DE3238316A1 - Antibakterielle mittel ll-c23024(alpha),ss und jota und mikroorganismus antinomadura yumaense nrrl 12515 - Google Patents

Description

Antibakterielle Mittel LL-C23ö24a, ß und jota und Mikroorganismus Actinomadura yumaense NRRL 12515

Die vorliegende Erfindung betrifft antibakterielle Mittel und Anticoccidia-Mittel, die mit LL-C23024<x, ß und jota bezeichnet sind, sowie einen neuen Mikroorganismus Actinomadura yumaense sp. nov. oder Mutanten desselben.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein neues Verfahren zur Herstellung von antibiotischem LL-C23024oc, β und jota durch Fermentierung des neuen Mikroorganismus Actinomadura yumaense sp. nov. unter kontrollierten Bedingungen.

Das Antibiotikum LL-C23024oc hat folgende Struktur

QMe

COOH

Das Antibiotikum LL-C23O24ß gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von bekannten Verbindungen aufgrund seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften, u.a. durch seine Mikroanalyse, seine optische Rotation, sein IR-Spektrum, sein ¹^C-NMR-Spektrum und sein ¹H-NMR-spektrum.

Das Antibiotikum LL-C23O24ß hat die folgende postulierte Struktur

1BWCH3

wobei R₁ und R₂ verschieden sind und jeweils ausgewählt

sind unter H und CH,.

Die obige, postulierte Struktur beruht auf der Elementaranalyse, der optischen Drehung, dem mittels Felddesorptionsmassenspektroskopie ermittelten Molekulargewicht, dem Schmelzpunkt, dem Infrarot(IR)-Spektrum, dem '^C-kernmagnetischen Resonanz(^C-NMR)-Spektrum und dem protonenmagnetischen Resonanz( H-NMR)-Spektrum. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Beispielen genauer angegeben und sind in den Zeichnungen dargestellt; es zeigen:

Fig. I das IR-Spektrum von LL-C23O24ß in KBr;

Fig. II das ¹³C-NMR-Spektrum von LL-C23O24B; 20 MHz in CDCl,, TMS als interner Standard;

Fig. III das ¹H-NMR-Spektrum von LL-C23024B; 80 MHz in CDCl,, TMS als interner Standard.

Tabelle I
¹³C-NMR-Spektrum von LL-C23024ß (TpM relativ zu TMS)

Chemische Verschiebung (TpM) Anzahl der Kohlenstoffatome-

10.5 11.0 12.2 17.0 .17.7 17.9 22.3 26.1 26·. 8 27.6 30.2 32.0 33-3 33.7 33.8 36.5 36.8

- 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1

Tabelle I (Fortsetzung) Chemische Verschiebung (TpM) Anzahl der Kohlenstoffatome

39-0 39.9 45.5

57.

60. 66.

67.6

70 71

74 75

79.9 80.8 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

82.1	-	2
		1
84.5		1
84.7		1
85.6		" 1
86.9	Gesamtzahl d. Kohlenstoff atome	1
95.8	1
■ 96.9	1
97.7	1
107.5	1
179.2	46

BAD ORIGINAL

LL-C23024 jota ist ein neues PoIyäther-Antibiotikum mit äußerst starker Wirkung gegen Coccidia. Es ist mindestens um das 10fache potenter als die meisten anderen, bekannten Polyäther. Die Werte des Felddesorptionsmassenspektrums zeigen, daß es ein Molekulargewicht von 930 hat. Dieser Befund in Verbindung mit dem ^C-NMR-Spektrum gestattet die Voraussage einer möglichen Summenformel von ^C48^H82°17* LL-C23024 jota scheint vier Methoxygruppen aufzuweisen sowie den gleichen Zucker, der im Polyäther-Antibiotikum X-14868A (US-PS 4 278 663) beobachtet wurde, sowie eine Carboxylgruppe. Bei dem einzigen anderen Polyäther-Antibiotikum mit einem Molekulargewicht von 930, das bisher beschrieben wurde, handelt es sich um das Antibiotikum A28695B (Hedroxyseptamycin) [J.Antibiotics 33(2), 252 (1980)], welches sich hinsichtlich seiner strukturellen und biologischen Eigenschaften signifikant von dem erfindungsgemäßen Antibiotikum unterscheidet. Die obigen Beobachtungen beruhen auf der Elementaranalyse, der optischen. Drehung, dem berechneten Molekulargewicht mittels FeIddesorptionsmassenspektroskopie, dem IR-Spektrum, dem ^C-NMR-Spektrum und dem ¹H-NMR-Spektrum. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in den Beispielen im Detail erläutert und in den Zeichnungen dargestellt; es zeigen:

Fig. IV das IR-Spektrum von LL-C23024 jota in KBr;

Fig. V das ¹H-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota; 80 MHz in CDCl-,, TMS als interner Standard;

Fig. VI das ¹⁵C-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota; 20 MHz in CDCl,, TMS als interner Standard;

Fig. VII das ¹³C-NMR-Spektrum von LL-C23024 Öota; (expandierte Skala: 0-50 TpM), 20 MHz in CDCl₃, TMS als interner Standard;

Fig. VIII das ¹⁵C-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota;(expandierte Skala: 50-110 TpM), 20 MHz in CDCl₃, TMS als interner Standard.

ir

ß -

Das ¹⁵C-HMR-Spektrum von LL-C23024 Jota wurde in deuteriertem Chloroform (CDCl,) bei einer Feldstärke von 20 MHz erhalten. Die Signale mit ihren relativen chemischen Verschiebungen, in 1 eilen pro Million (TpM), relativ zu Tetramethylsilan (TMS) und die angenommene Zahl von Kohlenstoffatomen pro Signal sind in Tabelle II zusammengestellt. Für Chloroform wurden Signale bei 75,4, 77,0 und 78,6 beobachtet.

Tabelle II

Chem.Verschieb, Zahl d.C-Atome Chem.Verschieb. Zahl d.C-

Atome

10.6	1	59.9	1
10.9	1	60.8	2
11.7	1	68.5	1
16.4	1	68.8	1
17.6	1	71.3	1
18.0	1	72.2	1
21.7	1	76.1	1
22.9	1	76.9	1
24.1	1	78.5	1
28.2	1	81.0	1
31.2	2	81.3	1
32.2	1	81.-8	1
33.4	1	84.8	1
33.8	2	85.3	1
34.2	1	85.6	1'
36.7	1	86.8	1
37.2	1	88.5	1
39.4	1	95.9	1
40.3	1	97.9	1
44.5	1	99.6	1
45.5	1	107.2	1
47.6	1	173.0	1_
56.8	1	Total	48

Bei den Antibiotika LL-C23024a, β und jota handelt es sich um organische Carbonsäuren. Sie sind somit fähig, Salze mit nichttoxischen, pharmazeutisch akzeptablen Kationen zu bilden. Es können daher Salze gebildet werden, indem man das Antibiotikum in Form der freien Säure mit stöchiometrischen Mengen von Kationen, zweckentsprechend in einem neutralen Lösungsmittel, vermischt. Als Kationen kommen dabei beispielsweise Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und Ammonium in Frage sowie organische Aminkationen, wie Tri-(niederalkyl)-amin (z.B. Triäthylamin, Triäthanolamin), Procain und dergl.. Die kationischen Salze des Antibiotikums LL-C23024B sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, relativ unlöslich in Wasser und löslich in den meisten herkömmlichen, organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Heptan, Äther und Benzol. Für die Zwecke dieser Erfindung ist das Antibiotikum in Form der freien Säure ihren pharmazeutisch annehmbaren, nichttoxischen Salzen äquivalent.

Die Antibiotika LL-C23024S und jota sind in vitro gegen grampositive Bakterien aktiv, wenn sie mittels des Standard-Agarverdünnungsverfahrens untersucht werden. Die als minimale Hemmkonzentration (MIC) in mcg/ml ausgedrückten Ergebnisse sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt. Die Antibiotika LL-C23O24B und jota sind bei Konzentrationen von 256 mcg/ml oder weniger nicht wirksam gegenüber gramnegativen Organismen.

Tabelle III in vitro antibakterielle Aktivität von LL-C25O24ß

Organismus

MlCdncg/ml)

Staphylococcus aureus Smith	11 SSC 80-11	ß-hemolytic	S.SC-80-63	64
11	" SSC 80-32	Keller T623	64
ir	" SSC 80-38	pneumoniae 78-1	64'
Il	11 LL-14	Enterococcus SSC-80-62	64
Il	" LL-45	ti	64
Il	" LL-27	64
Il	" ATCC 25923	128
Il	Streptococcus pyogenes C203	64
Il	!
Il	8
8
64
128

Tabelle IV

in vitro antibakterielle Aktivität von LL-C23024 .jota Organismus . ; MIC (mcg/ml)

Enterococcus	OSU 75-1	1	.5
Enterococcus	SM 77-15	1	.5
Staphylococcus aureus	SSC 79-18	1
Staphylococcus aureus	FU 79-19-2	CVi
Micrococcus lutea	PCI 1001	1
Staphylococcus aureus	Smith	0
Staphylococcus aureus	ATCC 25923	0

ÖRIGIMAL

'-' ■■·⁴"--- 32383Ί6 -73

Wie aus den obigen Daten hervorgeht, inhibieren die Antibiotika LL-C23024a, ß und jota das Wachstum bestimmter grampositiver Bakterien und sind somit als topische oder Oberflächen-Antiseptika in Waschlösungen für die Haut, für Ausrüstungsgegenstände, für Wände, Fußböden und dergl. brauchbar.

Es wurde darüber hinaus festgestellt, daß die antibakteriellen Mittel LL-C23Ö24oc, β und jota in vivo wirksam sind, und zwar als Anticoccidia-Mittel bei Geflügel. Das wird durch die nachfolgenden Tests erläutert.

2 Tage vor der Inokulation wird mit Medikamenten behandeltes Futter, welches die Wirkstoffe mit unterschiedlichen Dosisniveaus enthält, verschiedenen Gruppen von 1 Tag alten Testküken angeboten. Das während des gesamten Tests verwendete Geflügelfutter ist folgendermaßen hergestellt worden: ^

Vitamin-Aminosäure-Prämix 0,5

Spurenmineralien 0,1

Natriumchlorid 0,3

Dicalciumphosphat 1,2

gemahlener Kalkstein 0,5

stabilisiertes Fett 4,0

getrocknetes Alfalfa, 17% Protein 2,0

Maisklebermehl, 41% Protein '5,0

Menhadenfischmehl, 60% Protein 5,0

Sojabohnenölmehl, 44% Protein 30,0

gemahlener, gelber Mais, fein, zum

Auffüllen auf 100

Das in der obigen Futterzusammensetzung verwendete Vitamin-Aminosäure-Prämix ist aus der folgenden Formulierung hergestellt . Die Quantitätsangaben beziehen sich dabei auf Einheiten/kg der fertigen Futterzusammensetzung.

- U0 -

Butyliertes Hydroxytoluol 125,0 mg

dl-Methionin , 500,0 mg

Vitamin A 3300,0 IE

Vitamin D, 1100,0 ICE

Riboflavin 4,4 mg

Vitamin E 2,2 IE

Niacin 27,5 mg

Panthothensäure 8,8 mg

Cholinchlorid 500,0 mg

Folsäure 1,43 mg

Menadion-natriumbisulfat 1,1 mg

Vitamin B^ 11,0 mcg

gemahlener, gelber Mais, fein, zum Auffüllen auf 5,0 g

Die Testküken werden dann inokuliert, und zwar durch direkte Inokulation in den Kropf jedes Kükens unter Verwendung eines gemischten Inokulums von 5000 sporenbildenden Oocyten von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl Oocyten von Eimeria tenella zur Erzeugung einer 85 bis 100% Mortalität bei nichtbehandelten Kontrolltieren. Die Küken haben während der gesamten Testdauer freien Zugang zu Futter und Wasser. 7 Tage nach der Inokulation werden die Tests abgebrochen. Die Vögel werden gewogen, getötet und ihr Intestinaltrakt wird hinsichtlich Läsionen untersucht. Die in den folgenden Tabellen V und VI zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß bei den infizierten Küken eine verbesserte Überlebensrate erreicht wird, wenn ihrem Futter 10 TpM oder mehr der Antibiotika LL-C23024ß oder jota zugesetzt sind. Die Ergebnisse zeigen ebenso eine signifikante Unterdrückung von intestinalen Läsionen, die durch Eimeria tenella und Eimeria acervulina verursacht sind.

BAD

	Antibiotikums LL-C23O24ß	Tabelle V	gegen Coccidien bei Küken	% Vögel mit verringerten Läsionen	E.acervulina	> t 1, 1 > > V I ) > »
Bewertung des	Konz.imFutter TpM	als Mittel	% Überle bende	E.tenella	100
Verbindung		Anz.d.Vögel bei Beginn		100	100
	15		loo"	60	100
LL-C23024 β	10	3	100	0	0	(Jj ....
LL-C23024 β	5	5	80	0	100	* > t > i » t h λ » i
LL-C23024 β	0	5	46.6	100	100	t · ϊ
NNC*	120	15	100	100	100
LL-C23024 β	60	15	100	100	0
	30	15	100	0	—
	0	15	20	--	100	CO ro
	NNC	15	100	87	100	383
	20	15	100	60	0
LL-C23024 ß	15	15	100	Ό	0
	10	15	60	7	0
	5	15	47	0	--
	0	15	27	--
	NNC	15	100
		15

Tabelle VI Bewertung des Antibiotikums LL-C23024 .iota als Mittel gegen Coccidien bei Küken

% Überlebende % Vögel mit verringerten Läsionen

E. tenella E.acervulina

100 100

100 100

20 60

0 0

10 100 100 100

7,5 10 100 70 100

Konzentration im Futter	Anz.d.Vögel
(TpM)	zu Beginn
15	5
10	5
5	5
0	15

•7?-

Durch die folgenden Tests wird die nematocide Aktivität demonstriert.

Beispiel A

Bewertung von Testzusammensetzungen hinsichtlich der nematociden Aktivität unter Verwendung der freilebenden, hermaphroditischen, mikrobivorösen Nematode Caenorhabditis elegans II

Bei den folgenden Tests werden G. elegans zur Bestimmung der nematociden Aktivität der Fermentationsbrühe und der geernteten Maische, die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt wurden, verwendet. Dieser Organismus wird ebenfalls zur Bewertung von LL-C23024α und LL-C23024B verwendet, um deren nematocide Aktivität zu bestimmen.

Bei diesen Tests handelt es sich bei der Fermentations- ^; brühe um die bei der Fermentation erhaltene Mischung von Flüssigkeit und Feststoffen, die entnommen wird, bevor die Feststoffe, d.h. die geerntete Maische, von der Flüssigkeit abgetrennt wird. Bei der geernteten Maische handelt es sich um die Feststoffe, die nach der Abtrennung zurückbleiben.

Zur Bewertung der geernteten Maische werden die Feststoffe der geernteten Maische in destilliertem Wasser im Verhältnis 1:1 dispergiert. Die Fermentationsbrühe wird so, wie sie ist, verwendet und enthält sowohl Flüssigkeit als auch Feststoffe.

Bei den vorliegenden Bewertungen wird C. elegans in einem C. briggsae Maintenance Medium aufbewahrt. Das Maintenance-Medium ist im Handel erhältlich von Grant Island Biological Company, Grant Island, New .York, und weist die folgende Zusammensetzung auf. -

Maintenance Medium

(ι)

Komponente

KH₂PO₄

MnCI₂.4H₂O

Anorganische Salze

CaCl₂.2H₂C CuCl₂.2H₂O Fe (NH₄)₂(SO₄)₂.6H₂O KH₂I

KOH

MnC]

ZnCl₂

Andere Komponenten

N-Acetylenglucosamin Adenosin-3¹-(2^!)-phosphorsäure.H Cytidin-3'-(2')-phosphorsäure D-Glucose

Glutathion, reduziert Guanosin-3'-(2·)-PO₄Na₂.H₂O Magnesiumcitrat.5HpO (dibasisch) Kaliufflcitrat.H₂O DL-Thioktsäure

Thymin

Uridin-3'-(2')-phosphorsäure

Aminosäuren

L-Alanin

L-Arginin !,-Asparaginsäure L-Cystein-HCl .H₂O Gl-Glutamat (Na).H₂O L-Glutamin

Glycin

L-Histidin

L-Isoleucin

L-Leucin

L-Lysin-HCl L-Methionin

220	,50
6	,50
58	,80
1225	,50
(a)
22	,20
10	,20
15:	,00
365,	,00
323:	,00
1315,	,00
204,	,00
363.	,00
915,	,00
486,	,00
3,	,75
126,	,00
324,	,00
1395,	00
975,	00
1620,	00
28,	00
550,	00
1463,	00
722,	00
283,	00
861,	00
1439,	00
1283,	00
389,	00

PAD

Komponente mg/l

L-Phenylalanin 803,00

L-Prolin 653,00

L-Serin 788,00

L-Threonin 717,00

L-Tryptophan 184,00

L-Tyrosin 272,00

L-Valin 1020,00 Vitamine

p-Aminobenzoesäure 7,50

Biotin 3,75

Cholindihydrogencitrat 88,50

Cyanocobalamin (B¹ ) 3,75

Folinat (Ca) 3,75

Myo-inosit 64,50

Niacin 7,50

Pantethein (Pantethine) 3,75

Pantothenat (Ca) 7,50

Pterolyglutaminsäure 7,50

Pyridoxalphosphat 3,75

Pyridoxamin 2HCl 3,75

Pyridoxin HCl 7,50

Riboflavin-5'-Ρ0^(Na).2H₂O 7,50

Thiamin HCl 7,50

Literatur:

(1) E.L.Hansen, Proc.Soc.Exp.Bio. &Med.12i, 30-393(1966); Bemerkungen:

(a) So viel, wie nötig, um den pH auf 5,9 + 0,1 einzustellen.

Für die Bewertungen wird eine Lochplatte mit einer Reihe von kleinen Löchern verwendet. 25 ml der Fermentationsbrühe, der 1:1 Wasser/geerntete Maische-Suspension oder einer wäßrigen Acetonlösung von LL-C23024oc oder LL-C23024ß, enthaltend 31,25 bis 500 TpM der Testverbindung, werden

2tr

323831.&

unter aseptischen Bedingungen in gesonderten Schächten deponiert. Jedem Schacht werden dann 25 ml des C.elegans Maintenance Mediums, enthaltend 10 bis 20 adulte Würmer plus Larven verschiedenen Alters plus Eier, zugesetzt. Die Platten werden anschließend in einen Abzug placiert und 48 h nach der Inokulation untersucht, um die Geschwindigkeit und den Grad der nematociden Aktivität der Testzusammensetzungen zu beurteilen. Die erhaltenen Daten sind im folgenden aufgeführt. In den Fällen, in denen bei der Fermentationsbrühe eine Aktivität beobachtet wird, wird die Brühe weiter verdünnt, um ein 1:4 Brühe/C.elegans-Verhältnis zu schaffen.

Tabelle VII

Zusammensetzung	Konzentration(TpM) oder Verdünnung	1:1 1:4	Nematocide Akti vität während 48 h
Fermentations brühe	D = D =	TpM	8 (keine Bewegungsfähigkeit)
geerntete Maische LL-23024a	500	Il	7
	250	ti	7
	125	15"	7
	62,	,25 "	6
	31,	TpM	0
LL-23024B	500	Il	7
	250	0

Die bei diesen Bewertungen verwendete Aktivitätseinteilung

ist wie folgt:

Aktivitätslegende

8 = keine Bewegungsfähigkeit (scheinbar tot) 7 = merklich reduzierte Bewegungsfähigkeit 6 = verringerte Bewegungsfähigkeit 0 = normale Bewegungsfähigkeit der Species

BAD ORiGtNAL

323831S

Beispiel B

Bewertung von LL-C23024oc als nematocides Mittel gegen

infektiöse Larven von Wiederkäuerneinatoden

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wird die Bewertung von LL-C23024a als nematocides Mittel gegen infektiöse Larven von Wiederkäuernematoden durchgeführt, wobei folgende Nematodenspecies anstelle von C. elegans verwendet wurden: Haemonhmus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus axei, T. colubriformis; sowie der Essigälchenwurm, Turbatrix aceti. Die erhaltenen Daten sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Larven im dritten Häutungsstadium.

In den folgenden Tabellen bezieht sich die Aktivitätseinteilung auf die zuvor aufgeführte Aktivitätslegende.

in vitro ^-
Konzentr.von
LL-C23O240C

TpM

Tabelle VIII Aktivität Kep;en (bei 48 Stunden)

H.contort.

0. circum.

T. axei

T. colüb.

500 8

250 7

125 7

62,5 7

31,25 6

0 (Vergl.) 0

8^L

8^l

7	6
7	6
O	6
O	O

T. aceti

6 6 6 6

(a) durchgeführt in Gewebekulturplatten mit 96 Schächten, X14868A, hergestellt in doppeltdestilliertem Wasser: 25/Ul LL-C23024a-Lösung und 25/ul der Kematodenkultur werden pro
Schacht zugesetzt.

(b) innerhalb von 24 h

OO NJ OJ CO OJ

Beispiel C

Bewertung der nematociden Aktivität des Antibiotikums LL-C23024oc gegen Nematospiroides dubius und Aspicularis te t rapt era bei Mäusen '

Bei den folgenden Tests werden weibliche, weiße Swiss-Webstermäuse mit Nematospiroides dubius und Aspicularis tetraptera infiziert und 3-Wochen, gehalten, um die Infektionen sich entwickeln zu lassen.

Nach diesem Zeitraums des Haltens werden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Gruppen von vier aufgeteilt. Die Gruppen werden in getrennte Käfige placiert. Anschließend wird ein mit Medikamenten behandeltes Futter angeboten, welches von etwa 31,25 TpM bis 4000 TpM der Testverbindung enthält. Das Futter wird den Mäusen eine Woche lang ad libitum angeboten. Wasser wird ebenfalls ad libitum während der Testperiode zur Verfügung gestellt. Während der Behandlungsperiode werden die Ausscheidungen der Mäuse untersucht, um zu bestimmen, ob Würmer ausgeschieden werden. Bei allen behandelten Gruppen wurde festgestellt, daß sie Würmer ausscheiden. Dadurch wird eine nematocide Aktivität bei allen Konzentrationen der Verbindung gegenüber beiden Nematoden angezeigt. Am Ende der einwöchigen Behandlung mit medikamentiertem Futter werden die Mäuse getötet und die Inhalte der intestinalen Trakte der Mäuse werden auf Würmer untersucht. Die erhaltenen Werte sind im folgenden als prozentuale Verringerung von Würmern, verglichen mit infizierten, nicht-medikamentierten Kontrolltieren, ausgedrückt.

Bei diesen Tests wurden rohe Fermentationsbrühen bewertet, welche vor Ernte der Maische erhalten wurden und welche 1000 bis 4000 TpM des nematociden Antibiotikums enthielten. Das Mäusefutter, welches mit 31,25 bis 500 TpM LL-C23024cc, gelöst in einem Aceton/Wasser-Gemisch (1:1), behandelt war, wurde ebenfalls bewertet.

Testzusammen- Nahrung Aktivität (% Reduktion) gegen

setzung Konz.	TpM	N. Dubius	A.Tetraptera
+Fermentations-
brühe	4000	73	-
mit LL-C23034a	2000	44	53
LL-C23024a	1000	65	33
	500	70	SA++
	250	63	SA
	125	61	SA
	62,5	29	SA
	31,25	32	SA

Menge an LL-C23024oc nicht bestimmt

⁺⁺ geringfügige Aktivität: gesteigerte Zahl von Pinwürmern bei der fäkalen Untersuchung entdeckt

⁺⁺⁺ verglichen mit infizierten,nichtmedikamentierten Kontrolltieren.

Die neuen antibakteriellen und gegen Coccidia wirkenden Mittel gemäß der Erfindung werden bei der Kultivierung von Actinomadura yumaense sp. nov. unter kontrollierten Bedingungen gebildet.

Ein repräsentativer Stamm dieses Mikroorganismus wurde von einer Bodenprobe isoliert, die in Yuma County, Arizona, gesammelt wurde. Der Stamm wird in der Culture Collection der Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, als Kultur-Nr. LL-C23024 aufbewahrt. Eine lebensfähige Kultur dieses repräsentativen Stamms ist bei Culture Collection Laboratory, Northern Regional Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 6i604, hinterlegt und in deren permanenter Sammlung unter der Nr. NRRL 12515 aufgenommen worden.

BAD ORJGiNAL

Taxonomische Charakterisierung von NRRL 12515

Der Stamm IiRRL 12515 ist taxonomisch charakterisiert und identifiziert worden als Stamm einer neuen Species der Art Actinomadura, welcher als Actinomadura yumaense sp.nov. bezeichnet wird.

Die kulturellen, physiologischen und morphologischen Merkmale des repräsentativen Stamms NRRL 12515 wurden untersucht, und zwar unter Verwendung von Verfahren, welche beschrieben wurden von E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods for characterization of Streptomyces species", Internat. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966), und R.E. Gordon et al., "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardin strain", internat. J. Syst. Bacteriol. 24:54-63 (1974). Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien wurden ausgewählt unter solchen, welche von T.G. Pridham et al., "A selection of media for maintenance and taxonomic study of Streptomycetes", Antibiotics Ann., Seiten 947-953 (1956/1957); G.F.Gauze et al., "Problems in the classification of antagonistic actinomycetes", State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Moskau (1957); und R.E. Gordon et al., supra, für die taxonomischen Untersuchungen von Actinomyceten und Bodenbakterien empfohlen werden. Die chemische Zusammensetzung der Zellwände des Mikroorganismus wurde bestimmt unter Anwendung des Verfahrens von H.A. Lechevalier et al., "Chemical composition as a criterion in the classification of actinomycetes", Adv.ApIl.Microbiol. 14:47-72 (1971). Die Phospholipid-Muster wurden bestimmt unter Anwendung des Verfahrens von M.P.Lechevalier et al., "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biochem. Syst. Ecol.5:249-260 (1977). Einzelheiten sind in den Tabellen VII bis IX zusammengestellt. Eine allgemeine Beschreibung der Kultur ist unten angegeben. Die unterstrichenen Farbnamen sind entnommen aus K.K. Kelly und D.B.

Judd, "Color. Universal Language and Dictionary of Names", U.::. Nat. Bur. Stand., Spec. Publ. 440, Washington, CD. (1976), und dem begleitenden Inter-Society Color Council, Natl.Bur,Stand.Centroid Color Charts.

Die für diese neue Species, repräsentiert durch den Stamm NRRL 12515, beobachteten Daten wurden mit den Daten verglichen, die für die bekannten Species der Gattung Actinomadura publiziert sind [M.Goodfellow et al., "Numerical Taxonoray of Actinomadura and related actinomycetes", J. Gen.Microbiol. 122:95-111 (1979); L.H.Huang, »Actinomadura macry sp.nov., the producer of antibiotic CP-47,433 and CP-47,434", Internat. J. Syst. Bateriol., 30: 565-568 (1980); J. Meyer, "New species of the genus Antinomadura", Z.Allgem. Mikrobiol. 19:37-44 (1979); H.Nomura und Y. Ohara, "Distribution of actinomycetes in soil. XI. Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier et al.", J. Ferment. Technol. 49:904-912 (1971); und T.P. Preobrazhenskaya et al., "Key for identification of the species of the genus Actinomadura", The Biology of Actinomycetes and Related Organisms 12:30-38 (1977)]. Die Kultur NRRL 12515 hat eine geringe Ähnlichkeit mit Actinomadura pelletieri, weist jedoch keine Ähnlichkeit mit irgendeiner anderen beschriebenen Species auf und unterscheidet sich von A. pelletieri in einer Vielzahl von Eigenschaften. Der Stamm NRRL 12515 wurde daher als der Typenstamm einer neuen Species bezeichnet und Actinomadura yumaense sp.nov. benannt, wobei die Benennung nach dem Ort der Sammlung der Bodenprobe erfolgt, aus der der Typenstamm isoliert wurde.

Mikromorphologie

Sporen werden in kurzen, ■ spir'älformigen Ketten (maximale Länge etwa 20 Sporen/Kette) auf verzweigten, fast verticillaten (quirlblättrigen) Luftsporophoren gebildet. Die

BAD 'ORlGiIMAL

Sporen sind ovoid(eiförmig), 0,6 bis 0,8 Mikron x 1,0 bis 1,4 Mikron, mit einer glatten Oberfläche.

Zellwandzusammensetzung

GesamtzellenhydrolysaiE dieser Kultur enthalten Madurose (3-0-Methyl-D-galactose) und das Mesoisomere der Diaminopimelinsäure (DAP) . Die Kultur weist auch ein Typ P-1 Phospholipid-Muster auf und keine anderen diagnostischen Phospholipide als etwas Phosphatidylglycerin. Diese Charakteristika sind alle sehr typisch für Mitglieder der Gattung Actinomadura.

Wachstum seigenschaften

Ein gutes Wachstum wird beobachtet auf Bennett's Agar, Gauze Nr. 2 Agar, NZ-Amin-Stärke-Glucose-Agar (ATCC Medium 172), Tomatenpaste-Hafermehl-Agar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar; mäßiges Wachstum wird beobachtet auf Benedict's Agar, Czapek¹ s" Saccharose-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar, Hickey-Tresner-Agar und Hafermehl-Agar; ein geringes Wachstum wird beobachtet auf Calclummalat-Agar, Gauze Nr. 1 Agar und anorganische Salze-Stärke-Agar.

Vegetatives Myzel

Auf Media, bei denen gutes Wachstum auftrat, wurde beobachtet, daß sich das vegetative Myzel entwickelte und zusammenrollte und allmählich gelblich-graue Farbschattierungen annahm.

Luftmyzel und Sporenfarbe

Das Luftmyzel und/oder die Sporenmassen waren weiß bis 264. light gray gefärbt. Die Luftmyzelbildung ist auf den meisten Media leicht.

- .24 -

Lösliche Pigmente

Fehlend auf vielen Media; gelbes Pigment auf Benedict's und Glycerin-Asparagin-Agar; gelb-grünes Pigment auf CaI-ciummalat-Agar; grünlich-braunes Pigment auf NZ-Amin-Stärke-Glucose-Agar; orangefarbenes Pigment auf Bennett's und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agars.

Physiologische Reaktionen

Keine Melamin-Pigmente auf Pepton-Eisen-Agar und Tyrosin-Agar (IS0--7); starke Peptonisierung von Lackmusmilch; starke Proteolyse von Nährgelatine; mäßige Reduktion von Nitrat; keine Hydrolyse von Adenin oder Guanin; starke Hydrolyse von Hypoxanthin, Tyrosin und Xanthin; schwache Hydrolyse von Stärke; Hydrolyse von Äsculin; variable Hydrolyse von Harnstoff. Kein Wachstum bei 4⁰C, 10⁰C oder 55⁰C; mäßiges Wachstum bei 25⁰C und 45⁰C; gutes Wachstum bei 32⁰C und 37⁰C. Kohlenhydratnutzung nach dem Verfahren von T.G.Pridham und D,Gottlieb, "The Utilization of carbon compounds by some actinomycetales as an aid for species determination", J.Bacteriol, 56:107^114 (1948): gute Nutzung von Glucose, Glycerin und Trehalose; mäßige Nutzung von Maltose und Saccharose; schlechte Nutzung von Fructose, Galactose, Inosit, Mannose und Melezitose; keine Nutzung von Adonit, Arabinose, Dulcit, Lactose, Mannit, MeIibiose, Raffinose, Rhamnose, Salicin, Sorbit und Xylose. Säurebildung aus Kohlenhydraten nach dem Verfahren von Gordon et al., supra: gute Säureproduktion von Glucose, Glycerin, Maltose, Saccharose und Trehalose; schwache Säureproduktion von Galactose, Inosit und Mannose. Nutzung von organischen Säuren nach dem Verfahren von Gordon et al., supra; Nutzung von Acetat, Malat, Propionat, Fyruvat, Succinat und Tartrat; keine Nutzung von Benzoat, Citrat, Lactat, Mucat und Oxalat.

BAD ORiGiNAL

Tabelle VII Kulturoharakteristika von Actinomadura yumaense NRRL 12515

Inkubation; 14 Tage

Medium

Wachstum Luftmyzel und/oder Sporen Lösl.Pigment

Temperatur: 28 C Rückseitenfarbe

Benedict's
Agar

Bennett's gut
Agar

Calciummalat-Agar

Czapek's

Saccharose-

Gauze Nr.1
Agar

Gauze Nr.2
Agar

Glycerin-Asparagin
Agar

Hickey-Tresner
Agar

mäßig bis flach, pulvrige Kolonien; Luftmyzel schlecht weiß bis 264-. light %räy

kein Luftmyzel;gerolltes,vegetatives Wachstum 95.yellowish gray bis 80. grayish yellowish brown

schlecht flaches Wachstum; spärliches, weißes Luftmycel

mäßig bis flaches Wachstum';mäßiges Luftmyzel - schlecht vegetatives Wachstum 90»grayish yellow

schlecht farbloses,flaches Wachstum; spärliches, weißes Luftmyzel

gut erhabene, gerollte Kolonien',vegetatives Myzel 93»Yellowish gray; mäßiges Luftmyzel, 92.yellowish white

schlecht flache,pulvrige Kolonien; weißes bis mäßig Luftmyzel

mäßig flache,wachsartige Kolonien* 90.

grayish yellow spärliches Luftmyzel, weiß bis 2b4. light gray gelblich
orangefarben

geIb-grün
keines

keines
keines

gelb
keines

89.pale yellow

81.dark grayish yellowisn brown

90.greenish yellow 89. pale yellow

farblos

72	. dark orange ,	•	I t > J
	yellow	J A » * ί > *
89	•pale yellow	> S)
		* · > » I
		» Λ *
		* · *
90	. grayish yellow	OO
		ro
		OO
		OO
		OO

or>

Tabelle VII (Fortsetzung)

Medium Wachstum Luftmyzel und/oder Sporen

Lösl.Pigment

Ri'ickseitenfarbe

gut

anorgan. schlecht Salze-Stärke-Agar

NZ-Amin-Stärke- Glucose-Agar

Hafermehl- mäßig Agar

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Hefeextrakt- Malzex-^ trakt-Agar

gut

gut

flache,farblose,pulvrige Kolonien; weißes Luftmyzel

stark gerolltes Wachstum,61.grayish brown bis 65. brownish black;mäßiges Lüftmyzel,weiß bis 264.light gray keines

grünlich-braun

flaches,wachsartiges Wachstum,90.

grayish yellow;mäßiges Luftmyzel,weiß keines

flaches,wachsartiges Wachstum, 91.dark keines

f ravish yellow; Spur eines weißen üftmyzels

erhabene,wachsartige,gerollte Kolonien, 93. yellowish gray bis grayish yellowish brown; kein Luftmyzel farblos

78. dark yellowish
brown

90. grayish yellow

orangefarben

78. dark

yellowish
brown

Tabelle VIII

Mikromorphologie von Actinomadura yumaense NRRL 12515
Medium Luftmyzel und/oder sporifere Strukturen Sporenform Sporengröße Sporenoberfläche

Czapek¹s Luftsporophoren;verzweigt, fast kreisförmig ovoid 0,6-0,8 Mikron glatt

Saccharose angeordnet;relativ kurze, spirale Ketten χ

Agar von reifen Sporen tragend 1,0-1,4 Mikron

ro co oo co

Tabelle IX

Physiologische	Medium	Reaktionen νο·η	Actinomadura	yumaense MRRL 12515
Pep ton-Eisen-Aga-r*	Inkubations·*- dauer (Tage)	Wachstum	Physiologische Reaktion
Tyro, s in-Agar	7 14	gut !I	leichte Braunfärbung Il Il
Lackmusmilch	7 14	mäßig gut	kein Pigment gelbliches Pigment
Nährgelatine	14 28	gut Il	gute Peptonisierung starke Peptonisierung
Nitratbrühe	14 28	gut Il	geringfügige Proteolyse totale Proteolyse
Adenin-Agar	14 28	gut Il	sehr schwache Reduktion mäßige Reduktion
Guanin-Agar	14 21	gut Il	keine Hydrolyse 11 It
Hypoxanthin-Agar	14 21	gut Il	keine Hydrolyse Il Il
Tyrosin-* Agar	14 21	gut Il	totale Hydrolyse Il Il
Xanthin^Agar	14 21	gut Il	starke Hydrolyse It Il
14 21	gut It	mäßige Hydrolyse starke Hydrolyse

ro co oo co

Tabelle IX (Fortsetzung)

Medium

Inkubationsdauer (Tage)

Wachstum

Physiologische Reaktion

NZ-Amin mit lösl. Stärke und Glucose-Agar (ATCC Med. Nr.172)

Harnstoff-Brühe	28	gut
Äsculin-Brühe	14 28	gut ti
Stärke-Agar	5 10	gut H

schlechtes oder kein Wachstum bei 4°, 10° und 55⁰C; mäßiges Wachstum bei 25°C, 28° und 45 C; gutes Wachstum bei 32° und 37⁰C

Zersetzung variabel Hydrolyse

keine Hydrolyse

II ti

OO OO OO

323831G

Tabelle X

Kohlenstoffauellennutzung von Actinomadura yumaense IRRL 1251g auf ISP-9 Kohlenhydra tnu tzungsmedium Inkubation: 28 Tage Temperatur: 28⁰C

Kohlens toff quelle.. . Nutzung

Adonit 1-Arabinose DuIcit

Fructose schlecht

α-Galactose "

d-Glucose gut

Glycerin "

i-Inosit schlecht

Lactose

Kaitose mäßig

d-Mannit

d-Manno.se schlecht

d-Melezitose "

d-Malibiose d-Raffinose 1-Rhamnose Salicin Sorbit

Saccharose mäßig

d-Trehalose gut

d-Xylose negative Kontrolle

3233316

Tabelle XI

Säurebildung aus verschiedenen Kohlenhydraten mittels Actinomadura yumaense IiRRL 12515 auf Gordon's basalem anorganischem Stickstoffmedium

Inkubation: 28 Tage	Temperatur: 280C
Kohlenstoffquelle	Säurebildunp;
	? Tage 28 Tage

Adonit

1-Arabinose

Dulcit

Fructose -

d-Galactose - +

d-Glucose +++ +++

Glycerin ++ +++

i-Inosit - +

Lactose

Maltose - +++

d-Mannit

d-Mannose +

d-Melezitose

d-Melibiose

d-Raffinose

1-Rhamnose

Salicin

Sorbit

Saccharose - +++

d-Trehalose - +++

d-Xylose

negative Kontrolle

+++ = starke, positive Reaktion ++ = mäßige, positive Reaktion + = geringe, positive Reaktion = negative Reaktion

Tabelle XII

Hu!.:;un;_^p organischer Säuren mittels Actinomadura yumaense IRkL 12513 auf Gordon's Modifizierung von Koser¹ s Basal Ärar (Koser's Cjtrst-A/rar) Inkubation: 28 Ta.^.e Temperatur: 28°C

Kohlenstoff quelle Nutzung

Acetat * +

Benzoat

Citrat

Lactat

Malat +

Muconsäure

Oxalat

Propionat +

Pyruvat +

Cuccinat +

Tartrat +

+ = positive Reaktion; - = negative Reaktion

Es ist darauf hinzuweisen, daß der Ausdruck "Actinomadura yumaense" nicht auf den Stamm Actinomadura yumaense NRRL 12515 oder auf Stämme beschränkt ist, die in vollem Umfang den obigen Wachstums- und mikroskopischen Charakteristika entsprechen, welche lediglich zur Illustration angegeben sind. Das hier beschriebene Actinomadura yumaen se umfaßt alle Stämme von Actinomadura yumaense, welche die Antibiotika LL-C23O24a, ß und jοta bilden und welche nicht eindeutig von Actinomadura yumaense NRRL 12515 und dessen Subkulturen einschließlich der Mutanten und Varianten derselben unterschieden werden können. Der Begriff "Mutanten" umfaßt die natürlichen (spontanen) Mutanten dieses Organismus sowie die induzierten Mutanten, die, ausgehend von diesem Organismus, mittels verschiedener, mutagener Mittel, welche dem Fachmann geläufig sind, hergestellt werden können. Derartige Mittel sind beispielsweise das Bestrahlen mit Röntgenstrahlung, Ultraviolett-

BAD ORIGINAL

strahlung, das Behandeln mit Stickstofflost, Actinophagen, Nitrosaminen und dergl.. Ebenfalls sollen die inter- und intraspezifischen, genetischen Rekornbinanten, die mittels bekannter genetischer Techniken hergestellt werden können, umfaßt sein. Solche genetischen Techniken sind beispielsweise Konjugation, Transduktion und Techniken des genetic engineering.

Die Kultivierung von Actinomadura yumaense .kann mit einer weiten Vielzahl von festen oder flüssigen Kulturmedia durchgeführt werden. Brauchbare Media zur Bildung der Antibiotika LL-C23024ct, β und jota umfassen eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maiswasser, etc., sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid, etc.. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän, Kupfer, etc., werden als Verunreinigungen anderer Bestandteile der Media zur Verfügung gestellt. Die Belüftung in Tanks oder Flaschen erfolgt, indem man sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentiermediums drückt. Eine weitergehende Bewegung in den Tanks wird durch einen mechanischen Propeller gewährleistet. Ein Antischaummittel, wie Schmalzöl oder Silikon-Entschäumer, kann erforderlichenfalls zugesetzt werden.

Actinomadura yumaense wird auf geneigten Agar-olatten (agar slants) aufgezogen und am Leben gehalten, z.B. auf Bennett's Agar, Hefe-Malz-Agar oder ATCC Medium Nr.172. Das ATCC Medium Nr. 172 ist bevorzugt. Die geneigte Platte wird mit einer Kultur von Actinomadura yumaense inokuliert und etwa 7 Tage bei 28 bis 37⁰C, vorzugsweise bei etwa 32⁰C, inkubiert. Diese Basiskulturen können durch serienweise Übertragung auf friscne Agar slants am Leben erhalten werden, oder es kann auch ein Pfropfen

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des Agars mit einem Gehalt an Myzel von dem gut entwikkelten Agar slant verwendet werden, um flüssige Media zu inokulieren.

Durch Inokulation von 100 ml sterilem, flüssigem Medium in 500 ml-Flaschen mit den von einem Agar slant der Kultur abgekratzten oder abgewaschenen Sporenmaterial werden Schüttelflaschen-lmpfZubereitungen von Actinomadura yumaense hergestellt. Beispiele geeigneter Saatmedia sind die folgenden.

Medium A

Rinderextrakt 0,3

Bacto^ ' Trypton 0,5

Glucose 1,0

Hefeextrakt 0,5

Wasser qs. 100 ( ein Pepton, Warenzeichen von Difco Laboratories, Detroit, Michigan)

Der pH-Wert wird mit einer verdünnten Base, z.B.Natriumhydroxid, auf 6,8 bis 7,2 eingestellt.

Medium B ₀,

Glucose 1

Stärke 2

Hefeextrakt 0,5

NZ-Amin A^ ² 0,5

Calciumcarbonat 0,1

Wasser qs. - 100

( Casein-Verdauungsprodukt, Warenzeichen von Sheffield Chemical Co., Div. Nat'l.Dairy Products Corp., Norwich,

N.Y.).

Medium B wird bevorzugt.

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j~ ■' '■■'-'"■ 32383Ί6

Die Flaschen werden bei einer Temperatur von 25 bis 35°C, vorzugsweise bei 32 C, inkubiert und 1 bis 4 Tage auf einer rotierenden Schüttelmaschine heftig geschüttelt. Dieses Saatinokulum wird anschließend verwendet, um die Fermentationskultur zu inokulieren. Die Saatkultur kann auch gefroren und gelagert werden, um für anschließende Saatkulturen ein Inokulum bereitzustellen.

Die im folgenden angegebenen Media sind Beispiele für
brauchbare Media zur Fermentierung von Actinomadura
yumaense, um Antibiotika LL-C23O24a, β und jota herzustellen.

Medium C _ö,

Jo__

Glucose 1,5

Glycerin 1,5

Sojamehl^⁵ . 1,5

Calciumcarbonat 0,1

Natriumchlorid 0,3

Wasser qs. 100

(^ kann durch Baumwollsamenöl oder lösliche Fleischbestandteile mit gleichem Effekt ersetzt werden).

Medium D ₀/

Glucose 3,0

Sojamehl 1,5

Calciumcarbonat 0,1

Natriumchlorid 0,3

Wasser qs. 100

Medium E ₀,

Stärke 1

Melassen 2

Sojamehl 1,5

Calciumcarbonat 0,1

Wasser qs. 100

323831S

Kef]iurn F _oy

Glucose 3

lösliche Fleischbestandteile 2,5

r.atriumchlorid 0,2

Calciumcarbonat 0,1

Wasser qs. 100

Medium G ₀,

Glucose 3

•Sojamehl 0,5

Ammoniumsulfat 0,3

Natriumchlorid 0,2

Calciumcarbonat 0,1

"Wasser qs. 100

Medium H · ₀,

Glucose 3

Ammoniumsulfat 0,3

dibasisches Kaliumphosphat 0,1

Calciumcarbonat 0,2

Natriumchlorid 0,1

V/asser qs. 100

Medium D ist bevorzugt.

Die Fermentierung kann in 100 ml der Media in einer 500 ml-Flasche durchgeführt werden, wobei mit 3 bis Λ0% (Vol/Vol) einer Saatkultur inokuliert wird, die auf die zuvor beschriebene Weise hergestellt wurde. Die Inkubation erfolgt bei 25 bis 35⁰C, vorzugsweise bei etwa 32⁰C, während 24 bis 72 h unter Belüftung. Proben der Fermentationskultur können eingefroren und gelagert werden, um sie später als Inokulum für Saatkulturen zu verwenden.

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Alternativ kann die Fermentation auch in größeren Fermentationstanks durchgeführt werden, welche mit einer Belüftungseinrichtung und einer Rühreinrichtung ausgerüstet sind. Jeder Tank wird mit 3 bis 10% (Vol/Vol) des auf die oben beschriebene Weise hergestellten Inokulums inokuliert. Die Belüftung wird mit einer Rate von 0,5 bis 2,0 1 steriler Luft/l Brühe/min durchgeführt und das Fermentierungsmedium wird mittels eines Propellers, der mit 200 bis 400 U/min angetrieben wird, gerührt. Die Temperatur wird bei 25 bis 35°C, vorzugsweise bei 32°C, gehalten. Die Fermentation wird so lange fortgeführt, bis sich Antibiotika in dem Fermentationsmedium anreichern, gewöhnlich nach 100 bis 150 h. Zu diesem Zeitpunkt wird das Antibiotikum geerntet.

Das Antibiotikum kann gemäß den in der US-PS 4 278 663 beschriebenen Verfahren geerntet und gereinigt werden oder gemäß der folgenden Verfahrensweise.

Die rohe Fermentationsbrühe mit einem Gehalt der gesamten Zellen und hergestellt auf die oben beschriebene Weise wird mit einem gleichen Volumen eines beliebigen NichtKohlenwasserstoff- wasser-unmischbaren, organischen Lösungsmittels vermischt. Methylenchlorid oder Äthylacetat ist bevorzugt. Die organische Phase wird abgetrennt und im Vakuum zu einem öligen Sirup konzentriert.

Der ölige Sirup wird in Methylenchlorid aufgelöst und auf eine Säule aus Silikagel, Aluminiumoxid, Sephadex LH-20^· ' (Pharmacia Fine Chemicals Div. of Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) oder Magnesiumaluminiumsilikat gegeben. Beispiele geeigneter Lösungsmittel zur Entwicklung der Säule sind Diäthyläther, Äthylacetat, eine 1:1- bis 1:7-(VoI/VoI)Mischung von Methylenchlorid:Äthyläther, 10 bis 40% Aceton in Methylenchlorid, 2 bis 10% niederer Alkohol

(Methanol ist bevorzugt) in Methylenchlorid, 2 bis 15% Acetonitril in Methylenchlorid, oder 2 bis 15$ Dioxan in Iiethylenchlorid. Methylenchlorid:Äthylacetat 1:1 (Vol/ Yol) ist bevorzuft. Es werden Fraktionen aufgefangen und auf das Vorliegen von antibakterieller Aktivität untersucht, und zwar mittels eines Bioassays gegen einen empfänglichen Organismus, z. B. Bacillus subtilis. Aktive Fraktionen werden kombiniert und im Vakuum zu einem Rücksxand konzentriert. Dieser Rückstand wird in einem organischen Lösungsmittel, z.B. t-Butanol (bevorzugt), Benzol oder p-Dioxan, aufgelöst und gefriergetrocknet.

Der gefriergetrocknete Feststoff wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid, Hexan, Methylenchlorid:Äthylacetat, Diäthylather, Hexan:Äthylacetat, Hexan:Chloroform oder Hexan:Äther, aufgelöst. Diäthyläther ist bevorzugt. Diese Lösung wird mit Wasser geschüttelt und der pH auf 1,5 bis 4,0, vorzugsweise etwa 2,5, mit einer beliebigen, verdünnten Mineralsäure eingestellt. Die organische Phase wird abgetrennt, mit Wasser zur Entfernung überschüssiger Säure gewaschen, über einem geeigneten Trocknungsmittel getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem Rückstand konzentriert.

Dieser Rückstand wird in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst und die Lösung langsam eindampfen lassen, vorzugsweise bei etwa 4⁰C. Beispiele geeigneter Lösungsmittel sind Methylenchlorid, Hexan, Methylenchlorid:Äthylacetat, Diäthylather, Hexan:Äthylacetat, Hexan:Chloroform oder Hexan:Äther. Hexan:Äther 5:2 (Vol/Vol) ist bevorzugt. Die resultierenden Kristalle werden gesammelt und mit einem beliebigen, mäßig siedenden Kohlenwasserstoff, wie Hexan oder Heptan, gewaschen, vorzugsweise bei etwa 40⁰C, und an der Luft getrocknet. Man erhält so als Endprodukt das Antibiotikum X-14868A in Form der freien Säure.

Falls das Produkt in Form eines Salzes erwünscht ist, kann die freie Säure durch eine Behandlung; mit einem zv/eckentsprechenden Kation, vorzugsweise in Form einer verdünnten, mineralischen Base, umgewandelt werden, und zwar nach Verfahrensweisen, die dem Fachmann geläufig sind.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert. Bei den Media A, B, C, etc. handelt es sich um die oben definierten. Falls nichts anderes angegeben ist, werden alle Verfahren bei Zimmertemperatur (ungefähr 22⁰C) und bei 1 at Druck durchgeführt.

Beispiel 1

Gewaschene Sporen von einem Agar slant von Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden verwendet, um eine 500 ml Flasche, enthaltend 100 ml steriles Medium B, zu inokulieren. Die Flasche wird 2 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 28⁰C inkubiert.

Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird anschließend zu 100 ml sterilem Medium C in einer 500 ml Flasche transferiert und 5 Tage bei 28⁰C auf einem Rotationsschüttler inkubiert.

Das Vorliegen von antibiotischer Aktivität wird täglich mittels eines Bioassays-gegen'Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Bacillus subtilis und Streptococcus faecalis beobachtet und die anthelmintische Aktivität wird mittels eines Bioassays gegen die freilebende Nematode Caenorhabditis elegans beobachtet.

Beispiel 2

})z v/erden sieben 500 ml Flaschen vorbereitet, jede enthaltend 100 ml eines der folgenden sterilen Media:

Flasche 1: 100 ml Medium C

Flasche 2: 100 ml Medium C mit i,55o Baumwollsamenöl anstelle des Sojamehls

Flasche 3: 100 ml Medium C mit 1,5Si lösliche Fleischbestandteile anstelle des Sojamehls

Flasche 4: 100 ml Medium D

Flasche 5: 100 ml Medium Ξ

Flasche 6: 100 ml Medium F

Flasche 7: 100 ml Medium G.

Diese Flaschen werden jeweils mit einem 5% Inokulum von Actinomadura yumaense NRRL 12515,in Medium B gewachsen, inokuliert. Die Flaschen werden anschließend 4 bis 6 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 28⁰C inkubiert. Jede der obigen Kulturen erwies sich als aktiv, wenn sie gemäß Beispiel 1 hinsichtlich ihrer antibiotischen Aktivität untersucht wurde und wenn sie hinsichtlich ihrer Anticoccidienaktivität gegen Eimeria tenella in Kükennieren-Gewebekulturen untersucht wurde.

Beispiel 3 '"

Gefrorene Fermentationskulturzellen von Actinomadua yumaen se NRRL 12515 werden verwendet, um eine 100 ml steriles Medium B enthaltende 500 ml-Flasche zu inokulieren. Die Flasche wird anschließend 4 Tage bei 32⁰C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird anschließend zu 100 ml sterilem Medium H in eirer 500 ml-Flasche transferiert und 5 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 28⁰C inkubiert.

Die antibakterielle Aktivität wird gemäß Beispiel 1 festgestellt und die Anticoccidienaktivität gemäß Beispiel

BAD

Das Vorliegen der antibiotischen Aktivität wird ebenfalls mittels DünnschichtChromatographie auf Silikagelplatten, .entwickelt in Äthylacetat-.Chloroform 70:30 (^vol/ VoI), untersucht.

Beispiel 4

100 ml steriles Medium A in einer 500 ml-Flasche werden mit gewaschenen Sporen eines Agar slants von Actinomadura yumaense NRRL 12515 inokuliert. Die Flasche wird 2 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 32⁰C inkubiert. Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird dann zu 100 ml sterilem Medium H in einer 500 ml-Flasche transferiert und 2 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 32⁰C inkubiert. Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird anschließend zu einer 500 ml-Flasche, enthaltend 100 ml frisches, steriles Medium H, transferiert und 6 Tage bei 28⁰C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die antibakterielle Aktivität wird gemäß Beispiel 1 festgestellt.

Beispiel 5

Zwei 500 ml-Flaschen, jede enthaltend 100 ml steriles Medium A, werden mit einer gefrorenen Saatkultur vcn Actinomadura yumaense NRRL 12515 inokuliert und 2 Tage bei 32⁰C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die Inhalte der beiden Flaschen werden anschließend kombiniert und zu 12 1 frischen, sterilem Medium A in einem 20 1 Gefäß gegeben. Diese Kultur wird dann 2 Tage bei 28^CJ unter Belüftung inkubiert. Der Inhalt dieses Gefäßes wird danach in einen 300 1 Saattank, enthaltend 288 1 steriles Medium A, transferiert. Diese Kultur wird 25 h bei 32⁰C belüftet und gerührt. Am Ende der 25stündigen Inkubation werden die 300 1 der Saatkultur in einen 1500 1 Fermentor, enthaltend 1200 1 steriles Medium C, überführt. Diese Kultur wird 115 h bei 28⁰C unter Belüftung und Rühren inkubiert.

IAB ORIGINAL

Die Ferrnentationsbrühe wird hinsichtlich ihrer antibiotischen Aktivität mittels Dunns chi ch tchromato graphi e auf Silikagelplatten, entwickelt in Äthylacetat:Chloroform 70:30 (Vol/Vol), untersucht. Alternativ werden mehrere der entwickelten Platten einem Bioassay gegen Bacillus subtilis unterworfen, wobei sich das Vorliegen von antibiotischer Aktivität ebenfalls zeigt.

B eispiel 6

Ein typisches Medium, welches verwendet wird, um das primäre Inokulum wachsen zu lassen, wird gemäß der folgenden Formulierung hergestellt. _c/

Rinderextrakt 0,3

3acto^^R'-Trypton 0,5

Glucose 1,0

Hefeextrakt 0,5

Bacto^ Agar 0,1

Wasser qs. 100

Gewaschene oder abgekratzte Sporen und Myzel von einem Agar slant von Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden verwendet, um eine 500 ml-Flasche, enthaltend 100 ml des obigen sterilisierten Mediums, zu inokulieren. Die Flasche wird auf einen Rotationsschüttler gestellt und 48 h bei 32⁰C heftig geschüttelt. Das resultierende Flaschen-Inokulum (100 ml) wird verwendet, um 1 1 des gleichen sterilen Mediums in einer 2 1-Flasche zu inokulieren. Dieses Inokulum wird mit steriler Luft belüftet, während das Wachstum 48 h bei 28⁰C fortgesetzt wird. Diese 1 1-Kultür wird dann verwendet, um einen 30 1 Fermentortank, enthaltend das gleiche sterile Medium, zu inokulieren; dieser Tank wird mit steriler Luft belüftet und 42 h bei 28⁰C inkubiert.

BAD ORIGINAL

Beispiel 7

Ein Fermentationsmedium wird gemäß folgender Formulierung hergestellt. _e,

Dextrose 1,5

Glycerin 1,5

Sojamehl 1,5

Calciumcarbonat 0,1

Natriumchlorid 0,3

Wasser qs. 100

Der pH wird mit 6N Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt und das Medium sterilisiert. Eine 30 1-Portion des gemäß Beispiel 1 hergestellten Inokulums wird verwendet, um 250 1 des obigen Mediums in einem 300 1 Fermentor zu inokulieren. Die Maische wird mit steriler Luft versorgt und mittels eines Propellers, der mit 220 U/min angetrieben wird gerührt. Die Fermentation wird 97 h bei 32° C durchgeführt. Anschließend wird die Maische geerntet.

Beispiel 8

Ein Fermentationsmedium wird gemäß folgender Formulierung hergestellt. ₀,

Dextrose 3,0

Sojamehl 1,5

Calciumcarbonat 0,1

Natriumchlorid 0,3

Wasser qs. 100

Der pH wird mit 6N Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt und das Medium sterilisiert. Eine 300 1-Portion des gemäß Beispiel 1 hergestellten Inokulums wird verwendet, um 3000 1 des obigen Mediums in einem Fermentor zu inokulieren. Die Maische wird mit steriler Luft versorgt und mittels eines Propellers, der mit 100 ti/mi η angetrieben wird, gerührt. Die Fermentation wird 115h bei 32⁰C durchge-

-BAD ORIGINAL

-IA-

fiibrt. Anschließend v,^rird die Maische geerntet.

?. eispiel 9

(1) Die Fernentationsmaische (100 ml) wird mit 6N KCl auf pH 4,0 eingestellt. Die saure Maische wird dann 1 bis 2 h mit einem gleichen Volumen Methylenchlorid gerührt. Das Gemisch aus Maische und Methylenchlorid wird anschließend filtriert, und zwar unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfe. Der Methylenchloridextrakt wird abgezogen und im Vakuum auf etwa 2 1 konzentriert, wobei man die teilweise gereinigten Antibiotika erhält.

(2) Chromatographie der teilweise gereinigten Antibiotika auf Silikagel

Eine Glassäule mit einem Durchmesser von 7 cm wird bis zu einer Höhe von 91 cm mit Woelm Silika Gel TSC bepackt. Das rohe Konzentrat [siehe (1) oben] mit einem Volumen von etwa 2 1 läßt man in die Säule aus Silikagel einsickern. Die Säule wird dann zunächst mit 3 1.Methylenchlorid und dann mit Methylenchlorid:Äthylacetat (1:1 nach Volumen) entwickelt. Man erhält insgesamt 126 Fraktionen, jede mit einem Volumen von 80 ml. Anschließend wird weiter entwikkelt unter Verwendung von Äthylacetat:Äthanol (7:3)> um zusätzliche 87 Fraktionen zu erhalten.

Die Fraktionen 58 bis 87, die reich an C23024oc sind, werden kombiniert und im Vakuum bis zu einem Rückstand mit einem Gewicht von 90,4 g konzentriert. Dieser Rückstand wird in einem Gemisch von 600 ml Diäthyläther und 600 ml Hexan aufgelöst. Die resultierende Suspension wird filtriert, wobei man ein klares Filtrat erhält. Das klare Filtrat wird im Vakuum so weit konzentriert, bis die Kristallbildung beginnt. Diese Suspension wird über Nacht stehengelassen. Das kristalline C23024a wird auf einem

BAD

- to -

Trichter gesammelt, mit kaltem Äther gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält 33,1 g kristallines C23024a. Weitere 12,4 g C23024a werden durch weitere Verringerung des Volumens der vereinigten Waschlösungen und Filtrate erhalten.

Die Fraktionen 177 bis 203 aus der Eluierung mit Äthylacetat: Äthanol, welche mit C23024ß angereichert sind, werden kombiniert und im Vakuum konzentriert. Man erhält 6,7 g teilweise gereinigtes C23024B, das, wie oben beschrieben, behandelt wird.

Die Fraktionen 204 bis 213 aus der Eluierung mit Äthylacetat: Äthanol, welche mit LL-C23024 jοta angereichert sind, werden vereinigt und im Vakuum zu einer Paste konzentriert und wiederholt mit Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wird mit Methylenchlorid extrahiert, welches auf eine Säule gegeben wurde, die Woelm Silikagel enthält. Die Säule wird mit Methylenchlorid gewaschen und dann mit Methylenchlorid:Äthylacetat (2:3) eluiert. Die Fraktionen (cuts) werden mittels Dünnschichtchromatographie untersucht und die aktiven Fraktionen v/erden gesammelt, mit Aktivkohle behandelt, konzentriert und wiederholt mit Heptan extrahiert. Der letzte Heptanextrakt wird 48 h auf O⁰C gekühlt und die Kristalle werden durch Filtration von der Mutterlauge entfernt.

Diese Mutterlauge wird anschließend in Methylenchlorid und in eine mit Woelm Silikagel bepackte Glassäule einsickern lassen. Die Säule wird dann aufeinanderfolge;·.! mit 2 1 Methylen, 8 1 Methylenchlorid:Äthylacetat (1:1) und 4 1 Äthylacetat:Methanol (9:1) eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden hinsichtlich ihrer antibiotischen Zusammensetzung untersucht. Die aktiven Fraktionen werden kombiniert und im

D Q

Vakuum konzentriert, wobei man einen Rückstand erhält, der LL-C23O24 jota enthält.

I: e i s ρ i e...l.. 10

(3) V/eitere Reinigung von LL-C23O24ß aus der Chromatographie

auf Silikagel

(R) Kan läßt Sephadex^* "'LH20 in einem Gemisch von Hexan*

Me thy lenchlo r i d-Me tlianö 1 (1G: 5:1) que Ilen. Eine Glas s äu-Ie mit einem Durchmesser von 5 cm wird bis zu einer Höhe von 36 cm mit dem Gel bepackt. Die Charge, 3 g gereinigtes LL-C23024ß, wird in 10 ml Methylenchlorid·, 1 ml Methanol und 10 ml Hexan aufgelöst und in die Säule des Gels einsickern lassen. Die Säule 3 wird anschließend mit einem Lösungsmittel der gleichen Zusammensetzung entwickelt, wie das, welches zum Aufbringen des Antibiotikums auf die Säule verwendet wurde. Er, werden Fraktionen unter Verwendung eines Sammlers aufgefangen. Die ersten 23 Fraktionen haben jeweils ein Volumen von 17 ml. Die Fraktionen 17 bis 26 enthielten C23024ß gemäß Dünnschichtchromatographie (TLC). Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wobei man reines, amorphes LL-C23024ß (1269 "mg) erhält.

B ei s .p. i e 1. 11

Kristallisation, vo.n LL-C23Q24ß als Natriumsalz

Gereinigtes LL-C23Ö24ß(2,4 g), hergestellt wird in den Abschnitten B und C beschrieben, wird in einem Gemisch von Diäthylather (500 ml), Hexan (16O ml) und Methylenchlorid (25 ml) aufgelöst. Die resultierende Lösung wird in einen Trenntrichter überfuhrt, der 300 ml destilliertes Wasser enthält. Verdünnte HCl (1N) wird tropfenweise zugesetzt, bis der pH 2,0 bis 2,5 nach Umschütteln und Absitzen erreicht. Di^;e saure, wäßrige Phase wird verworfen und die mit Säure behandelte, organische Phase dreimal nacheinander mit 400 ml—Volumen Wasser gewaschen. Die gewaschene,

organische Schicht wird mit einem Teelöffel von Darco G-60 Pulver 15 min gerührt und durch CeIite filtriert. Die entfärbte, organische Schicht wird über 500 ml destilliertes Wasser placiert und 5N NaOH wird tropfenweise zugesetzt, bis der pH 11,0 bis 11,5 nach Schütteln und Absitzen erreicht. Die alkalische, wäßrige Phase wird verworfen und die zurückbleibende, organische Schicht wird zweimal mit 400 ml-Portionen Wasser gewaschen. Die gewaschene, organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum zu einem Volumen von 150 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wird mehrere Stunden in einem Abzug stehengelassen. Das kristalline LL-C23024B wird auf einem Trichter gesammelt, mit kaltem Hexan gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält 402 mg des kristallinen Salzes von LL-C23024ß. An dieser Probe wurden die mikroanalytischen und ausgewählten spektralen Messungen durchgeführt. Analyse: berechnet für C^H₇₇O₁ ^Na C 59,70%; H 8,33^c/o; 0 29,46%; Asche 2,49%. C 61,55; H 8,79; Asche 3,31; N 0;
Schmelzpunkt [Fisher-Johns Apparat =174

(FD-Massenspektrum) = 924 [a]^ = +3,2 in Methanol].

Beispiel 12 Reinigung; von LL-C23024 .iota

Ein Waters Prep. 500A high performance liquid chromatography instrument (Flüssigkeitschromatograph) wird unter einem Druck von 500 psi mit einer Silikagelpatrone beladen. Die Charge, bei welcher es sich um 5,0 g des Rohmaterials von Beispiel 3 handelt, wird in 50 ml Heptan: Äthylacetat (45:55) aufgelöst und auf die Säule von SiIikagel injiziert. Die Säule wird anschließend mit dem gleichen Losungsmittelgemisch bei einer Flußrate von 200 ml/min entwickelt, wobei vierzig 200 ml-Fraktionen

BAD ORIGINAL

- 48 -

i!jr/'P^r'c-jri[-,eri v/erden. Die Fraktionen 21 bis 32 werden kombiniert, zn einerr. Rückstand konzentriert, mit Hexan verriebe··; und eingedampft. Man erhält reines LL-C23O24 jota. Das cöige Verfahren wird viermal wiederholt, wobei man eine
kombinierte Gesamtmenge von 230 mg amorphes LL-C23024 jota erhält.

Eine 90 mg-Portion des amorphen LL-C23024 jota wird in
10 ml Diäthylather aufgelöst, mit 10 ml Wasser vermischt
■and mit O,1N Chlorwasserstoff säure auf pH 2,5 eingestellt. Die Ätherschicht wird mit Wasser gewaschen, mit 0,1N
Hatriumhydroxid auf etwa pH 11 eingestellt, abgetrennt und wiederum mit Wasser gewaschen. Die Ätherphase wird über
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Rückstand konzentriert. Eine Lösung dieses Rückstands in Äther-Hexan wird langsam eindampfen gelassen, wobei man einen amorphen, weißen Feststoff erhält. Dieser amorphe, weiße Feststoff
hat folgende Eigenschaften.

Elementaranalyse: C 61,79% ; H 8,84%; Asche 0,3296; p/r

. [oc]£° = +27 (C 0,724, Methanol);

Felddesorptionsmassenspektroskopie: (M+Na) = m/e 953,
das berechnete Molekulargewicht beträgt daher 930.

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Claims (16)

Patentansprüche

1. Biologisch reine Kultur von Actinomadura yunaense sp. nov., welche fähig ist, bei Fermentation in einem flüssigen Nährmedium, enthaltend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, die Antibiotika LL-C23024a, β und jota in isolierbaren Mengen zu bilden.

2. Biologisch reine Kultur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei Actinomadura yumaense sp. nov. um Actinomadura yumaense NRRL 12515 handelt.

3· Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Actinomadura yumaense sp.nov. nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus spontan in der Weise mutiert ist, daß der Mikroorganismus genetisch geändert ist, jedoch immer noch seine Fähigkeit zur Synthese der Antibiotika LL-C23024cc, ß und j ο ta behalten hat.

4. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Actinomadura yumaense sp. nov. nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus mutagenen Mitteln ausgesetzt worden ist, so daß der Mikroorganismus genetisch verändert ist, jedoch nach wie vor die Fälligkeit behalten hat, die Antibiotika LL-C23024a, ß und jοta zu synthetisieren.

5. Das Antibiotikum LL-C23O24B, dessen im wesentliche reine Form folgende Eigenschaften aufweist:

(a) eine optische Drehung [a]_D von +32 + 2 (0,495%, Methanol) und I>]q⁵ von +46° + 2 (0,440?S, Chloroform) ;

(b) eine Elementaranalyse (%) von etwa C 61,55; H 8,79;

BAD ORiQlWAL

(c) einen Schmelzpunkt von etv-^ra 171 "bis 173°C; (ei) ein Molekulargewicht gemäß FelddesorptionsiriESsenspektroskopie von 902;

(e) ein ^C-kernmagnetisches Resonanzspektrum

in deuteriertem Chloroform bei 80 MHz, welches im wesentlichen dem in Fig.II gezeigten entspricht;

(f) ein Infrarot-Absorptionsspektrum in KBr, das im wesentlichen dem in Fig. I gezeigten entspricht; und

(g) ein Protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum in deuteriertem Chloroform bei 20 MHz, welches im wesentlichen dem in Fig. III gezeigten entspricht.

6. Pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze des Antibiotikums LL-C23024ß gemäß Anspruch 5.

7. Antibiotikum LL-C23024 jota, dessen im wesentlichen reine Form folgende Eigenschaften aufweist:

(a) eine optische Drehung [a]{j = +27 (C 0,724, Methanol);

(b) eine Elementaranalyse (%) von etwa C 61,79; H 8,84;

(c) ein Molekulargewicht gemäß Felddesorptionsmassenspektroskopie von 930;

(d) ein -T-kernmagnetisches Resonanzspektrum in deuteriertem Chloroform bei 80 MHz, welches im wesentlichen dem in den Fig. VI, VII und VIII gezeigten entspricht;

(e) ein Infrarot-Adsorptionsspektrum in KBr, welches im wesentlichen dem in Fig. IV gezeigten entspricht; ^^ (f) ein Protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum in deuteriertem Chloroform bei 20 MHz, welches im wesentlichen dem in Fig. V gezeigten entspricht.

8. Pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze des Antibiotikums LL-C23024 jota gemäß Anspruch 7.

[~Ν'ΛΟΪ äC Γ. ν" - -,—.τ]

3~2 3 3 3 1 6

9. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika LL-C23024a, ß und jota, dadurch gekennzeichnet, daß man Actinomadura yumaense sp. nov. oder eine Mutante desselben in einem flüssigen Medium, enthaltend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, aerob fermentiert, bis die Fermentationsbrühe eine wesentliche antibiotische Aktivität aufweist, und anschließend das Antibiotikum von derselben isoliert.

10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der Fermentationskultur während eines Zeitraums von 24 bis 150 Stunden bei 25 bis 35⁰C gehalten wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Actinomadura sumaense sp. nov. um Actinomadura yumaense NRRL 12515 han-

.delt.

12. Verwendung der Verbindung LL-C23024B oder LL-C23024 jota nach einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Bekämpfung von Protozoen-Infektionen bei Warmblütern.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Warmblütern um Tiere für die Fleischproduktion handelt und bei der Infektion um Coccidiosis.

14. Mittel zur Bekämpfung von Coccidiosis-Infektionen bei Geflügel/ umfassend einen eßbaren Träger und etwa 0,000025 bis etwa 0.06 Gew.% der Verbindung LL-C23O24ß,

c...i'i'iT V-!T

LL-C23024 Jota oder der pharmazeutisch akzeptablen Salze derselben.

15. Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem eßbaren Träger um das Trinkwasser handelt und dieses 2,5 bis 120 TpM des Anticoccidienmittels enthält.

16. Verwendung der Verbindung LL-C23024« oder LL-C23Q24B gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 zur Bekämpfung von Nematoden in Warir±>lütern und im Erdboden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nematicid wirksame Menge einer Verbindung LL-C23024OI , LL-G23024ß oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes der Verbindungen, Mischungen der Verbindungen oder Salze oder Fermentationsbrühen oder Festkörper der geernteten Maische, aus der die nematiciden Antibiotika erhalten werden, auf den mit Nematoden verseuchten Erdboden aufbringt.