PL98223B1 - Fermentacyjny sposob wytwarzania linkomycyny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest fermentacyjny spo¬ sób wytwarzania linkomycyny, antybiotyku po¬ wstajacego w wyniku hodowli mikroorganizmów Streptomyces vellosus.Antybiotyk linkomycyna, znany dawniej jako linkolnensyna moze byc wytwarzany przez mi¬ kroorganizm S. lincolnensis var. lincolnensis NRRL 2936, jak podano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 086 912. W wyzej wymienio¬ nym opisie patentowym podany zakres tempera¬ tur inkubacji dla wytwarzania linkomycyny wy¬ nosi 18—40°C, korzystnie 26D—30°C. Wytwarzany równiez podczas fermentacji linkomycynowej zwia¬ zek, znany jest jako linkomycyna B. Chociaz lin¬ komycyna i linkomycyna B zasadniczo sa aktyw¬ ne w tym samym zakresie mikroorganizmów, to wiadomo, ze linkomycyna B jest zdecydowanie mniej aktywna, niz linkomycyna. Odpowiednio wiec z tych dwóch linkomycyna jest preferowa¬ nym antybiotykiem.W prowadzeniu powyzszej fermentacji, konieczne jest uzycie w wiekszosci instalacji fermentacyj¬ nych duzej ilosci wody chlodzacej, aby utrzymac wymagana temperature fermentacji. Ponadto, utrzymywanie temperatury w zakresie od 18°— —40°C, chociaz sprzyja zasadniczo wytwarzaniu antybiotyku wyzej wymienionego, sprzyja tez roz¬ wojowi i rozmnazaniu sie mikroorganizmów, za¬ nieczyszczajacych kadz fermentacyjna.Przedmiotem wynalazku jest fermentacyjny spo- sób wytwarzania linkomycyny przez nowy mikro¬ organizm Streptomyces vellosus var. yellosus NRRL 8037, w zakresie temperatur 18°—45°C.Stwierdzono nieoczekiwanie, ze miano linkomy¬ cyny, wytwarzanej w temperaturze 45°C, jest po¬ równywalne z mianem linkomycyny, wytwarzanej w temperaturze 28DC. Aktywnosci linkomycyny, wytwarzanej wedlug wynalazku w temperaturach 28° i 45 DC, wobec mikroorganizmów pokazano w tablicy 1. Rozmiary stref zahamowania podane sa w milimetrach. Test jest standardowa próba mi¬ krobiologiczna krazkowa na 13 mm-owych kraz¬ kach papierowych.Tablica 1 Organizm Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Sarcina lutea Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Salmonella schottmuelleri Mycobacterium avium | Penicillium oxalicum 28°C 21 22 31 0 0 0 22 0 45°C 18 24 29 0 0 0 f 0 | Wyniki, pokazane w tablicy 1 sa nieoczekiwane, 80 poniewaz nasze testy wskazywaly, ze S. lincol- 98 22398 223 nensis var. lincolnensis NRRL 2936 nie wytwarza linkomycyny przy hodowli w temperaturze okolo 45°C.Wyrazna przewage stosowania tego mikroorga¬ nizmu do wytwarzania linkomycyny jest mniej¬ sze zapotrzebowanie na chlodzenie fermentacyj¬ nej kadzi. Mniejsze zapotrzebowanie na chlodze¬ nie jest szczególnie wazne w regionach o gora¬ cym klimacie i na obszarach, majacych limitowane zaopatrzenie w wode, poniewaz woda jest glów¬ nym srodkiem, uzywanym do chlodzenia i utrzy¬ mywania temperatur fermentacji. Dalsza wyrazna przewaga sposobu wedlug wynalazku jest wytwa¬ rzanie linkomycyny bez jednoczesnego wytwarza¬ nia linkomycyny B. f. Nowym promieniowcem uzytym w sposobie we¬ dlug wynalazku do wytwarzania linkomycyny jest Streptomyces vellpsus. Jedna z glównych jego wla¬ sciwosci jest ^wytwarzanie linkomycyny bez jedno¬ czesnego^ wytwarzania linkomycyny B. Inna z glównych wlasciwosci jest wytwarzanie linkomy¬ cyny o porównywalnych mianach w temperaturze 28DC i 45°C. Hodowle wtórna tego zywego orga¬ nizmu mozna otrzymac na zadanie ze stalego zbio¬ ru z Northern Regional Research Laboratories, Agricultiural Research Services, U.S. Departament of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. W skladnicy tej ma ona numer kolejny NRRL 8037.Mikroorganizm, uzyty w sposobie wedlug wy¬ nalazku, zostal zbadany i opisany przez Alme Dietz z Upjohn Research Laboratory.Odporny na temperature gatunek Streptomyces, wyizolowany z gleby Arizony, wytwarza antybio¬ tyk linkomycyne. Hodowla jest latwo odróznial- na od innych wytwórców linkomycyny, jak mozna stwierdzic na podstawie tablicy 5. Wlasciwosci odpornosci na temperature, mikroskopowe bada¬ nia dlugosci, proste lancuchy zarodnikowe zawi¬ niete na koncu, zarodniki z drugimi kolcami i wloskami i charakterystyczna zdolnosc wytwa¬ rzania antybiotyku przez Streptomyces vellosus nie sa opisane dla zadnego z gatunków Strepto¬ myces o niebiesko-szarej barwie zarodników w przewaznie cytowanych najwazniejszych publika¬ cjach klasyfikujacych Streptomyces: Hiittera (R.Hutter. 1967. Systematic der Streptomyceten unter besondere Beriicksichtigung der von ihnen gebil- deten Antibiotica; S. Karger, Basel), Krasilnikowa N. A. Krasilnikov i inni. 1966. Biology of Anti- biotic-Producing Actinomycetes. Akademia Nauk ZSRR. Wydane przez Ya. I. Rautenstein. Publi¬ kacja dla U.S Departament of Agriculture i Na¬ tional Science Foundation, Washington, D.C. przy Israel Program for Scientific Translations), Kutz- nera (H. J. Kuztner. 1956. Beitrag zur Systematik und Okologie der Gattung Streptomyces Waksm. et Henrici Diss. Landw. Hochst. Hohenheim), Prid- hama i innych (T, G. Pridham, C. W. Hasseltine i R. Gr, Benedict. 1958. A quide for the classifi¬ cation of streptornycetes according to selected groups. Placement of strains in morphological sec- tions, Applied Microbiol, 6: 52—79), Shirlinga i Gottlieba (E. B. Shirljng i D. Gottlieb. 1968.Cooperative description of type cultures of Strep- 45 50 55 63 tomyces II. Species description from first study.Int. J. of Syst. Bacteriol. 18, 69—189, E. B. Shir- ling and D. Gottlieb 1968. Cooperative description of type Cultures Streptomyces III. Additional spe¬ cies description from first and second studies.Int. J. of Syst. Bacteriol 18: 279—392; E. B. Shir- Jing i D. Gottlieb 1969. Cooperative description of type cultures of Streptomyces IV. Species des¬ cription from the second, third smd fourth stu¬ dies. Int. J. of Syst. Bacteriol. 19: 391—512; oraz E. B. Shirling i D. Gottlieb. 1972. Cooperative description of type strains of Streptomyces V. Ad¬ ditional descriptions, Int. J. of Syst. Bacteriol. 22: 265—394), Trejo (W. H. Trejo i R. E. Bennett. 1963.Streptomyces species comprising the blue-spore se- ries J. Bacteriol. 85: 676—690) czy Waksmana (S. A. Waksman. 1961. The Actinomycetes, vol 2, Classification, identyfication and descriptions of genera and species. The Williams and Wilkns Co., Baltimore). Dlatego zaproponowano, aby te kul¬ ture nazywac Streptomyces vellosus Dietz sp.n. i aby ten gatunek nazywac rodzajem Streptomy¬ ces vellosus var. vellosus. Nazwy gatunku i ro¬ dzaju utworzono zgodnie z regulami, przedstawio¬ nymi w Miedzynarodowym Kodzie Nazewnictwa Bakterii (International Code of Nomenclature of Bacteria. 1966). Wydanym przez Editorial Board of the Judicial Commission of the International Commitee on Nomenclature of Bacteria. Int. J.Syst. Bacteriol. 16: 459—490).Streptomyces vellosus Dietz, sp.n.Barwa. Wzrost powietrzny niebiesko-szary do szarego. Melanin-Dodatnia. Barwa na Ektachromie (A. Dietz. 1954, Ektachrome transparencies as aids in actinomycete classification. Ann. N. Y. Acad.Sci. 68: 152—154) jest podane w tablicy 2. Odno¬ sne dane o barwie sa podane w tablicy 3. Strep¬ tomyces vellosus moze byc umieszczony w niebie¬ skiej (B) i bialej (W) w seriach barw Tresnera i Backusa (H. D. Tresner i E. J. Backus. 1962.System of color wheels for Streptomycete taxo- nomy. Applied Microbiol. 11: 335—338).Obraz mikroskopowy. Dlugie lancuchy zarodni¬ kowe, proste z przylegajacym lub odchylonym za¬ winieciem na koncu. Lancuchy zarodnikowe spi¬ ralne (S) wedlug definicji Pridhama i in. (T. G.Pridham, C. W. Hasseltine i R. G. Benedict. 1958.A auide for the classification of streptornycetes according to selected groups. Placement of strains in morphological sections. Applied Microbiol: 6 52—79). Zarodniki duze, przewaznie owalne. Po¬ wierzchnia zarodników przybrana dlugimi kolca¬ mi i wloskami. Owlosienie powierzchni zarodni¬ ków wedlug definicji Dietz i Mathews'a (A. Dietz i J. Mathews. 1971. Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups. Appl. Microbiol. 21: 527—533).Hodowla i wlasciwosci biochemiczne. Patrz ta¬ blica 4.Wykorzystanie wegla. Wzrost S. vellosus na zwiazkach wegla byl zdeterminowany uzyciem syntetycznych pozywek Pridhama i Gottlieba (T. G.Pridham i D. Gottlieb. 1948. The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as98 223 6 an aid for species determination. J. Bacteriol. 56: 107—114) oraz Shirlinga i Gottlieba (E. B. Shirling i D. Gottlieb. 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. Int. J. of Syst. Bacteriol. 16: 313—340). W formerze hodowla wykazala slady wzrostu na próbach (podstawowa pozywka bez zwiazku wegla) dulcytu, D-sorbitu szczawianu so¬ dowego i winianu sodowego; umiarkowany wzrost na octanie sodowym, cytrynianie sodowym i bursz- tynianie sodowym; dobry wzrost na D-ksylozie, L-arabinozie, ramnozie, D-fruktozie, D-galaktozie, D-glikozie, D-mannozie, maltozie, sacharozie, lak¬ tozie, celobiozie, rafinozie, dekstrynie, inulinie, skrobi rozpuszczalnej, glicerynie, D-mannicie i ino- zycie.Hodowla nie rosla na salicynie, fenolu, krezolu, mrówczanie sodowym i salicylanie sodowym. Na pozywce Shirlinga i Gottlieba hodowla rosla nie¬ znacznie na ujemnej próbie (podstawowa pozywka bez zwiazku wegla) i dobrze na dodatniej próbie (podstawowa pozywka z D-glikoza). Wzrost byl taki sam lub lepszy, od wzrostu na podstawowej pozywce z dodatkiem glikozy, na D-ksylozie, inno- zycie, D-mannicie, ramnozie i rafinozie. Wzrost byl zdecydowanie lepszy niz wzrost na próbie ujemnej, nie mniejszej od wzrostu na D-glikozie z dodatkiem L-arabinozy, sacharozy i D-fruktozy, wzrost na celulozie byl watpliwy.Temperatura. S. vellosus jest promieniowcem od- pornym na temperature. Rosnie on dobrze w tem¬ peraturach 18—55°C. Optymalny wzrost nastepuje w temperaturze 28—37° w ciagu 10—14 dni; w temperaturze 45 DC w ciagu 48 godzin.Wlasciwosci wytwarzania antybiotyku. S. vello- sus wytwarza antybiotyk linkomycyne.Pochodzenie: gleba z Arizony.Hodowla: Streptomyces vellosus Dietz sp.n.NRRL 8037.Rodzaj: Streptomyces vellosus var. vellosus NRRL 8037.Tablica 2 Wyglad Streptomyces vellosus na Ektrachromie*) Pozywka agarowa Bennett'a Sacharoza Czapek'a Maltoza-trypton Peton-zelazo 0,1% Tyrozyna Kazeina-skrobia Powierzchnia szara sladowo-szara — — sladowo-nie- biesko-szara niebiesko-szara Spód brazowo-bru- natny zólto-brazowy brunatny brunatny brunatny brazowo-bru- natny | *) A. Dietz. 1954, Ektachrome tranparencies as aids in actinomycete classification. Ann. N.Y. Acad. Sci. 60: 152—154.Tablica 3 Wykaz barw Streptomyecs vellosus Pozywka agarowa i Bennetfa Sacharoza Czapek'a Maltoza -trypton Hickey'a -Tresnera Ekstrakt drozdzowy ^ekstrakt sloodwy Miejsce 2 S R P S R S R P S R P S S R Zabarwienie wedlug Color Harmony Manual 3-cie wyd. 1948 3 ba (g) do 5 ba 3 gc 3 ie 3 cb 3 ec ba 31 g 3 ie ba do 3 cb 31 g 31 e ba do 2 ba 3 b niebieski do jasnorózo- wego jasnobrazowy kamei, cukier klonowy brazowy piaskowy porcelanowy, jasnobezo¬ wy jasnorózowy ceglasto-brunatny, cynamonowo-brunatny, jasnobrunatny kamei, cukier, klonowy, brazowy niebieski do piaskowego ceglasto-brunatny, cynamonowo-brunatny, jasnobrunatny cynamonowo, zólto-klonowy niebieski do perlowego, barwa muszli Zabarwienie wedlug NBS Circular ddj 1955**) 4 184 m 189 gm 9 m 76 gm 76 m 77 g — 79 gm 90 9 77 gm 76 m 77 g 184 m 189 gm 77 m 74 g 76 m 184 m 189 gm 92 gm 74 g 76 m bardzo blado-niebieski niebiesko-bialy rózowo-bialy jasno zólto-brunatny jasno zólto-brunatny umiarkowany zólto-bru¬ natny jasny szaro-zólto-bru- natny szaro-zólty rózowo-bialy umiarkowany zólto-bru¬ natny jasny zólto-brunatny umiarkowany zólto-bru¬ natny bardzo blado niebieski niebiesko-bialy umiarkowany zólto-bru¬ natny silny zólto-brunatny jasno zólto-brunatny bardzo blado-niebieski niebiesko-bialy [ zólto-bialy 1 silny zólto-brunatny 1 jasny zólto-brunatny |9&223 7 8 dalszy ciag tablicy 3 1 1 (BSP-2) Maka owsiana . (LSP-3) Sole nieorganiczne- -skrobia 1 (ISP-4) ; Gliceryna - asparagi- na (ISP-5) 2 P S R P S R P S R P 1 3 31 e cb 2 gc 19 dc 2 fb — 1'5 ba 2 fb blekitny bambusowo-irchowy wodno szary bambusowy, jasnozólty slomkowy, pszeniczny niebieski bambusowy, jasnozólty slomkowy, pszeniczny 4 | 74 g 76 m ; 184 m 190 g 90 gm 149 g 190 m 87 g 89 m — 184 m. 189 gm 87 g 89 m silny zólto-brunatny jasny zólto-brunatny bardzo bialo niebieski jasny niebiesko-szary szaro-zólty bladozielony jasno niebiesko-szary umiarkowanie zólty 1 bladozólty bardzo blado niebieski niebiesko-bialy umiarkowanie zólty blado-zólty 1 S = powierzchnia (g) = wszystkie dla blyszczacej powierzchni barwnego skrawka R =spód g = blyszczaca powierzchnia barwnego skrawka P = pigment m = matowa powierzchnia barwnego skrawka gm = blyszczaca lub matowa, powierzchnia barwnego skrawka •) — E. Jacobson, W.C. Granvikle i CE. Foss. 1948. Color harmony manual, 3-cie wyd. Container Corporation of America, Chicago, Illionois.**) — K.L. Kelly i D.B. Judd. 1955. Tn« ISCO — NBS method of designating colors and a dictionary of colors name U.S. Dept. Comm. Circ. 553, Tablica 4 Hodowla i wlasciwosci biochemiczne Streptomyces vellosus Pozywka | 1 Pozywka agarowa Pepton — zelazo Jablczan wapnia Glikoza — asparagina Mleko zbierane Tyrozyna Ksantyna Pozywka skrobiowa Ekstrakt-drozdzowy Ekstrakt4 slodowy Bennett'a Sacharoza Czapek'a< | Powierzchnia (wzrost powietrzny) 2 zadne w 28°C szara w 45 °C sladowobiala blado-rózowo-biala sladowo-szara w 28°C zadne w 45°C sladowo-Bzara w 28°C jasnoszara w 45°C zadne w 28°C • rózowo-biala w 45°C Zadna- w 28°C • Rózowo-biala w 45°C ; Rózowo-biala (wiecej w 45°C) '¦ Bladb^niebiesko*biala • Bladb.4cromowo-rózowa Spód 3 Brunatny Bezbarwny Kremowy w 28°C Oliwkowy w 45 °C Brazowo-Brunatny Brunatny w 28°C Brazowy w 45°C Zólty Zólto-brazowy w 28?C Zólty w 4S°C * Czerwono-brazowy w 28°C . Bryzowy w 45°C Brazowy, Zólty Inne wlasciwosci 4 | Brunatny pigment melanina-dodatnia Brak pigmentu Jablczan nierozpuszczony Zólty pigment w 28°C Brak pigmentu w 45°C Brazowo-brunatny pigment Kazeina nierozpuszczona Brunatny pigment w 28°C Brazowy pigment w 45°C Tyrozyna rozpuszczona w 28°G Tyrozyna rozpuszczona podczas 1 wzrostu w 45°C Zólty pigment i Ksantyna nierozpuszczona i Zólto-rózowy pigment w 28°C 1 Zólty pigment w 45°C | Skrobia niezHydrolizowana f 1 Czerwono-brazowy pigment w 28°C { i Brazowy pigment w 45°C i Brazowy pigment i Zólty pigment 19S223 9 W dalszy ciag tablicy 4 1 * Maltoza-trypton Hickey'a-Tresnera Pepton-ekstrakt drozdzowy-zelazo (ISP-6) Tyrozyna (ISP-7) Pozywki zelatynowe Bezbarwna Odzywka Pozywki bulionowe Syntetyczny azotan Odzywka azotowana Mleko lakmusowe 1 2 Blado-niebiesko-biala Blado-niebiesko-biala Zadne Rózowo-biala -- Bialo-szary wzrost powietrzny na powierzchni krazka \ 3 Brunatny Pomaranczowo- -brazowy Brunatny Brunatny — — 1 ^ 1 Brunatny pigment Jasnobrazowy pigment Brunatny pigment Melanina dodatnia Brunatny pigment Melanina dodatnia Brunatny pigment na powierzchni Oliwkowy pigment wewnatrz Nie rozpuszcza podloza Brunatny pigment na: powierzchni 1 Brazowy pigment wewnatrz | Nie rozpuszcza podloza | — 2 rurki 1 Siady rozpuszczania — 2 rurki Bezbarwny wzrost wegetatyw¬ ny wewnatrz bulionu i na podstawie Brak pigmentu Azotan nieredukowany do * azotynu 1 Bezbrawny gesty gruntowy 1 wzrost Zólty pigment Azotan nieredukowany do azotynu Brunatny pigment Lakmus redukowany pH=6,8 Tablica 5 Porównanie Streptomyc.es vellosus z innymi wytwórcami linkomycyny - 1 Grzybnia powietrzna Próba melaninowa Lancuchy zarodnikowe Zarodniki Powierzchnia zarodników Agar wapniowo-jablczano- wy . Zbierane mleka — agar Tyrozyna Ksantyna Odzywka skrobiowa S. vellosus NRRL 8037 2 Niebiesko-szara do szarej Dodatnia Spiralne (S) bardzo dlu¬ gie i zawiniete na koncu Kuliste Dlugie kolce i wloski Jablczan nierozpuszczany Kazeina nierozpuszczana nierozpuszczana nierozpuszczana skrobia niezhydrolizowana S. lincolnensis NRRL 2936 3 Kremowa do rózowej, lub szarej Dodatnia Dlugie faliste (RF) Prostokatne Gladka z detalami na powierzchni Jablczan nierozpuszczany Kazeina nierozpuszczana nierozpuszczana , nierozpuszczana dookola wzrostu . skrobia zhydrolizowana S. espinosus NRRL 3890 | 4 ] Szaro-zielona Ujemna Krótkie^proste, lub faliste lub otwarta ] spirala (RF, RA) — krótkie . Kuliste Ciernista lub kolczasta przejecie do wlosków na niektórych kolcach : Jablozan nierozpuszczany ( Kazeina nierozpuszczana , nierozpuszczana^ 1 nierozpuszczana- skrobia 1 zhydrolizowana |98 223 11 12 1 Grzybnia powietrzna Próba melaninowa Lancuchy zarodnikowe Zarodniki Powierzchnia zarodników Agar wapniowo-jablcza- nowy Zbierane mleko-agar Tyrozyna Ksantyna Odzywka skrobiowa S. pseudogriseolus chemovar linmyceticus NRRL 3985 Szara do bialej lub czerwonej Ujemna Krótkie lub umiarkowanie dlugie proste (RF) lub ot¬ warta spirala (RA) lub spirala (s) Owalne lub podluzne Miejscami kolczasta lub gladka i Jablczan nierozpuszczany Kazeina rozpuszczana pod wzrostem Rozpuszczana Rozpuszczana Skrobia zhydrolizowana S. variabilis chemovar liniabilis NRRL 5618 6 Szara do bialej Ujemna Krótkie lub umiarkowanie dlugie fal- ste (RF) lub otwarta spirala (RA) Owalne lub podluzne Gladka lub slabo pokryta brodawkami lub kolczasta Jablczan rozpuszczany Kazeina rozpuszczana Rozpuszczana Rozpuszczana Skrobia zhydrolizowana dookola wzrostu Sposobem wedlug wynalazku linkomycyna jest wytwarzana przez nowy mikroorganizm w czasie hodowli mikroorganizmu na wodnej odzywce w warunkach aerobowych. Jest wiec zrozumiale, ze do organicznych ilosci moga byc zastosowane ho¬ dowle powierzchniowe i butlowe. Organizm rosnie na pozywkach, zawierajacych zródlo wegla, na przyklad przyswajalny weglowodan i zródlo azotu, na przyklad przyswajalny zwiazek azotowy lub substancje bialkowa. Zalecane zródla wegla obej¬ muja glikoze, cukier surowy, brunatny, sacharoze, gliceryne, skrobie, skrobie kukurydziana, laktoze, dekstryne, melase itp. Preferowane zródla azotu obejmuja bulion zbozowy, drozdze, autolizowane drozdze browarniane z mlekiem, make sojowa, make z nasion bawelny, make kukurydziana, mle¬ ko w proszku, trzustkowa tresc z kazeiny, pozo¬ stalosci podestylacyjne, zwierzece buliony pepto- nowe, maczke rybna, odpady miesne i kostne itp.Z korzyscia moga byc uzyte kombinacje tych zró¬ del wegla i azotu. Siady metali, na przyklad cynk, magnez, mangan, kobalt, zelazo itp. nie sa doda¬ wane, poniewaz jako komponentów pozywki uzy¬ wa sie wody wodociagowej oraz nieoczyszczalnych_ skladników.Wytwarzanie linkomycyny sposobem .wedlug przedstawionego wynalazku moze byc efektywne w temperaturze od okolo 18° do okolo 45°C, a zwlaszcza od temperatury okolo 20° do okolo 45°. Przecietnie, optimum wytwarzania linkomy¬ cyny jest uzyskiwane w ciagu dwóch do dziesie¬ ciu dni. Koncowe pH jest zalezne w czesci od obecnego buforu, jesli jest on uzyty i w czesci od poczatkowego pH pozywki hodowli.Gdy hodowla przeprowadzana jest w duzych ka¬ dziach i zbiornikach, wskazane jest raczej uzycie formy wegetatywnej niz formy zarodnikowej mi¬ kroorganizmu dla szczepienia, aby uniknac wy¬ raznego opóznienia w wytwarzaniu linkomycyny i towarzyszacego nieefektywnego wykorzystania aparatury.Odpowiednio, wskazane jest wytwarzanie wege¬ tatywnej szczepionki w hodowli na odzywce bu¬ lionowej przez zaszczepienie hodowli bulionowej wyciagiem z gleby lub odchylonej hodowli. Gdy 40 45 50 55 60 mlody, wegetatywny, aktywny material zostanie w ten sposób zabezpieczony, jest on aseptycznie przenoszony do duzych kadzi lub zbiorników. Po- zywka, na której wytwarzany jest wegetatywny material, moze byc ta sama lub rózna od pozyw-; ki, która wykorzystano do wytwarzania linkomy¬ cyny, tak dlugo, jak dlugo uzyskiwany jest dobry rozwój mikroorganizmu.Linkomycyna, wytwarzana przedstawionym spo¬ sobem, moze byc izolowana w sposób, podany* w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 086 912.W preferowanym sposobie izolowania, linkomy- cyne wyodrebnia sie z hodowli przez rozdzielenie grzybni i nierozpuszczonych czesci stalych w kon¬ wencjonalny sposób, jak np. poprzez filtracje i od¬ wirowanie. Linkomycyna jest wtedy odzyskiwana z przefiltrowanego lub odwirowanego bulionu przez przepuszczenie powyzszego bulionu przez zywice, która zawiera niejonowy makropórowaty kopoli¬ mer styrenu usieciowany dwuwinylobenzenem.Zywice tego typu sa opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 515 717. Przykladem zywicy tego typu jest.Amberlite XAD-2. Linkomy¬ cyna jest wymywana z zywicy rozpuszczalnikiem,, zawierajacym 95%: objetosciowego metanolu i 5eyV wody. Aktywne biologicznie frakcje eluatu sa ba¬ dane w- standardowych mikrobiologicznych pró¬ bach krazkowych z uzyciem mikroorganizmów Sarcina lutea. Aktywne biologicznie frakcje sa laczone, zatezane w wodnym roztworze, który jest nastepnie suszony przez wymrazanie. Wysuszony przez wymrazanie material jest potem rozcierany z chlorkiem metylenu. Ekstrakt w chlorku mety¬ lenu jest odparowywany do sucha i pozostalosc rozcierana z acetonem. Przesacz miesza sie z ete¬ rem w celu otrzymania osadu, który oddziela sie.Pozostaly przesacz miesza sie z metanolowym roz¬ tworem chlorowodoru (11^), w celu wytracenia bezbarwnego chlorowodorku linkomycyny. Osad ten oddziela sie przez filtracje i krystalizuje sie z mieszaniny woda—aceton, dajac krystaliczny chlorowodorek linkomycyny.Ponizej przedstawiony przyklad nie ogranicza sposobu wedlug wynalazku. Wszystkie udzialy sa98 223 13 procentami wagowymi i uklady wszystkich mie¬ szanek rozpuszczalników sa podawane w czesciach objetosciowych, o ile nie zaznaczono inaczej.Przyklad. Czesc A. Fermentacja w tempera¬ turze 28°C.Pochodzacy z gleby Streptomyces vellosus NRRL 8037 uzyto do zaszczepienia serii 500 ml kolb Er- lenmeyera, zawierajacych 100 ml sterylnie przy¬ rzadzonej pozywki z nastepujacych skladników: Monohydrat glikozy 25 g/litr Pharmamedia*) 25 g/litr Woda wodociagowa Róznica pH przed sterylizacja = 7,2 *) Pharmamedia jest przemyslowym gatunkiem maki z nasion bawelny produkcji Traders Oil Mili Company Fort Worth, Teksas.Hodowle prowadzono przez 3 dni w 28°C na wytrzasarce rotacyjnej.Zarodniki szczepionki wyzej opisanej uzyto do zaszczepienia serii 500 ml kolb fermentacyjnych, zawierajacych po 100 ml pozywki z nastepujacych 'skladników: Monohydrat glikozy 15 g/litr Plyn peptonowy Wilsona nr 159*) 15 g/litr Ekstrakt drozdzowy Difco**) 2,5 g/litr Woda wodociagowa Róznica pH przed sterylizacja = 6,0 *) Plyn peptonowy Wilsona nr 159 jest prepara¬ tem z hydrolizy bialek pochodzenia zwierze¬ cego.**) Dostarczony przez Difco Laboratories, Detroit, Michigan.Kolby szczepiono 5 ml szczepionek na 100 ml pozywki fermentacyjnej. Kolby potem inkubowa- no w temperaturze 28°G na wytrzasarce rotacyj¬ nej (250 obr./min., skok 6 cm). Kolby zbierano po 96 godzinach fermentacji.Czesc B. Fermentacja w temperaturze 45°C.Zebrana szczepionke opisana w czesci A uzyto do zaszczepiania serii 500-ml kolb fermentacyj¬ nych, zawierajacych po 100 ml sterylnej pozywki z nastepujacych skladników: Gliceryna 30 g/litr NZ-amina B*) 30 g/litr Ekstrakt drozdzowy Difco 2 g/litr Chloreksodu 3 g/litr Woda wodociagowa Róznica pH przed sterylizacja = 7,2 *) Pepton w postaci proszku, otrzymany z trzust¬ kowej tresci z kazeiny.Kolby szczepiono 5 ml szczepionkami na 100 ml pozywki fermentacyjnej. Kolby potem inkubowa- no w temperaturze 45°C na rotacyjnej wy¬ trzasarce (250 obr/min., skok 6 cm). Kolby zbie¬ rano po 96 godzinach fermentacji. 14 Czesc C. Wydzielanie.Linkomycyne wytworzona w fermentacjach cze¬ sci A i B wydzielono w czystej formie przez pierwsze filtrowanie cieczy fermentacyjnej przy uzyciu ziemi okrzemkowej jako wypelnienia fil¬ tru. Osad na filtrze przemywano woda, która la¬ czono z czystym przesaczem. Otrzymany filtrat nastepnie przepuszczono przez kolumne, zawiera¬ jaca zywice Amberlite XAD-2, wypelniona woda.Linkomycyne wymywano z zywicy roztworem me- tanol-woda (95*/o obj. : 5tyo obj.). Frakcje zbierano i analizowano na cienkich warstwach chromato¬ graficznych silicazelu G przy uzyciu ukladu roz¬ puszczalnikowego: keton metylo-etylowy, aceton, woda (186:52:20 czesci obj.) Aktywne frakcje laczono i zatezano do roztworów wodnych, po czym suszy sie przez wymrazanie. Sucha substan¬ cje roztarto z chlorkiem metylenu. Ekstrakt w chlorku metylenu odparowano do sucha, a nastep- nie pozostalosc roztarto z acetonem. Nierozpu¬ szczalny material oddzielono przez filtracje, a fil¬ trat mieszano z eterem. Ponownie, wytracony ma¬ terial oddzielono przez filtracje, a przesacz mie¬ szano z roztworem metanolowym chlorowodoru (IN). Uzyskany bezbarwny osad chlorowodorku linkomycyny oddzielono przez filtracje. Substan¬ cje przeprowadzono w forme krystaliczna przez krystalizacje z roztworu woda-aceton.Ilosc linkomycyny B w normalnej fermentacji Streptomyces lincolnesis rodz. lincolnensis zalezy bardzo od skladu pozywki, czasu i temperatury inkubacji, napowietrzenia itp. W normalnych wa¬ runkach pracy ilosc linkomycyny B w takiej fer¬ mentacji, bedzie wynosic od 5 do 10% calkowitej ilosci linkomycyny. Linkomycyna B jest usuwana przez powtórna rekrystalizacje produktu linko- mycynowego z odpowiednich rozpuszczalników, na przyklad z mieszaniny woda-aceton lub woda-niz- szy alkohol. Poniewaz w sposobie wedlug wyna- 40 lazku nie powstaje linkomycyna B, takie krysta¬ lizacje nie sa konieczne. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 45 1. Fermentacyjny sposób wytwarzania linkomy¬ cyny z nastepnym jej wydzieleniem z bulionu fermentacyjnego, znamienny tym, ze poddaje sie hodowli nowy Streptomyces vellosus o wlasciwo¬ sciach podanych w NRRL 8037, ewentualnie w 50 temperaturze wyzszej od pokojowej na wodnej pozywce, zawierajacej zródlo przyswajalnych we¬ glowodanów i przyswajalnego azotu, w warun¬ kach aerobowych do czasu, az pozywka ta bedzie wykazywala zasadnicza aktywnosc przeciwbakte- 55 ryjna w wyniku wytworzenia linkomycyny.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w zakresie temperatur 18— —45°C. PL