CH661283A5 - Verfahren zur herstellung der antibiotika ll-c23024 alpha, beta und jota. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotika, die mit LL-C23024a, ß und jota bezeichnet sind und antibakterielle Mittel und Anticoccidia-Mittel darstellen. Das Verfahren beruht auf der Fermentie-rung des neuen Mikroorganismus Actinomadura yumaense sp. nov. unter kontrollierten Bedingungen.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist im Anspruch 1 definiert.

Das Antibiotikum LL-C23024a hat folgende Struktur:

.OMe

QMe

Me a AOMe

Me«»

H k H COOH Me

Das Antibiotikum LL-C23024ß unterscheidet sich von bekannten Verbindungen aufgrund seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften, u.a. durch seine Mikroanalyse,

seine optische Rotation, sein IR-Spektrum, sein 13C-NMr-Spektrum und sein 'H-NMR-Spektrum.

Das Antibiotikum LL-C23024ß hat die folgende Struktur:

OMe

COOH

Die obige Struktur beruht auf der Elementaranalyse, der optischen Drehung, dem mittels Felddesorptionsmassenspek-troskopie ermittelten Molekulargewicht, dem Schmelzpunkt, dem Infrarot(IR)-Spektrum, dem 13C-kernmagnetischen Resonanz(13C-NMR)-Spektrum und dem protonenmagnetischen Resonanz(1H-NMR)-Spektrum. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Beispielen genauer angegeben und sind in den Zeichnungen dargestellt; es zeigen: 45 Fig. I das IR-Spektrum von LL-C23024ß in KBr;

Fig. II das 13C-NMR-Spektrum von LL-C23024ß; 20 MHz in CDCh, TMS als interner Standard;

Fig. III das 'H-NMR-Spektrum von LL-C23024ß; 80 MHz in CDCh, TMS als interner Standard.

661 283

4

Tabelle I

I3C-NMR-Spektrum von LL-C23024ß (TpM relativ zu TMS) Chemische Verschiebung (TpM) Anzahl der Kohlenstoffatome

10.5 11.0 12.2 17.0 17.7 17.9 22 3 26 i 2t 2', j 30.2 32.0 33 3

33.7

33.8 36.5

36.8

39.0

39.9

45.5

57.1

59.1

60.7 66.9

67.6

70.2

71.3 72.9 74.9 75.1 79.9

80.8 82.1

84.5

84.7

85.6

86.9

95.8

96.9

97.7 107.5

179.2 _

Gesamtzahl der

Kohlenstoffatome 46

Das Antibiotikum LL-C23024jota hat die folgende Struktur:

OMe

= OMe

LL-C23024jota ist ein neues Polyäther-Antibiotikum mit äusserst starker Wirkung gegen Coccidia. Es ist mindestens um das lOfache potenter als die meisten anderen, bekannten Polyäther. Die Werte des Felddesorptionsmassenspektrums 3 zeigen, dass es ein Molekulargewicht von 930 hat. Dieser Befund in Verbindung mit dem l3C-NMR-Spektrum führt zu einer Summenformel von C48H82O17. Bei dem einzigen anderen Polyäther-Antibiotikum mit einem Molekulargewicht von 930, das bisher beschrieben wurde, handelt es sich um das 10 Antibiotikum A28695B (Hedroxyseptamycin) [J. Antibiotics 33(2), 252 (1980)], welches sich hinsichtlich seiner strukturellen und biologischen Eigenschaften signifikant von dem erfmdungsgemäss erhält.ichen Antibiotikum unterscheidet. Die obigen Beobachtungen beruhen auf der Elementarana-15 lyse, der optischen Drehung, dem berechneten Molekulargewicht mittels Felddesorptionsmassenspektroskopie, dem IR-Spektrum, dem I3C-NMR-Spektrum und dem 'H-NMR-Spektrum. Die Ergebnise dieser Messungen sind in den Beispielen im Detail erläutert und in den Zeichnungen dargestellt; es 20 zeigen:

Fig. IV das IR-Spektrum von LL-C23024jota in KBr;

Fig. V das 'H-NMR-Spektrum von LL-C23024jota; 80 MHz in CDCh, TMS als interner Standard;

Fig. VI das 13C-NMR-Spektrum von LL-C23024jota; 20 25 MHz in CDCh, TMS als interner Standard;

Fig. VII das 13C-NMR-Spektrum von LL-C23024jota; (expandierte Skala: 0-50 TpM), 20 MHz in CDCb, TMS als interner Standard;

Fig. VIII das 13C-NMR-Spektrum von LL-C23024jota; 30 (expandierte Skala: 50-110 TpM), 20 MHz in CDCb, TMS als interner Standard.

Das 13C-NMr-Spektrum von LL-C23024jota wurde in deuteriertem Chloroform (CDCh) bei einer Feldstärke von 20 MHz erhalten. Die Signale mit ihren relativen chemischen 35 Verschiebungen, in Teilen pro Million (TpM), relativ zu Tetramethylsilan (TMS) und die angenommene Zahl von Kohlenstoffatomen pro Signal sind in Tabelle II zusammengestellt. Für Chloroform wurden Signale bei 75,4,77,0 und 78,6 beobachtet.

Tabelle II

H H H OMe

COOH

Chem.

Zahl

Chem.

Zahl

Verschiebung der C-Atome

Verschiebung der C-Atome

10.6

1

59.9

1

10.9

1

60.8

2

11.7

1

68.5

1

16.4

1

68.8

1

17.6

1

71.3

1

18.0

1

72.2

1

21.7

1

76.1

1

22.9

1

76.9

1

24.1

1

78.5

1

28.2

1

81.0

1

31.2

81.3

1

32.2

1

81.8

1

33.4

1

84.8

1

33.8

85.3

1

34.2

1

85.6

36.7

1

86.8

1

37.2

1

88.5

1

39.4

1

95.9

1

40.3

1

97.9

1

44.5

1

99.6

1

45.5

1

107.2

1

47.6

1

173.0

1

56.8

1

Total

48

5

661 283

Bei den Antibiotika LL-C23024a, ß und jota handelt es sich um organische Carbonsäuren. Sie sind somit fähig, Salze mit nichttoxischen, pharmazeutisch akzeptablen Kationen zu bilden. Es können daher Salze gebildet werden, indem man das Antibiotikum in Form der freien Säure mit stöchiometri-schen Mengen von Kationen,, zweckentsprechend in einem neutralen Lösungsmittel, vermischt. Als Kationen kommen dabei beispielsweise Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und Ammonium in Frage sowie organische Aminkationen, wie Tri-(niederalkyl)-amin (z.B. Triäthylamin, Triäthanol-amin), Procain und dgl. Die kationischen Salze des Antibiotikums LL-C23024ß sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, relativ unlöslich in Wasser und löslich in den meisten herkömmlichen, organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Heptan, Äther und Benzol. Für die Zwecke dieser Erfindung ist das Antibiotikum in Form der freien Säure ihren pharmazeutisch annehmbaren, nichttoxischen Salzen äquivalent.

Die Antibiotika LL-C23024ß und jota sind in vitro gegen grampositive Bakterien aktiv, wenn sie mittels des Standard-AgarverdünnungsVerfahrens untersucht werden. Die als minimale Hemmkonzentration (MIC) in mcg/ml ausgedrückten Ergebnisse sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt. Die Antibiotika LL-C23024ß und jota sind bei Konzentrationen von 256 mcg/ml oder weniger nicht wirksam gegenüber gramnegativen Organismen.

Tabelle III

In vitro antibakterielle Aktivität von LL-C23024ß

Organismus

MIC (mcg/ml)

Staphylococcus aureus Smith

64

Staphylococcus aureus SSC 80-11

64

Staphylococcus aureus SSC 80-32

64

Staphylococcus aureus SSC 80-38

64

Staphylococcus aureus LL-14

64

Staphylococcus aureus LL-45

64

Staphylococcus aureus LL-27

128

Staphylococcus aureus ATCC 25923

64

Streptococcus pyogenes C203

1

Streptococcus ß-hemolytic Keller T623

8

Streptococcus pneumoniae 78-1

8

Enterococcus SSC-80-62

64

Enterococcus SSC-80-63

128

Tabelle IV

In vitro antibakterielle Aktivität von LL-C23024jota

Organismus

MIC (mcg/ml)

Enterococcus OSU 75-1

1

Enterococcus SM 77-15

1

Staphylococcus aureus SSC 79-18

1

Staphylococcus aureus FU 79-19-2

2

Micrococcus lutea PCI 1001

1

Staphylococcus aureus Smith

0.5

Staphylococcus aureus ATCC 25923

0.5

Wie aus den obigen Daten hervorgeht, hemmen die Antibiotika LL-C23024a, ß und jota das Wachstum bestimmter grampositiver Bakterien und sind somit als topische oder Oberflächen-Antiseptika in Waschlösungen für die Haut, für

Ausrüstungsgegenstände, für Wände, Fussböden und dgl. brauchbar.

Es wurde darüber hinaus festgestellt, dass die antibakteriellen Mittel LL-C23024ce, ß und jota in vivo wirksam sind, und zwar als Anticoccidia-Mittel bei Geflügel. Das wird durch die nachfolgenden Tests erläutert.

2 Tage vor der Inokulation wird mit Medikamenten behandeltes Futter, welches die Wirkstoffe mit unterschiedlichen Dosisniveaus enthält, verschiedenen Gruppen von 1 Tag alten Testküken angeboten. Das während des gesamten Tests verwendete Geflügelfutter ist folgendermassen hergestellt worden:

%

Vitamin-Aminosäure-Prämix 0,5

Spurenmineralien 0,1

Natriumchlorid 0,3

Dicalciumphosphat 1,2

gemahlener Kalkstein 0,5

stabilisiertes Fett 4,0

getrocknetes Alfalfa, 17% Protein 2,0

Maisklebermehl, 41% Protein 5,0

Menhadenfischmehl, 60% Protein 5,0

Sojabohnenölmehl, 44% Protein 30,0 gemahlener, gelber Mais, fein, zum Auffüllen auf 100

Das in der obigen Futterzusammensetzung verwendete Vitamin-Aminosäure-Prämix ist aus der folgenden Formulierung hergestellt. Die Quantitätsangaben beziehen sich dabei auf Einheiten/kg der fertigen Futterzusammensetzung.

Butyliertes Hydroxytoluol

125,0 mg dl-Methionin

500,0 mg

Vitamin A

3300,0 IE

Vitamin D3

1100,0 ICE

Riboflavin

4,4 mg

Vitamin E

2,2 IE

Niacin

27,5 mg

Pantothensäure

8,8 mg

Cholinchlorid

500,0 mg

Folsäure

1,43 mg

Menadion-natriumbisulfat

1,1 mg

Vitamin B12

11,0 mcg gemahlener, gelber Mais, fein, zum Auffüllen

auf 5,0 g

Die Testküken werden dann inokuliert, und zwar durch direkte Inokulation in den Kropf jedes Kükens unter Verwendung eines gemischten Inokulums von 5000 sporenbildenden Oocyten von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl Oocyten von Eimeria tenella zur Erzeugung einer 85 bis 100% Mortalität bei nichtbehandelten Kontrolltieren. Die Küken haben während der gesamten Testdauer freien Zugang zu Futter und Wasser. 7 Tage nach der Inokulation werden die Tests abgebrochen. Die Vögel werden gewogen, getötet und ihr Intestinaltrakt wird hinsichtlich Läsionen untersucht. Die in den folgenden Tabellen V und VI zusammengestellten Ergebnisse zeigen, dass bei den infizierten Küken eine verbesserte Überlebensrate erreicht wird, wenn ihrem Futter 10 TpM oder mehr der Antibiotika LL-C23024ß oder jota zugesetzt sind. Die Ergebnisse zeigen ebenso eine signifikante Unterdrückung von intestinalen Läsionen, die durch Eimeria tenella und Eimeria acervulina verursacht sind.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

661283

6

Tabelle V

Bewertung des Antibiotikums LL-C23024ß als Mittel gegen Coccidien bei Küken

Verbindung Konzentration im Anzahl der Vögel bei % Überlebende % Vögel mit verringerten Läsionen

Futter (TpM) Beginn E. tenella E. acervulina

LL-C23024ß

15

3

100

100

100

LL-C23024ß

10

5

100

60

100

LL-C23024ß

5

5

80

0

100

NNC*

0

15

46.6

0

0

LL-C23024ß

120

15

100

100

100

60

15

100

100

100

30

15

100

100

100

0

15

20

0

0

NNC

15

100

-

-

LL-C23024ß

20

15

100

87

100

15

15

100

60

100

10

15

60

0

0

5

15

47

7

0

0

15

27

0

0

NNC

15

100

-

_

* nichtbehandelte, nichtinfizierte Kontrolltiere

Tabelle VI

Bewertung des Antibiotikums LL-C23024jotà als Mittel gegen Coccidien bei Küken

Konzentration im Futter Anzahl der Vögel % Überlebende % Vögel mit verringerten Läsionen

(TpM) zu Beginn E. tenella E. acervulina

15 5 100 100 100

10 5 100 100 100

5 5 60 20 60

0 15 20 0 0

15 10 100 100 100

7,5 10 100 70 100

Durch die folgenden Tests wird die nematocide Aktivität demonstriert.

Beispiel A

Bewertung von Testzusammensetzungen hinsichtlich der nematociden Aktivität unter Verwendung der freilebenden, hermaphroditischen, mikrobienfressenden Nematode Cae-norhabditis elegans II

Bei den folgenden Tests werden C. elegans zur Bestimmung der nematociden Aktivität der Fermentationsbrühe und der geernteten Maische, die nach dem Verfahren gemäss der Erfindung hergestellt wurden, verwendet. Dieser Organismus wird ebenfalls zur Bewertung von LL-C23024a und LL-C23024ß verwendet, um deren nematocide Aktivität zu bestimmen.

Bei diesen Tests handelt es sich bei der Fermentationsbrühe um die bei der Fermentation erhaltene Mischung von Flüssigkeit und Feststoffen, die entnommen wird, bevor die Feststoffe, d.h. die geerntete Maische, von der Flüssigkeit 45 abgetrennt wird. Bei der geernteten Maische handelt es sich um die Feststoffe, die nach der Abtrennung zurückbleiben.

Zur Bewertung der geernteten Maische werden die Feststoffe der geernteten Maische in destilliertem Wasser im Verhältnis 1:1 dispergiert. Die Fermentationsbrühe wird so, wie so sie ist, verwendet und enthält sowohl Flüssigkeit als auch Feststoffe.

Bei den vorliegenden Bewertungen wird C. elegans in einem C. briggsae Maintenance Medium aufbewahrt. Das Maintenance-Medium ist im Handel erhältlich von Grant 55 Island Biological Company, Grant Island, New York, und weist die folgende Zusammensetzung auf.

7

661 283

C. briggsae Maintenance Medium1

Komponente mg/1

Anorganische Salze

CaCl2-2H20

220,50

CuCh-2H20

6,50

Fe(NH4>(S04)2-6H2/

58,80

KH2PO4

1225,50

KOH

a

MnCl2-4H20

22,20

ZnCh

10,20

Andere Komponenten

N-Acetylenglucosamin

15,00

Adenosin-3'-(2')-phosphorsäure • H2O

365,00

Cytidin-3'-(2')-phosphorsäure

323,00

D-Glucose

1315,00

Glutathion, reduziert

204,00

Guanosin-3'-(2')-P04Na2 ■ H2O

' 363,00

Magnesiumeitrat-5H20 (dibasisch)

915,00

Kaliumeitrat - H2O

486,00

DL-Thioktsäure

3,75

Thymin

126,00

Uridin-3'-(2')-phosphorsäure

324,00

Aminosäuren

L-Alanin

1395,00

L-Arginin

975,00

L-Asparaginsäure

1620,00

L-Cystein-HCl • H2O

28,00

Gl-Glutamat (Na) • H2O

550,00

L-Glutamin

1463,00

Glycin

722,00

L-Histidin

283,00

L-Isoleucin

861,00

L-Leucin

1439,00

L-Lysin-HCl

1283,00

L-Methionin

389,00

L-Phenylalanin

803,00

L-Prolin

653,00

L-Serin

788,00

L-Threonin

717,00

L-Tryptophan

184,00

L-Tyrosin

272,00

L-Valin

1020,00

Vitamine

p-Aminobenzoesäure

7,50

Biotin

3,75

Cholindihydrogencitrat

88,50

Cyanocobalamin (B12)

3,75

Folinat (Ca)

3,75

Myo-inosit

64,50

Niacin

7,50

Pantethein (Pantethine)

3,75

Pantothenat (Ca)

7,50

Pterolyglutaminsäure

7,50

Pyridoxalphosphat

3,75

Pyridoxamin 2HC1

3,75

Pyridoxin HCl

7,50

Riboflavin-5'-P04(Na) • 2H2O

7,50

Thiamin HCl

7,50

Für die Bewertungen wird eine Lochplatte mit einer Reihe von kleinen Löchern verwendet. 25 ml der Fermentationsbrühe, der 1:1 Wasser/geerntete Maische-Suspension oder einer wässrigen Acetonlösung von LL-C23024a oder LL-C23024ß, enthaltend 31,25 bis 500 TpM der Testverbindung, werden unter aseptischen Bedingungen in gesonderten Schächten deponiert. Jedem Schacht werden dann 25 ml des C. elegans Maintenance Mediums, enthaltend 10 bis 20 adulte Würmer plus Larven verschiedenen Alters plus Eier, zugesetzt. Die Platten werden anschliessend in einen Abzug plaziert und 48 h nach der Inokulation untersucht, um die Geschwindigkeit und den Grad der nematociden Aktivität der Testzusammensetzungen zu beurteilen. Die erhaltenen , Daten sind im folgenden aufgeführt. In den Fällen, in denen bei der Fermentationsbrühe eine Aktivität beobachtet wird, wird die Brühe weiter verdünnt, um ein 1:4 Brühe/C. elegans-Verhältnis zu schaffen.

Tabelle VII

Zusammensetzung

Konzentration (TpM)

Nematocide

oder Verdünnung

Aktivität während 48 h

Fermentationsbrühe

D=l:l

8 (keine Bewe

D = 1:4

gungsfähigkeit)

geerntete Maische

LL-23024«

500 TpM

7

250 TpM

7

125 TpM

7

62,5 TpM

6

31,25 TpM

0

LL-23024ß

500 TpM

7

250 TpM

0

Die bei diesen Bewertungen verwendete Aktivitätseinteilung ist wie folgt:

Aktivitätslegende

8 = keine Bewegungsfähigkeit (scheinbar tot)

7 = merklich reduzierte Bewegungsfähigkeit 6 = verringerte Bewegungsfähigkeit 0 = normale Bewegungsfähigkeit der Species

Beispiel B

Bewertung von LL-C23024a als nematocides Mittel gegen infektiöse Larven (Larven im dritten Häutungsstadium) von Wiederkäuernematoden

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wird die Bewertung von LL-C23024a als nematocides Mittel gegen infektiöse Larven von Wiederkäuernematoden durchgeführt,

wobei folgende Nematodenspecies anstelle von C. elegans verwendet wurden: Haemonhmus contortus, Ostertagia cir-cumcincta, Trichostrongylus axei, T. colubriformis; sowie der Essigälchenwurm, Turbatrix aceti. Die erhaltenen Daten sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Ii. den folgenden Tabellen bezieht sich die Aktivitätseinteilung auf die zuvor aufgeführte Aktivitätslegende.

Literatur:

1 E.L. Hansen, Proc. Soc. Exp. Bio. & Med. 121,30-393 (1966); Bemerkungen:a So viel, wie nötig, um den pH auf 5,9 ± 0,1 einzustellen.

661 283

8

Tabelle Vili

In-vitroa-Konzentr. von Aktivität gegen (bei 48 Stunden)

LL-C23024a (TpM) H. contort. O. circum. T. axei T. colub. T. aceti

500 8 8b • 8b 8 6

250 7 8b 8b 7 6

125 7 7 7 6 6

62,5 7 6 7 6 6

31,25 6 6 0 6 6

0 (Vergi.) 0 0 0 0 0

a Durchgeführt in Gewebekulturplatten mit 96 Schächten, X14868A, hergestellt in doppeltdestilliertem Wasser: 25 ul LL-C23024a-Lösung und 25 |il der Nematodenkultur werden pro Schacht zugesetzt.

b innerhalb von 24 h

Beispiel C

Bewertung der nematociden Aktivität des Antibiotikums LL-C23024a gegen Nematospiroides dubius und Aspicularis tetraptera bei Mäusen

Bei den folgenden Tests werden weibliche, weisse Swiss-Webstermäuse mit Nematospiroides dubius und Aspicularis tetraptera infiziert und 3 Wochen gehalten, um die Infektionen sich entwickeln zu lassen.

Nach diesem Zeitraum des Haltens werden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Gruppen von vier aufgeteilt. Die Gruppen werden in getrennte Käfige plaziert. Anschliessend wird ein mit Medikamenten behandeltes Futter angeboten, welches von etwa 31,25 TpM bis 4000 TpM der Testverbindung enthält. Das Futter wird den Mäusen eine Woche lang ad libitum angeboten. Wasser wird ebenfalls ad libitum während der Testperiode zur Verfügung gestellt. Während der Behandlungsperiode werden die Ausscheidungen der Mäuse untersucht, um zu bestimmen, ob Würmer ausgeschieden werden. Bei allen behandelten Gruppen wurde festgestellt, dass sie Würmer ausscheiden. Dadurch wird eine nematocide Aktivität bei allen Konzentrationen der Verbindung gegenüber beiden Nematoden angezeigt. Am Ende der einwöchigen Behandlung mit medikamentiertem Futter werden die Mäuse getötet und die Inhalte der intestinalen Trakte der Mäuse werden auf Würmer untersucht. Die erhaltenen Werte sind im folgenden als prozentuale Verringerung von Würmern, verglichen mit infizierten, nicht-medikamentierten Kontrolltieren, ausgedrückt.

Bei diesen Tests wurden rohe Fermentationsbrühen bewertet, welche vor Ernte der Maische erhalten wurden und welche 1000 bis 4000 TpM des nematociden Antibiotikums enthielten. Das Mäusefutter, welches mit 31,25 bis 500 TpM LL-C23024a, gelöst in einem Aceton/Wasser-Gemisch (1:1), behandelt war, wurde ebenfalls bewertet.

Testzusammen- Nahrung Aktivität (% Reduktion)***

Setzung Konz. TpM gegen

N. Dubius A. Tetraptera

♦Fermentationsbrühe 4000 mit LL-C23034a 2000 LL-C23024a 1000 500 250 125 62,5 31,25

* Menge an LL-C23024a nicht bestimmt ** geringfügige Aktivität: gesteigerte Zahl von Pinwürmern bei der fäkalen Untersuchung entdeckt *** verglichen mit infizierten, nichtmedikamentierten Kon-25 trolltieren.

Die neuen antibakteriellen und gegen Coccidia wirkenden Mittel gemäss der Erfindung werden bei der Kultivierung von 30 Actinomadura yumaense sp. nov. unter kontrollierten Bedingungen gebildet.

Ein repräsentativer Stamm dieses Mikroorganismus wurde von einer Bodenprobe isoliert, die in Yuma County, Arizona, gesammelt wurde. Der Stamm wird in der Culture 35 Collection der Lederle Laboratories Division, American Cya-namid Company, Pearl River, New York, als Kultur-Nr. LL-C23024 aufbewahrt. Eine lebensfähige Kultur dieses repräsentativen Stamms ist am 10. August 1981 bei Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U.S. 40 Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt und in deren permanenter Sammlung unter der Nr. NRRL 12515 aufgenommen worden.

Taxonomische Charakterisierung von NRRL 12515 45 Der Stamm NRRL 12515 ist taxonomisch charakterisiert und identifiziert worden als Stamm einer neuen Species der Art Actinomadura, welcher als Actinomadura yumaense sp. nov. bezeichnet wird.

Die kulturellen, physiologischen und morphologischen so Merkmale des repräsentativen Stamms NRRL 12515 wurden untersucht, und zwar unter Verwendung von Verfahren, welche beschrieben wurden von E.B. Shirling und D. Gottlieb, «Methods for characterization of Streptomyces species», Internat. J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340 (1966), und R.E. Gor-55 don et al., «Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardin strain», internat. J. Syst. Bacteriol. 24: 54-63 (1974). Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien wurden ausgewählt unter solchen, welche von T.C. Pridham et al., «A selection of media for maintenance and taxonomic bo study of Streptomycetes», Antibiotics Ann., Seiten 947-953 (1956/1957); G.F. Gauze et al., «Problems in the classification of antagonistic actinomycetes», State Publishing House for Medicai Literature, Medgiz, Moskau (1957); und R.E. Gordon et al., supra, für die taxonomischen Untersuchungen es von Actinomyceten und Bodenbakterien empfohlen werden. Die chemische Zusammensetzung der Zellwände des Mikroorganismus wurde bestimmt unter Anwendung des Verfahrens von H.A. Lechevalier et al., «Chemical composition as a

73

-

44

53

65

33

70

SA**

63

SA

61

SA

29

SA

32

SA

9

661 283

criterion in the classification of actinomycetes», Adv. Apll. Microbiol. 14:47-72 (1971). Die Phospholipid-Muster wurden bestimmt unter Anwendung des Verfahrens von M.P. Lechevalier et al., «Chemotaxonomy of aérobic actinomycetes: phospholipid composition», Biochem. Syst. Ecol. 5: 249-260 (1977). Einzelheiten sind in den Tabellen VII bis IX zusammengestellt. Eine allgemeine Beschreibung der Kultur ist unten angegeben. Die unterstrichenen Farbnamen sind entnommen aus K.K. Kelly und D.B. Judd, «Color. Universal Language and Dictionary of Names», U.S. Nat. Bur. Stand., Spec. Pubi. 440, Washington, C.D. (1976), und dem begleitenden Inter-Society Color Council, Nati. Bur. Stand. Centroid Color Charts.

Die für diese neue Species, repräsentiert durch den Stamm NRRL 12515, beobachteten Daten wurden mit den Daten verglichen, die für die bekannten Species der Gattung Actinomadura publiziert sind [M. Goodfellow et al., «Nume-rical Taxonomy of Actinomadura and related actinomycetes», J. Gen. Microbiol. 122: 95-111 (1979); L.H. Huang, «Actinomadura macry sp. nov., the producer of antibiotic CP-47,433 and CP-47,434», Internat. J. Syst. Bateriol., 30: 565-568 (1980); J. Meyer, «New species of the genus Antino-madura», Z. Allgem. Mikrobiol. 19: 37-44 (1979); H. Nomura und Y. Ohara, «Distribution of actinomycetes in soil. XI. Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier et al.», J. Ferment. Technol. 49:904-912 (1971); und T.P. Preo-brazhenskaya et al., «Key for identification of the species of the genus Actinomadura», The Biology of Actinomycetes and Related Organisms 12:30-38 (1977)]. Die Kultur NRRL 12515 hat eine geringe Ähnlichkeit mit Actinomadura pelle-tieri, weist jedoch keine Ähnlichkeit mit irgendeiner anderen beschriebenen Species auf und unterscheidet sich von A. pel-letieri in einer Vielzahl von Eigenschaften. Der Stamm NRRL 12515 wurde daher als der Typenstamm einer neuen Species bezeichnet und Actinomadura yumaense sp. nov. benannt, wobei die Benennung nach dem Ort der Sammlung der Bodenprobe erfolgt, aus der der Typenstamm isoliert wurde.

Mikromorphologie

Sporen werden in kurzen, spiralförmigen Ketten (maximale Länge etwa 20 Sporen/Kette) auf verzweigten, fast verti-cillaten (quirlblättrigen) Luftsporophoren gebildet. Die Sporen sind ovoid (eiförmig), 0,6 bis 0,8 Mikron x 1,0 bis 1,4 Mikron, mit einer glatten Oberfläche.

Zellwandzusammensetzung

Gesamtzellenhydrolysate dieser Kultur enthalten Madu-rose (3-O-Methyl-D-galactose) und das Mesoisomere der Diaminopimelinsäure (DAP). Die Kultur weist auch ein Typ P-l Phospholipid-Muster auf und keine anderen diagnostischen Phospholipide als etwas Phosphatidylglycerin. Diese Charakteristika sind alle sehr typisch für Mitglieder der Gattung Actinomadura.

Wachstumseigenschaften

Ein gutes Wachstum wird beobachtet auf Bennett's Agar, Gauze Nr. 2 Agar, NZ-Amin-Stärke-Glucose-Agar (ATCC Medium 172), Tomatenpaste-Hafermehl-Agar und Hefeex-s trakt-Malzextrakt-Agar; massiges Wachstum wird beobachtet auf Benedict's Agar, Czapek's Saccarose-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar, Hickey-Tresner-Agar und Hafermehl-Agar; ein geringes Wachstum wird beobachtet auf Calciummalat-Agar, Gauze Nr. 1 Agar und anorganische Salze-Stärke-Agar.

10

Vegetatives Myzel

Auf Media, bei denen gutes Wachstum auftrat, wurde beobachtet, dass sich das vegetative Myzel entwickelte und zusammenrollte und allmählich gelblich-graue Farbschattie-15 rangen annahm.

Luftmyzel und Sporenfarbe

Das Luftmyzel und/oder die Sporenmassen waren weiss bis 264. light gray gefärbt. Die Luftmyzelbildung ist auf den 20 meisten Media leicht.

Lösliche Pigmente

Fehlend auf vielen Media; gelbes Pigment auf Benedict's und Glycerin-Asparagin-Agar; gelb-grünes Pigment auf Cal-25 ciummalet-Agar; grünlich-braunes Pigment auf NZ-Amin-Stärke-Glucose-Agar; orangefarbenes Pigment auf Bennett's und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agars.

Physiologische Reaktionen 30 Keine Melamin-Pigmente auf Pepton-Eisen-Agar und Tyrosin-Agar (ISO-7) ; starke Peptonisierung von Lackmusmilch; starke Proteolyse von Nährgelatine; massige Reduktion von Nitrat; keine Hydrolyse von Adenin oder Guanin; starke Hydrolyse von Hypoxanthin, Tyrosin und Xanthin; 35 schwache Hydrolyse von Stärke; Hydrolyse von Asculin; variable Hydrolyse von Harnstoff. Kein Wachstum bei 4 °C, 10 °C oder 55 °C; mässiges Wachstum bei 25 °C und 45 °C; gutes Wachstum bei 32 °C und 37 °C. Kohlenhydratnutzung nach dem Verfahren von T.G. Pridham und D. Gottlieb, «The 40 Utilization of carbon Compounds by some actinomycetales as an aid for species détermination», J. Bacteriol. 56: 107-114 (1948): gute Nutzung von Glucose, Glycerin und Trehalose; mässige Nutzung von Maltose und Saccharose; schlechte Nutzung von Fructose, Galactose, Inosit, Mannose und Mele-45 zitose; keine Nutzung von Adonit, Arabinose, Dulcit, Lactose, Mannit, Melibiose, Raffinose, Rhamnose, Salicin, Sorbit und Xylose. Säurebildung aus Kohlenhydraten nach dem Verfahren von Gordon et al., supra: gute Säureproduktion von Glucose, Glycerin, Maltose, Saccharose und Trehalose; 50 schwache Säureproduktion von Galactose, Inosit und Mannose. Nutzung von organischen Säuren nach dem Verfahren von Gordon et al., supra: Nutzung von Acetat, Malat, Propionat, Pyruvat, Succinat und Tartrat; keine Nutzung von Ben-zoat, Citrat, Lactat, Mucat und Oxalat.

661283

10

Tabelle VII

Kulturcharakteristika von Actinomadura yumaense NRRL 12515 Inkubation: 14 Tage, Temperatur: 28 °C

Medium

Wachstum

Luftmyzel und/oder Sporen

Lösl. Pigment Rückseitenfarbe

Benedict's Agar Bennett's Agar mässig bis schlecht gut

Calciummalat-Agar schlecht

Czapek's Saccharose-Agar Gauze Nr. 1 Agar mässig bis schlecht schlecht

Gauze Nr. 2 Agar gut

Glycerin-Asparagin schlecht Agar bis mässig

Hickey-Tresner Agar mässig anorgan.

Salze-Stärke-Agar NZ-Amin-Stärke-Glucose-Agar

Hafermehl-Agar

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar Hefeextrrakt-Malz- gut extrakt-Agar schlecht gut mässig gut flach, pulvrige Kolonien; Luftmyzel weiss bis 264. light gray kein Luftmyzel; gerolltes, vegetatives Wachstum 93. yellowish gray bis 80. grayish yellowish brown flaches Wachstum; spärliches, weisses Luftmycel flaches Wachstum; mässiges Luftmyzel vegetatives Wachstum 90. grayish yellow farbloses, flaches Wachstum; spärliches, weisses Luftmyzel erhabene, gerollte Kolonien; vegetatives Myzel 93. Yellowish gray; mässiges Luftmyzel, 92. yellowish white flache, pulvrige Kolonien; weisses Luftmyzel flache, wachsartige Kolonien, 90. grayish yellow spärliches Luftmyzel, weiss bis 264. light gray flache, farblose, pulvrige Kolonien; weisses Luftmyzel stark gerolltes Wachstum, 61. grayish brown bis 65. brownish black; mässiges Luftmyzel, weiss bis 264. light gray flaches, wachsartiges Wachstum, 90. grayish yellow; mässiges Luftmyzel, weiss flaches, wachsartiges Wachstum, 91. dark grayish yellow; Spur eines weissen Luftmyzels erhabene, wachsartige, gerollte Kolonien, 93. yellowish gray bis 80. grayish yellowish brown; kein Luftmyzel gelblich

89. pale yellow orangefarben 81. dark grayish

yellowish brown gelb-grün

90. greenish yellow keines

89. pale yellow keines farblos keines

72. dark orange

yellow gelb

89. pale yellow keines

90. grayish yellow keines farblos grünlich-braun

78. dark yellowish

brown keines

90. grayish yellow keines orangefarben 78. dark yellowish brown

Tabelle VIII

Mikromorphologie von Actinomadura yumaense NRRL 12515

Medium

Luftmyzel und/oder sporifere Strukturen Sporenform

Sporengrösse

Sporenoberfläche

Czapek's

Luftsporophoren; verzweigt, fast kreisförmig angeordnet; ovoid

0,6-0,8 Mikron glatt

Saccharose relativ kurze, spirale Ketten von reifen Sporen tragend

X

Agar

1,0-1,4 Mikron

11

661 283

Tabelle IX

Physiologische Reaktionen von Actinomadura yumaense NRRL 12515

Medium

Inkubationsdauer (Tage)

Wachstum

Physiologische Reaktion

Pepton-Eisen-Agar

7

gut leichte Braunfärbung

14

gut leichte Braunfärbung

Tyrosin-Agar

7

mässig kein Pigment

14

gut gelbliches Pigment

Lackmusmilch

14

gut gute Peptonisierung

28

gut starke Peptonisierung

Nährgelatine

14

gut geringfügige Proteolyse

28

gut totale Proteolyse

Nitratbrühe

14

gut sehr schwache Reduktion

28

gut mässige Reduktion

Adenin-Agar

14

gut keine Hydrolyse

21

gut keine Hydrolyse

Guanin-Agar

14

gut keine Hydrolyse

21

gut keine Hydrolyse

Hypoxanthin-Agar

14

gut totale Hydrolyse

21

gut totale Hydrolyse

Tyrosin-Agar

14

gut starke Hydrolyse

21

gut starke Hydrolyse

Xanthin-Agar

14

gut mässige Hydrolyse

21

gut starke Hydrolyse

NZ-Amin mit lösl.

5

schlechtes oder kein Wachstum bei 4°, 10° und

Stärke und

55 °C; mässiges Wachstum bei 25°, 28° und 45 °C;

Glucose-Agar

gutes Wachstum bei 32° und 37 °C

(ATCC Med. Nr.

172)

Harnstoff-Brühe

28

gut

Zersetzung variabel

Äsculin-Brühe

14

gut

Hydrolyse

28

gut

Hydrolyse

Stärke-Agar

5

gut keine Hydrolyse

10

gut keine Hydrolyse

661 283

12

Tabelle X

Kohlenstoffquellennutzung von Actinomadura yumaense NRRL 12515 auf ISP-9 Kohlenhydratnutzungsmedium Inkubation: 28 Tage, Temperatur: 28 °C

Kohlenstoffquelle

Nutzung

Tabelle XII

Nutzung organischer Säuren mittels Actinomadura yumaense NRRL 12515 auf Gordon's Modifizierung von Koser's Basal Agar (Koser's Citrat-Agar)

Inkubation: 28 Tage, Temperatur: 28 °C

Adonit

1-Arabinose

Dulcit

Fructose d-Gr'actose d-G cose

Gly rin i-Inosit

Lactose

Maltose d-M mnit d-Mannose d-Melezitose d-Malibiose d-Raffinose

1-Rhamnose

Salicin

Sorbit

Saccharose d-Trehalose d-Xylose negative Kontrolle schlecht schlecht gut gut schlecht mässig schlecht

Kohlenstoffquelle

Nutzung

Acetat

+

Benzoat

—

Citrat

—

Lactat

—

Malat

+

Mucinsäure

—

Oxalat

—

Propionat

+

Pyruvat

+

Succinat

+

Tartrat

+

+ = positive Reaktion; - = negative Reaktion

Es ist darauf hinzuweisen, dass der Ausdruck « Actinoma-

massig gut

Tabelle XI

Säurebildung aus verschiedenen Kohlenhydraten mittels Actinomadura yumaense NRRL 12515 auf Gordon's basalem anorganischem Stickstoffmedium Inkubation: 28 Tage Temperatur: 28 °C

Kohlenstoffquelle

Säurebildung 7 Tage 28 Tage

Adonit

1-Arabinose

Dulcit

Fructose d-Galactose d-Glucose

Glycerin

I-Inosit

Lactose

Maltose d-Mannit d-Mannose d-Melezitose d-Melibiose d-Raffinose

1-Rhamnose

Salicin

Sorbit

Saccharose d-Trehalose d-Xylose negative Kontrolle

+ + + + +

+

+ + + + + + +

+ + +

+ + + + + +

+ + + = starke, positive Reaktion + + = mässige, positive Reaktion + = geringe, positive Reaktion — = negative Reaktion dura yumaense» nicht auf den Stamm Actinomadura yumaense NRRL 12515 oder auf Stämme beschränkt ist, die in vollem Umfang den obigen Wachstums- und mikroskopischen Charakteristika entsprechen, welche lediglich zur Illustration 30 angegeben sind. Das hier beschriebene Actinomadura yumaense umfasst alle Stämme von Actinomadura yumaense, welche die Antibiotika LL-C23024«, ß und jota bilden und welche nicht eindeutig von Actinomadura yumaense NRRL 12515 und dessen Subkulturen einschliesslich der Mutanten 35 und Varianten derselben unterschieden werden können. Der Begriff «Mutanten» umfasst die natürlichen (spontanen) Mutanten dieses Organismus sowie die induzierten Mutanten, die, ausgehend von diesem Organismus, mittels verschiedener, mutagener Mittel, welche dem Fachmann geläufig sind, 40 hergestellt werden können. Derartige Mittel sind beispielsweise das Bestrahlen mit Röntgenstrahlung, Ultraviolettstrahlung, das Behandeln mit Stickstofflost, Actinophagen, Nitro-saminen und dergleichen. Ebenfalls sollen die inter- und intraspezifischen, genetischen Rekombinanten, die mittels •45 bekannter genetischer Techniken hergestellt werden können, umfasst sein. Solche genetischen Techniken sind beispielsweise Konjugation, Transduktion und Techniken des genetic engineering.

Die Kultivierung von Actinomadura yumaense kann mit so einer weiten Vielzahl von festen oder flüssigen Kulturmedia durchgeführt werden. Brauchbare Media zur Bildung der Antibiotika LL-C23024cc, ß und jota umfassen eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maiswasser usw., sowie anorganische 55 Anionen und Kationen, wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid usw. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän, Kupfer usw. werden als Verunreinigungen anderer Bestandteile der Media zur Verfügung gestellt. Die Belüftung in Tanks oder Flaschen erfolgt, indem 60 man sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentiermediums drückt. Eine weitergehende Bewegung in den Tanks wird durch einen mechanischen Propeller gewährleistet. Ein Antischäummittel, wie Schmalzöl oder Silikon-Entschäumer, kann erforderlichenfalls zugesetzt werden. 65 Actinomadura yumaense wird auf geneigten Agarplatten (agar slants) aufgezogen und am Leben gehalten, z.B. auf Bennett's Agar, Hefe-Malz-Agar oder ATCC Medium Nr. 172. Das ATCC Medium Nr. 172 ist bevorzugt. Die geneigte

13

661 283

Platte wird mit einer Kultur von Actinomadura yumaense Medium E %

inokuliert und etwa 7 Tage bei 28 bis 37 °C, vorzugsweise bei Stärke 1

etwa 32 °C, inkubiert. Diese Basiskulturen können durch Melassen 2

serienweise Übertragung auf frische Agar slants am Leben Sojamehl 1,5

erhalten werden, oder es kann auch ein Pfropfen des Agars 5 Calciumcarbonat 0,1

mit einem Gehalt an Myzel von dem gut entwickelten Agar Wasser qs. 100 slant verwendet werden, um flüssige Media zu inokulieren.

Durch Inokulation von 100 ml sterilem, flüssigen Medium Medium F %

in 500-ml-Flaschen mit den von einem Agar slant der Kultur Glucose 3

abgekratzten oder abgewaschenen Sporenmaterial werden io lösliche Fleischbestandteile 2,5

Schüttelflaschen-Impfzubereitungen von Actinomadura Natriumchlorid 0,2

yumaense hergestellt. Beispiele geeigneter Saatmedia sind die Calciumcarbonat 0,1

folgenden. •- Wasser qs. 100

Medium A Rinderextrakt Bacto® Trypton1 Glucose Hefeextrakt Wasser qs.

%

0,3 0,5 1,0 0,5 100

(' ein Pepton, Warenzeichen von Difco Laboratories, Detroit, Michigan)

Der pH-Wert wird mit einer verdünnten Base, z.B. Natriumhydroxid, auf 6,8 bis 7,2 eingestellt.

Medium B Glucose Stärke Hefeextrakt NZ-Amin A® 2 Calciumcarbonat Wasser qs.

%

1

2

0,5 0,5 0,1 100

Medium C

Glucose

Glycerin

Sojamehl3

Calciumcarbonat

Natriumchlorid

Wasser qs.

%

1,5 1,5 1,5 0,1 0,3 100

(3 kann durch Baumwollsamenöl oder lösliche Fleischbestandteile mit gleichem Effekt ersetzt werden.)

Medium D

Glucose

Sojamehl

Calciumcarbonat

Natriumchlorid

Wasser qs.

%

3,0 1,5 0,1 0,3 100

Medium G

Glucose

Sojamehl

Ammoniumsulfat

Natriumchlorid

Calciumcarbonat

Wasser qs.

Medium D ist bevorzugt

Medium H Glucose

Ammoniumsulfat dibasisches Kaliumphosphat Calciumcarbonat Natriumchlorid Wasser qs.

Medium D ist bevorzugt.

%

3

0,5 0,3 0,2 0,1 100

%

3

0,3 0,1 0,2 0,1 100

(2 Casein-Verdauungsprodukt, Warenzeichen von Sheffield Chemical Co., Div. Nat'l. Dairy Products Corp., Norwich, N.Y.).

Medium B wird bevorzugt.

Die Flaschen werden bei einer Temperatur von 25 bis 35 °C, vorzugsweise bei 32 °C, inkubiert und 1 bis 4 Tage auf einer rotierenden Schüttelmaschine heftig geschüttelt. Dieses Saatinokulum wird anschliessend verwendet, um die Fermentationskultur zu inokulieren. Die Saatkultur kann auch gefroren und gelagert werden, um für anschliessende Saatkulturen ein Inokulum bereitzustellen.

Die im folgenden angegebenen Media sind Beispiele für brauchbare Media zur Fermentierung von Actinomadura yumaense, um Antibiotika LL-C23024a, ß und jota herzustellen.

Die Fermentierung kann in 100 ml der Media in einer 35 500-ml-Flasche durchgeführt werden, wobei mit 3 bis 10% (Vol/Vol) einer Saatkultur inokuliert wird, die auf die zuvor beschriebene Weise hergestellt wurde. Die Inkubation erfolgt bei 25 bis 35 °C, vorzugsweise bei etwa 32 °C, während 24 bis 72 h unter Belüftung. Proben der Fermentationskultur kön-40 nen eingefroren und gelagert werden, um sie später als Inokulum für Saatkulturen zu verwenden.

Alternativ kann die Fermentation auch in grösseren Fermentationstanks durchgeführt werden, welche mit einer Belüftungseinrichtung und einer Rühreinrichtung ausgerüstet 45 sind. Jeder Tank wird mit 3 bis 10% (Vol/Vol) des auf die oben beschriebene Weise hergestellten Inokulums inokuliert. Die Belüftung wird mit einer Rate von 0,5 bis 2,01 steriler Luft/1 Brühe/min durchgeführt und das Fermentierungsme-dium wird mittels eines Propellers, der mit 200 bis 400 U/min so angetrieben wird, gerührt. Die Temperatur wird bei 25 bis 35 °C, vorzugsweise bei 32 °C, gehalten. Die Fermentation wird so lange fortgeführt, bis sich Antibiotika in dem Fermentationsmedium anreichern, gewöhnlich nach 100 bis 150 h. Zu diesem Zeitpunkt wird das Antibiotikum geerntet. 55 Das Antibiotikum kann gemäss den in der US-PS 4 278 663 beschriebenen Verfahren geerntet und gereinigt werden oder gemäss der folgenden Verfahrensweise.

Die rohe Fermentationsbrühe mit einem Gehalt der gesamten Zellen und hergestellt auf die oben beschriebene 60 Weise wird mit einem gleichen Volumen eines beliebigen Nicht-Kohlenwasserstoff-, wasserunmischbaren, organischen Lösungsmittels vermischt. Methylenchlorid oder Äthylacetat ist bevorzugt. Die organische Phase wird abgetrennt und im Vakuum zu einem öligen Sirup konzentriert.

65 Der ölige Siurp wird in Methylenchlorid aufgelöst und auf eine Säule aus Silikagel, Aluminiumoxid, Sephadex LH-20® (Pharmacia Fine Chemicals Div. of Pharmacia, Inc., Pis-cataway, N.J.) oder Magnesiumaluminiumsilikat gegeben.

661283

14

Beispiele geeigneter Lösungsmittel zur Entwicklung der Säule sind Diäthyläther, Äthylacetat, eine 1:1- bis 1:7- (Vol/Vol)-Mischung von Methylenchlorid :Äthyläther, 10 bis 40% Aceton in Methylenchlorid, 2 bis 10% niederer Alkohol (Methanol ist bevorzugt) in Methylenchlorid, 2 bis 15% Acetonitril in Methylenchlorid oder 2 bis 15% Dioxan in Methylenchlorid. Methylenchlorid :Äthylacetat 1:1 (Vol/Vol) ist bevorzugt. Es werden Fraktionen aufgefangen und auf das Vorliegen von antibakterieller Aktivität untersucht, und zwar mittels eines Bioassays gegen einen empfänglichen Organismus, z.B. Bacillus subtilis. Aktive Fraktionen werden kombiniert und im Vakuum zu einem Rückstand konzentriert. Dieser Rückstand wird in einem organischen Lösungsmittel, z.B. t-Butanol (bevorzugt), Benzol oder p-Dioxan, aufgelöst und gefriergetrocknet.

Der gefriergetrocknete Feststoff wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid, Hexan, Methylenchlorid :Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan :Äthylace-tat, Hexan :Chloroform oder Hexan Äther, aufgelöst. Diäthyläther ist bevorzugt. Diese Lösung wird mit Wasser geschüttelt und der pH auf 1,5 bis 4,0, vorzugsweise etwa 2,5, mit einer beliebigen, verdünnten Mineralsäure eingestellt. Die organische Phase wird abgetrennt, mit Wasser zur Entfernung überschüssiger Säure gewaschen, über einem geeigneten Trocknungsmittel getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem Rückstand konzentriert.

Dieser Rückstand wird in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst und die Lösung langsam eindampfen lassen, vorzugsweise bei etwa 4 °C. Beispiele geeigneter Lösungsmittel sind Methylenchlorid, Hexan, Methylenchlorid Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan :Äthylacetat, Hexan :Chloroform oder HexanrÄther. Hexan:Äther 5:2 (Vol/Vol) ist bevorzugt. Die resultierenden Kristalle werden gesammelt und mit einem beliebigen, mässig siedenden Kohlenwasserstoff, wie Hexan oder Heptan, gewaschen, vorzugsweise bei etwa 40 °C, und an der Luft getrocknet. Man erhält so als Endprodukt das Antibiotikum X-14868A in Form der freien Säure.

Falls das Produkt in Form eines Salzes erwünscht ist,

kann die freie Säure durch eine Behandlung mit einem zweckentsprechenden Kation, vorzugsweise in Form einer verdünnten, mineralischen Base, umgewandelt werden, und zwar nach Verfahrensweisen, die dem Fachmann geläufig sind.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert. Bei den Media A, B, C usw. handelt es sich um die oben definierten. Falls nichts anderes angegeben ist, werden alle Verfahren bei Zimmertemperatur (ungefähr 22 °C) und bei 1 at Druck durchgeführt.

Beispiel 1

Gewaschene Sporen von einem Agar slant von Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden verwendet, um eine 500-ml-Flasche, enthaltend 100 ml seriles Medium B, zu inokulieren. Die Flasche wird 2 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 28 °C inkubiert.

Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird anschliessend zu 100 ml sterilem Medium C in einer 500-ml-Flasche transferiert und 5 Tage bei 28 °C auf einem Rotationsschüttler inkubiert.

Das Vorliegen von antibiotischer Aktivität wird täglich mittels eines Bioassays gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Bacillus subtilis und Streptococcus faecalis beobachtet und die anthelmintische Aktivität wird mittels eines Bioassays gegen die freilebende Nematode Caenorhabditis elegans beobachtet.

Beispiel 2

Es werden sieben 500-ml-Flaschen vorbereitet, jede enthaltend 100 ml eines der folgenden sterilen Media:

Flasche 1:100 ml Medium C

Flasche 2:100 ml Medium C mit 1,5% Baumwollsamenöl anstelle des Sojamehls

Flasche 3:100 ml Medium C mit 1,5 % lösliche Fleischbestandteile anstelle des Sojamehls

Flasche 4: 100 ml Medium D

Flasche 5: 100 ml Medium E

Flasche 6:100 ml Medium F

Flasche 7:100 ml Medium G.

Diese Flaschen werden jeweils mit einem 5% Inokulum von Actinomadura yumaense NRRL 12515, in Medium B gewachsen, inokuliert. Die Flaschen werden anschliessend 4 bis 6 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 28 °C inkubiert. Jede der obigen Kulturen erwies sich als aktiv, wenn sie gemäss Beispiel 1 hinsichtlich ihrer antibiotischen Aktivität untersucht wurde und wenn sie hinsichtlich ihrer Anticocci-dienaktivität gegen Eimeria tenella in Kükennieren-Gewebekulturen untersucht wurde.

Beispiel 3

Gefrorene Fermentationskulturzellen von Actinomadua yumaense NRRL 12515 werden verwendet, um eine 100 ml steriles Medium B enthaltende 500-ml-Flasche zu inokulieren. Die Flasche wird anschliessend 4 Tage bei 32 °C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird anschliessend zu 100 ml sterilem Medium H in einer 500-ml-Flasche transferiert und 5 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 28 °C inkubiert.

Die antibakterielle Aktivität wird gemäss Beispiel 1 festgestellt und die Anticoccidienaktivität gemäss Beispiel 2. Das Vorliegen der antibiotischen Aktivität wird ebenfalls mittels Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten, entwickelt in Äthylacetat:Chloroform 70:30 (Vol/Vol), untersucht.

Beispiel 4

100 ml steriles Medium A in einer 500-ml-Flasche werden mit gewaschenen Sporen eines Agar slants von Actinomadura yumaense NRRL 12515 inokuliert. Die Flasche wird 2 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 32 °C inkubiert. Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird dann zu 100 ml sterilem Medium H in einer 500-ml-Flasche transferiert und 2 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 32 °C inkubiert. Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird anschliessend zu einer 500-ml-Flasche, enthaltend 100 ml frisches, steriles Medium H, transferiert und 6 Tage bei 28 °C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die antibakterielle Aktivität wird gemäss Beispiel 1 festgestellt.

Beispiel 5

Zwei 500-ml-Flaschen, jede enthaltend 100 ml steriles Medium A, werden mit einer gefrorenen Saatkultur von Actinomadura yumaense NRRL 12515 inokuliert und 2 Tage bei 32 °C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die Inhalte der beiden Flaschen werden anschliessend kombiniert und zu 121 frischen, sterilem Medium A in einem 20-1-Gefäss gegeben. Diese Kultur wird dann 2 Tage bei 28 °C unter Belüftung inkubiert. Der Inhalt dieses Gefässes wird danach in einen 300-1-Saattank, enthaltend 2881 steriles Medium A, transferiert. Diese Kultur wird 25 h bei 32 °C belüftet und gerührt. Am Ende der 25stündigen Inkubation werden die 3001 der Saatkultur in einen 1500-1-Fermentor, enthaltend 12001 steriles Medium C, überführt. Diese Kultur wird 115 h bei 28 °C unter Belüftung und Rühren inkubiert. Die Fermentationsbrühe wird hinsichtlich ihrer antibiotischen Aktivität mittels Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten, entwickelt in Äthylacetat:Chloroform 70:30 (Vol/Vol), untersucht. Alternativ werden mehrere der entwickelten Platten einem Bioas-say gegen Bacillus subtilis unterworfen, wobei sich das Vorliegen von antibiotischer Aktivität ebenfalls zeigt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

15

661 283

Beispiel 6

Ein typisches Medium, welches verwendet wird, um das primäre Inokulum wachsen zu lassen, wird gemäss der folgenden Formulierung hergestellt.

%

Rinderextrakt 0,3

Bacto®-Trypton 0,5

Glucose 1,0

Hefeextrakt 0,5

Bacto®Agar 0,15

Wasser qs. 100

Gewaschene oder abgekratzte Sporen und Myzel von einem Agar slant von Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden verwendet, um eine 500-ml-Flasche, enthaltend 100 ml des obigen sterilisierten Mediums, zu inokulieren. Die Flasche wird auf einen Rotationsschüttler gestellt und 48 h bei 32 °C heftig geschüttelt. Das resultierende Flaschen-Inokulum (100 ml) wird verwendet, um 11 des gleichen sterilen Mediums in einer 2-1-Flasche zu inokulieren. Dieses Inokulum wird mit steriler Luft belüftet, während das Wachstum 48 h bei 28 °C fortgesetzt wird. Diese 1-1-Kultur wird dann verwendet, um einen 30-1-Fermentortank, enthaltend das gleiche sterile Medium, zu inokulieren; dieser Tank wird mit steriler Luft belüftet und 42 h bei 28 °C inkubiert.

Beispiel 7

Ein Fermentationsmedium wird gemäss folgender Formulierung hergestellt.

%

Dextrose 1,5

Glycerin 1,5

Sojamehl 1,5

Calciumcarbonat 0,1

Natriumchlorid 0,3

Wasser qs. 100

Der pH wird mit 6N Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt und das Medium sterilisiert. Eine 30-1-Portion des gemäss Beispiel 1 hergestellten Inokulums wird verwendet, um 2501 des obigen Mediums in einem 300-1-Fe±mentor zu inokulieren. Die Maische wird mit steriler Luft versorgt und mittels eines Propellers, der mit 220 U/min angetrieben wird,

gerührt. Die Fermentation wird 97 h bei 32 °C durchgeführt. Anschliessend wird die Maische geerntet.

Beispiel 8

Ein Fermentationsmedium wird gemäss folgender Formulierung hergestellt.

%

Dextrose 3,0

Sojamehl 1,5

Calciumcarbonat 0,1

Natriumchlorid 0,3

Wasser qs. 100

Der pH wird mit 6N Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt und das Medium sterilisiert. Eine 300-1-Portion des gemäss Beispiel 1 hergestellten Inokulums wird verwendet, um 30001 des obigen Mediums in einem Fermentor zu inokulieren. Die

Maische wird mit steriler Luft versorgt und mittels eines Propellers, der mit 100 U/min angetrieben wird, gerührt. Die Fermentation wird 115 h bei 32 °C durchgeführt. Anschliessend wird die Maische geerntet.

Beispiel 9

(1) Die Fermentationsmaische (100 ml) wird mit 6N HCl auf pH 4,0 eingestellt. Die saure Maische wird dann 1 bis 2 h mit einem gleichen Volumen Methylenchlorid gerührt. Das Gemisch aus Maische und Methylenchlorid wird anschliessend filtriert, und zwar unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfe. Der Methylenchloridextrakt wird abgezogen und im Vakuum auf etwa 2 1 konzentriert, wobei man . die teilweise gereinigten Antibiotika erhält.

(2) Chromatographie der teilweise gereinigten Antibiotika auf Silikagel

Eine Glassäule mit einem Durchmesser von 7 cm wird bis zu einer Höhe von 91 cm mit Woelm Silika Gel TSC bepackt. Das rohe Konzentrat [siehe (1) oben] mit einem Volumen von etwa 2 1 lässt man in die Säule aus Silikagel einsickern. Die Säule wird dann zunächst mit 3 1 Methylenchlorid und dann mit Methylenchlorid :Äthylacetat (1:1 nach Volumen) entwik-kelt. Man erhält insgesamt 126 Fraktionen, jede mit einem Volumen von 80 ml. Anschliessend wird weiter entwickelt unter Verwendung von Äthylacetat :Äthanol (7:3), um zusätzliche 87 Fraktionen zu erhalten.

Die Fraktionen 58 bis 87, die reich an C23024a sind, werden kombiniert und im Vakuum bis zu einem Rückstand mit einem Gewicht von 90,4 g konzentriert. Dieser Rückstand wird in einem Gemisch von 600 ml Diäthyläther und 600 ml Hexan aufgelöst. Die resultierende Suspension wird filtriert, wobei man ein klares Filtrat erhält. Das klare Filtrat wird im Vakuum so weit konzentriert, bis die Kristallbildung beginnt. Diese Suspension wird über Nacht stehengelassen. Das kristalline C23024a wird auf einem Trichter gesammelt, mit kaltem Äther gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält 33,1 g kristallines C23024a. Weitere 12,4 g C23024a werden durch weitere Verringerung des Volumens der vereinigten Waschlösungen und Filtrate erhalten.

Die Fraktionen 177 bis 203 aus der Eluierung mit Äthylacetat :Äthanol, welche mit C23024ß angereichert sind, werden kombiniert und im Vakuum konzentriert. Man erhält 6,7 g teilweise gereinigtes C23024ß, das, wie oben beschrieben, behandelt wird.

Die Fraktionen 204 bis 213 aus der Eluierung mit Äthylacetat Äthanol, welche mit LL-C23024jota angereichert sind, werden vereinigt und im Vakuum zu einer Paste konzentriert und wiederholt mit Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wird mit Methylenchlorid extrahiert, welches auf eine Säule gegeben wurde, die Woelm Silikagel enthält. Die Säule wird mit Methylenchlorid gewaschen und dann mit Methylenchlorid Äthylacetat (2:3) eluiert. Die Fraktionen (cuts) werden mittels Dünnschichtchromatographie untersucht und die aktiven Fraktionen werden gesammelt, mit Aktivkohle behandelt, konzentriert und wiederholt mit Heptan extrahiert. Der letzte Heptanextrakt wird 48 h auf 0 °C gekühlt und die Kristalle werden durch Filtration von der Mutterlauge entfernt.

Diese Mutterlauge wird anschliessend in Methylenchlorid und in eine mit Woelm Silikagel bepackte Glassäule einsik-kern lassen. Die Säule wird dann aufeinanderfolgend mit 2 1 Methylen, 8 1 Methylenchlorid Äthylacetat (1:1) und 41 Äthylacetat:Methanol (9:1) eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden hinsichtlich ihrer antibiotischen Zusammensetzung untersucht. Die aktiven Fraktionen werden kombiniert und im Vakuum konzentriert, wobei man einen Rückstand erhält, der LL-C23024jota enthält.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

661 283

16

Beispiel 10

(3) Weitere Reinigung von LL-C23024ß aus der Chromatographie auf Silikagel

Man lässt Sephadex® LH20 in einem Gemisch von Hexan-Methylenchlorid-Methanol (10:5:1) quellen. Eine Glassäule mit einem Durchmesser von 5 cm wird bis zu einer Höhe von 86 cm mit dem Gel bepackt. Die Charge, 3 g gereinigtes LL-C23024ß, wird in 10 ml Methylenchlorid, 1 ml Methanol und 10 ml Hexan aufgelöst und in die Säule des Gels einsickern lassen. Die Säule 3 wird anschliessend mit einem Lösungsmittel der gleichen Zusammensetzung entwik-kelt, wie das, welches zum Aufbringen des Antibiotikums auf die Säule verwendet wurde. Es werden Fraktionen unter Verwendung eines Sammlers aufgefangen. Die ersten 23 Fraktionen aaben jeweils ein Volumen von 17 ml. Die Fraktionen 17 bis 26 enthielten C23024ß gemäss Dünnschichtchromatographie (TLC). Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wobei man reines, amorphes LL-C23u24ß (1269 mg) erhält.

Beispiel 11

Kristallisation von LL-C23024ß als Natriumsalz

Gereinigte sLL-C23024ß (2,4 g), hergestellt wird in den Abschnitten B und C beschrieben, wird in einem Gemisch von Diäthyläther (500 ml), Hexan (160 ml) und Methylenchlorid (25 ml) aufgelöst. Die resultierende Lösung wird" in einen Trenntrichter überführt, der 300 ml destilliertes Wasser enthält. Verdünnte HCl (IN) wird tropfenweise zugesetzt, bis der pH 2,0 bis 2,5 nach Umschütteln und Absitzen erreicht. Die saure, wässrige Phase wird verworfen und die mit Säure behandelte, organische Phase dreimal nacheinander mit 400-ml-Volumen Wasser gewaschen. Die gewaschene, organische Schicht wird mit einem Teelöffel von Darco-G-60-Pulver 15 min gerührt und durch Celite filtriert. Die entfärbte, organische Schicht wird über 500 ml destilliertes Wasser plaziert und 5N NaOH wird tropfenweise zugesetzt, bis der pH 11,0 bis 11,5 nach Schütteln und Absitzen erreicht. Die alkalische, wässrige Phase wird verworfen und die zurückbleibende, organische Schicht wird zweimal mit 400-ml-Portionen Wasser gewaschen. Die gewaschene, organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet und anschliessend im Vakuum zu einem Volumen von 150 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wird mehrere Stunden in einem Abzug stehengelassen. Das kristalline LL-C23024ß wird auf einem Trichter gesammelt, mit kaltem Hexan gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält 402 mg des kristallinen Salzes von LL-C23024ß. s An dieser Probe wurden die mikroanalytischen und ausgewählten spektralen Messungen durchgeführt.

Analyse: berechnet für Cis^OnNa C 59,70%; H 8,33%; O 29,46%; Asche 2,49%. C 61,55; H 8,79; Asche 3,31 ; N O; Schmelzpunkt [Fisher-Johns-Apparat = 174, (FD-Massen-io spektrum) = 924 [afo = +3,2 in Methanol].

Beispiel 12

Reinigung von LL-C230_4jota

Ein Waters Prep. 500A high performance liquid chromais tography instrument (Flüssigkeitschromatograph) wird unter einem Druck von 500 psi mit einer Silikagelpatrone beladen. Die Charge, bei welcher es sich um 5,0 g des Rohmaterials von Beispiel 3 handelt, wird in 50 ml Heptan Äthylacetat (45:55) aufgelöst und auf die Säule von Silikagel injiziert. Die 20 Säule wird anschliessend mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch bei einer Flussrate von 200 ml/min entwickelt, wobei vierzig 200-ml-Fraktionen aufgefangen werden. Die Fraktionen 21 bis 32 werden kombiniert, zu einem Rückstand konzentriert, mit Hexan verrieben und eingedampft. Man erhält 25 reines LL-C23024jota. Das obige Verfahren wird viermal wiederholt, wobei man eine kombinierte Gesamtmenge von 280 mg amorphes LL-C23024jota erhält.

Eine 90-ml-Portion des amorphen LL-C23024jota wird in 10 ml Diäthyläther aufgelöst, mit 10 ml Wasser vermischt und 30 mit 0,1N Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,5 eingestellt. Die Ätherschicht wird mit Wasser gewaschen, mit 0,1N Natriumhydroxid auf etwa pH 11 eingestellt, abgetrennt und wiederum mit Wasser gewaschen. Die Ätherphase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Rückstand 35 konzentriert. Eine Lösung dieses Rückstands in Äther-Hexan wird langsam eindampfen gelassen, wobei man einen amorphen, weissen Feststoff erhält. Dieser amorphe, weisse Feststoff hat folgende Eigenschaften.

Elementaranalyse: C 61,79%; H 8,84%; Asche 0,32%; [a]o 40. = +27 (C 0,724, Methanol); Felddesorptionsmassenspektro-skopie: (M + Na)+ = m/e 953, das berechnete Molekulargewicht beträgt daher 930.

G

4 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

1. 661283

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika LL-C23024a, LL-C23024ß und LL-C23024jota der untenstehenden Formeln:

   OMe

   COOH

   IH Me

   Me H H H OH

   LL-C23024 alpha OMe

   MeQ,

   'Ò

   Me

   OH

   OH H * H Me

   HU Me

   Me H Me H H H OH

   COOH

   LL-C23024 beta

   OMe

   Êr OMe

   COOH

   LL-C23024 jota dadurch gekennzeichnet, dass man Actinomadura yumaense sp. nov. in einem flüssigen Medium, enthaltend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, aerob fermentiert, bis die Fermentationsbrühe eine wesentliche antibiotische Aktivität aufweist, und anschliessend das Antibiotikum von derselben isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur der Fermentationskultur während eines Zeitraums von 24 bis 150 Stunden bei 25 bis 35 °C gehalten wird.
3. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Actinomadura yumaense sp. nov. um Actinomadura yumaense NRRL 12515 handelt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Antibiotikums LL-C23024a, dadurch gekennzeichnet, dass man

   60

   65

   Actinomadura yumaense sp. nov. in einem flüssigen Medium, enthaltend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, aerob fermentiert, bis die Fermentationsbrühe eine wesentliche antibiotische Aktivität aufweist, und anschliessend das Antibiotikum von derselben isoliert.
5. 5. Mittel zur Bekämpfung von Coccidiosis-Infektionen bei Geflügel, umfassend einen essbaren Träger und 0,000025 bis 0,06 Gew.-% des nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellten Antibiotikums.
6. 6. Verfahren zur Bekämpfung von Nematoden in Erdböden, welche Nematoden enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine nematocid wirksame Menge eines nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellten Antibiotikums auf die mit Nematoden verseuchten Erdböden aufbringt.

   661 283