２ｂ）＋Ｒ－酸（３ａ）＋Ｓ－酸（３ｂ））×１００を使用することによって算出した。配列番号２と比べた各バリアントのＦＩＯＰ活性を、バリアントの変換％を配列番号２の変換％で割ることによって算出した。各バリアントのエナンチオ特異性（Ｅ）を決定するために、基質および生成物の％ｅｅを、式％ｅｅ（基質）＝（（Ｓエステル（２ｂ）のピーク面積－Ｒ－エステル（２ａ）のピーク面積／（Ｒ－エステル（２ａ）のピーク面積＋Ｓ－エステル（２ｂ）のピーク面積）×１００、％ｅｅ（生成物）＝（Ｒ－酸（３ａ）のピーク面積－Ｓ－酸（３ｂ）／Ｒ－酸（３ａ）のピーク面積＋Ｓ－酸（３ｂ）のピーク面積）×１００を使用することによって算出した。各バリアントのエナンチオ特異性（Ｅ）値を、方程式Ｅ＝ｌｎ［（１－ｅｅｓ）／（１＋ｅｅｓ／ｅｅｐ）］／ｌｎ［（１＋ｅｅｓ）／（１＋ｅｅｓ／ｅｅｐ）］を使用することによって、基質の％ｅｅおよび生成物の％ｅｅから決定した。配列番号２と比べた各バリアントのＦＩＯＰ Ｅを算出し、活性および選択性の改善を有する全てのヒットバリアントを、表４－１に列挙する。
（実施例５）
振とうフラスコ粉末および発酵粉末の試験
振とうフラスコ粉末および発酵粉末の試験
以下の手順により、１００ｇ／Ｌの出発基質濃度および１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを用いて、反応混合物を得る。酵素粉末溶液および水の体積を変えて、異なる全体的な反応酵素濃度を得ることができる。５００μＬの反応のための反応条件は以下を含んでいた：５０μＬの１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０μＬのＤＩ水、ＤＭＳＯ中の１００μＬのエステル基質（化合物（２ａ）および（２ｂ）のラセミ混合物）（ＤＭＳＯ中の５００ｇ／Ｌのストック）、および２００μＬの希釈酵素粉末溶液。５０μＬの１Ｍのリン酸カリウム緩衝液のアリコートを、テフロン（登録商標）コート磁気撹拌棒を備えた４ｍＬのガラスバイアルに添加し、次いで、ＤＩ水をバイアルに添加し、それに続いてＤＭＳＯ中の１００μＬのエステルのストック溶液をバイアルに添加した。最後に、酵素粉末溶液の２００μＬのアリコートをバイアルに添加して、所望の酵素濃度を得た。ＰＴＦＥラインキャップをバイアルにねじ止めし、これを、予熱されたアルミニウムブロックにおいて、３０℃および９００ｒｐｍで２４時間撹拌した。
反応を、各バイアルに２．５ｍＬの水中の５０％ｖ／ｖのアセトニトリルを添加することによってクエンチした。バイアルを十分に撹拌し、濁った懸濁液をエッペンドルフ管に移した。管を約１０分間遠心分離して、細胞ペレットを形成し、上清を清澄化した。溶液を、バイアル／プレートにデカンテーションし、キラルＨＰＬＣ（方法８．２）およびアキラルＨＰＬＣ（方法８．１）分析の両方のために、水中の５０％のアセトニトリルで２倍希釈した。振とうフラスコ粉末の試験の結果を表５－１に示す。
（実施例６）
発酵粉末の試験
発酵粉末の試験
用量応答を、実施例５に記載される上記のプロトコールに従って行い、磁気撹拌しながらガラスバイアル中で、配列番号５３６の発酵粉末および振とうフラスコ粉末を比較した。試料を処理し、キラル（実施例８、方法８．２）および非キラル（実施例８、方法８．１）方法によって分析した。データは、振とうフラスコ粉末および発酵粉末が同様の結果を示したことを示した。
（実施例７）
ｐＨスタット実験
ｐＨスタット実験
この一般手順を、配列番号２６８および配列番号８２の発酵粉末の試験のために実行した。使用される滴定剤は、０．２ＭのＮａＯＨ、２００ｇ／ＬのＫ２ＣＯ３、および０．２ＭのＫ２ＣＯ３を含んでいた。以下の手順により、１００ｇ／Ｌの出発基質濃度、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ、および１．２５ｇ／Ｌの酵素を用いて、反応混合物を得る。
ｐＨスタット試験プロトコール：Ｔｉｔｒｏｎｉｃ ３００モデルをｐＨスタット反応のために使用し、５００μＬの反応のための条件は以下を含んでいた：１．５ｍＬの１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１０．１９ｍＬのＤＩ水、ＤＭＳＯ中の３．０ｍＬのエステル基質（化合物（２ａ）および（２ｂ）のラセミ混合物）、および３１３μＬの６０ｇ／Ｌの酵素粉末溶液。リン酸カリウム緩衝液を、十字型テフロン（登録商標）コート磁気撹拌棒を備えた４０ｍＬのガラスバイアルに添加し、ＤＩ水をバイアルに添加し、それに続いてＤＭＳＯ中のエステル基質の溶液をバイアルに添加した。反応を、アルミニウムブロック中に設置し、５００ｒｐｍで磁気的に撹拌することによって４０℃に予熱した。
ｐＨスタットにおけるｐＨプローブをバイアルに添加し、チップが溶液に覆われることを確実にし、撹拌を維持した。プローブを、ＰＴＦＥラインキャップにおける開口によって通した。データ収集をｐＨスタットにおいて開始し、プローブを移動させ、酵素溶液を迅速に反応に添加した。プローブを置き換え、キャップをねじ止めし、ニードルを通して、キャップを通じて滴定剤を分注し、ニードルが溶液に浸されるのを確実にした。滴定剤を、反応の進行につれて添加し、体積が増加した。体積の増加につれて、撹拌の速度を増加させた（通常、４～６時間にわたって７００ｒｐｍまで）。２０～２４時間後、データ収集を終了した。プローブおよびニードルを除去し、反応を、５倍ｖ／ｖの水中の５０％のアセトニトリルに全反応物を溶解し、１０分間撹拌することによってクエンチした。溶液のアリコートを、エッペンドルフ管に移し、約１０分間遠心分離した。結果を、分析方法８．４（下記に記載）により記載されるようにして、ＨＰＬＣによって分析した。
ｐＨスタット試験結果：ｐＨスタットによる全ての反応を、上記の手順に従って行った。反応は、４０℃で、磁気撹拌下（５００～７００ｒｐｍ）、２０～２４時間の時間、実行した。
（実施例８）
分析方法
分析方法
アキラルＵＰＬＣ法を、方法８－１におけるパラメーターに従って、ＳＦＰ試験において使用した。
キラルＨＰＬＣ法８．２をルーチンの振とうフラスコ粉末の試験のための酸のｅｅを測定するために使用し、方法の詳細を下記に示す。
キラル（酸）ＨＰＬＣ法８．３を使用して、振とうフラスコ反応のエナンチオ選択性を評価した。
キラルＨＰＬＣ法８．４を使用して、酸を経由した変換およびエステルのｅｅ％を測定し、実施例４において、ならびに配列番号２６８および配列番号８２のｐＨスタット試験において使用した。
さまざまな具体的な実施形態を、説明および記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができることが認識されるであろう。
Claims (30)
- 配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼ。
- 前記操作されたカルボキシエステラーゼが、１つまたは複数のアミノ酸置換を、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ７０、Ｘ８２、およびＸ１８０から選択される位置に含む、請求項１に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
- 前記ポリペプチド配列内の前記少なくとも１つの置換または置換セットが、置換を、３／４／６／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、３／６／９／１０／７０／９９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／１０７、３／８／９／１０／１１／７０、３／８／９／１０／１１／７０／２２９、３／８／９／１０／１３／７０／８２／１０７、３／８／９／１０／１３／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／８２、３／８／９／１０／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／２２９、３／９／１０／１１／１３／８２、３／９／１０／１１／７０／８２／１０７、３／９／１０／１１／７０／２２９、３／９／１０／７０／８２、３／９／１１、３／９／１１／７０／８２／１８０、４／６／８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／６／９／１０／７０／８２／２２９、４／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／６５／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／８／９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、６／９／１０／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、６／９／１０／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、８／９／１０、８／９／１０／１１／１３／７０、８／９／１０／１１／１３／７０／８２、８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、８／９／１０／１１／４３／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／７０、８／９／１０／１１／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／７０／２２９、８／９／１０／７０、８／９／１０／７０／８２／２２９、９／１０、９／１０／１１／１２／４９／５１／７０／７３／８２／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／４９／７０／７３／８２／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２００、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／１１／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／７０／８２／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／３５／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／６５／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１９６／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、９／１０／１１／４０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５４／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／７０／８２／１１０／１８０／１９２／２１９、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１８０／１９２、９／１０／１１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／５４／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０、９／１０／１１／７０／７１／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０／１９２／２００、９／１０／１１／７０／７３／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２、９／１０／１１／７０／８２／８７／１１０／１８０／２１９、９／１０／１１／７０／８２／１００／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１０７、９／１０／１１／７０／８２／１０８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８７／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／１０７、９／１０／１２／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／５４／７０／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１２／７０／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１３／７０、９／１０／１３／７０／８２、９／１０／１３／７０／２２９、９／１０／１３／２０７、９／１０／１７、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２００／２１９、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／４９／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１７／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１７／５１／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／１７／７０／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１７／７０／１０４／１６０／１６５、９／１０／１７／７０／１３９／１６０／１６５、９／１０／２６、９／１０／２９／７０、９／１０／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３７、９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３９、９／１０／３９／１８６、９／１０／４１、９／１０／４５／７０、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２１９、９／１０／４９／５１／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／７０／８２／１８０／２２５、９／１０／４９／５４／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／７３／８２／８７／１０８／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２２５、９／１０／５１／５４／７０／８２／８７／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／７０／８２／１１０／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０／２００、９／１０／５４／７０／８２／１８０、９／１０／６２、９／１０／７０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１
０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２を基準に番号付けされる、請求項１に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。 - 配列番号８２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号８２を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼ。
- 前記ポリペプチド配列内の前記少なくとも１つの置換または置換セットが、置換を、３／４／６／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、３／６／９／１０／７０／９９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／１０７、３／８／９／１０／１１／７０、３／８／９／１０／１１／７０／２２９、３／８／９／１０／１３／７０／８２／１０７、３／８／９／１０／１３／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／８２、３／８／９／１０／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／２２９、３／９／１０／１１／１３／８２、３／９／１０／１１／７０／８２／１０７、３／９／１０／１１／７０／２２９、３／９／１０／７０／８２、３／９／１１、３／９／１１／７０／８２／１８０、４／６／８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／６／９／１０／７０／８２／２２９、４／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／６５／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／８／９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、６／９／１０／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、６／９／１０／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、８／９／１０、８／９／１０／１１／１３／７０、８／９／１０／１１／１３／７０／８２、８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、８／９／１０／１１／４３／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／７０、８／９／１０／１１／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／７０／２２９、８／９／１０／７０、８／９／１０／７０／８２／２２９、９／１０、９／１０／１１／１２／４９／５１／７０／７３／８２／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／４９／７０／７３／８２／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２００、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／１１／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／７０／８２／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／３５／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／６５／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１９６／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、９／１０／１１／４０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５４／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／７０／８２／１１０／１８０／１９２／２１９、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１８０／１９２、９／１０／１１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／５４／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０、９／１０／１１／７０／７１／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０／１９２／２００、９／１０／１１／７０／７３／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２、９／１０／１１／７０／８２／８７／１１０／１８０／２１９、９／１０／１１／７０／８２／１００／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１０７、９／１０／１１／７０／８２／１０８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８７／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／１０７、９／１０／１２／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／５４／７０／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１２／７０／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１３／７０、９／１０／１３／７０／８２、９／１０／１３／７０／２２９、９／１０／１３／２０７、９／１０／１７、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２００／２１９、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／４９／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１７／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１７／５１／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／１７／７０／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１７／７０／１０４／１６０／１６５、９／１０／１７／７０／１３９／１６０／１６５、９／１０／２６、９／１０／２９／７０、９／１０／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３７、９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３９、９／１０／３９／１８６、９／１０／４１、９／１０／４５／７０、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２１９、９／１０／４９／５１／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／７０／８２／１８０／２２５、９／１０／４９／５４／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／７３／８２／８７／１０８／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２２５、９／１０／５１／５４／７０／８２／８７／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／７０／８２／１１０／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０／２００、９／１０／５４／７０／８２／１８０、９／１０／６２、９／１０／７０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１
０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号８２を基準に番号付けされる、請求項４に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。 - 配列番号２６８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも大きな配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２６８を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼ。
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前記ポリペプチド配列内の前記少なくとも１つの置換または置換セットが、置換を、３／４／６／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、３／６／９／１０／７０／９９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／１０７、３／８／９／１０／１１／７０、３／８／９／１０／１１／７０／２２９、３／８／９／１０／１３／７０／８２／１０７、３／８／９／１０／１３／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／８２、３／８／９／１０／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／２２９、３／９／１０／１１／１３／８２、３／９／１０／１１／７０／８２／１０７、３／９／１０／１１／７０／２２９、３／９／１０／７０／８２、３／９／１１、３／９／１１／７０／８２／１８０、４／６／８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／６／９／１０／７０／８２／２２９、４／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／６５／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／８／９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、６／９／１０／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、６／９／１０／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、８／９／１０、８／９／１０／１１／１３／７０、８／９／１０／１１／１３／７０／８２、８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、８／９／１０／１１／４３／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／７０、８／９／１０／１１／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／７０／２２９、８／９／１０／７０、８／９／１０／７０／８２／２２９、９／１０、９／１０／１１／１２／４９／５１／７０／７３／８２／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／４９／７０／７３／８２／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２００、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／１１／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／７０／８２／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／３５／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／６５／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１９６／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、９／１０／１１／４０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５４／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／７０／８２／１１０／１８０／１９２／２１９、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１８０／１９２、９／１０／１１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／５４／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０、９／１０／１１／７０／７１／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０／１９２／２００、９／１０／１１／７０／７３／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２、９／１０／１１／７０／８２／８７／１１０／１８０／２１９、９／１０／１１／７０／８２／１００／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１０７、９／１０／１１／７０／８２／１０８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８７／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／１０７、９／１０／１２／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／５４／７０／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１２／７０／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１３／７０、９／１０／１３／７０／８２、９／１０／１３／７０／２２９、９／１０／１３／２０７、９／１０／１７、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２００／２１９、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／４９／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１７／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１７／５１／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／１７／７０／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１７／７０／１０４／１６０／１６５、９／１０／１７／７０／１３９／１６０／１６５、９／１０／２６、９／１０／２９／７０、９／１０／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３７、９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３９、９／１０／３９／１８６、９／１０／４１、９／１０／４５／７０、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２１９、９／１０／４９／５１／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／７０／８２／１８０／２２５、９／１０／４９／５４／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／７３／８２／８７／１０８／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２２５、９／１０／５１／５４／７０／８２／８７／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／７０／８２／１１０／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０／２００、９／１０／５４／７０／８２／１８０、９／１０／６２、９／１０／７０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１
０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２６８を基準に番号付けされる、請求項６に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。 - 配列番号５３６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片であって、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号５３６を基準に番号付けされる、操作されたカルボキシエステラーゼ。
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前記ポリペプチド配列内の前記少なくとも１つの置換または置換セットが、置換を、３／４／６／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、３／６／９／１０／７０／９９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、３／８／９／１０／１１／１３／７０／１０７、３／８／９／１０／１１／７０、３／８／９／１０／１１／７０／２２９、３／８／９／１０／１３／７０／８２／１０７、３／８／９／１０／１３／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／８２、３／８／９／１０／７０／８２／２２９、３／８／９／１０／７０／２２９、３／９／１０／１１／１３／８２、３／９／１０／１１／７０／８２／１０７、３／９／１０／１１／７０／２２９、３／９／１０／７０／８２、３／９／１１、３／９／１１／７０／８２／１８０、４／６／８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／６／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／６／９／１０／７０／８２／２２９、４／８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／８／９／１０／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／３６／６５／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、４／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、４／９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／８／９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、６／９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、６／９／１０／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、６／９／１０／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４／２２９、８／９／１０、８／９／１０／１１／１３／７０、８／９／１０／１１／１３／７０／８２、８／９／１０／１１／１３／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、８／９／１０／１１／４３／７０／８２／１８０／２００／２１４、８／９／１０／１１／７０、８／９／１０／１１／７０／８２／１０７／２２９、８／９／１０／１１／７０／２２９、８／９／１０／７０、８／９／１０／７０／８２／２２９、９／１０、９／１０／１１／１２／４９／５１／７０／７３／８２／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／４９／７０／７３／８２／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／１１／１２／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／１２／５１／７０／７３／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２００、９／１０／１１／１７／４９／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／１７／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／１１／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１１／１７／７０／８２／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／３５／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／６５／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／１９６／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４／２２９、９／１０／１１／３８／７０／８２／１８０／１８６／２００／２１４、９／１０／１１／４０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５１／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／５４／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１１／４９／７０／８２／８７／１８０、９／１０／１１／４９／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０／２００／２２５、９／１０／１１／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／５１／７０／８２／１１０／１８０／１９２／２１９、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０、９／１０／１１／５４／７０／８２／８７／１８０／１９２、９／１０／１１／５４／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１１／５４／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０、９／１０／１１／７０／７１／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／７３／８２／１４８／１８０／１９２／２００、９／１０／１１／７０／７３／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２、９／１０／１１／７０／８２／８７／１１０／１８０／２１９、９／１０／１１／７０／８２／１００／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１０７、９／１０／１１／７０／８２／１０８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８２／１８０、９／１０／１１／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／８７／１８０／２００／２１４、９／１０／１１／７０／１０７、９／１０／１２／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／５４／７０／１８０／２２５、９／１０／１２／５１／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／１２／７０／８２／１４８／１８０／２２５、９／１０／１２／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１３／７０、９／１０／１３／７０／８２、９／１０／１３／７０／２２９、９／１０／１３／２０７、９／１０／１７、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２００／２１９、９／１０／１７／４９／５１／５４／７０／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／４９／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／１７／５１／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／２００、９／１０／１７／５１／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２１９、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／５４／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／１７／７０／７３／８２／８７／１８０／２１９、９／１０／１７／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／８７／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／１７／７０／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／１７／７０／８２／１１０／１４８／１８０／２００、９／１０／１７／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／１７／７０／１０４／１６０／１６５、９／１０／１７／７０／１３９／１６０／１６５、９／１０／２６、９／１０／２９／７０、９／１０／３６／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３７、９／１０／３８／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／３９、９／１０／３９／１８６、９／１０／４１、９／１０／４５／７０、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／５４／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１１０／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０／１９２、９／１０／４９／５１／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２１９、９／１０／４９／５１／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／４９／５１／７０／８２／１８０／２２５、９／１０／４９／５４／７０／７３／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／８７／１１０／１８０、９／１０／４９／５４／７０／８２／１０８／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／７３／８２／８７／１０８／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０／２２５、９／１０／４９／７０／８２／８７／１４８／１８０、９／１０／４９／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１１０／１８０、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２１９、９／１０／５１／５４／７０／７３／８２／１８０／２２５、９／１０／５１／５４／７０／８２／８７／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０、９／１０／５１／５４／７０／８２／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／５１／７０／８２／１１０／１８０／２００、９／１０／５１／７０／８２／１８０／２１９、９／１０／５４／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／５４／７０／８２／８７／１０８／１８０／２００、９／１０／５４／７０／８２／１８０、９／１０／６２、９／１０／７０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／８７／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１１０／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／７３／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／７３／８２／１４８／１８０、９／１
０／７０／７３／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２、９／１０／７０／７３／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１４８／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０、９／１０／７０／８２／８７／１０８／１１０／１８０／１９２、９／１０／７０／８２／８７／１８０、９／１０／７０／８２／１０７、９／１０／７０／８２／１０７／２２９、９／１０／７０／８２／１０８／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１０８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１１０／１８０／２１９、９／１０／７０／８２／１４８／１８０、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００、９／１０／７０／８２／１４８／１８０／２００／２１９、９／１０／７０／８２／１８０、９／１０／７０／８２／１８０／１９２／２１９、９／１０／７０／８２／１８０／２００／２１４、９／１０／７０／８２／２２９、９／１０／７０／９２、９／１０／７０／９９、９／１０／７０／９９／２２９、９／１０／７０／１０７／２２９、９／１０／７０／１５６、９／１０／７０／１６５、９／１０／７０／２２９、９／１０／８８、９／１０／９０、９／１０／９６、９／１０／１０７、９／１０／１１０、９／１０／１１１、９／１０／１１２、９／１０／１３３、９／１０／１７８、９／１０／１８５、９／１０／１８６、９／１０／１９６、９／１０／２１１、９／１０／２２６、１１／２４、１１／２４／２１９、および１１／３６／２０６／２０８から選択される位置に含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号５３６を基準に番号付けされる、請求項８に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。 - 前記ポリペプチド配列が、配列番号４～５３６の偶数の配列識別子から選択される、請求項１に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
- 前記操作されたカルボキシエステラーゼが、配列番号２の野生型Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓカルボキシエステラーゼと比較して少なくとも１つの特性の改善を含む、請求項１に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
- 前記特性の改善が、加水分解活性の改善、溶媒耐性、熱安定性、ｐＨ安定性、エナンチオ選択性、位置選択性、立体選択性、基質範囲、および／または基質の低減もしくは生成物の阻害、ならびに前記操作されたカルボキシエステラーゼを産生する細菌宿主細胞に対する毒性の低減から選択される、請求項１１に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
- 前記細菌宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉを含む、請求項１２に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
- 化合物（２ａ）
- 化合物（２ａ）
- 精製されたものである、請求項１に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
- 固定化されたものである、請求項１に記載の操作されたカルボキシエステラーゼ。
- 請求項１に記載の少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼを含む組成物。
- 請求項１から１８までのいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
- 配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、前記操作されたカルボキシエステラーゼが、前記ポリペプチド配列内の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸の位置が、配列番号２を基準に番号付けされる、ポリヌクレオチド配列。
- 少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼまたはその機能性断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号３～５３５の奇数の配列識別子から選択される配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を含む、ポリヌクレオチド配列。
- 制御配列に作動可能に連結している、請求項１９から２１までのいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
- コドン最適化されたものである、請求項１９から２２までのいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
- 請求項１９から２３までのいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項２４に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１９から２３までのいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
- Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項２５または２６に記載の宿主細胞。
- 操作されたカルボキシエステラーゼを宿主細胞において産生させる方法であって、請求項２５から２７までのいずれかに記載の宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼが産生されるように適切な条件下で培養するステップを含む、方法。
- 少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼを培養物および／または宿主細胞から回収するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの操作されたカルボキシエステラーゼを精製するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
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