DE2164664A1

DE2164664A1 - Verfahren zur Herstellung von Lincomycin

Info

Publication number: DE2164664A1
Application number: DE19712164664
Authority: DE
Inventors: Alexander Demetrios Portage; Coats John Henry Kalamazoo; Pyke Thomas Richard Portage; Mich. Argoudelis (V.St.A.)
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1970-12-28
Filing date: 1971-12-24
Publication date: 1972-07-27
Also published as: JPS557238B1; NL156441B; FR2120924A5; DE2164664B2; SE387364B; NL7117563A; DE2164664C3; DK126340B; US3697380A

Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin ohne gleichzeitige Erzeugung von Lincomycin B (4^l-Depropyl-4'-äthyllincomycin). Die Abwesenheit von Lincomycin B in der Gärbrühe ermöglicht eine verbesserte und wirksamere Lincomycingewinnung hieraus..

Lincomycin ist ein nützliches Antibiotikum, das durch Gärverfahren unter Verwendung des Mikroorganismus Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis gewonnen wird. In der U.S.A.Patentschrift 3 086 912 wird ein solches Gär- und Gewinnungsverfahren für Lincomycin, früher als Lincolnensin bekannt, beschrieben. Bei der Gärung gemäß dieser Patentschrift fällt gleichzeitig Lincomycin B, eine stickstoffhaltige Base der Molekularformel C-jyH^NoOgS ^an* ^^war sind Lincomycin und Lincomycin B gegen praktisch das gleiche Spektrum von Mikroorganismen wirksam, doch liegt bekanntlich die Wirksamkeit des Lincomycin B gegen diese Mikroorganismen erheblich unter

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jener des Lincomycins. Lincomycin ist infolgedessen das bevorzugte Antibiotikum.

Zum mikrobiologischen Verfahren dieser Erfindung.wird ein neuartiger Mikroorganismus zur Herstellung von Lincomycin herangezogen, wobei die gleichzeitige Erzeugung von Lincomycin B unterbleibt.

™ Der im vorliegenden für die Lincomycinherstellung herangezogene, neuartige Actinomycet ist Streptomyces espinosus Dietz, sp. n. Eine seiner Stammeseigenschaften liegt in der Bildung von Lincomycin ohne gleichzeitige Bildung von Lincomycin B. Eine Subkultur dieses lebenden Organismus kann auf Anfrage von der hierfür vorgesehenen Sammelbank der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Services, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A., bezogen werden, D^e Eintragungsnummer bei dieser Bank lautet NRRL 3890.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus Streptofc myces espinosus Dietz, sp. n. wurde von Alma Dietz vom Upjohn-Porschungslaboratorium untersucht und wird nachfolgend beschrieben:

Farbeigenschaften: grau-grünes Luftwachstum. Melanin negativ. Sein Erscheinungsbild auf Ektachrom (2) beschreibt Tabelle I. Die Bezugsfarbeigenschaften sind in Tabelle II zusammengestellt. Die Kultur kann in der Grün- (GN) und Grau- (GY) farbreihe nach Tresner und Backus Applied Microbiol. Bd. jll, S. 353-338 (1962)7 untergebracht werden.

Mikroskopische Eigenschaften: Sporenträger sind kurz, gerade bis zickzackförmig bis offenspiralig (RF, RA) im Sinne von

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Pridham und Mitarbeitern Applied Microbiol. Bd. j5, S. 52-79 (1958)7 Sporen sind meistens kugelförmig, viele davon mit ausgesprochener Verkettung (linkage). Die Sporenoberfläche ist dornig bis stachelig und scheint bei manchen Stacheln ins Haarförmige überzugehen. Die Stacheln erscheinen reichlich und gemustert, wenn sie auf Sporen beobachtet werden, die nach der Kohlenstoff-Vermehrungsmethode von Dietz und Mathews /Ipplied Microbiol. Bd. 10, S. 258-263 und Bd. 16, S. 935-941 (1968)7 behandelt worden sind.

Biochemische und Kultureigenschaften: - siehe Tabelle III Verwendung von Kohlenstoff:

Das Wachstum der Kultur auf Kohlenstoffverbindungen wurde in dem synthetischen Medium nach Pridham und Gottlieb /J. Bacteriol. Bd. 5_6, S. 107-114 (1948)7 und in deren modifiziertem Medium ^international Journal of Systematic Bacteriology Bd. 1(5, S. 313-340 (1966)J ermittelt. Im erstgenannten Medium erfolgte ein geringes Wachstum der Kultur auf der Kontrolle, Inulin, Dulcit, D-Sorbit, Phenol, Natriumoxalat, Natriumtartrat und Natriumsuccinat; ein mäßiges Wachstum auf Sucrose, Raffinose, Salicin und Natriumacetat; ein gutes Wachstum auf D-Xylose, L-Arabinose, Rhamnose, D-Fructose, D-Galaetose, D-GlUcose, D-Mannose, Maltose, Lactose, Cellobiose, Dextrin, löslicher Stärke, Glycerin, D-Mannit und Inosit; kein Wachstum auf Kresol, Natriumformiat und Natriumsalicylat. Im modifizierten Medium etffolgte eine geringe Entwicklung auf der negativen Kontrolle (kein Zusatz von Kohlenstoffverbindung) und gute Entwicklung auf der positiven Kontrolle (Glucose). Das Wachstum auf L-Arabinose, D-Xylose, Inosit, D-Mannit, D-Pructöse, Rhamnose und Cellulose (eine von zwei Platten) war gleichartig oder besser als die Glucosekontrolle. Es zeigte sich kein Wachstum auf Saccharose oder Raffinose.

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-H-

Temperatur: Auf Bennett's-Agar, Czapek's-Saccharose-Agar und Maltose-Trypton-Agar gedieh das Wachstum ziemlich gut bei 18°, 45° und 55°C; gut bei 24°C und reichlich bei 28 37°C.

S. espinosus ist leicht zu unterscheiden von dem Lineomycin-Erzeuger Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis (D. J. Mason, A. Dietz und C. DeBoer, 1962 "Lincomycin, A New Antibiotic"; I. Discovery and Biological Properties,

) Antimicrobial Agents and Chemotherapy, S. 55^-559). Die neue Kultur entfaltet grau-grünes Luftwaehstum, ist melaninnegativ, hat kurze, gerade bis offenspiralige Sporenträger mit runden, dornigen bis stacheligen bis haarigen Sporen, solubilisiert Xanthin nicht und gedeiht bei 45-55°C sowie bei niedrigeren Temperaturen. S. lincolnensis zeigt dagegen blass-rosafarbenes Luftwaehstum, ist melanin-positiv, hat lange gerade bis zxckzackformige Sporenträger mit rechtwinkligen glatten Sporen mit feinem Oberflächendetail, solubilisiert Xanthin und entfaltet bei 45~55°C kein bzw. nur spurenartiges Wachstum.

S. espinosus unterscheidet sich von anderen zur begrenzten " "grünen" Gruppe von Streptomyces gehörenden Organismen durch seine Produktion von Antibiotikum Lincomycin, durch sein rasches Wachstum und die Bildung von grau-grünem Luftmycel, durch sein auffallendes weißes Luftwachstum auf Pepton-Eisen-Agar, sein Wachstum bei 18 - 55°C und seine ausgeprägten runden Sporen mit dorniger bis stacheliger bis haariger Oberfläche £vgl. Cultures in the Viridis Series of Waksman (s.A.Waksmann, 1961, The Actinomyeetes, Band 2, Classification, Identification, and Descriptions of Genera and Species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore) und Baldacci, Giornale di Mierobiologia, Bd. j>, S. 10-27 (1958)7: die prasinus-Parbgruppe von Ettlinger et al. /Archiv, für Mikrobiologie,

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_ cz —

Bd. 31.3 ^s· 326-358 (1958)7, die prasinus-farbene azureusglaucus-Gruppe von Hütter ^R. Hütter, "Systematik der Streptomyceten unter besonderer Berücksichtigung der von ihnen gebildeten Antibiotika", S. Karger, Basel (196J)J, die malachiticus-Gruppe von Küster /International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 20, S. 25-29 (1970)7, die grünsporige Farbgruppe X von Kutzner /H.J. Kutzner, "Beitrag zur Systematik und Ökologie der Gattung Streptomyces Waksman« et Henrici", Diss. Landw. Hochschule Hockenheim (195617 und die Prasinomycin-Erzeuger von Myers et al. /Äppl. Microbiol. Bd.

i£, s. 603-608 (1968)7.

Von den aufgeführten Arten der Upjohn-Kulturensammlung und von den in der Literatur beschriebenen Arten ist der Streptomyces espinosus durch die Art seiner auffallende Farbmuster tragenden Sporenträger und Sporen sowie durch sein Vermögen, Lincomycin zu produzieren, unterscheidbar. Es wird vorgeschlagen, das neue Bodenisolierungsprodukt mit Streptomyces espinosus Dietz, sp. n. und diese Typenart als Variante Streptomyces espinosus var. espinosus gemäß Bestimmung 9d(2) des Internationalen Code der Bakteriennomenklatur /Intern. J. System. Bacteriol., Bd. 16_, S. 459-490 (1966)7 zu bezeichnen.

Die Eigenschaften des Streptomyces espinosus Dietz, sp. nov., NRRL 389O sind in nachstehenden Tabellen zusammengestellt:

Tabelle I: Erscheinungsbild des Streptomyces espinosus auf Ektachrome.

Tabelle II: Bezugsfarbeigenschaften des Streptomyces espinosus.

Tabelle III: Biochemische und,Kultureigenschaften des Streptomyces espinosus.

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TABELLE I

Erscheinungsbild des Streptomyces espinosus auf Ektachrome

Agar-Medium

Oberfläche

Unterseite

Bennett¹s Czapek's-Saccharose Maltose-Trypton

Pepton-Eisen 0,1 % Tyrosin Kaseinstärke

grau-grün grau-grün grau-grün

weiß

farblos

grau-grün

blassgelb-gelbbraun mattgrau geIb-gelbbraun bis oliv gelb rot mattgrau-grün

A. Dietz, "Ektachrome Transparencies as Acids in

Actinomycete Classification", Annals of the New York Academy of Sciencies, Bd. 6C), S. 152-154, (1954).

TABELLE II

Bezugsfarbeigenschaften von Streptomyces espinosus

Agar-Medium	0	Nach "Color Harmony	Nach "ISCC-NBS-Methode
		Manual", 3· Auflage,	zur Farbenbezeichnung
		1948⁺⁾	und Wörterbuch der Farb- ++)
			bezeichnungen"3
Bennett's	U	1 l/2ge helles Oliv	109gm helles Gräulich-
	P	grau	oliv
	Ige Zitronat-zitronen	109gm helles Gräulich-
	grau	oliv
	2ec Biskuit, hellbraun,	90gm gräulich-gelb
	Hafermehl, Sand	--

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TABELLE II (Fortsetzung)

Bezugsfarbeigenschaften von Streptomyces espinösus

Agar-Medium

Nach "Color Harmony Manual", 3. Auflage,

1948⁺^

Nach "ISCC-NBS-Methode zur Parbenbezexchnung und Wörterbuch der Farbbezeichnungen '

Czapek¹s-Saecharose

Maltose-•Erypton

Hefeex-

trakt-

Malzex-

trakt

(ISP-2)

2ig schiefergraugelbbraun

2ig schiefergrauge Ibbraun

1 l/2ge helles

Olivgrau

1 ih olivgrau

2gc Bambus, mois

cha-

1 l/2ge helles Olivgrau

2ih dunkles, gedecktes Grau

lih olivgrau

2gc Bambus, chamois

2ie helles Senfgelbbraun

110 g gräulich-oliv 112m helles Olivgrau 110 g gräulich-oliv 112m helles Olivgrau

109gm helles Gräulieholiv

112m helles Olivgrau 113g olivgrau 127g gräulich-olivgrün

90gm gräulich-gelb 109gm helles Gräulicholiv

j 112m helles Olivgrau

113g olivgrau 112m helles Olivgrau 113g olivgrau 127g gräuliches Olivgrün

90gm gräulich-geIb

91gm dunkles gräuliches Gelb

9¹Jg helles Olivbraun 106g helles Oliv

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TABELLE II (Fortsetzung)

Bezugsfarbeigenschaften von Streptomyces espinosus

Agar-Medium

Hafermehl
(ISP-3)

Anorganische Salz-Stärke
(ISP-4)

Glycerin-Asparagin

(ISP-5)

U
P

Nach "Color Harmony Manual", 3. Auflage,

1948⁺⁾

1 l/2ig olivgrau 2fe gedecktes Grau

1 l/2ge helles Olivgrau

2ec Biskuit, hellbraun, Hafermehl, Sand

3ih beige-graUjMaus

lih olivgrau

2gc Bambus, chamois

2ec Biskuit, hellbraun, Hafermehl, Sand

2ik dunkles, gedecktes Grau

2fe gedecktes Grau

2ge gedecktes Gelbbraun n

gräulich-gelbbraun (griege)

2ge gedecktes Gelbbraun _Λ

gräulich-gelbbraun (griege)

Nach "ISCC-NBS-Methode zur Farbenbezeiehnung und Wörterbuch der Farbbe-

zejLchnungen '

94g helles Olivbraun 112gm helles Olivgrau

109gm helles gräuliches Oliv
90gm gräulich-gelb

113g olivgrau 265m mittelgrau

112m helles Olivgrau 113g. olivgrau 127g gräuliches Olivgrün 90gm gräulich-gelb 90gm gräulich-gelb

112m helles Olivgrau 113g olivgrau 94g helles Olivbraun 112gm helles Olivgrau 90gm gräulich-gelb

90gm gräulich-gelb

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O = Oberfläche U = Unterseite P = Pigment

+) E. Jacobson, W.C. Granville und CE. Foss, "Color Harmony Manual", 3. Aufl., Container Corporation of America, Chicago, Illinois, (1948).

++) K.S. Kelly and D.B. Judd, "The ISCC-NBS-Method of Designating Colors and a Dictionary of Color-Names", U.S. Department of Comm. Circular 553 (1955).

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TABELLE III

Kultur und Biochemie des Streptomyces espinosus: EIGENSCHAFTEN

Medium

Agar-Medien

Oberfläche (Luftwachstum)

Unterseite

Weitere Eigenschaften

	Pepton-Eisen	grau-weiß in der Mitte; grün am Rand	gelb	Melanin-negativ
	Calciummalat	schwaches bis kräftiges Graugrün	mattgrau	Malat wird nicht solu bilisiert
to O	Glucose- Asp ar agin	grauweiß bis grau gelb	hellcreme bis creme	r—
co co cc»	Magermilch	hellgrau-grün-gelb bis grau-grün-rosa	tiefgelb bis gelb-gelbbraun	Ctelbes bis gelb-gelb braunes Pigment Kasein wird solubilisiert
*>. O co	Tyrosin	starkes Graugrün	rotbraun	Rotbraunes Pigment Tyrosin wird solubilisiert
to ' i	Xanthin	krätiges Graugrün bis nur an der Peripherie kräftiges Graugrün	blassgelb bis blass gelb-grün	Xanthin wird nicht solubi lisiert
2	Nährstärke	kräftiges Graugrün	blassoliv	Stärke wird hydrolysiert
5JNAL IN	Hefeextrakt- Malzextrakt	starkes Graugrün	blassgelb- gelbbraun	. —
co T>	Bennett's	starkes Graugrün	oliv	--
=CTED	Czapek's- Saccharose	kräftiges Graugrün	graugrün	—
	Maltose- Trypton	kräftiges Graugrün mit weiß bis starkes Graugrün	oliv

TABELLE III (Portsetzung) Kultur und Biochemie des Streptomyces espinosus:

EIGENSCHAFTEN

Medium

Agar-Medien Pepton-Hefeex-

trakt-Eisen (ISP-6)

Tyrosin (ISP-7)

Gelatine-Med.ien

ungest?reckt (piain)

Nährgelatine

Brühe-Medien

synthetisches Nitrat

Nähr-Nitrat

Oberfläche (Luftwachstum)

blassrosa

graugrün mit weiß bis graugrün

Unterseite.

gelb-gelbbraun blassgelb-grün

Weitere Eigenschaften

Melanin-'negativ

Melanin-negativ

Farbloses vegetatives Wachstum
Verflüssigung 1/4-1/2

Weißes Luftwachstum auf Oberflächenhäutchen Verflüssigung 1/3-1/2

Rosa-cremefarbenes Luftwachstum auf Oberflächenhäutchen

Flockiges Wachstum an der Basis

Wachstum im ganzen Medium Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

Spur von grünem Luftwachs tumco auf gelbem vegetativem Wachstum des Oberflächen-

Medium

TABELLE III (Portsetzung)

Kultur und Biochemie des Streptomyces espinosus: EIGENSCHAFTEN

Unterseite

Oberfläche (Luftwachstum)

Brühe-Medien

Lackmus-Milch Weitere Eigenschaften

häutchens

Flockiges Wachstum an

der Basis

Gelbpigment

Weder Nitrat noch Nitrit

vorhanden

Cremefarben bis grün bis graugrün auf gelbem bis graugrünem vegetativen Ring

Lackmus reduziert Peptonisierung 1/1 pH 7₃5 7,9

Der neue Mikroorganismus erzeugt Lincomycin, wenn er in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Für die Herstellung begrenzter Mengen können natürlich Oberflächenkulturen und Flaschen benutzt werden. Man züchtet den Organismus in einem Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle, z.B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, und eine Stickstoffquelle, etwa eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein assimilierbares eiweißartiges Material enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind u.a. Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse u. dgl. Als Stickstoffquelle verwendet man zweckmäßig Maisquellwasser,-Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, SojatfSshl-, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, pankreatischen Kasein-Verdauungssaft, in Brennereien anfallende Feststoffe, tierische Pepton-Flüssigkeiten, Fleisch- und Knochenschnitzel u. dgl. Mit Vorteil können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen eingesetzt werden. In der Regel ist es nicht nötig, Spurenmetalle wie Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen usw. den Gärmedien zuzusetzen, da als Komponenten der Medien Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile verwendet werden.

Die Lincomycinherstellung nach dem vorliegenden Verfahren kann bei jeder Temperatur erfolgen, die zu einem befriedigenden Wachstum des neuen Mikroorganismus führt, so z.B. zwischen etwa 18 und 40, vorzugsweise zwischen etwa 20 und 32°C. Eine optimale Lincomycinerzeugung liegt gewöhnlich in etwa 2 bis 10 Tagen vor. Während der Gärung bleibt das Medium normalerweise basisch. Der pH-Endwert hängt teilweise von den vorhandenen Pufferstoffen, sofern solche überhaupt zugegen sind, und teilweise von dem anfänglichen pH-Wert des Kulturmediums ab.

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Erfolgt die Züchtung in großen Gefäßen und Behältern, so inokuliert man vorzugsweise eher mit der vegetativen als mit der Sporenform des Mikroorganismus, um dadurch eine deutliche Verzögerung bei der Lincomycinerzeugung und den damit verbundenen unökonomischen Geräteeinsatz auszuschalten. Es ist daher ratsam, ein vegetatives Inokulum dadurch in einer Nährlösungskultur herzustellen, daß man letztere mit einem Bruchteil aus einer Boden- oder einer Schrägbodenkultur inokuliert. Nach derartiger Beschaffung eines jungen aktiven vegetativen Inokulums wird dieses aseptisch auf große Gefäße oder Behälter " übertragen. Das Medium, in dem das vegetative Inokulum erzeugt wird, kann dasselbe oder ein anderes sein als das, welches für die Lincomycinerzeugung herangezogen wird, so lange es so beschaffen, ist, daß der Mikroorganismus gut gedeiht.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus kann auch unter Heranziehung der in der U.S.A.-Patentschrift 3 086 912 geoffenbarten Medien und Bedingungen gezüchtet werden. Des weiteren kann "die nach vorliegendem Verfahren erzeugte Lincomycin-Verbindung nach den in obiger Patentschrift beschriebenen Methoden aufgearbeitet werden.

Nach einem bevorzugten Aufarbeitungsverfahren erhält man das Lincomycin aus seinem Kulturmedium durch herkömmlich durchgeführte Abtrennung der Myeele und ungelösten Peststoffe, z.B. durch Filtrieren und Zentrifugieren. Dann wird das Lincomycin dadurch vom Filter oder aus der zentrifugieren Brühe gewonnen, daß man mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, in dem Lincomycin löslich ist, z.B. mit 1-Butanol, Methyläthylketon, Benzol oder vorzugsweise Methylenchlorid extrahiert. Vorzugsweise wird die Extraktion nach Einstellung der filtrierten Gärbrühe auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 10,0 mit einer Base wie Natriumhydroxid durchgeführt. Der lincomycinhaltige Lösungsmittelextrakt läßt sich zu einem öligen Stoff einengen, der anschließend mit Äther und ange-

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säuertem Methanol unter Gewinnung eines farblosen, amorphen Lincomycinpräparates extrahiert werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht infolge des Nichtvorhandenseins von Lincomycin B eine leichtere Lincomycinaufarbeitung.

Wenn auch das vorliegende Verfahren unter besonderer Berücksichtigung des neuen Mikroorganismus Streptomyces espinosus Dietz, sp. n., NRRL 3890, ausführlich beschrieben wird, so beschränkt es sich dennoch nicht auf diesen speziellen Mikroorganismus oder auf Mikroorganismen, die durch die hierin geoffenbarten Kultureigenschaften genau definiert wurden. In die vorliegende Erfindung sind auch andere Stämme oder Mutanten dieses Mikroorganismus einzubeziehen, die durch bekannte Techniken, z.B. durch Einwirkung von Röntgenstrahlen oder Ultraviolettbestrahlung auf den neuen Mikroorganismus, durch Einwirkung von Stickstofflost, von Pliagen usw. gebildet werden können.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Sofern nicht anders vermerkt, beziehen sieh alle Prozentsätze auf das Gewicht und säinfcliche für Lösungsmittelgemische angegebenen Mengen auf das Volumen.

Beispiel 1 A. FERMENTATION

Mit einer Schrägbodenkultur von Streptomyces espinosus Dietz, sp. n., NRRL 3890 wurde eine Reihe von 500 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die jeweils 100 ml Keimungsmedium folgender Zusammensetzung enthielten:

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4Φ

Glucosemonohydrat 25 g/1

Baumwollsaatmehl, techn. rein 25 g/1 Rest Leitungswasser zur Auffüllung

Handelsprodukt "Pharmamedia" der Firma

Traders Oil Mill Comp., Fort Worth, Texas, V.St.A.

Die Kolben wurden auf einer Rotationsschüttelmaschine drei Tage bei 28°C kultiviert.

Mit 5% des obigen Keimungsinokulums wurde ein 500 ml Erlenmeyer-Gärkolben inokuliert, der 100 ml steriles Medium folgender Zusammensetzung enthielt:

Feinvermahlenes, aus Sojamehl extrahiertes Fett 35 g/1 Magermilch 10 g/1 Czapek Dox Broth⁺⁺^ 10 g/1 CaCO₃ 3 g/1

Antischaummittel, bestehend aus PoIyalkylenglykolen und deren Derivater Rest Leitungswasser zur Auffüllung

alkylenglykolen und deren Derivaten 2 ml/100 1

'Handelsprodukt "Kay-soy"

Handelsprodukt der Difco Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A., folgender Zusammensetzung:

NaNO, 2 g/1

K₂HPO₁J 1 g/1

MgSO₁J-TH₂O 0.5 g/1

KCl' 0.5 g/1

FeSOh·7H₂O Spuren

Sucrose 30.0 g/1

pH 6.6

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'Ucon LB^625j Handelsprodukt der Union Carbide Corp., Chemicals Division, Detroit, Michigan, V.St.A.

Eine Reihe vorstehend beschriebener 500 ml Kolben wurde zur Beschaffung von weiterem Fermentationsmaterial benutzt. Vor der Inokulierung wurden diese Kolben 30 Minuten bei 130⁰C sterilisiert. Die inokulierten Gärkolben wurden auf einer RotationsSchüttelmaschine (250 U/min, 6 cm Hub)vier Tage bei 28°C inkubiert.

Nach Ermittlung durch mikrobiologische Standardscheiben-Plattenanalyse wies ein typischer Gärkolben folgendes antibakterielle Spektrum auf:

Organismus

Zone (mm)	96 Stunden
72 Stunden	30
26	32
34	44
43	20
21	0
0	0
0	0
0	36
34

B. subtilis

S. aureus

S. lutea

K. pneumoniae

E. coli

S, schottmuelleri

P. vulgaris

M. avium

B. EXTRAKTION

Die ganze, nach obiger Beschreibung hergestellte Gärbrühe (etwa 9 Liter) wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 1 Liter Wasser gewaschen, das Waschwasser mit der klaren Brühe vereinigt und dieses klare Gemisch (7»2 1) auf pH 8,8 eingestellt und dreimal mit Methylenchlorid extrahiert, wobei jedes-

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mal ein Drittel des Volumens der klaren Brühe verwendet wurde. Die Methylenchlorid-Extrakte wurden vereinigt und dann unter Gewinnung eines öligen Stoffes zur Trockne eingeengt. Man löste diesen Stoff in 500 ml Äther und vermischte die Lösung mit 5 ml In methanolischem Chlorwasserstoff, aus dem Lincomycin als farbloses amorphes Material in einer Ausbeute von ^50 mg ausfiel. Dieses Präparat wurde durch Dünnschicht Chromatographie unter Verwendung von Silicagel G (Merck A.G., Darmstadt) als Trägerstoff und mittels Methyläthyl- w keton-Aceton-Wasser (186:52:20 V/V) als Lösungsmittel untersucht. Des weiteren wurde das Präparat durch Infrarot- und NMR-Spektroskopie untersucht. All diese Untersuchungen wiesen das Präparat als Lincomycin aus und ergaben, daß darin kein nachweisbares Lincomycin B enthalten war.

Die Menge an Lincomycin B bei normaler Fermentation von Streptomyces lincolmensis var. lincolnensis ändert sich je nach der Zusammensetzung der Medien, der Inkubationszeit, der Temperatur, Belüftung usw. Unter normalen Arbeitsbedingungen betragen die Mengen an Lincomycin B bei einer derartigen Gärung 5 bis 10% des gesamten vorhandenen Lincomyeins. Das Lincomycin B wird durch wiederholte Umkristallisierung des Lineomycinproduktes in geeigneten Lösungsmitteln wie Wasser/Aceton-Gemischen oder Gemischen aus Wasser und niederem Alkohol entfernt. Da nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kein Lincomycin B entsteht, erübrigen sich derartige Umkristallisierungen.

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Claims

Patentansprüche:

Verfahren zur Herstellung von Lincomycin, dadurch gekennzeichnet;, daß man Streptomyces espinosus Dietz, sp. n. mit der Identifizierungskennzahl NRRL 389O sowie Mutanten desselben in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis dieses Medium infolge der Lincomycinerzeugung eine erhebliche antibiotische Aktivität aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Nährmedium eine Quelle für assimilierbares Kohlenhydrat und für assimilierbaren Stickstoff enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lincomycin aus der Gärbrühe isoliert wird.

Für: The Upjohn Company

Kalamazoo, Mich., V.St..A,

(Dr.H.J.Wolff) Rechtsanwalt

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