SU797591A3

SU797591A3 - Способ получени антибиотика сс-1065

Info

Publication number: SU797591A3
Application number: SU782672704A
Authority: SU
Inventors: Джеймс Ханка Ладислав; Гленн Мартин Дейвид
Original assignee: Дзе Апджон Компани (Фирма)
Priority date: 1977-10-17
Filing date: 1978-10-16
Publication date: 1981-01-15
Also published as: IT7828063A0; US4169888A; DE2841361A1; GB2008088B; FR2405956B1; FR2461001A1; CH643564A5; NL7809639A; GB2008088A; JPS5464695A; FR2405956A1; FR2461001B1

Description

(54). СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА СС-1065 галактозе, глюкозе, маннозе, мальто целлобиозе, декстрине, растворимом крахмале, глицерине, маннкге и инозите . Слабо растет на арабинозе, ок лате натри , ацетате натри и сукци нате натри . Плохо - на рамнозе, са харозе, лактозе, рацинозе, инулине, дульците, сорбите, салицине, феноле цитрате натри , формиате натри , та рате натри и салицилате натри . Культура слабо растет при , умеренно при 18, 24 и хорошо растет при 28, 32 и 37°С. При 55°С роста не наблюдаетс . Предложенный антибиотик получают путем выращивани организма в водно питательной среде в погруженных аэробных услови х. Дл вьоращивани мо использовать поверхностные культуры и колбы-бутыли. Организм выращивают в питательной среде, содержащий источник углерода, например ассимилирующийс углеводород, и источник аз та, например ассимилирующеес соеди нение азота или белковое вещество. К предпочтительным углеродным источ никам относ тс глюкоза, желтый сах сахароза, глицерин, крахмал, кукурузный крахмал, лактоза, декстрин, черньае патоки и т.п. К предпочтител ным источникам азота относ тс жидкость от отсто кукурузы, дрожжи, автолизовднные пивные дрожжи с твер дыми молочнйми продуктами, соевую муку, муку сем н хлопчатника, кукурузную мукуf твердые молочные продукты , панкреатический продукт пищеварени казеина, рыбную муку, твер дые продукты от перегонки, животные пептоновые жидкости, мелкие м сные и костные остатки и т.п. Микроколичества металлов, как цинк, магний, марганец; кобальт, железо и т.п., добавл ть в ферментационную среду не нужно,поскольку перед стерилизацией поелейней в качеству компонен тов примен ют водопрподную воду и неочиценные ингредиенты. Выращивание осуществл ют при любой температуре, обеспечивающей удов летворительный рост ми1кроорганиэма, например в диапазоне примерно 1840°С , предпочтительно примерно 2028°С . Обыкновенно оптимального количества антибиотик достигает в течение примерно через 3-15 дней. Среда обычно остаетс в течение ферментационного процесса щелочной. Конечный рН зависит частично от присутствующе го буфера,если таковой примен етс , и частично от начального рН культуральной среды. Если выращивание производ т в больших сосудах или баках, целесообразно примен ть вегетативную, а не споровую форму микроорганизма при :инокул ции во избежание заметной за держки при производстве антибиотика и св занного с этим неэффективного использовани оборудовани . Желательно получение вегетативного прививочного материала в питательной бульонной культуре путем инокул ции этой . бульонной культуры .аликвотным количеством почвы, жидкой W-агаровой среды или же разводкой на косой среде. По обеспечении такого молодого активного вегетативного прививочного материала его стерильно - помещают в большие сосуды или баки. При выделении и очистке антибиотика , получаемого предлагаемым способом из,ферментационного пива, может найти применение целый р д способов . Вьщеление осуществл ют экстрагированием с,, помощью растворителей, как хлористый метилен, ацетон, бутанол , этилацетат и T.n.j дл очистки сырых препаратов антибиотика примен ют хроматографию на силикагеле. Согласно предпочтительному варианту процесса выделени антибиотик выдел ют из культуральной среды разделением мицели и нерастйоренного твердого продукта обычными способами, например фильтрацией или центрифугированием и экстракцией растворителем мицелкевого жмыха иставшего прозрачным бульона. Мицелиевый экстрагируют ацетоном, а экстракт выпаривают при пониженном давлении до водного концентрата. Водный концентрат добавл ют в фильтрованный бульон, который затем трижды экстрагируют половиной объема хлористого метилена, Соединенные экстракты выпаривают при пониженном давлении, полученное масло разбавл ют скеллизольвом в(изомерные гексаны). Полученную взвесь охлаждают в течение ночи, после чего собирают твердый продукт, промывают скеллизольвом В и сушат,получа относительно сырой препарат(желто-коричневый твердый продукт) антибиотика СС-1065. Полученный сырой препарат антибиотика подвергают очистке, получа существенно чистый кристаллический препарат антибиотика СС-1065. Первой очистной ступенью вл етс экстракци сырого прэпарата антибиотика СС-1065 ацетоном. После выпарки ацетона полученный остаток растирают с метанолом , получа кристаллический препарат антибиотика СС-1065. Эти кристаллы можно промыть холодным метанолом с целью повышени степени их чистоты. Дальнейшую очистку антибиотика СС-1065 осуществл ют путем хроматографии на силикагеле с кристаллизацией активных фракций. Препарат антибиотика СС-1065 целевой степени чистоты получают перекристаллизацией вышеприведенного антибиотика СС-1065препарата из ацетона метанола. Активные фракции от хроматогра- , фии на силикагеле определ ют тонкослойной хроматогр)афиеи-биоавтографией

Согласно этому способу 1 мк образцапробы антибиотика помещают в виде капли на силикагель Baker flex silic gel IB-F и биоавтографируют на орга низме Bacillus subtil is (синтетическа среда)или же Sarcina lutea после про влени в растворе, состо щем из 90 ч хлороформа, 10 ч метанола и 0,5 концентрированной гидроокиси аммони ТСХ-зона антибиотика СС-1065 от 1мк или более высоких количеств кристаллического образца-пробы также можно визуализировать с помощью УФ-света (254 нм) в виде зоны нтарного света при обвдчном свете.

Пример. Ферментаци . Дл инокул ции крлб Эрленмейера емкостью в 500 мл со 100 мл стерильной среды, содержащей вес.%: Экстракт дрожжевой . О,3 Бакто-триптон0,5

Декстрин0,1

используют штамм Streptococcus 2e1ensis NRRh 11,183.

Эту среду инкубируют при в течение 48 ч на ротационном вибраторе типа Gunp rotaru shaker при 250 об./мин.

Прививочный материал примен ют дл инокул ции колб Эрленмейера емкостью 500 мл дл ферментации, со 100 мл стерчльной ферментационной средаа, содержащей вес.%:

Черна патока 1 Декстрин 1

Бакто-триптон 1 , CaCOj0,5

Хлористый натрий 0,2. Значение рН-7,2. Ферментационньта колбы инокулируют при концентрации 5 МП прививочного материала на 100мл ферментационной среды. Колбы инкубируют 120 ч при 28°С на ротационном вибраторе типа ВАРИАН при 250 об/мин Испытание антибиотика СС-1065 завершаетс экстракцией исчерпанной питательной среды с применением двух объемов хлористого метилена. Разные количества метиленхлоридного экстракта (20, 10, 5, 2 и 1 мкл)нанос т на полиграммные силикагельные листы типа Polygram Sil - N-HR и биоавтографи- руют на Sarcina lutea после про влени в системе растворителей, содержащих , мл:

Метиловый спирт10

Хлороформ90

Гидроокись аммони 0,5 дл этого 125 мл охлаиаденного до 48°С агара инокулируют отта нной бульонной культурой Sarcina lutea (0,5 мл/л), вылива затем в пластмассовые сосуды и дава отвердитель. Агаровые сосуды инкубируют при 32 С в течение 20-24 ч.

Прививочный материал Sarcina lutea , содержащий 10 клеток/мл хран т в качестве .аликвоты в газовой фазе жидкого азота.

Выделение антибиотика. Получе ный ферментационный бульок от 4-ферментационных процессов в баках по 10 л каждый фильтруют через слой Gel а ton FW 40 (диатомова земл ). Мицелиевый жмых экстрагируют ацетоном экстракт выпаривают под пониженным давлением. В прозрачный бульон добавл ют водный концентрат,полученный выше , затем трижды экстрагируют половиной объема хлористого метилена. НвтиO ленхлоридные экстракты выпаривают под пониженным давлением до масла, которое разбавл ют скеллизольвом В (1,5 л), после чего полученную взвесь охлаждают в течение ночи. Затем твер5 дый продукт собирают, промывают скеллизольвом В и сушат, получа сравнительно сырой препарат анфибиотика СС-1065 в виде желто-коричневого твердого продукта. Этот сырой пре0 парат можно подвергнуть биоиспытанию тонкослойной хроматографией-биоавтографией , как описано выше.

Очистка. Оарой препарат антибиотика СС-1065 экстрагируют ацетоном (400-800 мл) в цел х удалени не5 больших количеств нерастворимых в ацет.оне продуктов. Ацетон выпаривают , остаток растирают с метанолом (10 мл/мг). Взвесь охлавдают в течение ночи, полученный твердый крис0 таллический продукт собирают, промывают холодным метанолом и сушат, выход 40-180 мг кристаллического препарата антибиотика СС-1065. Этот кристаллический препарат подвергают

5 биоиспытанию путем ТСХ-биоавтографии на силикагеле.

Дальнейшую очистку осуществл ют . хроматографией на силикагеле и кристаллизацией активных фракций. Так,

0 например, 470 мг этого кристаллического твердого продукта раствор ют в 940 мл ацетона и выпаривают на 10 мл силикагел Geduran TMS160.

Полученный порошок хроматографируют на 100 мл силикагел , элюиру

5 растворителем, состо щим из 80 ч хлороформа , 20 ч метанола и 4 . гидроокиси аммони . 20 фракций (по 20 мл кажда ) собиргиот и выпаривают досуха. Фракции затем подвергают биоиспыта0 нию посредством ТСХ-биоавтографии. Фракции 6-19 помещают в емкость и растирают с метанолом, получа 218мг высококачественного кристаллического антибиотика СС-1065. Целевой степени

5 чистоты можно достичь перекристаллизацией из ацетона-метанола, получа 167 г (77%) в основном чистых кристаллов антибиотика СС-1065.

Молекул рный вес антибиотика СС-1065 приблизительно 700, элемен0 тный анализ С 61,06; Н 4,92,N 13Д7.

УФ-спектр поглощени . Раствор антибиотика СС-1065В.диоксане показывает сильное концевое поглощение с плечами при 230. нм(способнссть пог5

лощени ,00) и 258 нм(,10 и максимум при 364 нм(,10) .

ИК-спектр поглощени . Антибиотик СС-1бб5 показывает характерный ИКспектр поглощени в пасте на основе минерального масла в диапазоне волн 3800-600 (см.

Пики наблюдаютс при следующих диапазонах вола, 2960, 2920, 2850, 1465 и 1377 , частично они завис т от алифатических С-Н колебаний минерального масла.

Растворимость. Антибиотик СС-1065 растворим в таких, растворител х, как диметил-сульфоксид(дмсф диметилформамид , ацетон, хлористый метилен, этилацетат, дйоксан и хлороформ.

с-ЯМР-спектр антибиотика СС-1065 при 20 МГц найден на спектрометре Varlan CFT-20 в растворе (около 1,0м71 около 75 мг/мп)образца-пробы антибиотика СС-1065 в дейтеро-диметилсульфоксиде . Спектр калибруют против центральной линии d6 ДМСО, помеченной 39/6 Ч/МЯ1 (частей на миллион в пересчете на тетраметилсилан, принимаемый за О ч/мл. Частоты регистрируют вниз от тетраметилсилана.

Протонно-магиитный резонансный спектр(н-ЯМР антибиотика CC-1065 при 100 МГц наблюдают на спектрометре типа Vartan XL 100-15 в растворе (около 0,5 МП, около 150 мг/мл образца-пробы антибиотика СС-1065 в

дейтеро-диметилсульфоксиде (d6 ДМСО). Спектр калибруют против внутреннего тетраметилсилана, частоты регистрируют в ч/MJiH. вниз от тетраметилсилана

Противомикробный спектр антибиотика СС-1065. Антибиотик СС-1065 действует против различных грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий и грибов, как видно из таблицы.

Опыты провод т следующим образом.

Минимальную ингибируккдую концентрацию (мик) определ ют стандартными бактерицидными способами с применением двукратно разбавленных растворов антибиотика в бульоне Brain Heart.

Прививаемые организмы - полученные за ночь культуры испытуемых организмов , разбавленных таким образом, чтобы конечна попул ци содержала приблизительно 10 клеток/мл. Трубки инкубируют на 42 ч при 28-37°С. МИК определ ют переносом О,1 мл бульона из тех трубок, которые не показывают развити в 10 мл не содержащего антибиотика бульона, трубки, в которых за 24 ч не наблюдаетс роста культуры рассматриваютс как содержащие бактерицидные концентрации. Бульон дл грибов содержит,%:

0,5

3,0 Декстроза Дрожжевой

0,7, экстракт

Грамм-положительные бактерии Staphylococcus aureus UC 76 Staphylococcus aureus UC 552 Staphilococcusi aureus UC 70 Staphylococcus aureus UC 3665 Baci1lus sHbtilis UC 564 Streptococcus pyogenes UC 6055 Sarclna lutea UC 130 Streptococcus faecal is UC 157 Streptococcus faeca)is UC 3235

Грамм-отрицательные бактерии Escherichia col i UC 57

Proteus vulgaris UC 93

Pseubomonas aerugJnosa UC 95 Pseubomonas mildenbergii UC 3029

Salmonella gallinarum UC 265

0,0015

0,003

0,0015

0,003

0,025

0,0008

0,012

0,003

0,32

0,08

0,08 0,3

2,5

Klebsiella pneumoniae UC 57 Salmonella schottmue11eri UC 126 Salmonella pullorum UC 267

Fung i г

Candida albicans UC 1392 Saccharomyces cerenisiae UC 1337 Saccharomyces pastorianus UC 1342 PeniciIlium oxalicum UC 1268 Антибиотик CC-1065 также оказывает действие против опухолевых клеток L 1210, развивающихс в культуре (в пробирке). На живом организме мышей антибиотик СС-1065 также ингибирует лейкемию L1210, лейкемию Р 388 и меланому В 16. Антибиотик СС-1065 оказывает действие против грамм-положительных бак терий, например против Proteus vulga г i s, и тем самым может найти применение в качестве маслоконсервирующего .средства в цел х ингибировани де стви этой бактерии, вызывающей порч масла(растительного. Он также полезен в промывных растворах в области санитарии. Поскольку антибиотик СС-1065 оказывает действие против Bacillus subtilis его можно примен т дл обработки мест размножени тутового шелкопр да в цел х предупрежде:ни или же минимализации заражений.

Продолжение таблицы .. „

0,8 0,3 0,08

Claims

0,3 0,04 0,3 0,2 вызываемых, как известно, этой бактерией . Предложенный способ позвол ет получить новый антибиотик, который найдет применение в народном хоз йстве. Формула изобретени Способ получени антибиотика, о тлич .ающийс тем, что Streptomyces zelensis 11,183 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в аэробных услови х, отдел ют мицелий от культуральной жидкости, далее мицелий экстрагируют ацетоном, полученный экстракт концентрируют, объедин ют о отделенной культуральной жидкостью и полученную смесь многократно экстрагируют хлористым метиленом .