DE2164664C3 - Verfahren zur Herstellung von Lincomycin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von LincomycinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin ohne
gleichzeitige Erzeugung von Lincomycin B (4'-Despropyl-4'-äthyl-iincomycin). Die Abwesenheit von Lincomycin B in der Gärbrühe ermöglicht eine verbesserte
und wirksamere Lincomycingewinnung hieraus.
Lincomycin ist ein nützliches Antibiotikum, das durch Gärverfahren unter Verwendung des Mikroorganismus
Streptomyces lincolnensis van lincolnensis gewonnen
wird. In der US-Patentschrift 30 86 912 wird ein solches Gär- und Gewinnungsverfahren für Lincomycin, früher
als Lincolnensin bekannt, beschrieben. Bei der Gärung
gemäß dieser Patentschrift fällt gleichzeitig Lincomycin B, eine stickstoffhaltige Base der Molekularformel
C17H32N2O6S an. Zwar sind Lincomycin und Lincomycin B gegen praktisch das gleiche Spektrum von
Mikroorganismen wirksam, doch liegt bekanntlich die Wirksamkeit des Lincomycin B gegen diese Mikroorganismen erheblich unter jener des Lincomycins. Lincomycin ist infolgedessen das bevorzugte Antibiotikum.
Zum mikrobiologischen Verfahren dieser Erfindung wird ein neuartiger Mikroorganismus zur Herstellung
von Lincomycin herangezogen, wobei die gleichzeitige Erzeugung von Lincomycin Bunterbleibt.
Der im vorligenden für die Lincomycinherstellung herangezogene, neuartige Actinomycet ist Streptomyces espinosus Dietz, sp. nov. Eine seiner Stammeseigenschaften liegt in der Bildung von Lincomycin ohne
gleichzeitige Bildung von Lincomycin B. Eine Subkultur dieses lebenden Organismus kann auf Anfrage von der
hierfür vorgesehenen Hinterlegungsstelle der Northern -ti
Utilization and Research Division, Agricultural Research Services, U. S. Department of Agriculture, Peoria,
Illinois, U.S.A., bezogen werden. Die Eintragungsnummer bei dieser Hinterlegungsstelle lautet NRRL 3890.
Des weiteren erfolgte eine Hinterlegung bei der ίο
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen mit der Eintragungsnummer DSM 920.
Der erfindungsgemäO verwendete Mikroorganismus Streptomyces espinosus Dietz, sp. nov. wurde von Alma
Dietz vom Upjohn-Forschungslaboraiorium untersucht «
und wird nachfolgend beschrieben:
Farbeigenschaften:grau-grünes Luftwachstum. Melanin
negativ. Sein Erscheinungsbild auf Ek t ach rom (2) beschreibt Tabelle I. Die ßezugsfafbeigenschäften
sind in Tabelle Il zusammengestellt. Die Kultur kann in der Grün(GN) und Grau-(GY)farbreihe
nach Tresner und Backus (Applied Microbiol. Bd. II1S. 353-338[1962]) untergebracht werden.
Mikroskopische Eigenschaften: Sporenträger sind kurz, gerade bis zickzackförmig bis offenspiralig (RF,
RA) im Sinne von Pridham und Mitarbeitern (Applied Microbiol. Bd. 6, S. 52-79[1958]). Sporen
M)
sind meistens kugelförmig, viele davon mit
ausgesprochener Verkettung (linkage). Die Sporenoberfläche ist dornig bis stachelig und scheint
bei manchen Stacheln ins Haarförmige überzugehen, D?e Stacheln erscheinen reichlich und gemustert, wenn sie auf Sporen beobachtet werden, die
nach der Kohlenstoff-Vermehrungsmethode von Dietz und Mathews (Applied MicorbioL Bd, 10,
S. 258-263 und Bd. 16, S. 935—941 [1968]) behandelt worden sind
Biochemische und Kultureigenschaften: siehe Tabelle III
Verwendung von Kohlenstoff: Das Wachstum der Kultur auf Kohlenstoffverbindungen wurde in dem
synthetischen Medium nach Pridham un<J Gottlieb (J. Bacteriol. Bd. 56, S. 107-114[1948J und in deren
modifiziertem Medium (International Journal of Systematic Bacteriology Bd. 16, S. 313—340 [1966])
ermittelt Im erstgenannten Medium erfolgte ein geringes Wachstum der Kultur auf der Kontrolle,
Inulin, Dulcit, D-Sorbit, Phenol, Natriumoxalat,
Natriumtartrat und Natriumsuccinat; ein mäßiges
Wachstum auf Sucrose, Raffinose, Saücin und Natriumacetat; ein gutes Wachstum auf D-Xylose,
L-Arabinose, Rhamnose, D-Fructose, D-Galactose, D-GIucose, D-Mannose, Maltose, Lactose, Cellobiose, Dextrin, löslicher Stärke, Glycerin, D-Mannit
und Inosit: kein Wachstum auf Kresol, Natriumformiat und Natriumsalicylat Im modifizierten Medium erfolgte eine geringe Entwicklung auf der
negativen Kontrolle (kein Zusatz von Kohlenstoffverbindung) und gute Entwicklung auf der positiven Kontrolle (Glucose). Das Wachstum auf
L-Arabinose, D-Xylose, Inosit, D-Mannit, D-Fructose, Rhamnose und Cellulose (eine von zwei
Platten) war gleichartig oder besser als die Glucosekontrolle. Es zeigte sich kein Wachstum auf
Saccharose oder Raffinose.
Temperatur: Auf Bennett's-Agar, Czapek's-Saccharose-Agar und Maltose-Trypton-Agar gedieh das
Wachstum ziemlich gut bei 18°C, 45°C und 55°C;
gut bei 24°C und reichlich bei 28—37°C.
S. espinosus ist leicht zu unterscheiden von dem Lincomycin-Erzeuger Streptomyces lincolnensis var.
lincolnensis (D.). Mason, A. Dietz und C. DeBoer, 1962, »Lincomycin, A New Antibiotic«; .'. Discovery and
Biological Properties, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, S. 554—559). Die neue Kultur entfaltet
grau-grünes Luftwachstum, ist melaninnegativ, hat kurze, gerade bis offenspiralige Sporenträger mit
runden, dornigen bis stacheligen bis haarigen Sporen, solubilisiert Xanthin nicht und gedeiht bei 45—55°C
sowie bei niedrigeren Temperaturen. S. lincolnensis zeigt dagegen blaß-rosafarbenes Luftwachstum, ist
melanin-positiv, hat lange gerade bis zickzackförmijse
Sporenträger mit rechtwinkligen glatten Sporen mit feinem Oberflächendetail, solubilisiert Xanthin und
entfaltet bei 45—55°C kein bzw. nur spurenartiges Wachstum.
S. espinosus unterscheidet sich von anderen zur begrenzten »grünen« Gruppe von Streptomyces gehörenden Organismen durch seine Produktion von
Antibiotikum Lincomycin, durch sein rasches Wachstum und die Bildung von grau-grünem Luftmycel, durch sein
auffallendes weißes Luftwachstum auf Pepton-Eisen-Agar, sein Wachstum bei 18—55"C und seine ausge-
prägten runden Sporen mit dorniger bis stacheliger Ws
haariger Oberfläche (vgl Cultures in the Viridis Series
of Waksman [s, A, Waksmann, 1961, The Aotinomycetes,
Band 2, Classification, Identification, and Descriptions of
Genera and Species, The Williams and Wilkins Con
Baltimore] und Baldacci, Giornale di Microbiologja,
Bd. 6, S. 10—27 [1958]); die prasinus-Farbgruppe von
Ettlinger et al, (Archiv, für Mikrobiologie, Bd. 31,
S. 326—358 [1958J, die prasinus-farbene azureus-glaucus-Gruppe
von Hütter (R. Hütter, »Systematik der Streptomyceten unter besonderer Berücksichtigung der
von ihnen gebildeten Antibiotika«, S. Karger, Basel [1967]), die malachiticus-Gruppe von Küster (International
Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 20, S. 25—29 [1970]), die grünsporige Fafbgruppe X von Kutzner
(H. J. Kutzner, »Beitrag zur Systematik und Ökologie der Gattung Streptomyces Waksman et Henrici«, Diss.
Landw. Hochschule Hockenheim [1956]) und die Prasinomycin-Er.tjuger von Myers et al. (Appl. Microbio!.,
Bd. 16, S. 603-608[!95S]).
Von den aufgeführten Arten der Upjohn-Kulturensammlung
und von den in der Literatur beschriebenen Arten ist der Streptomyces espinosus durch die Art
seiner auffallende Farbmuster tragenden Sporenträger und Sporen sowie durch sein Vermögen, Lincomycin zu
produzieren, unterscheidbar. Es wird vorgeschlagen, das neue Bodenisolierungsprodukt mit Streptomyces espinosus
Dietz, sp. nov. und diese Typenart als Variante Streptomyces espinosus var. espinosus gemäß Bestimmung
9d(2) des In'ifirnationalen Code der Bakterienno- Jo
menklatur (Intern. J. System. BacterioU Bd. 16, S. 459—490 [1966J zu bezeichnen.
Bezugsfarbeigenschaften von Streptomyces espinosus Pie Eigenschaften des Streptomyces espinosus Pietz,
sp, nov„ NRRL 3890 sind in nachstehenden Tabellen zusammengestellt;
Tabelle 1; Erscheinungsbild des Streptomyces espinosus auf Ektachrome,
Tabelle II; Bezugsfarbeigenschaften des Streptomyces espinosus.
Tabelle III: Biochemische und Kultureigenschaften des
Streptomyces espinosus.
Tabelle I | Oberfläche | Unterseite |
grau-grün | blaßgelb- gelbbraun |
|
grau-grün | mattgrau | |
Erscheinungsbild des Streptomyces espinosus auf Ekta chrome*) |
grau-grün | gelb-gelbbraun bis oliv |
Agar-Medium | weiß | gelb |
Bennett's | farblos | rot |
Czapek's-Saccharose | grau-grün | mattgrau-grün |
Maltose-Trypton | ||
Pepton-Eisen | ||
0,1% Tyrosin | ||
Kaseinstärke |
*) A. Dietz, »Ektachrome Transparencies as Acids in Actinomycete Classification«, Annals of the New York Academy
of Seiendes, Bd. 60, S. 152-154 (1954).
Nach »ISCC-N'ßS-Methode zur
Farbenbezeichnung und Wörterbuch der Farbbezeichnungen«**)
Bennett's
O
O
Czapek's-Saccharose
O
O
1 '/2ge helles Olivgrau
Ige Zitronat-zitronengrau
Ige Zitronat-zitronengrau
2ec Biskuit, hellbraun, Hafermehl, Sand
2ig schiefergraugelbbraun
2ig schiefergraugelbbraun 109gm helles Gräulicholiv
109gm helles Gräulicholiv
109gm helles Gräulicholiv
90gm gräulich-gelb
110g gräulich-oliv
II2m helles Olivgrau
110g gräulich-oliv
112m helles Olivgrau
II2m helles Olivgrau
110g gräulich-oliv
112m helles Olivgrau
Maltose*Trypton
Ö
Ö
1 'Age helles Olivgrau
Hh olivgrau
Hh olivgrau
2gc Bambus, chamois
1 '/2ge helles Olivgrau
1 '/2ge helles Olivgrau
109gm helles Gräulicholiv
112m helles Olivgrau
113g olivgrau
127g gräulich-olivgrün
112m helles Olivgrau
113g olivgrau
127g gräulich-olivgrün
90gm gräulich-gelb
109gm helles Gräulicholiv
109gm helles Gräulicholiv
Fortsetzung
Agar-Medium
Nach »Color Harmony Manual«, 3. Auflage, 1948*)
Nach »ISCC-NBS-Methoile zur
Farbenbezeichnung und Wörterbuch tier Farbbezeichnungen«**)
Hefeextra kt-Malzextrakt (ISP-2)
2ih dunkles, gedecktes Grau lih olivgrau
2gc Bambus, chamois 2ie helles Senfgelbbraun 112m helles Olivgrau
113g olivgrau 112m helles Olivgrau 113g olivgrau
127g gräuliches Olivgrün 90gm gräulich-gelb 91gm dunkles gräuliches Gelb 94g helles Olivbraun
106g helles Oliv
Hafermehl (ISP-3) O
1 Vag olivgrau
2fe gedecktes Grau
1 'Age helles Olivgrau
2ec Biskuit, hellbraun, Hafermehl, Sand 94g helles Olivbraun
112gm helles Olivgrau 109gm helles gräuliches Oliv
90gm gräulich-gelb
Anorganische Salz-Stärke (ISP-4)
3ih beige-grau, Maus Hh olivgrau
2gc Bambus, chamois
2ec Biskuit, hellbraun, Hafermehl, Sand
113g olivgrau
265m mittelgrau
112m helles Olivgrau
113g olivgrau
127g gräuliches Olivgrün
90gm gräulich-gelb
90gm gräulich-gelb
Glycenn-Asparagin (ISP-5)
2ik dunkles, gedecktes Grau 2fe gedecktes Grau
2ge gedecktes Gelbbraun, gräulich-gelbbraun (griege)
2ge gedecktes Gelbbraun, gräulich-gelbbraun (griege)
112m helles Olivgrau
113g olivgrau
94g helles Olivbraun 112gm helles Olivgrau
90gm gräulich-gelb 90gm gräulich-gelb
O = Oberfläche. U = Unterseite. P = Pigment.
*) E. Jacobson, W. C. Granville und C. E. Foss, »Color Harmony Manual«, 3. Aufl., Container Corporation of America,
Chicago, Illinois (1948).
**) K. S. Kelly and D. B. Judd, »The ISCC-NBS-Method οΓ Designating Colors and a Dictionary of Color-Names«,
U.S. Department ofComm. Circular 553 (1955).
Kultur und Biochemie des Streptomyces espinosus
Medium | Eigenschaften | Unterseite | Weitere Eigenschaften |
Oberfläche (Luftwachstum) | |||
Agar-Medien | gelb | Melanin-negativ | |
Pepton-Eisen | grau-weiß in der Mitte; grün | ||
am Rand | mattgrau | Malat wird nicht solubilisieri | |
Calciummalat | schwaches bis kräftiges | ||
Graugrün | hcllcreme | ||
Glucose-Asparagin | grauweiß bis graugelb | bis creme | |
tiefgelb bis | gelbes bis gelb-gelbbraunes | ||
Magermilch | hellgrau-grün-gelb bis | gelb-gelb | Pigment |
grau-grün-rosa | braun | Kasein wird solubilisiert | |
rotbraun | rotbraunes Pigment | ||
Tyrosin | starkes Graugrün | Tyrosin wird solubilisiert | |
blaßgelb bis | Xanthin wird nicht | ||
Xanthin | kräftiges Graugrün bis nur | blaßgelb- | solubilisiert |
an der Peripherie | grün | ||
kräftiges Graugrün | blaßoliv | Stärke wird hydrolysiert | |
Nährstärke | kräftiges Graugrün | blaßgelb- | - |
Hefeextrakt-Malzextrakt | starkes Graugrün | gelbbraun | |
oliv | - | ||
Bennett's | starkes Graugrün | graugrün | - |
Czapek's-Saccharose | kräftiges Graugrün | oliv | - |
Maltose-Trypton | kräftiges Graugrün mit weiß | ||
bis starkes Graugrün | |||
Agar-Medien | gelb | Melanin-negativ | |
Pepton-Hefeextrakt-Eisen | blaßrosa | gelbbraun | |
(ISP-6) | blaßgelb- | Melanin-negativ | |
Tyrosin (ISP-7) | graugrün mit weiß bis | grün | |
graugrün | |||
Gelatine-Medien | - | farbloses vegetatives | |
Ungestreckt (piain) | - | Wachstum | |
Verflüssigung 1A-1/: | |||
- | weißes Luftwachstum auf | ||
Nährgelatine | - | Oberflächenhäutchen | |
Verflüssigung '/>-'/: | |||
Brühe-Medien | - | rosa-eremefarbenes Luft- | |
Synthetisches Nitrat | - | ||
wachstum auf Oberflächenhäutchen
flockiges Wachstum an der Basis
Wachstum im ganzen Medium Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert
Spur von grünem Luftwachstum auf gelbem vegetativem Wachstum des
Oberflächenhäutchens flockiges Wachstum an der Basis
Gelbpigment
weder Nitrat noch Nitrit vorhanden
Fortsetzung
M otl ι um
M otl ι um
Hruii'j-Medien
Lackmus-Milch
Lackmus-Milch
hipcnsi lullen
Obcrll.ivho f Lullwachstum)
cremefarben bis grün bis graugrün auf gelbem bis graugrünem vegetativen Ring
Lackmus reduziert Peptonisierung Vi pH 7,5-7,9
Der neue Mikroorganismus erzeugt Lincomycin, π wenn er in einem wäßrigen Nährmedium unter
Mihmnrsen aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Für
die Herstellung begrenzter Mengen können natürlich Oberflächenkulturen und Flaschen benutzt werden.
Man züchtet den Organismus in einem Nährmedium. _>o
das eine Kohlenstoffquelle, z. B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, und eine Stickstoffquelle wie eine
assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein assimilierbares eiweißartiges Material enthält. Bevorzugte
Kohlenstoffquellen sind u. a. Glucose, brauner Zucker. r> Saccharose. Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose.
Dextrin. Melasse. Als Stickstoffquelle verwendet man zweckmäßig Maisquellwasser. Hefe, autolysierte Brauere:hefe
mit Milchfeststoffen, Sojamehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, pankreatischen n>
Kasein-Verdauungssaft, in Brennereien anfallende Feststoffe, tierische Pepton-Flüssigkeiten, Fleisch- und
Knochenschnitzel. Mit Vorteil können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen eingesetzt
werden. In der Regel ist es nicht nötig, Spurenmetalle r> wie Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen den
Gärmedien zuzusetzen, da als Komponenten der Medien Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile
verwendet werden.
Die Lincomycinherstellung nach dem vorliegenden ad
Verfahren kann bei jeder Temperatur erfolgen, die zu einem befriedigenden Wachstum des neuen Mikroorganismus
führt, so z. B. zwischen etwa 18 und 40, vorzugsweise zwischen etwa 20 und 32°C. Eine optimale
Lincomycinerzeugung liegt gewöhnlich in etwa 2 bis 10 .»-> Tagen vor. Während der Gärung bleibt das Medium
normalerweise basisch. Der pH-Endwert hängt teilweise von den vorhandenen Pufferstoffen, sofern solche
überhaupt zugegen sind, und teilweise von dem anfänglichen pH-Wert des Kulturmediums ab.
Erfolgt die Züchtung in großen Gefäßen und Behältern, so inokuliert man vorzugsweise eher mit der
vegetativen als mit der Sporenform des Mikroorganismus, um dadurch eine deutliche Verzögerung bei der
Lincomycinerzeugung und den damit verbundenen unökonomischen Geräteeinsatz auszuschalten. Es ist
daher ratsam, ein vegetatives Inokulum dadurch in einer Nährlösungskultur herzustellen, daß man letztere mit
einem Bruchteil aus einer Boden- oder einer Schrägbodenkultur inokuliert. Nach derartiger Beschaffung eines to
jungen aktiven vegetativen Inokulums wird dieses aseptisch auf große Gefäße oder Behälter übertragen.
Das Medium, in dem das vegetative Inokulum erzeugt wird, kann dasselbe oder ein anderes sein als das,
welches für die Lincomycinerzeugung herangezogen wird, so lange es so beschaffen ist, daß der
Mikroorganismus gut gedeiht
Der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus kann auch unter Heranziehung der in
der US-Patentschrift 30 86 912 geoffenbarten Medien und Bedingungen gezüchtet werden. Des weiteren kann
die nach vorlegendem Verfahren erzeugte Lincomycin Verbindung nach den in obiger Palentschrift beschriebenen
Methoden aufgearbeitet werden.
Nach einem bevorzugten Aufarbeitungsverfahren erhält man das Lincomycin aus seinem Kulturmedium
durch herkömmlich durchgeführte Abtrennung der Mycele und ungelösten Feststoffe, z. B. durch Filtrieren
und Zentrifugieren. Dann wird das Lincomycin dadurch vom Filter oder aus der zentrifugierten Brühe
gewonnen, daß man mit einem mit Wasser niehl mischbaren organischen Lösungsmittel, in dem Lincomycin
löslich ist. z. B. mit I-Butanol, Methylethylketon Benzol oder vorzugsweise Methylenchlorid extrahiert
Vorzugsweise wird die Extraktion nach Einstellung der filtrierten Gärbrühe auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis
10,0 mit einer Base wie Natriumhydroxid durchgeführt Der lincomycinhaltige Lösungsmittelextrakt läßt sich zu
einem öligen Stoff einengen, der anschließend mit Äther und angesäuertem Methanol unter Gewinnung eine:
farblosen, amorphen Lincomycinpräparates extrahieri werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht infolge des NichtVorhandenseins von Lincomycin B eine leichtere
Lincomycinaufarbeitung.
Wenn auch das vorliegende Verfahren unter besonderer Berücksichtigung des neuen Mikroorganismus
Streptomyces espinosus Dietz, sp. nov., NRRL 3890 ausführlich beschrieben wird, so beschränkt es sich
dennoch nicht auf diesen speziellen Mikroorganismus oder auf Mikroorganismen, die durch die hierir
geoffenbarten Kultureigenschaften genau definierl wurden. In die vorliegende Erfindung sind auch andere
Stämme oder Mutanten dieses Mikroorganismu« einzubeziehen, die durch bekannte Techniken, ζ. Β
durch Einwirkung von Röntgenstrahlen oder Ultravio lettbestrahlung auf den neuen Mikroorganismus, durch
Einwirkung von Stickstofflost, von Phagen gebildei werden können.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläute rung der Erfindung. Sofern nicht anders vermerkt
beziehen sich alle Prozentsätze auf das Gewicht unc sämtliche für Lösungsmittelgemische angegebener
Mengen auf das Volumen.
Beispiel
A) Fermentation
A) Fermentation
Mit einer Schrägbodenkultur von Streptomyce espinosus Dietz, sp. nov, NRRL 3890 wurde eine Reih«
von 500 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die jeweils
100 ml Keimungsmedium folgender Zusammensetzung enthielten:
Glucosemonohydrat 25 g/l
Baumwollsaatmehl, techn. rein'· 25 g/l
Rest Leitungswasser zur Auffüllung
*) Handelsprodukt »Pharmamedia« der Firma Traders Oil
Mill Comp.. Fort Worth,Texas.
Die Kolben wurden auf einer Rotationsschüttelmaschine drei Tage bei 28°C kultiviert.
Mit 5% des obigen Keimungsinokulums wurde ein 500-ml-Erlenmeyer-Gärkolben inokuliert, der 100 ml
steriles Medium folgender Zusammensetzung enthielt:
Feinvermahlenes, aus Sojamehl | 35 g/l |
extrahiertes Fett *) | 10 g/l |
Magermilch | 10 g/l |
Czapek Dox Broth**) | 3 g/l |
CaCO1 | |
Antischaummittel, bestehend aus | |
Polyalkylenglykolen und deren | 2 ml/100 I |
Derivaten***) | |
Rest Leitungswasser zur Auffüllung | |
*) Handelsprodukt »kay-soy«.
*) Handelsprodukt der Difco Laboratories, Detroit, Michigan,
folgender Zusammensetzung:
NaNOi
K2HPO-1
MgSOi · 7 H2O
KCl
FeSO4 · 7 H2O
Sucrose
pH
2 g/l I g/l 0,5 g/l 0,5 g/l Spuren 30.0 g/l 6.6.
***) Ucon LB-625. Handelsprodukt der Union Carbide Corp.. Chemicals Division, Detroit, Michigan.
Eine Reihe vorstehend beschriebener 500-ml-Kolben
wurde zur Beschaffung von weiterem Fermentationsmaterial benutzt. Vor der Inokulierung wurden diese
Kolben 30 Minuten bei 130°C sterilisiert. Die inokulierten
Gärkolben wurden auf einer Rotationsschüttelmaschine (250 U/min, 6 cm Hub) vier Tage bei 28° C
inkubiert.
Nach Ermittlung durch mikrobiologische Standardscheiben-Plattenanalyse
wies ein typischer Gärkolben folgendes antibakterielles Spektrum auf:
Organismus | Zone (mm) | 96 Stunden |
72 Stunden | 30 | |
B.sublilis | 26 | 32 |
S. aureus | 34 | 44 |
S. lutea | 43 | 20 |
K. pneumoniae | 21 | 0 |
E.coli | 0 | 0 |
S. schottmuelleri | 0 | 0 |
P. vulgaris | 0 | 36 |
M. avium | 34 | |
B) Extraktion | ||
π Die ganze, nach obiger Beschreibung hergestellte
Gärbrühe (etwa 9 Liter) wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterkuchen
wurde mit 1 Liter Wasser gewaschen, das Waschwasser mit der klaren Brühe verrinigt und dieses
.'Ii klare Gemisch (7,2 1) auf pH 8,8 eingestellt und dreimal
mit Methylenchlorid extrahiert, wobei jedesmal ein Drittel des Volumens der klaren Brühe verwendet
wurde. Die Methylenchlorid-Extrakte wurden vereinigt und dann unter Gewinnung eines öligen Stoffes zur
2) Trockne eingeengt. Man löste diesen Stoff in 500 ml
Äther und vermischte die Lösung mit 5 ml In methanolischem Chlorwasserstoff, aus dem Lincomycin
als farbloses amorphes Material in einer Ausbeute von 450 mg ausfiel. Dieses Präparat wurde durch Dünn-Schichtchromatographie
unter Verwendung von Silicagel G als Trägerstoff und mittels Methyläthylketon-Aceton-Wasser
(186:52:20 V/V) als Lösungsmittel untersucht. Des weiteren wurde das Präparat durch
Infrarot- und NMR-Spektroskopie untersucht. All diese
Untersuchungen wiesen das Präparat als Lincomycin aus und ergaben, daß darin kein nachweisbares
Lincomycin B enthalten war.
Die Menge an Lincomycin B bei normaler Fermentation von Streptomyces lincolmensis var. lircolnensis
ändert sich je nach der Zusammensetzung der Medien, der Inkubationszeit, der Temperatur, Belüftung. Unter
normalen Arbeitsbedingungen betragen die Mengen an Lincomycin B bei einer derartigen Gärung 5 bis 10%
des gesamten vorhandenen Lincomycins. Das Lincomy-4)
ein B wird durch wiederholte Umkristallisierung des Lincomycinproduktes in geeigneten Lösungsmitteln wie
Wasser/Aceton-Gemischen oder Gemischen aus Wasser und niederem Alkohol entfernt. Da nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren kein Lincomycin B entin steht, erübrigen sich derartige Umkristallisierungen.
Claims (1)
- 2t 64Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von Lincomycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Strep- s tomyces espinosus Dietz NRRL 3890 oder daraus durch bekannte Techniken erhältliche Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen zwischen etwa 18 und 400C kultiviert und das Lincomycin aus der Gärbrühe isoliert
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