DE1617925A1 - Pharmazeutisches Praeparat mit antibiotischer Wirkung und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

1617S25

Dr. Walter Beil Hr? ^ IIoep^ener DtL .•-»-'«».iaV*'««

Dr. rlar.s Chr. Beil

Frankfurt a. M.-Höchst AddoaatnS* M ·Tel. 301024

Unsere Kr. 14 195

SHE UPJOHK CGMPAHT Kalamazoo (Michigan, YStA)

Pharmazeutisches Präparat mit antibiotisclier Wirkung und "Verfahren au seiner Herstellung

Vorliegende Erfindung besieht sich auf ein neues pharmazeutisches Präparat und auf ein Verfahren au seiner Herstellung, Die Erfindung feesieht sich insbesondere auf eine neue Verbindung, Lomondomycin .(TT-24»792)jt und auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung«

ist eine chemische Verbindung, die sich durch Kultivieren eine® londaiEyeinbildenden Actinoayeeten iß einem wässrigen liähraiediiyn herstellen lässt* Es handelt sich um eine saure Verbindung₈ welche die Eigenschaft hat, das Wachstum von grampositiven uviä graisuies&tiveii Bakterien au beeinträchtigen» so S_nB₃ von Stapirflscöcus aureus^ Bacillus siibtÜiSf Streptococcus heisolytieusg Streptocoecus faacalis» Diploeoeeus pneuiaoBiae, Bsoheriöhia asli,- Proteus imlgarisj Klebsiella pneuiaoniae» Safeonella sohottsiuelleri itnä Pseiidomonas aeruginosa» Eomondosiycin besitzt auch eine fungi side Wirkung gegen verschiedene Pungi v/ie

mmu/nm _{0RIGtNAL 1NSPECTH)}

ζ·B, ITocardia asteroides, Blasiomyces dermatitidia, Coccidioides immitis, Geotrichum sp._f Hormodendrtun compactus, Gryptococcus neoformans, Histcplasma capsulatum, Sporotrichura achenckii, Honosporum apiospermum, Trichophyton rubrum, Micro sporunv canis, Irichophyton interdigitale, Candida albicans, 'iirichophyton violaceum, Trichophyton asteroides und Trichophyton mentagrophytes. Dementsprechend kann Lomondomycin allein oder in Kombination mit anderen antibiotischen Mitteln zur Torhinderung des ¥:·.ο·ΐ3-tums oder Verringerung der Anzahl der vorgenannten Bakterien und Fungi wie vorstehend angegeben in verschiedenen Umgebungen verwendet werden. Beispielsweise ist es nützlich für die Bekämpfung der durch ptfathogene Kulturen" von Bacillus subtilis verursachten Infektion von Seidenraupen; es ist ebenfalls brauchbar als Ölkonservierungsmittel, z.3« als bakteriostatinches Kittel zur Verhinderung des W= chsturas gewisser Kikroorga_nismen, die das Verderben von Schneidölen verursachen« Lomondomycin ist auch brauchbar als fungizidea Mittel in industriellen Konservierungsmitteln, z»B. als fungizide Spülung für gewaschene Wäsche und zur Imprägnierung von Papieren und ^evebeni ferner ist es züitzlieh zur Unterdrückung des Funguswachsturns bei empfindlichen Organismen in Plattenkulturen tmd andeim biologischen Medien, Lomondomycin kann auch als Futterzusatz zur Förderung des Wachstums von Tieren, z.3. Säugetieren, Vögeln, Fisohen und Reptilien verwendet werden·

Chemische und physikalische Eigenschaften von Lomondomycin Kristallines Lomondomycin hat die folgenden chemieor^en und physikalischen Eigenschaften:

Farbe: Olivgelb

Eleraer-taranalyse: C$ 56,89ϊ H?6 3,35; $& 8,9Oj 0?6 30,28 Smpirische Formelί ^-it^in^o^G

Molekulargev/icht: 314- (Massenspektrometer) Schmelzpunkts >32O⁰C unter Zersetzung Löslichkeit: Weniger als 1 mg/ccm in "asser, Methanol, Cyclohexan, Aceton, Äther und Ithylaeetat« Sehr gut löslich in Aceton und Kethyläthylketon bei einem pE-\iert ve η etwa 2,0. Mehr als 10 mg/ccm in Wasser bei einem pH-Wert von 10-12« Mehr als 25 mg/ccm in Diiaethylformaaid«

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tlltrairio^ettabsorptlonsspelctrumi

Methanolι

Maximum bei 219/υ, a = 80,61 Schulter bei 260m, a « 84,48 ' Maximum bei 284/u-, a = 112,23 Maximum bei 316 au, a = 41,87 Schulter bei 330 au, a = 39,9? Maximum bei 372/U, a = 28,32 Maximum bei 441 ,u, a = 14,51 Schulter bei 463/U, a = 13/54

Ο,θϊ η Hol in Methanol:

Maxiraum bei 221yu, a = 87,58 Maximum bei 27OaU, a * 160,47 Maximum bei 311/U, a « 43,36 Maximum bei 375/a, a ■ 29,95 Schulter bei 439/u, a «= 15,14 Schulter, bei 465/U, ·* 12,75

0,01 η Katriumhydroxyd

Maximum bei 239/U, a = 62,16 Maximum bei 265/U, a * 111,01 Maximum bei 299/U, a « 90,01 Maximum bei 342/U, a * 111,29 Schulter bei 390*u» a · 26_ft3 Maximum bei 478/^u*^aag 15|O8

Infrarot Spektrum 8 Das InfrarotabsorptionsBpektrum von Lomondomycin, suspendiert in MineralBlmull ist in Fig. 1 der Zeichnungen wiedergegeben. Lomondomycin zeigt Banden** bei den folgenden Wellenlängen, die in reziproken Zentimetern ausgedrückt sind:

(W) 1560 (M) 1136 (M)

(M) 1547 (S) 1120 (W)

(M) 1523 (S) 1100 (W)

(M) 1492 (M) 1059 (S)

(M) 1458 (S) (Öl) 1049 (S)

(S) (Öl) 1446 (S) 562 (W)

2920	(S) (Öl)	1436	(S)
2850	(S) (Öl)	1430	(S)
2680	(W) . ·	1401	(M)
2620	(W)	1390	(S)
1720	(W)	1344	(S)
1702	(S)	1320	(M)
1097	(S)	1275	(S)
1655	(W)	1238	(S)
1643	(S)	1223	(S)
1625	(S)	1201	(M)
1600	(S)	1170	(S)
1577	(M)	1153	<s)

917	(W)
875	(W)
865	(W)
854	(M)
845	(M)
826	(W)
820	(M)
783	(M)
760	(W)
749	(W)
710	(W)

In einem KBr-PreBsling v/eist Lomondomycin Banden bei den folgenden Wellenlängen (in reziproken Zentimetern) auf:

3370 (M)	1546	(S)	1136 (M)
3075 (M)	1524	(S)	1120 (M)
2945 (M)	1494	(M)	1056 (S)
2660 (W)	1460	(S)	1048 (S)
2610 (W)	1446	(S)	962 (W)
1720 (W)	1433	(S)	917 (W)
1702 (S)	1401	(M)	875 (W)
1697 (S)	1390	(S)	854 (M)
1655 (M)	1344	(S)	845 (M)
1649 (M)	1320	(M)	826 (W)
1643 (S)	1275	(S)	820 (M)
1626 (S)	1238	(S)	788 (M)
1600 (S)	1223	(S)	750 (W)
1580 (M) '	1170	(S)	710 (W)
1562 (M)	1154	(S).

Die Bandenintensitäten sind mit "S", "M" bzw. ^MW^W bezeichnet
und stellen Annäherungen dar. Eine "S^H«-Bande besitzt die gleiche Grössenordnung der Intensität wie die stärkste Bande im Spektrum} "M»-Banden sind 1/3 bis 2/3 so intensiv wie die stärkste Bande? und "W"-Banden sind weniger als 1/3 so intensiv wie die etärkete Bande. Diese Näherungen werden auf Basis einer prozentualen Irans«

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missionsskala gemacht.

Lomondomycin besitzt ein in Fig. 2 der Zeichnungen"dargestelltes . charakteristisches Papierchromatogramm bei Anwendung der folgenden Lösungsmittelsystemeϊ

I 1-Butanol, Wasser (84:16), 16 Stunden,

II 1-Butanol, Wasser (84:16), plus 0,25 # p-Toluolsulfonsäure, 16 Stunden.

III 1-Butanol, Essigsäure, Wasser (2:111), 16 Stunden.

IV 2 56 Piperidin (Vol./Vol.) in 1-Butanol, Wasser (84:16), 16 Stunden.

V 1-Butanol, Wasser (4J96), 5 Stunden. _r

VI 1-Butanol, Wasser (4s96), plus 0,25 $> p-Toluolsulfansäure, 5 Stunden.

Mikrο ο rffaniamen

Das n-;ch der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Lomondomycin verwendete Aktinomyees ist Streptomyces lomondensis var. lomondensis. Eine* seiner StasHaclBrakteristiken ist die Bildung von Lomondomycin« Eine Subkultur des lebenden Organismus kann von der permanenten Sammlung der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Ser«vice, II.S.-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A. bezogen werden. Seine Registernummer in dieser Sammlung ist NRRL 3252_e

Die Eigenschaften von Streptomyces lomondensis var* lomondensis NRRL 3252 sind in den folgenden Tabellen angegeben:

Tabelle I

Aussehen von Sy lomondensis var. lomondensis auf Bktachrome '

vo figarmedium Oberfläche Rückseite

° Bennett's Agar blaugrau braun

<*> Cafapek¹ s,Sucrose blau-pfirsichfarben orange

** Maltose-Trypton blau-rosa braun

_»Pepton-BisQii kein Luftwachstum braun

^0,1^ lyrogin blau dunkelgelb-braun

α» Kaseinstärke blau dunkelgelb-braun

+) Dietz» A,» "Ektachrome-Diapositive als Hilfsmittel für die Klassifizierung- voa Aktinomyeeteri", Ann. 1T,Y# Acad.Sci«, Band 60, Seite 152-154 (1954).

0R16INAL

Tabelle II Mikroskopische Eigenschaften von S. lomondenais var.lonu-ndensis

Li chtmikroskop

Elekt ronenmilcro skop direkte Untersuchung Kohlenstoffprobe Sporophoren kurz, gerade "bis offeng "bis spiralförmig

Sporen v/arzig bis stachelig

Sporen warzig bis stachelig Schlechte Differenzierung von Sporen.

Tabelle III

Wachstum von S. lomondensis auf Kohlenstoffverbindungen in synthetischem Medium

(J. Bac«, Band 56, Seite 107-114-, 1946)

	Kontrolle
1.	D-XyIosβ
2.	Ii-Ar ab ino se
3.	Rhamnose
4.	D-Pructose
5.	D-Galaetose
6.	D-Glucose
7.	D-Mannose
8.	Haitose
9.	Sucrose
10.	Lactose
11«	Cellcbinose
12.	Raffinose
15.	Dextrin
14.	Inulin
15.	lösliche Stärke
16.	Glycerin
17.	Dulcit
18.	D-Mannit
19.	D-Sorbit
2Oi	Inosit
21.	Salicin
22.	Phenol
23.	Cresol
24.	Na-Pormiat
25.	Ka-Oxalat ί
26.	Na-Tartrat

-5-

COPY

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27. Ha-Sallcylat

28. fla-Acetat

29. Iia-Citrat
30« Ua-Succinat

Tabelle III (Fortsetzung)

+ = gutes Wachstum
(+)= massiges Wn
(-)= schlechtes W„cJistun

- = kein V/- chsturn.

Tabelle IV

KuJturei_f:pn:3co?.rt"rj .md phyciologiiscrje Si.-e-ischaften von S«, lomondensis var, lomondensis. .-

Agarmedium
Pepton-Eisen

Calcium-malat
Glucose-Asparagin
entralimte Milch

Tyrosin

Xanthin

Nährstärke

Hefeextrakfe-MaI ζ extrakt

Bennett's Agar
Czapek's Sucrose
Maltο β e-Trypton

Oberfläche Spur grau

graugrün

pfirs ichfarben

grauweiss

graublau

graugrün

blaugrau

grau-οrange

blaugrau-pfirsichfarben

blassblau-grau

pfirsichfarben -blau

Rückseite
braun

gelbgrüii
orange

dunkelgelbbraun

braun

grün

blass olivgelb

orange

orange—dunkelgelb

pf iris i chf arbengrün

orange-dunkelgelb

909884/1808 COPY

Sonstiges

braunes Pigment Melanin -h.

Kein Pigment,Malat löslich gem»

Pigment orangedunkelgelb

dunkelgelbes Pig ment, Kasein nicht löslich gemacht.

dunkelgelb-braunes Pigment. Tyrosin löslich gemacht.

blassgelb-dunkel gelbes Pigment. Xanthin löslich gemacht

felbes Pigment; tärke hydrolysiert

ο range-dunke1-gelbes Pigment

orange-dunkelgel bes Pigment

blass pfirsichfarbenes Pigment

orange-dunkelgel bes Pigment

BAD ORiQiNAL

Gelatinemedium
einfach

ITährmedium

Bouiilonmedium
Nährnitrat

synthetisches
Nitrat

Lakmusmilch

!Tabelle IV (Fortsetzung) Oberfläche Rückseite

blaugrau auf Oberflächenring

weiss auf
braunem Oberflächenring Spur farblosen
vegetativen
Wachstums an
der Basis

Spur rosa-

dunekelgelbes

vegetatives

Wachstum

überall Sonstiges

braunes Pigment 1/2 verflüssigt

braunes Pigment 1/2 verflüssigt

gelblich-dunkelgelbes Pigment. Kitrat zu Nitrit reduziert*

Pigment orange, Nitrat reduziert zu Nitrit.

keine Peptonisierungi keine Koagulierung. pH-Wert 6,7.

Tabelle Y

Farbeigenschaften von S. lomondensis var. lomondensis nach

Farbindiees

Medium

"Color Harmony Manual" 3. Auflage, 1948 ISOC-NBS-Verfahren zur Bezeichnung von Farben uifl "A Dictionary of Color Names·¹ Rundschreiben 5531

Bennetts-Agar
Oberfläche

Rückseite

Pigment

3oa(gö perlrosa, muschelfarben bis 15cb(g) wolkenblau

5ng(g) ziegelrot, hennarot bis 5pg(g). hennarot, hellkupferbraun, braunrot, rostbraun

5pg(g) hennarot, hell kupferfarben, braun, rotbraun, rostbraun 73gm blassgelb orange, 184-m eehr blaesblauj I89gm bläulichweiss

4-3» massig rötlich braunj

55g kräftigbraunj 55gm kräftigbraun

55gm kräftigbraun

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Czapeks

Sucroseagar

oberfläche

.Rückseite

Pigment

Haitose Irypton-Agar

Oberfläche

Rückseite

Pigment

15ba(g)blaue Färbung

2f b(g) bambusfarben, ledergelb, strohfarben, weizenfarben

Spur 4ca(g) fleischfarbig-rosa, muschelrosa, teerosenfarben.

15ba(m) blauer Schimmer 3ni(g) nelkenbraun

blass 3ni(g) nelkenbraun

184m sehr blassblau; 189gm bläulieh-weiss

87g mässiggelb; 89m blass· gelb

28 g hell gelblichrosa; 31gm blassgelblichrosa

184m sehr blassblauj 189 gm bläulichweiss

77m massig gelblichbraun, 95g massig olivbraun

77m massig gelblichbraun; 95 g massig olivbraur..

Die neue Verbindung der vorliegenden Erfindung wird hergestellt, wenn man den erzeugenden Organismus in einem wässrigen 3Fährmedium unter submersen aeroben Bedingungen züchtet» Es ist weiter zu beachten, dass für die Herstellung begrenzter Mengen Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werfen können. 3er Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle, z.B. ein assimilierbares Kohlehydrat, und eine Stickstoffquelle, z.3, eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein proteinhaltiges Material enthält* Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glukose, brauner Zucker, Sucrose, Glycerin, Stärke, Maisstär&e, Laktose, Bextrein_s Molasse und dgl· Bevorsugte Stickst off quell en sind beispielsweise Maiswasser, Hefe, autolysierte Brauerhefe mit Milsiifeatstoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsanenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, pankreatischer Kaseindigest, lösliche Brennereirüokstände, tierische Peptonflüssigkeiten, Heisch- und Knoenena-bfgiie und dgl. ^sine Kombination dieser Kohlenstoff- und Stiokstoffquellen kann mit Vorteil verwendet

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- ίο -

werden. Spurenmetalle v/ie z.B. Zi.-.k, Magnesium, Wan^-rn, Kobalt, Eisen und dgl. brauchen dem Fcrmentaticn^rnedium nicht zugesetzt zu v/erden, da Leitungswasser und ungereinigte Bestanütf3ile ala Komponenten des Mediums ve rv; on.-et werde*..

Die Herstellung der erfindungSo'emässen Verbindung kann bei jeder Temperatur erfolgen» die ein zufriedenstellendes Wacnstum des Mikroorganismus ermöglicht, z.B. zwischen etwa 1e° und 4ü°G, vorzugsweise zwischen etwa 20 und 32 C. Gewöhnlich wird eine optimale Bildung der Verbindung in etwa 2 bis 10'Tagen erreicht. Das Medium bleibt während ier Fermentierung angenähert neu*."'·!, Der endgültige pH—Wert ist teils von den gegebenenfalls vorhin— denen Puffern, teils vom' anfänglichen pH-Wert ies Kulturmediums ,abhängig, welches vor der Sterilisierung zweckmässigfc;rwei.-;e auf einen pH-Wert von etwa 7,2 eingestellt wird.

Wenn die Kultivierung in ^rossen Kesseln oder Tanks durchgeführt wird, verwen^;et man vorzugsweise die vegetative Form statt der Sporenforra des Mikroorganismus für die Impfung, um eine wesentliche Verzögerung bei der Herstellung der neuen Verbindung und die daraus resultierende unwirtschaftliche Ausfenutzung der Anlage zu vermeiden. Dementsprechend ist es vorteilhaft, ein vegetatives Inoculum in einer liährbrühenkultur herzustellen, indem man die Bouillonkultur mit einer bestimmten ilenge einer Sodenkultur oder Schrägnährbodenkultur inokuliert. Wenn auf diese ^weise ein junges aktives vegetatives Inokulum sichergestellt worden ist, wird es aseptisch in grosse befasse oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetati*ve Inokulum gebildet wird, kann das gleiche sein das für die Herstellung der neuen Verbindung verwendet wird oder kann von ihm verschieden sein, solange es 3O beschaffen ist, dass ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erhalten wird.

Die neue erfindungsgemässe Verbindung ist eine saure chemische Verbindung, die die Formel ¹M5&10**2^6 besitzt, Sie ist in einer Menge von weniger als 1 mg/ccm löslich in Wasser und Methanol, 3utanol und ähnlichen niederen Alkanolen; Aceton,' Methylethylketon, Isopropylbutylketon und ähnlichen Alkanonenj Äthylacetat, Amylacetat, Butylaoetat und¹ ähnlichen aliphatischen Estern;

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Äther und öyelohexan» Sie ist in einer '-!enge von mehr als 10 mg/ ecm löslich in wasser mit einem pH von 10 bis 12, Lomondomycin ißt in einer lien^e von mehr als 25 mg/ccm löslich in Dimethylformamid und ist sehr löslich in Aceton und Methylethylketon bei einem pH-Wert von etwa £,Ü,

Zur Isolierung und Reinigung von Lo oiidcmyein kann eine Vielzahl von Verfahren anpewend t werden, z.B. Lösungsmittelextraktion Silikagelciirumatographie, Flüsairkeits-Flüs i(jkeits-Verteilung in einer Graig-Ap'paratur und Kristallisierung aus Lösungsmitteln. Lösungsmittelextraktionsverfahren werden für eine wirtschaftliche Gewinnung bevorzugt, da sie weniger zeitraubend- und weniger kostspielig sind. Die Kristallisation aus Dimethylforamamid ist ein bevorzugtes Heinigungsverfahren₀

Bei einem bevorzugten Gewinnungsverfahren wird Lomondomycin aus seinem Kulturmedium gewonnen, indem man das Mycel und die ungelösten Peststoffe durch übliche Mittel wie z.B. Filtrieren oder Zentrifugieren abtrennt. Das Antibiotikum wird dann aus der filtrierten oder Zentrifugieren Brühe durch Extraktion entfernt» Pur die Extraktion von Lomondomycin aus der filtrierten Brühe kann ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel verwendet "werden, in dem es bei einem pH von etwa 2,0 löslich ist, wie z.B. Methyläthjrlketon, Isopropylbutylketon und ähnliche niedere Alkanone. Methyläthylketon ist das bevorzugte Lösungsmittel für die Extraktion. Der bei der Extraktion mittels Methyläthylketon erhaltene Extrakt kann im Vakuum extrahiert werden. Kristallines Lomondomycin kann aus diesem Konzentrat erhalten werden, indem man ein niederes Alkanon, vorzugsweise Aceton, zugibt und die Mischung dann in Vakuum konzentriert, bis die Kristallisierung einsetzt. Das kristalline Lomondomycin kann abfiltriert, mit V/asser gewaschen und bis zur Erreichung eines konstanten Gewichts in Vakuum getrocknet werden. Dieses Herstellungsverfahren kann in Umgebungen verwendet werden, in denen eine hohe Reinheit des Antibiotikums nicht erforderlich ist*

Das Lomondomycin kann aus dem Kulturmedium aber auch gewonnen werden, indem man das Permentlerungsfiltriat mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von etwa 4,5 einstellt und dann auf etwa 4»5⁰C

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abkühlt, um die Ausfällung zu bewirken. Der Niederschlag wird abfiltriert, wobei eine kleine Menge Diatomeenerde al3 Filtrierhilfsmittel verwendet" v/ird. Lomondomycin liegt im Niederschlag vor. Der Niederschlag wird in Wasser und Ammoniumhydroxyd bei einem pH von etwa 9»2 gelöst und die Lösung filtriert. Die wässrige Lösung wird dann gefriergetrocknet, und man erhält ein rohes Lomondomycinpräparat, das in Umgebungen verwendet werden kann, in denen ein Antibiotikum höherer Reinheit nicht erforderlich ist.

Als weitere Alternative kann man Lomatomycin aus dem Kulturmedium durch Verwendung eines stark basischen AnionenaustauBcherharzes gewinnen» Geeignete Anionaustauscherharze für diesen Zweck werden erhalten, indem man nach dem bei Kunin, "Ion Exchange Resins", 2. Auflage (1958) John Wiley and Sons, Seite 88 und 97 beschriebenen Verfahren gegebenenfalls mit Mvinylbenzol vernetztes Polystyrol chloromethyliert, das n.ich dem bei Kunin, siehe oben, Seite 84, beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und mit Triethylamin oder Dimethyläthanolamin nach dem bei Kunin, oben, Seite 97 angegebenen Verfahren quaternieslert wurde. Anionenaustauscherharze dieses Typs werden unter den Handelsnamen Dowex-1, Dowex-2, Dowex-3# Amberlite IRA-400, Duolite A-I02, und Permutit S-1 vertrieben.

Als weitere Alternative kann Lomondomycin aus dem Kulturmedium oder dem organischen Extrakt durch Adsorptlonsteohnlken gewonnen werden, wobei Adsorptionsmittel**^ Kieselsäure, Entfärbungskohle oder Entfärbungsh_arz (ein geeignete· Entfärbungsharz ist Permu'tit DR| U.S.-Patent N_r. 2 702 265), Tonerde und Jloriiil (ein synthetisches Silikat des in der U,S.-Patentschrift Nr. 2 393 625 beschriebenen und von der Floridin Company vertriebenen Typs) verwendet werden. Das adsorbierte Antibiotikum kann aus dem Adsorptionsmittel in relativ reiner Form durch Auswaschen mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel entfernt werden, z.B. mit einem der vorgenannten Lösungsmittel, in denen Lomondomycin löslich ist.

Lomodomycin hoher Reinheit kann erhalten werden, indem man tin unreines trockenes Lomo%Omycinpräparat, dag auf die vorstehend

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beüehriebene Weise erhalten wurde, Kristallisationen mittels Dimethylformamid unterwirft« Ein rohes Lomondomyoinpräparat wird in Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird durch Filtrieren geklärt» Wasser wird langsam unter IIisehen zugesetzt, bis die Kriotallisation des Lomondomycins stattfindet. Die Lomondomycinkristalle können abfiltriert» mit einer Mischung von Dimethylformamid und Wasser (511) und anschliessend mit einem niederen Alkanol, z.B. Methanol gewaschen werden. Das kristalline lomondomycin kann in Vakuum bis zur Erreichung eines konstanten Gewichts getrocknet werden» Dieses kristalline Lomondomycinpräparat kann wiederum nach dem obigen Verfahren umkristallisiert werden»

Lomondomycin hoher Reinheit kann aber auch erhalten..werden,, indem, man ein unreines trockenes Lomondomycinpräparat der Silikagelchromatographie und** Kristallisation unterwirft» wobei ein aus Methanol und Äthylacetat (6s4) zusammengesetztes Lösungsmittelsystem zur Entwicklung.:der- Kolonne verwendet wird*

Als weitere Alternative kann hochgradig reines Lomondomycin durch Umkristallisieren eines ungereinigten Lomondomycinpräparats aus Aceton und Methanol erhalten werden· Ein ungereinigtes Lomondomycinpräparat ka_nn in siedendem Aceton gelöst werden, und die Lösung kann mit einer Mineralsäure» z.B. Salzsäure* angesäuert werden. Die Lösung kann dann in Vakuum konzentriert werden. Methanol wird dann zugesetzt, um den Niederschlag zu lösen, und die Lösung wird wiederum in Vakuum konzentriert* Das Konzentrat wird dann auf etwa 60° erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die sich bildenden Lomondomycinkristalle werden abfiltriert mit Methanol gewaschen und in Vakuum bis zur Erreichung eines konstanten Gewichts getrocknet·

Salze von Lomondomycin werden gebildet» indem man die freie Lomondomycinsäure und eine anorganische oder organische Base verwendet. Die Lomondomyeinsalze können beispielsweise hergestellt werden» indem man die freie Lomondomyοinsäure in Wasser und Dimethylformamid löst, eine verdünnte Base zusetzt, bis der pH-Wert etwa 10,0 bis 11,0 beträgt» und die Lösung konzentriert und trocknet, um einen getrockneten Bückstand zu erhalten, der ·

• 909864/1000 . BADORiGiNAL

-H-

aus dem Lonondomycinsalz besteht· Herstellbare Lomondomycinsalze sind z.B. die Natrium-, Kalium- und Calciunisalze. Andere Lonrndomycinsalze einsoiiliesslich solcher mit organischen Bas on wie primären, sekundären und tertiären Monoaminen sowie mit Polyaminen können ebenfalls unter Anwendung der vorstehend bescnriebenen odor anderer üblicherweise angewendeter Verfahren hergestellt -./orden. Andere wertvolle Salze werien mit therapeutisch wirksamen Basen erhalten, die den Salzen zusätzliche therapeutische Wirkungen verleihen, derartige Basen sind beispielsweise die Purinbasen wie Theophyllin, Theobromin, Koffein oder Derivate solcher Purinbaoen} antlhistaminische Basen, die !Erstände sind, Salze rait schwachen Säuren zu bilden} Pyridinverbindungen wie ITicotinEüureanid, Isonicotinsäurehydrazid und dgl.; Phenylalkylamine wie Adrenalin, ,Ephedrin und dgl., Cholin und andere. Die Salze von Lomondomycin können für die gleichen biologischen Zwecke verwendet werden wie die freie Säu:*e,

Wie in tabelle VI gezeigt ist, weist Lomondomycin ein breites antibacterielles Spektrum auf. Das autibacterielle Spektrum wurde mittels eines Verdünnungstastverfahrens be timmt_f wobei als Medium BHI (Bregen-Hera-Infusionsbouillon, Difco, Detroit, Michigan) verwendet wurde* Testgläaer (13 mm χ 100 mm) wurden auf übliche V/eise präpariert, wie bei Snell, B.E., "Vitamin Hot ho is", Band 1, Academic Press Inc., llew York (1950), Seit'-. 327 ber-l risben ist* Zur Inokuliorung des Testmediums wurden Teatorganigmen verwendet, die 18 Stunden bei 37° kultiviert worden waren. Die Ergebnisse wurden n. ch 16 Stunder, festgestellt.

tabelle VI

Antibacterlelle Wirkung von Lomondomycin _i Y erdünnungate st

Testorganismen kleinste hemmende Konzentration . in Hikrogramm/ccm

Staphylococcus auereus 62

Streptococcus hemolyticus 62

Escherichia coli 62 -

Proteus vulgaris 125

Klebsiella pneumoniae . 62

Salmonella schottmuelleri 31

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Tabelle VI (Fortsetzung)

kleinste hemmende Konzentration in IJikrogramm/ccm

Pseudomonas aeruginosa 62 .

Bacillus subtilis " 31

Diplococcus piieum_onj__ae -jβ

Lomondomycin besitzt eine fungicide Viirkun·;,· v:ie in Tabelle VII gezeig⁴ ist. Das antifuiigische Spektrum wurde auf Platten durch Agar-Verdümiungstests bestimmt«

Tabelle VII

Ant!funkische Wirkung von Lomondomycin Testorganismus kleinste hemmende Konzentration

in Mil:rogramm/ccm

Nocardia asteroide-s 100

Elastomyees dermatlttdts 100

G-eotrichum sp_e 1000

Phialophora -verrucoaa 100

Crjrptococcus neoformans 100

Sporotrichum schenckii 100

Monosporium apiospermum 1000 Trichophyton rubrum .100

Candida albicans (Abbott) 1000

Trichophyton viola_Ceum lOO

Trichophyton asteroides 100

Trichophyton mentagrophytee 100

Die neue erfindungsgemässe Verbindung, Lomondomycin, ist wirksam gegen Bacillus subtilis und kann verwendet werden, um den durch diesen Organismus hervorgerufenen Geruch bei Fisch oder FlBchkisten su verringern oder zu verhindern. Die neue Verbindung kann als Desinfektionsmittel für verschiedene dentale und medizinische Instrumente verwendet werden, die mit Staphylococcus aureue verunreinigt sind; sie kann auch als Desinfektionsmittel für gewaschene und gestapelte Nahrungsmittel-Gerätschaften verwendet werden, die mit Staphylococcus aureus behaftet sind· Da

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Lo.'iiondomycin gegen Cryptococcus neoforninns wirksam ist, kann es auch verwendet werden,· um Taubenschläge zu behandeln und damit diesen Fundus zv. bekämpfen, dr-r im Taubenmist gefunden wurde. (Journal of the American Medical Association, Band 191, Nr. 4 25· Jan.iy65f Seiten 269-274)β Die neue Verbindung gemäss vorliegender Srfindun.;· kann auch als Antifungusmittel in den Schuhoberteilen verw·:· ivi ; t werden, die in dom U.S.—Patent ir. 3 130 "foscnrieben sind.,,

Die folgenden I'sispiele erläutern die Produkte gemäss vorliegender Erfindung und ö-\r> Verfahren zu ihrer Herstellung, stellen jedoch keine Ein: -y ränkung dar. Alle Prozentsätze beziehen eich -5uf das Gewicht und alle Mengenverhältnisse in Lösungsmittelmischungen tezieiei'. sich auf das Volumen, sofern nichtB Anderes ist.

.Beispiel 1

A) FermentieruneC.

Ein Stamm einer Boier.kultur von Streptomyces lomondensis var. lomcndensic YJIPJj 3252 wurde zur Inokulierung einer Reihe von 500 ccm-Erlenmeyerkcl".;en verwendet, die jeweils 100 ecm steriles Impfmedium folgender "itstandteile enthielten:

Glucosemonohydrat 25 g/Liter

Pharmamedia ⁺⁾ 25 g/Liter

-5

Leitungswasser q.s. 1 Liter

Der pH-Werte vor dem Sterilisieren wird mit wässrigem Natriumhydroxyd auf 7_t2- eir.gestellt.

+) Pharmamedia ist ein Baumwollsamenmehl industrieller Reinheit, das von der Trader's CiI Mill Company, Fort Worth, Texas hergestellt wird..

Die leiben wurden bei 28°C 72 Stunden lang auf einer Gump-Rotatiaai schüttelvorrichtung inkubiert, die mit 250 Umdrehungen/Minute •lief.

Bin Teil des γρν^βρ.βτΛ, beschriebenen Inhalts eines Impfkolbens {ξ> ecm) wurde ■yjerw^r.Jet, um jeweils eine., einer -^eihe von 500 com "

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--17 —

fassenden Erlenmeyerkolben zu inokulieren, die Jeweils 100 ecm steriles Fermentationsmedium aus den folgenden- Beatandteilen enthielten:

Baumwollsamenmehl 20 g/Liter

G-lukosemonohydrat 20 g/Liter

Dextrin 20 g/Liter

(NH₄^SO₄ 1 g/Liter

Calciumcarbonat 4 g/Liter

Leitungswasser Rest

Der pH-Wert vor der Sterilisierung wurde mit wässrigem tfatrium— hydroxyd auf 7,2 eingestellt. Die Fermentierun£3kolben wurden "bei 2ö°C 120 Stunden auf einer Guinp-Rotationssehüttelvcrrichtung inkubiert, die mit 250 Umdrehungen/Minute lief, liach 48 Stunden ergab die Untersuchung einer typischen Fermentierungsbrühe 3,5 Bioeinheiten Lomondomycin; nach 72 Stunden wurden 4,9 Bioeinheiten Lomondomycin festgestellt,, nach 96 Stunden ergab die Fermentationsbrühe 6,0 Bioeinheiten Lomondomycin, und nach 120 Stunden wurden in der Fermentationsbrühe 4,8 Bioeiriheiten Lomondomycin festgestellt. Die "Versuche wurden gegen den Mikroorganismus Penicillium oxalicum durchgeführte P. oxalicum wurde 72 Stunden lang bei 24°0 auf einer linear bewegten Schüttelvorrichtung in dem folgenden Medium kultiviert: Malzextrakt (Difeo) 20 gf Pepton (Difco) 1,0 g; Dextrose 2ü g; entionisiertes Wasser 1 Liter,

Das für den Test verwendete Agar wurde hergestellt, inden man der vorstehend beschriebenen Bouillon 20 g Agar pro Liter zusetzte; und diese Mischung wurde durch Mischen in einem Mischer mit 15 ecm der Brühenkultur pro Liter Agarmedium inokuliert, Testproben wurden serienmässig in destilliertem Wasser verdünnt. Die Platten wurden bei .28⁰C für die Dauer von 18 Stunden inkubiert» Eine Bioeinheit ist die Menge Antibiotikum, die gelöst in 0,08 ecu der Testlösung und" auf eine Seheibe von 12,7 mm aufgebracht, eine Hemffiungszone von 20 mm ergibt,

Da3 gesamte Bier (1640 ecm) einer Lomondomycinfermentatiöri nach vorstehender Beschreibung wurde mit 5 f^a Diatomeenerde gemischt

SQ9--&-&4-/18-38

. . s - ^ Eau OR101NAL

und filtriert. ±>er Luchen wurde mit 200 com Wasser few-ecr.en und mi*; .'em geklärten Bier (144Ö ccin) vereinigt« -^ine büstir-ii.-.te weilte des klaren Biers und der V/aschfi'ia.iirkeit (95- oci··.} wurie mit Schwefelsäure n._uf einen pii-\vert vor. d_t.< einniste". :r ur.-i p.it 950 ocra Kethyläthylketon v-?riii c?it. Die Lösun.'>Tiit ⁺ elphnsen wurden abgetrennt und die wässrige Phase (13ÜO ecm) wu/de v;e^'geschüttet, -üer I^v:stj'.yläthylketon-Üxtrril<t v/urae in Tuicuum auf ein Volumen von 20 ecm konzentriert. Aceton (oO con,; --;urde zuges-itzt, und die --iisoliung wurde in Vakuum kcnrjeritrLert, bis die Kristallisation des Lomondomycin begann- Die Aristalline .■ilti.'.ung vurte über i-rioht im Ku .Isci.rank 3t.;eä;ellt» x.ristallines Lonondorr.ycin wurde abfiltriei't, mit 10 oc:n V/asser rev;aschen urd in Vakuum bis ; zur -Erreichung· eines konstanten ^ev/iohts 2^e^^r"^GiC:i:ie'"i ^.i^e Ausbeute waren 198 mg, deren Untersuchung 8,0 Bio einheit en/ng ge;:en den MIi=.ro Organismus Esoherichia ocli ergab,

E. coli würde 18-20 Stunden br;i 37 0 auf der linear bewegten Schüttelvorrichtung in folgen-ien synthetischen ---ed ium .-eil K₂HPo₄, 7,o g; KK₂Pc₄ 3,0 e; MgSC₄.7H₂O 0,1 g; (:;h₄)₂sc₄ 1,0 g; Ha-Citrat 1,0 g; Glucose 2,0 ■=·; destilliertes «asser 1 Liter.

Das für den Test verwendete synthetische Agar wu."de hergestellt, indem man dieser synthetischen urühe weiter 15g Agar pro Liter zusetzte, und diese -Cisahurig wurde mit 0,3 ecm der Kultur pro 100 ecm des Agamedluras geeimpft. Testproben wurden serien— massig in ü,1 m Phosphat-Puffer mit einem pH von 7,85 verdünnt. Die Platten wurden bei 32⁰C während 1B Stunden inkubiert. Eine Bioeinneit ist die Menge Antibiotikum, die gelöst in 0,08 ecm der Testlösung und auf eine 12,7 mm Scheibe aufgebracht, eine Eemmungszone vcn 2C mm ergibt.

C) Reinigung

Ein rohes kristallines Lomondomycinpräparat (10 g) wurde in 400 ecm Dimethylformamid"bei --aumtemperatur gelöst und durch Filtrieren geklärt. Nasser (60 scm j wurde langsam (während 15 Minuten) zugesetzt, wobei das Lomondomycin gemischt wurde. Das ilischen wurde weitere 15 bis 20 I-Iinuten fortgesetzt^ bis die Kristallisation (Stäbchen) einsetzte. Die !--iaehung wurde 12 stunden

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im Lülilijchrmk "t^estellt. Die Lomondomycinkristalle wurden abfiltriert und nit «inem '^emiBcli vor. Dimethylformamid und Wasser (ii:1) Uni rii.rc'.liesjejid mit :.ethanol gev/psohen» Das kristalline Lomondomycin vmrde im Vakuum bis _sur ErEielunr; eines konstanten ü-ewients f-etrocicnet; die Auet^ute betrug 7»24 g· Dieses kristalline !'"räparat wurie wiederum nach dem obigen Verfahren umkristallisiert, wobei 5 »67 g lcmrjni-.'mycinkristalle anfielen.

Beispiel 2 Kaliumsalz de-

i ·ΰ.χ dem Verfahren des 3eibp^:e:" 1 'ur-r. es¹ elites lorn-T.iomycin (^»5 g) v.'urae ir. Wasser suspencii rt_f ui.a aer '!i.;o;.uar:· vurden 17ö m_fj kaliuffihj-'irnxyd, gelöst in 2 ecm '»ascer, sugesetsto Das Heaktionsgefäss v?urde gekühlt, v»\ rauf *"s i-aliunsals voii LonQndc mycin kristallisierte. D±ß i.ristalle wurden abfiltriert und in Vakuum getrocknet.

BAD ORIGINAL 909884/1808

Claims (11)

PATENTANSPRÜCHE.«

1. Ph'jrmazeutiGches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daae es pro ecm mindestens 3,5 Bioeinheiten Lomondomycin entspricht, einer Verbindung, die

(a) d^r^s Wachstum verncüiedener gramnegativer und grampositiver Bakterien sowie Fungi henratj und in ihrer im wesentlichen reinen kristallinen Forme

(b) löslich ist in Dimethylformamid, relativ löslich ist in Wasser bei einem pH-Wert von etwa 10—12, und sehr löslich ist in Aceton und ^ethyläthylketon bei einem pH-Wert von etwa 2,0;

(c) folgende Elementaranaiyge^!

C# 56,89; H# 3,35; N# 8,90; 0% 30,20 und

(d) ein Molekulargewicht von 3H, bestimmt mit dem Massenspektrometer, sowie

(e) ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum aufweist, wie es in Fig. 1 der beigefügten Zeichnung gezeigt istj und

(f) ein charakteristisches Papierchromatogramm gemäss Fig.'2 der beigefügten Zeichnung besitzt.

2. Pharmazeutisches Präparat gemäss Anspruch 1 in trockener Form, das mindestens 8,0 Bioeinheiten/mg bei dem Escherichia coli-Test aufweist.

3. Lomondomycin·gemäss Anspruch 1 in ihrer im wesentlichen reinen Form.

4. Lomondomycin gemäss Anspruch 1 in ihrer im wesentlichen reinen kristallinen Fom.

5. Lomondomycin gem-äss Anspruch 1 und deren Salze mit Alkalimetallen, Erdalkalimetallen-oder Aminen.

6. Pharmazeutisches Präparat gemäss Anspruch 1 in Form seines

Kaliumsalzese

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7. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 1 definierten Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Lomondomycin-.bildenden Organismus in einem wässrigen Kährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis dem Medium durch die Bildung/von Lomondomycin eine wesentliche Wirksamkeit verliehen ist^. und •Lomondomycin aus dem Kulturmedium isoliert« ; τ;. -· ' -

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomycea lomondensis var» lomondenais in einem wässrigen Nährmediura unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis dem Medium durch die Bildung von Lomondomycin eine wesentliche Aktivität verliehen wird. - ^: ' ■ '

9· Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces lomondensis var. lomondensis in einem wässrigen Mthrniedium, das eine Quelle von assimilier tar en Kohlehydraten und assimilierbarem Stickstoff enthält, unter aerofcen Bedingungen kultiviert, bis dem Medium durch die Bildung von Lomondomycin eine wesentliche Wirksamkeit verliehen ist, und das so gebildete Lomondomycin isoliert. .

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung das Filtrieren des Kediums, die Extraktion des erhaltenen Filtrats mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Lomondomycin und die Gewinnung von. Lomondomycin aus dem Lösungsmittelextrakt umfasst·

11. Lomondomycin,

Mir Tim UPJOHJi

Ealamazoo (Mic±iigan_r VStA)

BAD ORIGINAL Hechtsanwalt