FI75187C - Ett nytt foerfarande foer framstaellning av kaenda antibiotika ll-c23024alfa, ll-c23024beta och ll-c23024iota. - Google Patents

Description

, 75187

Uusi menetelmä tunnettujen antibioottien LL-C23024alfa, LL-C23024beeta ja LL-C23024ioota valmistamiseksi Käsiteltävänä oleva keksintö koskee uutta mene-5 telmää tunnettujen antibioottien LL-C23024alfa(=X- 14868A), LL-C23024beeta(^)(=X-14868C) ja LL-C23024ioota-(t)(= X-14868B) valmistamiseksi, OMe

MeO xx\Me

10 U

OMe OH

^ o 15 I ° t|e h ° " ^Ö\p°TMe

_ * 0H H Me Me H Me H H H 0H

COOH

X-14868 A = LL-C23024alfa (jt) OMe 20 MeO \

Me OH OH = m ~ OMe O Me

Me H ° Me h 1 Me C00H X-14868C = LL-C23024beeta (p1) OMe ” .. rV“ CO^H Me X-14868B = LL-C23024ioota(t) 2 75187

Mainitut kolme antibioottia tunnetaan FI-paten-tista 70247.

Keksinnön mukaiselle uudelle menetelmälle mainittujen tunnettujen antibioottien valmistamiseksi on tun-5 nusomaista, että fermentoidaan aerobisesti mikro-organismia Actinomadura yumaense NRRL 12515 nestemäisessä elatusalustassa, joka sisältää hiilen ja typen assimiloituvia lähteitä sekä epäorgaanisia suoloja, pitämällä fer-mentointiviljelmä lämpötilassa 25-35°C 24-150 tuntia, 10 jonka jälkeen antibioottinen aine eristetään sinänsä tunnetulla tavalla.

Antibiootin LL-C23024beeta rakenne perustuu alkuaineanalyysiin, optiseen kiertoon, kenttädesorptioon, massaspektroskooppiseen molekyylipainoon, sulamispis- 13 15 teeseen, IR-spektriin, C-ydinmagneettiseen resonanssi- 13 spektriin ( C-NMR) ja protonimagneettiseen resonanssi-spektriin (^H-NMR), kuten yksityiskohtaisesti ilmenee esimerkeistä ja oheistetuista kuvioista:

Kuvio I; LL-C23024p:n IR-spektri KBr:ssä.

20 Kuvio II; LL-C23024/S :n 13C-NMR-spektri, 20 MHz CDCl^sssa, sisäinen TMS-vertailuekvivalentti.

Kuvio III: LL-C23024^:n 1H-NMR-spektri, 80 MHz CDCl^Jssa, sisäinen TMS- 25 vertailuekvivalentti.

3 75187

Taulukko I 13 LL-C230248:n C-NMR-spektri (ppm TMS:n suhteen)

Kemiallinen siir- . . , , . .. , . Hiiliatomien luku- c tyma (pom) ......

-3 1 _ maara_ 10.5 i n,o , 12,2 17.0 17.7 } 17 9 10 2 2 ^3 ] 26.1 ; 26.8 } 27.6 ! 30.2 | 32.0 } 33.3 } 15 33,7 y 33.8 t 36.5 f 36.8 t 39.0 7 39.9 , 45.5 2 20 57,1 ^ 59.1 i 60.7 n 66.9 7 67.6 i 70.2 7 71.3 7 72.9 1 25 74,9 7 75.1 7 79.9 7 80.8 -) 82.1 ; 84,5 i 84.7 i 30 85'6 1 86.9 i 95.8 i 96.9 i 97,7 i 107,5 i 179,2 i 35 46 4 75187 LL-C23024 ioota on polyeetteriantibiootti, jolla on hyvin voimakas antikokkidioosivaikutus. Se on vähintään kymmenen kertaa voimakkaampi kuin useimmat tunnetut poly-eetterit. Kenttädesorptiomassaspektroskopian antamat arvot 5 osoittavat, että sen molekyylipaino on 930. Tämän ja hii- 13 li-13 ydinmagneettisen resonanssispektrin ( C-NMR) nojalla sen tentatiiviseksi molekyylikaavaksi voidaan ehdottaa C48H82^17* siltä, että antibiootissa LL-C23024 ioota on neljä metoksiryhmää ja sama sokerilaji on havait-10 tu polyesteriantibiootissa X-14868A (amerikkalainen patent tijulkaisu 4 278 663) sekä karboksiryhmä. Ainoa toinen raportoitu polyeetteriantibiootti, jonka molekyylipaino on 930, on antibiootti A29695B (hydroksiseptamysiini) (J. Antibiotics 33(2):252 (1980)), joka merkitsevästi eroaa 15 rakenteeltaan ja biologisilta ominaisuuksiltaan. Havainnot perustuvat alkuaineanalyysiin, optiseen kiertoon, kenttädesprotiomassaspektroskopialla saatuun laskennolliseen molekyylipainoon, IR-spektriin, 13C-NMR-spektriin ja protoniydinmagneettiseen resonanssispektriin (^H-NMR), 20 kuten yksityiskohtaisesti ilmenee esimerkeistä ja oheistetuista kuvioista:

Kuvio IV: LL-C23024 iootan IR-spektri KBr:ssä.

Kuvio V: LL-C23024 iootan 1H-NMR-spektri, 80 MHz CDCl^ssa, sisäinen TMS-vertailuekviva-25 lentti.

13

Kuvio VI: LL-C23024 iootan C-NMR-spektri, 20 MHz CDCl3:ssa, sisäinen TMS-vertailuekvi-valentti.

Kuvio VIIA: LL-C23024 iootan l3C-NMR-spektri(levitet-30 ty asteikko: 0-50 ppm), 20 MHz CDCl3:ssa sisäinen TMS-vertailuekvivalentti.

13

Kuvio VIIIB: LL-C23024 iootan C-NMR-spektri (levitetty asteikko: 50-110 ppm), 20 MHz CDClyssa, sisäinen TMS-vertailuekviva-35 lentti.

Il 13 5 75187 LL-C23024 lootan C-NMR-spektri saatiin deuteroidus-sa kloroformissa (CDCl^) kenttävoimakkuudella 20 MHz. Taulukosta II ilmenevät huiput vastaavine kemiallisine siir-tymineen miljoonasosina suhteessa tetrametyylisilaaniin 5 (TMS) sekä hiiliatomien arvioitu lukumäärä huippua kohti.

Kloroformihuiput havaittiin kohdissa 75,4, 77,0 ja 78,6.

δ 75187

Taulukko II

kemiallinen hiiliatomien kemiallinen hiiliatomien siirtymä lukumäärä siirtymä lukumäärä 5 10»6 1 59i9 1 10i9 1 00,8 2 11.7 1 68,5 1 16,11 1 68,8 1 17,6 1 71,3 ' 1 10 18,0 1 72,2 1 21<7 1 76,1 1 22t9 1 76,9 1 24<1 1 78,5 1 28,2 1 81,0 1 15 31,2 2 81,3 1 32.2 1 81,8 1 33.4 1 84,8 1 33.8 2 85,3 1 · 34.2 1 85,6 1 20 36,7 1 86,8 1 37.2 1 88,5 1 39.4 1 95,9 1 40.3 1 97,9 1 44.5 1 99 ,6 1 45.5 1 107,2 1 47.6 1 173,0 _i_ 56.8 1 Summa 1j8 il 7 75187

Antibiootit LL-C23024-<-,/’ ja ioota ovat orgaanisia kar-boksyylihappoja ja voivat siten muodostaa suoloja myrkyttömien, farmaseuttisesti hyväksyttävien kationien kanssa. Suolat, jotka muodostuvat sekoitettaessa antibioottia va-5 paan hapon muodossa ja stokiometrisiä määriä kationeja, voidaan muodostaa kationien kuten natriumin, kaliumin, kalsiumin ja ammoniumin sekä orgaanisten amiinikationien kuten tri(alempi alkyyli)amiinin (esim. trietyyliamiinin, trietanoliamiinin), prokaiinin ja vastaavien kanssa. Anti-10 biootin LL-C230243 kationisuolat ovat yleensä kiteisiä kiintoaineita, suhteellisen liukenemattomia veteen ja liukoisia useimpiin tavallisiin orgaanisiin liuottimiin kuten metanoliin, etyyliasetaattiin, asetoniin, kloroformiin, heptaaniin, eetteriin ja bentseeniin. Keksinnön tarkoituk-15 sessa antibiootti vapaan hapon muodossa ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät, myrkyttömät suolat ovat samanarvoisia.

Antibiootit LL-C230234/' ja ioota tehoavat in vitro grampositiivisiin bakteereihin testattaessa standardoidun agarlaimennusmenetelmän mukaan. Taulukoissa III ja IV tulok-20 set on ilmoitettu minimiestokonsentraationa (MEK) mikrogrammaa per millilitra. Antibiootit LL-C230234^ ja ioota eivät tehoa gramnegatiivisiin konsentraation ollessa 256^ug/ml tai pienempi.

8 75187

Taulukko III

LL-C23024 f'-.n antibakteerinen teho in vitro

Minimiestokonsentraa- _Organismi__tio (|ig/ml)_ 5 Staphylococcus aureus Smith 64 " " SSC 80-11 64 " " SSC 80-32 64 " " SSC 80-38 64 " " LL-14 64 10 " " LL-45 64 " " LL-27 128 " " ATCC 25923 64

Streptococcus pyogenes C203 1 " /^-hemolytic . _ Keller T623 8 15 " pneumoniae 78-1 8

Enterococcus SSC-80-62 64 " SSC-80-63 128 1 2 3 4 5 6

II

2

Taulukko IV

3 LL-C23024 iootan antibakteerinen teho in vitro 4 LL-C23024 iootan 5

Organismi minimiestokon- 6 ___sentraatio (|ig/ml)

Enterococcus OSU 75-1 1

Enterococcus SM 77-15 1

Staphylocccus aureus SSC 79-18 1

Staphylococcus aureus FU 79-19-2 2 2Q Micrococcus lutea PCI 1001 1

Staphylococcus aureus Smith 0,5

Staphylococcus aureus ATCC 25923 0,5 9 75187

Kuten edellä esitetyistä arvioista ilmenee, estävät antibiootit LL-C23024^ja ioota määrättyjen gramposi-tiivisten bakteerien kasvun ja siten ne ovat käyttökelpoisia paikallisesti käytettävinä antisepteinä tai pinta-5 antisepteinä ihon, tarvikkeiden, sienien, lattioiden jne. pesuun tarkoitetuissa liuoksissa.

On myös osoittautunut, että antibioottiset aineet LL-C23024 r\, Jb ja ioota tehoavat in vivo siipikarjan kokkidi-oosin vastaisina lääkeaineina, mikä osoitetaan seuraavien 10 testien avulla.

Kaksi päivää ennen inokulointia vuorokauden vanhojen kananpoikien erilaisille ryhmille syötettiin rehua, johon oli lisätty vaihtelevia määriä lääkeaineita. Käytetty siipi-karjanrehu valmistettiin seuraavasti: 15 vitamiini-aminohappovalmisseosta 0,5 % hivenkivennäisaineita 0,1 % natriumkloridia 0,3 % dikalsiumfosfaattia 1,2 % jauhettua kalkkikiveä 0,5 % 20 stabiloitua rasvaa 4,0 % dehydratoitua alfalfaa, 17 % proteiinia 2,0»% maissigluteenijauhoa, 41 % proteiinia 5,0 % menhadenkalajauhoa, 60 % proteiinia 5,0 % soijapapujauhoa, 44 % proteiinia 30,0 % 25 jauhettua keltaista maissia ad 100 %

Yllä kuvatun rehuseoksen vitamiini-aminohappovalmissos valmistettiin seuraavan koostumuksen mukaisesti. Määrät on laskettu kiloa kohti valmista rehuseosta, butyloitua hydroksitolueenia 125,0 mg 30 dl-metioniinia 500,0 mg A-vitamiinia 3300,0 I.U.

D^-vitamiinia 1100,0 I.C.U.

riboflaviinia 4,4 mg E-vitamiinia 2,2 I.U.

35 niasiinia 27,5 mg 10 751 87 pantoteenihappoa 8,8 mg koliinikloridia 500,0 mg foolihappoa 1,43 mg menadioninatriumbisulfaattia 1,1 mg 5 B^2”vitamiinia 11,0 ^ug jauhettua keltaista maissia ad 5,0 g

Sitten testikananpojat inokuloitiin inokuloimalla suoraan jokaisen kananpojan kupuun inokulaattiseosta, jossa oli 5000 Eimeria acervulinan itiöitä muodostaneita ookys-10 toja ja riittävä määrä Eimeria tenellan ookystoja aiheuttamaan 85-100 %:n kuolleisuuden käsittelemättömissä kontrolleissa. Koko testiajan kananpoikaset saivat vapaasti nauttia rehua ja vettä. Seitsemän vuorokauden kuluttua testaus lopetettiin ja linnut punnittiin, tapettiin ja 15 tutkittiin. Ruoansulatuskanavasta etsittiin merkkejä vaurioitumisesta. Tulokset ilmenevät alla olevista taulukoista V ja VI ja ne osoittavat, että infektoitujen, eloon jääneiden kananpoikien määrä kasvoi, kun ravinnossa oli 10 ppm tai vähemmän antibioottia LL-C23024/* tai ioota.

20 Tulokset osoittavat myös, että Eimeria tenellan ja Eimeria acervulinan aiheuttamat vauriot ruoansulatuskanavassa vähenivät merkitsevästi.

Il n 75187

(d C •H (0 ι—I

- -P G

CO -H > O O O O OOOO I OOOOO I

P O P O O O OOO IOO I

P -H Q) I-H ιΗ i—I I—I I—I I—I rH rH

tn p υ o g <ϋ •h id -P > ·

-P W

g g (d ω :(0 G «g 0) O g (d <D H ΦΗ

G rH

•H :id 0)

(0 β > d o o o o oooo I o o r-~ o I

<U qjojoo ooo I oo o I

^ '1 I (0 -P rH rH rH rH

:(0 3 0) :oJ -P in ·

rH G -H W

•H -H 0 W iG ·γί| 0 0

•H I

Ό in

•Η *H

λ; e ή M :<d -P o -1-1

O :rd -P «· "P

Λί ·η g oooo oooooooor^r^o f—I

-H CO) OOOOTf 000<Ν0000Η·(Ν0 I—I

-P 0 W i—li—I rH rH rH rH rH rH ι-H 0 COO p

> (d -HP -P

w ft £ O G 0 λ; .« o 1

G Q) G +J

<H G Ai id 2 G (0 G ω g

(d G <h ω O

H G G +|

rii G rH -P

d) (d G

g ο £ .n 3:nJ rommin mmmmmmmmmmm -h &) 4-J p i—li—I rH rH i—li—I i—I rH i—I i—I i—I ιΗ 0 P G :(d ε n hm) o O J g p >

P M

(d i <u (0 Ή

CP G

O -H

x; o 0) -H g - -P 41 a .ti id ft momo oooouomomou ad (d rH iH (Noro SCNrHrH 2 g h* P (d «H 2 2 :0

(N p tn -P

0 c ui -P

ro o 0 :<0 (N tn G £

U G G

1 O Ή Ή .G 2 > ω j ΰ

G - H

•H «L ct^ ccx. tn 11 h4 ^ ^ji :id 0 d) <N (N (N (N (N Λ!

0 -P OOO O O

•H (Λ ro ro ro ro ro n

X) -H 04 (M (N (N (N

•h ό u υ o * υ cj u -p x: i i i o i i 2 G χ ,g ,G .G 2 vG iG 2 < j j J 2 J iG * 12 751 87 fÖ

G

id -h

01 rH

0) G

•H > O M o o o o o o

•n <D O O vo O O

!(fl O i—I H rH i—I

G - id d) 01

Q) G

λ; gw X 01

:td O

:<d -H nj

rH 4J -G

•H -P *H

oi GO

O d) -H

O oi SH

-h o G

Ό G id •H Dj > id

λ; rH

X G G rH

O QJ :rd <1)

X -r-igGOOOO OO

H G G QJ o o (N o r-

-P -P Q) -P rH rH rH

G Gi (d -rH :(d ·

w > w G <d •n O

M 04

> G

id i O G oi X id ή

XX g -H

G :<d -P

rH G :id -P

G rH -n G

(dQ) CO) OOOO OO

E-t-P 001 o o uo oi oo

0) 0 0 rH rH rH rH

O rH O

> M D,

G

id

G I

O G

x λ: (d Q) G dl -P rH 01

G

id G rH

-P qj (d lo in un in oo

O 'Π i—I rH rH

0 G :<d •H +J Sh

^ G :nJ

01 -H :id 0 W g m

01 CJ I

w o

•H

G -P

ή id *d p id oi O G 01 O -P O m

•g G G

Λ QjGgmomo in

•H 01 *H O »H rH rH

-P G > O

G o id

< «G

11 13 75187

Seuraavat testit osoittavat tehon sukkulamatolääk- keenä.

Esimerkki A

Testikoostumusten sukkulamatolääkkeenä tehon arvostelu 5 käytettäessä vapaasti elävää,kaksisukupuolista, mikrobeja syövää sukkulamatoa Gaenorhabditis elegans II

Alla olevissa testeissä käytettiin C. elegansia sukkulamato lääketehon määrittämiseksi keksinnön mukaisesti valmistetussa fermentointinesteessä ja bakteerimassassa.

10 Tätä organismia käytettiin antibioottien LL-C23024Ö suk- kulamatolääketehon määrittämiseksi.

Näissä testeissä fermentointiliemi muodostaa fermen-tointinesteen, joihin liukenee erilaisia kiintoaineita ennen kuin kiinteässä muodossa oleva bakteerimassa erote-15 taan nesteestä. Kiinteä bakteerimassa jää jäljelle erotuksen jälkeen.

Bakteerimassan arvostelemiseksi siinä oleva kiintoaines dispergoitiin tislattuun veteen suhteessa 1:1. Fermentointiliemi käytettiin sellaisenaan ja se sisälsi sekä 20 nestettä että kiintoaineita.

Alla kuvatuissa arvosteluissa C. elegansia ylläpidettiin C. briggsae-ylläpitoelatusalustassa. Tätä elatusalustaa myy Grant Island Biological Company, Grant Island,

New York, ja sen koostumus on seuraava: 25 "C. brjqgsae MAINTENANCE MEDIUM"(1)

Komponentti

Epäorgaanisia suoloja mg/1

CaCl2 . 2H20 220,50 30 CuC12 * 2H2° 6,50

Fe(NIl4)2 <S04)2 . rm20 58,80 KH2P04 1225,50 Κ0Η (a)

MnCl2' . 41120 22,20 35 ZnCl2 10,20 14 751 8 7

Muita komponentteja N-asetyyliglukosamiini 15,00 adenosiini-3'-(2')-fosforihappo. 1^0 365,00 sytidiini-3'-(2')-fosforihappo 323,00 5 D-glukoosi 1315,00 glutationi, pelkistetty 204,00 guanosiini-3'-(2')-PO^Na2*H20 363,00 magnesiumsitraatti.5H20 (kaksiemäksinen) 915,00 kaliumsitraatti. i^O 486,00 10 DL-tioktiinihappo 3,75 tyrniini 126,00 uridiini-31-(21)-fosforihappo 324,00

Aminohappoja L-alaniini 1395,00 15 L-arginiini 975,00 L-aspartiinihappo 1620,00 L-kysteiini. HClI^O 28,00 L-glutamaatti (Na) .1^0 550,00 L-glutamiini 1463,00 20 glysiini 722,00 L-histidiini 282,00 L-isoleusiini 861,00 L-leusiini 1439,00 L-lysiini.HC1 1183,00 25 L-metioniini 389,00 L-fenyylialaniini 803,00 L-proliini 653,00 L-seriini 788,00 L-treoniini 717,00 30 L-tryptofaani 184,00 L-tyrosiini 272,00 L-valiini 1020,00

Vitamiineja P-aminobentsoehappo 7,50 35 biotiini 3,75 koliinidivetysitraatti 88,50

II

is 75187 syanokobalamiini (Β.^) 3,75 folinaatti (Ca) 3,75 myoinositoli 64,50 niasiini 7,50 5 niasiiniamidi 7,50 pantetiini 3,75 pantotenaatti (Ca) 7,50 pyridoksaalifosfaatti 3,75 pyridoksa niini.2HC1 3,75 10 pyridoksiini.HC1 7,50 ribof laviini-5 '-PO^ (Na) . 21^0 7,50 tiamiini.HC1 7.50

Viitteitä: (1) Hansen, E.L., Proc. Soc. Exp. Bio. & Med. 121: 30-393 15 (1966).

Huom. (a) Tarpeen mukaan pH:n säätämiseksi arvoon 5,9 + 0,1.

Arvosteluissa käytettiin aaltolevyä, joka oli varustettu sarjalla pieniä aaltoja. Eri aaltotiloihin lisättiin aseptisesti 25 ml fermentointilientä, vesi-bakteeri-20 massasuspensiota suhteessa 1:1 tai LL-C23024<A :n tai LL-C23024/5 :n vesi-asetoniliuosta, jossa oli 31,25 -500 ppm testiyhdistettä. Sitten jokaiseen aaltotilaan lisättiin 25 ml C. elegansin ylläpitoelatusalustaa, jossa oli 10 - 20 aikuista matoa plus eri ikäisiä toukkia plus 25 munia. Tämän jälkeen levyt asetettiin suojuksen alle ja tutkittiin 48 tuntia inokuloinnin jälkeen testikoostu-musten tehon nopeus ja vaikutusaste sukkulamatolääkkeenä. Saadut arvot ilmenevät alla. Jos tehoa havaittiin fermentoin-tiliemessä, tämä laimennettiin edelleen liemen ja C. ele-30 ganssin l:4-suhteen saavuttamiseksi.

16 751 87

Taulukko VII

Koostumus Konsentraatio (ppm) Sukkulamatolääkete- _tai laimennussuhde ho 48 tunnin kohdalla

Fermentointi- D = 1:1 8 (ei motiliteettia) lie,nl o = 1:4

Bakteerimassa LL-23024-V 500 ppm 7 250 ppm 7 10 125 ppm 7 62,5 ppm 6 31,25 ppm 0 LL-23024^ 500 ppm 7 _250 ppm_0_ 15 Näissä arvosteluissa käytettiin seuraavaa arvosteluasteikkoa :

Tehoasteikko 8 = ei motiliteettia (madot näyttävät kuolleilta) 7 = selvästi vähentynyt motiliteetti 2 0

6 = vähentynyt motiliteetti 0 = lajille ominainen motiliteetti Esimerkki B

LL-C23024oC:n arvostelu märehtijöiden sukkulamato-25 jen tehottomiin toukkiin (kolmas peittynyt toukka-aste) tehoavana sukkulamatolääkkeenä.

LL-C23024l:n arvostelu märehtijöiden sukkulamatojen Haemonhmus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus axei, T. colubriformis ja Turbatrix 30 aceti tehottomiin toukkiin tehoavana sukkulamatolääkkei-nä suoritettiin käyttämällä yllä mainittua sukkulamato-lajeja C. elegansin asemasta.

Saadut tulokset ilmenevät alla olevasta taulukosta .

Il I? 75187

•H

P

(1) υ ιο νο νο vo vo o g

<C -H I

•H V

• P n

Eh P oi O) o P ro

01 OI

• -H u

Λ β I

G rH J

G rH mj m O oo vo vo vo o > mu ή -p < 01 · 00 m H vo in > oo oi

'T

m -h g

n -H X -H

0 — 0) -H

pm x λ λ * -p m-Hfiooooo'O-oo m-p g h m :m mm· i—i oi H Ij H -rt Ή H G Λ -P Ή ·— h λ! o o m

H M M . -PC P

> G c H m rH

01 g a mm -h o m-π ai

X -H C , , 00 OO Γ' VO VO O ·ιΗ rH

x μ g H vo -p h

G Φ G 1 σν o O

rH +) U -P G

GO· m rH X

m ίο o oi m eh οι τ* oi m :m -p tH — O :m :m Ή

•n G S > -P

• ai rH :m -p -h p ·> ai ai -p <u -p

Vt :m oi -n -P ai -p 0 rH Ή rH 4-1 ai p rH m -n :m -h ai

G 00 O- O- O- VO O >ιΛί> G rH P

O > O O -rt -H

u Q) -n P P P -H H

rH m O O -P -rl

. >, ·· e Ό g -P -P

se rH g m m ai o ai ai h g -P ai g i ·π <u m — p m rH p χ g -h e m -h ai m >i -h ai

Vt > > g -h p -rt e P ai ai P G P -H :m

g og paiomrH

ai OGrHOlÄgGrH

01 G G G—. ai :m -rl :m

G Ή Ji +1 P > P g M

O rH P ID ·· -H >1 o -H

X rH G m oi o rH -H G 01 m o-HrH^-Hp^ai

GO Vt -rHOimAi-POlprHG

••Vt P P -H -n -H O :m G Ή -H

Pp G -P-μ <DE>(D-HC

•ί-rH o aioimp rnx:-nG

oi > in P-Hpoi-HQ):mm3

0 oi·— -HO0ima)01>rHP

n g - M oi o O

01 -h o o in m rH o o X G Λ n » n »

Cj o m oi oi m G m -Ή Q) oi

10 in OJ rH VO C/lriirHEHOOO~VOOIQ

j -h m

J P

ie 75187

Esimerkki C

Antibiootin LL-C23024o0 arvostelu Nematospiroides budiuk-seen ja Aspicularis tetrapteraan tehoavana sukkulamato-lääkkeenä hiiressä ^ Seuraavissa testeissä valkoisia Swiss-Webster -naa- rashiiriä infektoitiin Nematospiroides dubiuksella ja Aspicularis tetrapteralla ja pidettiin kolme viikkoa infektioiden kehittymiseksi.

Tämän ajan kuluttua hiiret jaettiin neljä eläintä j^q käsittäviin ryhmiin ja ryhmät asetettiin eri häkkeihin. Sitten hiiret saivat viikon aikana mielin määrin rehua, joka lääkeaineena sisälsi n. 31,25 - 4000 ppm testiyhdis-tettä. Koko testijakson ajan hiiret saivat myös mielin määrin vettä. Käsittelyjakson aikana hiirien ulosteista tutkittiin mahdollisesti läpi kulkeneet madot. Osoittautui, että matoja kulki kaikkien käsittelyryhmien eläinten läpi. Tämä siis indikoi, että aineet kaikilla konsentraa-tioilla tehosivat sukkulmatolääkkeinä molempiin sukkulamato-lajeihin. Kun oli käsitelty viikko lääkeaineita sisältä-2Q väliä rehulla hiiret tapettiin ja ruoansulatuskanavan sisällöstä etsittiin matoja. Tulokset ilmenevät alla matojen prosentuaalisena vähenemisenä verrattuna infektoituihin ja lääkitsemättömiin kontrolleihin.

Näissä testeissä arvosteltiin fermentointiraakaliemi, 25 joka saatiin ennen bakteerimassan talteenottoa ja joka sisälsi 1000-4000 ppm sukkulamatoihin tehoavaa antibioottia. Samalla tavoin arvosteltiin hiirien rehu,jossa oli 31,25 -500 ppm antibioottia LL-C23024OCliuotettuna asetoni-veteen (1:1).

II

19 751 87

Testikoostumus Konsentraatio Teho ravinnossa prosentuaalinen väheneminen*** ppm N. dubius A. tetraptera *LL-C23024<+' :a 4 000 7 3 5 sisält. fermen- 2000 44 53 tointiliemi 1 000 65 33 500 70 SA**

250 63 SA

125 61 SA

10 ^ .

62,5 29 SA

_______31,25_32_RA

* = LL-C23024 :n määrä tarkentama ton ** = tehoaa jonkun verran: ulosteista löytyi kasvanut ^5 määrä sukkulamatoja *** = verrattuna infektoituihin, lääkitsemättömiin kontrolleihin.

Edellä mainitut antibakteeri- ja antikokkidioo-silääkeaineet muodostuvat viljelmällä kontrolloiduissa 20 olosuhteissa mikro-organismia Actinomadura yumaense sp.nov.

Tämä mikro-organismin edustava kanta eristettiin Yuma County'sta, Arizona, löydetystä maanäytteestä ja säilytettiin viljelmäkokoelmassa Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, viljel-25 mänumerolla LL-C23024. Elinvoimainen viljelmä tästä edus tavasta kannasta on talletettu Culture Collection Laboratory, Northern Regional Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, ja se on otettu tämän labotatorion pysyväiskokoelmaan saantinumerolla NRRL 12515.

30 NRRL 1215:n taksonominen karakterisointi

Kanta NRRL 12515 on taksonomisesti karakterisoitu ja tunnistettu uuden Actinomadura-lajin, Actinomadura yumaense sp. nov., tyyppikannaksi.

Edustavan kannan NRRL 12515 viljely-, fysiologisia 35 ja morfologisia tunnusmerkkejä on havainnoitu menetelmien avulla, joita ovat kuvanneet E. B. Shirling ja D. Gottlieb, 20 751 87 "Methods for characterization of Streptomyces species", Internat. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966), ja R.E. Gordon et al., "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardin strain", Internat. J. Syst. Bacteriol 5 24:54-63 (1974). Tässä tutkimuksessa käytettiin elatus- alustoja, joita ovat suositelleet T.G. Pridham et ai., "A selection of media for maintenance and taxonomic study of Streptomycetes", Antibiotics Ann., s. 947-953 (1956/ 1957), G.F. Gauze et al., "Problems in the classification 10 of antagonistic actinomycetes", State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Moskova (1957) ja R.E.

Gordon et al., yllä, Actinomycetes-lajien ja maabakteerien taksonomisiin tutkimuksiin. Mikro-organismien solunseinä-män kemiallinen koostumus määritettiin menetelmän avulla, 15 joka on kuvattu julkaisussa H.A. Lechevalier et al., "Chemical Composition as a criterion in the classification of actinomycetes", Adv. Appi. Microbiol. 14:47-72 (1971). Fosfolipidirakenteet määritettiin menetelmän avulla, joka on kuvattu julkaisussa M.P. Lechevalier at al., "Chemotaxo-20 nomy of aerobic actinomycetes; phospholipid composition",

Biochem. Syst.Ecol. 5:249-260 (1977). Yksityiskohdat ilmenevät taulukoista IV-IX ja viljelmän yleiskuvaus on esitetty alempana. Alleviivatut kuvailevat värit on otettu julkaisusta K.L. Kelly ja D.B. Judd, "Color, Universal Language and 25 Dictionary of Names", U.S. Nat. Bur. Stand., Spec. Pubi.

440, Washington D.C. (1976) ja siihen liittyvästä International Society Color Council, Natl. Bur. Stand. Centroid Color Charts.

Tällä uudella lajilla, jota edustaa kanta NRRL 12515, 30 havaittuja arvoja verrattiin arvoihin, joita on julkaistu Actinomadura-suvun tunnetuille lajeille (M. Goodfellow et al., "Numerical Taxonomy of Actinomadura and related actinomycetes", J. Gen. Microbiol. 122:95-111 (1979), L.H. Huang, "Actinomadura macra sp. nov. the producer 35 of antibiotic CP-47,433 and CP-47,434", Internat J. Syst.

Bacteriol. 30:565-568 (1980), J. Myer, "New species of the

II

2i 75187 genus Actinomadura", Z. Allgem, Mikrobiol. 19:37-44 (1979), H. Nomura ja Y. Ohara, "Distribution of actinomycetes in soil. XI Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier et ai. "J. Ferment. Technol. 49:904-912 (1971) 5 ja T.P. Preobrazhenskaya et al., "Key for identification of the species of the genus Actinomadura", The Biolody of Actinomycetes and Related organism 12:30-38 (1977)). Viljelmä NRRL 12515 muistuttaa jossain määrin lajia Actinomadura pelletieri, mutta ei muistuta mitään muuta 10 kuvattua lajia ja eroaa monen tunnusarvon suhteen lajista A. pelletieri. Niinpä kantaa NRRL 12515 pidetään uuden lajin eli Actinomadura yumaende sp. nov. tyyppikantana. Nimi on johdettu paikasta, josta löydetystä maanäytteestä tyyppikanta eristettiin.

15 Mikromorfologia

Itiöt muodostavat lyhyitä spiraaliketjuja (maksimipituus suunnilleen 20 itiötä ketjua kohti) haarautuneissa, lähes ympyrän muodostavissa ilmaitiökantajissa. Itiöt ovat munamaisia, 0,6-0,8 mikronia kertaa 1,0-1,4 mikronia ja 20 pinta on sileä.

Soluseinämän koostumus Tämän viljelmän kokosoluhydrolysaatti sisältää modu-roosia (3-0-metyyli-D-galaktoosia) ja diaminopimeliini-hapon (DAP) mesoisomeerejä. Viljelmässä on myös tyyppiä 25 P—1 oleva fosfolipidirakennekuvio eikä siinä ole muita diagnostisia fosfolipidejä kuin hieman fosfatidyyliglysero-lia. Kaikki nämä tunnusmerkit ovat hyvin tyypillisiä Actinomadura-suvulle.

Kasvuaste 30 Kasvun havaittiin tapahtuvan hyvin Bennettiin aga- rilla, Gauze No. 2 agarilla, NZ-amiini-tärkkelysglukoosi-agarilla (ATCC Medium 172), tomaattitahna-kaurajauhoagaril-la ja hiivauute-mallasuuteagarilla, kohtalaista kasvua havaittiin Benedictin agarilla. Czapekin sakkaroosiaga-35 rilla, glyseroli-asparagiiniagarilla, Hickeyn ja Tresnerin agarilla ja kaura-agarilla ja kasvu havaittiin heikoksi kai- 22 751 87 siummalaattiagarilla, Gauze No. agarippa ja epäorgaanisia suoloja sisältävällä tärkkelysagarilla.

Vegetatiivinen myseeli

Elatusalustoilla, joilla kasvu oli hyvä, havait-5 tiin vegetatiivisen myseelin lisääntyvän ja konvolutoi-van. Väriltään se oli yleensä kellahtavan harmaa.

Ilmamyseeli ja itiöiden väri

Ilmamyseelit ja/tai itiömassat olivat väriltään valkoisesta vaaleanharmaaseen 264. Ilmamyseelin kasvatus 10 kävi helposti useimmilla elatusalustoilla.

Liukoiset pigmentit

Monet elatusalustat ilman pigmenttiä, keltaista pigmenttiä Benedictin glyseroli-asparagiiniagarilla, kel-taisenvihreää pigmenttiä kalsiumalaattiagarilla, vihertä-15 vän ruskeaa pigmenttiä NZ-amiinitärkkelysglukoosiagarilla ja oranssin väristä pigmenttiä Bennettin ja hiivauute-mallasuuteagarilla.

Fysiologiset reaktiot

Ei melaniinipigmenttiä peptoni-rauta-agarilla eikä 20 tyrosiiniagarilla (ISO-7), lakmusmaito aiheuttaa voimakasta peptonisoitumista, elatusainegelatiini aiheuttaa voimakasta proteolyysiä, nitraatti pelkistyy kohtalaisesti, adeniini ja guaniini eivät hydrolysoidu, hypoksantiini, tyrosiini ja ksantiini hydrolysoituvat voimakkaasti, tärk-25 kelys hydrolysoituu heikosti, eskuliini hydrolysoituu ja urean hydrolysoituminen vaihtelee. Ei kasvua lämpötiloissa 4°C, 10°C ja 55°C, kohtalainen kasvu lämpötiloissa 25°C ja 45°C ja hyvä kasvu lämpötiloissa 32°C ja 37°C. Hiilihydraattien hyväksikäyttö T.G. Pridham ja D. Gottlieb, 30 "The ulitization of carbon compounds by some actinomyceta-les as an aid for species determination", J. Bacteriol. 56:107-114 (1948) kuvaaman menetelmän mukaan; glukoosia, glyserolia ja trehaloosia käytetään hyvin, maltoosia ja sakkaroosia käytetään kohtalaisesti, fruktoosia, ga-35 laktoosia, inositolia, mannoosia ja meletsitoosia käytetään huonosti; ja adonitolia, arabinoosia, dulsitolia, laktoosia, mannitolia, melibioosia, raffinoosia, ramnoo-

II

23 751 8 7 siä, salisiinia, sorbitolia ja ksyloosia ei käytetä lainkaan. Happojen tuottaminen hiilihydraateista Gordon et ai. yllä kuvaaman menetelmän mukaan: happoja muodostuu hyvin glukoosista, glyserolista, maltoosista, 5 sakkaroosista ja trehaloosista ja happoja muodostuu heikosti galaktoosista, inositolista ja mannoosista. Orgaanisten happojen hyväksikäyttö Gordon et ai. yllä kuvaaman menetelmän mukaan: asetaattia, malaattia, propionaat-tia, pyruvaatia, suksinaattia ja tartraattia käytetään 10 hyväksi, bentsoaattia, sitraattia, laktaattia, mukaattia ja oksalaattia ei käytetä hyväksi.

2* 7518 7 jj ^ S jj § iaj 1 S h 6 1’(ΰ »n °” t i 1 2 -1 ^ § ·· :§ g -H P Ο ω mo! :¾ og 3 σ>'m

s§ 00 ^ CO ΐ H O' M CO M > r-W 004J

(0 ^ d

M :n3 ^ C

(0 a? 5 $ §

if tin I

•§1 S $ W -Η -H -H 5 .¾.¾1^ ^ ,* > <u α)Φ ω

►ia M

«»

H +J I

E 3 1-S I i -π A , J,

I 3 1¾! -I B i ni S

1 3 Is s*i * ·η| I tii&jsi 1h 3 s 3 s.s 5«! 5 j i 3-sil Rfl g 1 2 .3 3 -h il ^3 ^ddi «8 5 5 33 6 £ § to I'd §dgj*c^wj| 5 r II § -5-11 5g js s, s^.s I si 6 -h 11S 3 b§I ^ 1 * I «r^s I, Ή! -jj ra g *q3 c « p si? g 5 S $ 5 > 33 JS "§ w § -r1 φ '“'ΐΕΦ-ΗρΜρΦΡ C n£

5 » -as |.aIs iI ae| s« 3.8.8¾ -I

* I 'III 1« 1" -3 i *.§5 el «is .·* 35 5 I ®ll ISgS 3-53 So si Sc· «I g a 3 Sis ίί·^ 5jis 581¾^ il ~ a sgg-sN^ssssifgialsss

•H

c| Φ -3 jj I

g 4J ω 75 x< a) gw y m -H -H (0 c § | -3 S £ S 3 8

$ ft 3 P _ 0 $ 0 m-H

E* I li I si § i si -a* μ x: χ: jghx!x; ,α -p

JTJ «H

u ** lisää 1 il

E-HW(0 tn -P Λί IP

O Q 3 ^ ro (0¾ Λ (0 5-SdS „ '«S'

3 1S'3 5 3 ” u .VS

8 3 3 5 .ti 1 ö -S ft Sa S 3:5

Η Φ C •Htp'Sd Φ tT> Φ ίβ ÖtP

w I S ,3* &8 3? g| RS .

Ä Ä jsxi ör öh öd. da

II

25 751 87

*H

^ ji! I ί L· I ίί ί! § I II Is ia ύ

I Ι & *Β 11 il II

s Is S U -3j ^ 3 * 2 o-S :¾ p <d οΐ oo (iJ oo 3

σιΠ3 > 4J-P «ΤιΛί t" t-l f" rH

- -sf II

ii p I

3 α φ Φ >rS aj φ 8 I 4 I fc .

•H| fö ·Η «I · ·* · O ^

%#rt 0) -H El -P(Ö O ch H Cd I I

1 I ||s h Pgjfi, “I* "Jliill - i h% d £|φ if1 Mp; ι ι !Lh.| leiliin i|iiii3 & g, 3*11 3SS S'0! «ii3g E -Η·Η·ΗΒ-Ηωω2*Ώΰν3 :¾ ,q c :id G h Q h > 3 cuojcaj ΦΦΦΊπρρίσ-Η,ΰ ai s 53 aj 3 >-i -P ® Φ 6 -P H 4JQi5i Β&ΜιίΗΐ 4JpC -PE-HOPi-l-Pq 5 3*'SS Us f 'g S S3 18 s |-3 S S 1¾ -säiliä

Hi c i> rH $ 3 >Λί δ 3 ÖiH Η£Η βΗ^^Λ^ΕΒΙ m c 1! f sll ill ί I I ij ä I δ ι fii ι s i»i -¾¾ I II i ι

3 I »Sips f Vs P

as as a ass is. § g g. a s EC nj <1> tt j-l Η λ: B K nj £ J2 «J .G ni

iH

26 7 5 1 87 i % •rl (Ο

-P rH

h ro •3 l o 1 1

sS

H 00 I

-P ·*

H O O

VO rH g ox8

H

H

£ S *g

1 3 ® S

e I

m - -δ I I

-rH (0 g ·Η Ή

tri -P (0 U) rH

O H ii Ο, Λ rH CU K (3 0 g v £ p

HH 3 (0 -H

U :(0 -P -H :rp Q -P g > -P (fl 1 :0 13 3 £ m •3 '5 I 8 & f H *H "Ö H fl •H **. 3 C* Cfl S 5 * .a s δ <8 in \ ·|—| -n g -r( o rH (0 0 (0 :3 rH 3

in -n -P -P M rH B

j i| 1 s1i 2 i/3 -H -H C a :0 (0 2 έι > -P ·Η ·Η ·η s is i 31* § S H Jij H S ·π S ^ S 43 Λ

D 3 W

m rH CP

§31 -S -3 •5 5 | 8 -p ίο a o 3 ä g ä

II

27 7 5 1 8 7 £5 ΰ <u tu d d Η Ή d EE ω >i d

4-> 4-> -Η -H

>ί >i d E ω tn -H -H -h :trj :n3 CU d >i >i tn tn tn en Οτνη-Hd-P >i 4-> >t >ι>ί >i

•H M >H 4-> -H -H H 111 +J >i -H -H >,-H

4-i :<0 td -pEO o -h tn hh m bi h m M >> d 3 M ·Η Jl Ή O O >1 >1 O >i ro HI 4J'H M4J ΗΛ >H >H >i >i Ml >i

(U -H-H E Ή e >1 o Hl H Ό Ό rl H Ό H

Sh entn tr O O >iM CX (U td td td td >i >i O O >(0 λ; x :to -h tn 4-> .h ex £X ·η ·η ·η -h x: x: M i-ι x: sh d id o -h α ή a o O tn oi tn tn Ό Ό 'ϋ ai φ o 4-i dd) did^jd >i>i>i>idd ^^d^ d M,* 44 d O CX 4-» CU ^ dl >i >i >i >i CU CU XlXd CU Xl •H in lii d > +t Od'HdrHrHrHrH dd d &> dd turo CX tn M-H d)-H o O 00 -h-h tntn-Htn O M M S 4-) dl rO CXrH xl d Sh M MX H H rO fO d d rH O^M r-H rH Ό Ό Ό Ό i—I i—( Ai ,¾ rH A! 0 td td -H d d td CU dd >i >i >i >i d) d) dd dd

h >> cxj :d6 > Ό -H+J x; x; x: x; Ό tu E E -PE

01 d)d) rH > -H CU >, > Xl >i >i -H -H XJ -rl >i -H -H -H <U >1 O ’H :d > O -H -H -H -H :d :d O O 0 0 x Pn nHMd)^x:>rH-px:rvd)d)d)(U4-i-p>>>;>

H

o $ X 'rf s -3 t—I 4-1

d M

d ja

EH S

w d d d> -h <u d

3 +> -H

fi tn d n d :d id r—i :d td :d td td td td td td td td td td td td td td X p >>I0>>>>>>>>>>>>>>>>> Q > >4 >, 4-» >1 >1>1 >1>1 >i >i >1 >1 >i >i >1 >1 >Ί >Ί >1 >1 •Hm x:x:x;x:x:x;x:x:x:x:x:x:x:xx:x:x:x:x:x: SL d o « λ; d s i tn h

(N -P

H d MM MM MM MM M M M M MM M M MM M M

H MiMiShShShShShJhShMiMiMiMiMiShShMiShMiSh JO >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> K Λ Οί dd r^t oo rr oo rr oo ^ ι-η <-h >—i 1 ·*τ —i

2; χχ rH rHrHC-IrHCHrHfMi-lfNrHCNli—ICNrHCNrHtN

d-H

CU H ro

UI

d O Sh d d Sh E <t> d d d d i tr> >i h-) i di d tn d r-π d -h Sh Sh dd-PM (Uxish snddd

SnrHd d O tp-H d d-H cp tn d rt d tji-P (UrH en tn -h d rt Ό 01 Ml rfl -H d-H d ro 4-) -H -rl d d i -h d -h 4-) -h -h e d d g-P-Hcgd-Pd d d-π -h o d d -h tn tn d -h -ri tn -h -h d rH O UI d P ‘H d Ή -H -rH X «1 4-1 .HW4-> o 6 H-idtned d o o d 4-1 CX Sh ,¾ d'H 41 C) 0) d CX »h d O 0) >1 d rH-H-H-HO d >i >1 01 <c ex tn j ω+j g rH < o « eh « 28 751 8 7 1¾ tn tn ·· 3 U -Π

O O

•H o «» ro C

P rH 3 3 0)

A tn tn C

(0 * tn · · *h Q) 3 ·· O e p tn o o (0

tn o cn O

CJ ·· in m -n :t0 :r0

<D O <N (0 -H -H

co 3 x: mm •H 3 > >1 >1 tji > tn ro -H -H >, >i

o totnro >tntorHrH

ή d m ^ ti) >i >i o o 0 > A rH >, >, p p •H rn :to (1) i—I rH 'ϋ Ό m töC> -P O O Sh >i N ϋ J) >t xi p p x: x: C xl ·Η Ό Ό C ·Η (0 t>i ί>ι ·Η ·Η 3 3* > xi xl 0) 0) to rH to e ® C -P tn ro -H Λ O (0 o u

Ai Ή Ai O

-P m rö -H - •n QJ ro “ tn ro •H tn -n X! tl) ro ·· to m -p -p u ro tn tn O to tn O ro o m tn ··

Ai 3 C in u :r0 :r0 :<0 :rö :r0

Ai > O o >>>>> 3 tn 3ι0υοο^ Sh Sh >i >i >i rH ro Λ n N m xi xl xl x; xl 3 X! 3 E-i

•H

-P

c

•H

O Ai Ai A! Ai Ai

Xl Ai P P P P P

3 3 P >>>>>

Ai A! > C -H co ^ oo in o

H 3 ιΠ tN rH CN rH

I CN

0) I r~

Ai Ή rH

tn a tn i

3 M O O -h 3 P

3 rH :3 O 2 E X! 3 P a +J A O -H tn tn 3 · -H rH 3 3 -H g rH Ό Ή -H tn rH C tl) tn Q)3C Sh

3 -H G S Xl -H H

tn -H -H 3 H -H 0)

3 EO-n UrHrH-H A

-P 3 A PO 3 3 G A

3 I 3 tn 3 E-i 0) A <1) P

rH tsa -H >, tn < P tn -H :3 W 2 ·—I i—13 ~ tD H <—I E-· n 29 75 1 8 7

Taulukko X

Actinomadura yumaense NRRL 12515:n kyky käyttää hyväksi hiililähdettä hiilihydraatin hyväksikäyttöelatusalus-5 talla ISP-9

Inkubointiaika: 28 vrk Lämpötila:28°C

Hiililähde_hyväksikäyttö adonitoli 1-arabinoosi 10 dulsitoli fruktoosi huono d-galaktoosi huono d-glukoosi hyvä glyseroli hyvä 15 i-inositoli huono laktoosi maltoosi keskinkertainen d-mannitoli d-mannoosi huono 20 d-meletsitoosi huono d-melibioosi d-raffinoosi 1-ramnoosi salisiini 25 sorbitoli sakkaroosi keskinkertainen d-trehaloosi hyvä d-ksyloosi negatiivinen kontrolli 30 75187

Taulukko XI

Actinomadura yumaense NRRL 12515:n kyky tuottaa happoja erilaisista hiilihydraateista Gordonin epäorgaanista typpeä sisältävällä peruselatusalustalla

5 Inkubointiaika: 28 vrk Lämpötila: 28°C

★

Hiililähde Hapontuotto _7 vrk_28 vrk adonitoli 1-arabinoosi - - 10 dulsitoli fruktoosi - - d-galaktoosi - + d-glukoosi +++ +++ glyseroli ++ +++ 15 i-inositoli - + laktoosi maltoosi - +++ d-mannitoli - - d-mannoosi - + 20 d-meletsitoosi - - d-melibioosi - - d-raffinoosi - - 1-ramnoosi sorbitoli 25 sakkaroosi - +++ d-trehaloosi - +++ d-ksyloosi negatiivinen kontrolli * 30 + + + = voimakkaasti positiivinen vaste ++ = kohtalaisen positiivinen vaste + = hieman positiivinen vaste - = negatiivinen vaste ti 75187 31

Taulukko XII

Actinomadura yumaense NRRL 12515:n kyky käyttää hyväksi orgaanisia happoja Gordonin muunnoksella Koserin perus-agarista (Koserin sitraattiagar)

5 Inkubointiaika: 28 vrk Lämpötila: 28°C

Hiililähde Hyväksikäyttö* asetaatti + bentsoaatti - sitraatti laktaatti malaatti + limahappo oksalaatti + pyruvaatti + 15 sukkinaatti + tartraatti + * + = positiivinen vaste - = negatiivinen vaste 20

On selvää, että sanonta Actinomadura yumaense ei rajoitu kantaan Actinomadura yumaense NRRL 12515 tai kantoihin, jotka täysin vastaavat yllä kuvattua kasvuja mikroskooppista karakterisointia, joka on esitetty 25 pelkästään valaisevana esimerkkinä. Tässä kuvattu Actinomadura yumaense käsittää kaikki Actinomadura yumaense-kannat, jotka pystyvät muodostamaan antinioot-teja LL-C23024oi,β ja ioota ja jotka eivät ehdottomasti ole erotettavissa Actinomadura yumaense NRRL 12515:stä 30 ja sen alaviljelmistä.

Actinomadura yumaensea voidaan viljellä käyttäen mitä erilaisimpia kiinteitä tai nestemäisiä viljelyalus-toja. Antibioottien LL-C23024.Αφ ja ioota tuottamisessa käyttökelpoiset alustat sisältävät assimiloituvaa 35 typpilähdettä kuten proteiinia, proteiinihydrolysaat- 32 751 87 tia, polypeptidejä, aminohappoja, maissinliotusnestet-tä jne. ja epäorgaanisia anioneja ja kationeja kuten kaliumia, natriumia, ammoniumia, kalsiumia, sulfaattia, karbonaattia, fosfaattia, kloridia jne. Elatusalustoi-5 hin lisätään hivenaineita kuten booria, molybdeeniä, kuparia jne. muiden aineosien epäpuhtauksien muodossa. Tankit ja kolvit ilmastetaan syöttämällä steriiliä ilmaa fermentointialustan läpi tai sen pinnalle. Lisäksi tankkia sekoitetaan mekaanisella sekoittimella.

10 Tarvittaessa voidaan lisätä vaahdonestoainetta kuten ihraöljyä tai silikonityyppistä öljyä.

Actinomadura yumaensea viljellään ja ylläpidetään vinoagarilla, esim. Bennettin agarilla hiiva-mal-lasagarilla tai ATCC Medium nro 172:lla.ATCC Medium 15 nro 172 on suositeltava. Vinoviljelmä inokuloidaan

Actinomadura yumaensen viljelmällä ja inkuboidaan 28-37°C:ssa, mieluummin n. 32°C:ssa n. seitsemän vuorokautta. Näitä varastoviljelmiä voidaan ylläpitää sarja-siirrostamalla tuoreisiin varastovinoviljelmiin tai 20 voidaan myös käyttää hyvin kasvaneesta vinoagarista saatua myseeliä sisältävää agartulppaa nestemäisten elatusalustojen inokuloimiseksi.

Actinomadura yumaensen ravistelukolvi-inokulaa-tit valmistettiin inokuloimalla 500 ml:n kolveissa ole-25 via 100 ml:n eriä steriiliä neste-elatusalustaa vino-agarviljelmästä saaduilla raaputteilla tai pestyillä itiöillä. Sopivien ymppielatusalustojen esimerkkejä ovat 11 33 7 5 1 87

Elatusalusta A

lihauutetta 0,3 % R 1

Bacto trypton'ia 0,5 % glukoosia 1,0 % 5 hiivauutetta 0,5 % vettä q.s. 100 % peptoni, rekisteröity tavaramerkki Difco Laboratories, Detroit, Michigan pH säädettiin arvoon 6,8-7,2 laimealla emäsliuoksella, esim. natriumhydroksidiliuoksella.

Elatusalusta B

glukoosia 1 % tärkkelystä 2 % _ hiivauutetta 0,5 % 1 -5 R 2 N-Z- amino A :a 0,5 % kalsiumkarboriaattia 0,1 % vettä q.s. 100 % 2 kaseiiniuute , rekisteröity tavaramerkki Sheffield Chemi-20 cal Co., Div. Nat'l. Dairy Products Corp. Norwich, N.Y.

Elatusalusta B on suositeltava.

Kolvit inkuboitiin lämpötilassa 25-35°C, mieluummin 32°C ja sekoitettiin voimakkaasti pyörivässä ravistelulait-teessa 1-4 vuorokautta. Sitten tätä ymppi-inokulaattia käy -25 tettiin fermentointiviljelmän inokuloimiseksi tai vaihto ehtoisesti tämä viljelmä voidaan pakastaa ja varastoida käytettäväksi myöhempien ymppiviljelmien inokulaattina.

Seuraavassa on esimerkkejä Actinomadura yumaensen sopivista fermentontialustoista antibioottien LL-C23023^(, P ja 30 iota valmistamiseksi.

Elatusalusta C

glukoosia 1,5 % glyserolia 1,5 % , 3 soi3a3auhoa 1,5 % 35 kalsiumkarbonaattia 0,1 % natriumkloridia 0,3 % vettä q.s. 100 % 75187 34 3 voidaan korvata puuvillansiemenjauholla tai liukoisilla liha-aineksilla yhtä hyvin tuloksin.

Elatusalusta D

glukoosia 3 % 5 soijajauhoa 1,5 % kalsiumkarbonaattia 0,1 % natriumkloridia 0,3 % vettä q.s. 100 %

Elatusalusta E

10 tärkkelystä 1 % siirappia 2 % soijajauhoa 1,5 % kalsiumkarbonaattia 0,1 % vettä q.s. 100 %

15 Elatusalusta F

glukoosia 3 % liukoisia liha-aineksia 2,5 % natriumkloridia 0,2 % kalsiumkarbonaattia 0,1 % 20 vettä q.s. 100 %

Elatusalusta G

glukoosia 3 % soijajauhoa 0,5 % ammoniumsulfaattia 0,3 % 25 natriumkloridia 0,2 % kalsiumkarbonaattia 0,1 % vettä q.s. 100 %

Elatusalusta H

glukoosia 3 % 30 ammoniumsulfaattia 0,3 % kaksiemäksistä kalium-fosfaattia 0,1 % kalsiumkarbonaattia 0,2 % natriumkloridia 0,1 % 25 vettä q.s. 100 %

Elatusalusta D on suositeltava.

11 35 7 5 1 87

Fermentointi voidaan suorittaa 100 ml:ssa elatusalustan 500 ml kolvissa, joka inokuloidaan 3-10 t/t-%:lla ymppiviljelmää, joka on valmistettu yllä kuvatulla tavalla, ja inkuboidaan 25-35°C:ssa, mieluummin n. 32°C:ssa, 5 24-72 tuntia ilmastaen. Fermentointiviljelmänäytteitä voi daan pakastaa ja varastoida myöhempää käyttöä varten ymppi-viljelmien inokulaattina.

Vaihtoehtoisesti fermentointi voidaan suorittaa suuremmassa fermentointitankissa, joka on varustettu il-10 mastus- ja sekoituslaitteilla. Jokainen tankki inokuloi daan 3-10 t/t-%:lla inokulaattia, joka on valmistettu yllä kuvatulla tavalla. Ilmastus suoritetaan nopeudella 0,5 - 2,0 litraa steriiliä ilmaa per litra viljelynestettä per minuutti ja elatusalustaa sekoitetaan sekoittimella, 15 jonka pyörimisnopeus on 200-400 kierr/min. Lämpötila pidetään 25-35°:ssa, mieluummin 32°C:ssa. Fermentointia jatketaan kunnes antibiootti rikastuu fermentointialustaan eli tavallisesti 100-150 tuntia, jolloin antibiootti otetaan talteen.

20 Antibiootti voidaan ottaa talteen ja puhdistaa mene telmin, jotka on kuvattu amerikkalaisessa patenttijulkaisussa 4 273 663 tai seuraavan menetelmän mukaan.

Sekoitetaan yllä kuvatulla tavalla valmistettu, kokonaisia soluja sisältävä epäpuhdas fermentintineste ja yhtä 25 suuri tilavuus veteen sekoittumatonta, ei-hiilivetytyyppis tä orgaanista liuotinta. Suositeltavia ovat metyleeniklori-di ja etyyliasetaatti. Orgaaninen faasi erotetaan ja konsentroidaan vakuumissa öljymäiseksi siirapiksi.

öljymäinen siirappi liuotetaan metyleenikloridiin ja 30 liuos lisätään kolonniin, jonka täytteenä on silikageeli,

R

alumiinioksidi, Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, joka on Pharmacia, Inc. Piscataway, N.J.:n tytäryhtiö) tai magnesiumalumiinisilikaatti. Esimerkkejä sopivista liuottimista kolonnin kehittämiseksi ovat dietyylieetteri, 35 etyyliasetaatti, metyleenikloridin ja etyylieetterin seos tilavuus/tilavuus-suhteessa 1:1 - 1:7, 10-40 % asetonia me- ,Ä 75187

Jo tyleenikloridissa, 2-10 % alempi-alkoholia (metanoli on suositeltava) metyleenikloridissa, 2-15 % asetonitriiliä metyleenikloridissa tai 2-15 % dioksaania metyleenikloridissa. Suositeltava on metyleenikloridi-etyyliasetaatti 5 tilavuus/tilavuus-suhteessa 1:1. Fraktiot otetaan talteen ja niistä tutkitaan antibakteerinen teho bioanalysoimalla vaikutukselle alttiin organismin, esim. Bacillus subtilik-sen suhteen. Aktiiviset fraktiot yhdistetään ja haihdutetaan vakuumissa jäännökseksi, joka liuotetaan orgaani-10 seen liuottimeen, esim. t-butanoliin (suositeltava), bent- seeniin tai p-dioksaaniin ja kylmäkuivataan.

Kylmäkuivattu kiintoaine liuotetaan sopivaan orgaaniseen liuottimeen, esim. metyleenikloridiin, heksaaniin, metyleenikloridi-etyyliasetaattiin, dietyylieetteriin, 15 heksaani-etyyliasetattiin, heksaani-kloroformiin tai hek- saani-eetteriin. Dietyylieetteri on suositeltava. Ravistellaan tätä liuosta ja vettä ja pH säädetään arvoon 1,5-4,0, mieluummin n. 2,5 hieman laimennetulla mineraalihapolla. Orgaaninen faasi erotetaan, pestään vedellä mahdollisen 20 happoylimäärän poistamiseksi, kuivataan sopivan kuivaus- aineen päällä, suodatetaan ja haihdutetaan jäännökseksi vakuumissa.

Tämä jäännös liuotetaan sopivaan liuottimeen ja liuos saa haihtua hitaasti, mieluiten n. 4°C:ssa. Esimerkkejä 25 sopivista liuottimista ovat metyleenikloridi, heksaani, metyleenikloridi-etyyliasetaatti, dietyylieetteri, heksaani-etyyliasetaatti, heksaani-kloroformi ja heksaani-eetteri. Suositeltava on heksaani-eetteri tilavuus/tilavuussuhtees-sa 5:2. Saadut kiteet eristetään ja pestään, mieluiten 30 n. 40°C:ssa, kohtalaisen korkean kiehumapisteen omaavalla hiilivedyllä, esim. heksaanilla tai heptaanilla ja kuivataan ilmassa, jolloin lopputuotteena saadaan antibiootti X-14868A vapaan hapon muodossa.

Haluttaessa tuote suolan muodossa voidaan vapaa 35 happo muuttaa käsittelemällä vastaavalla kationilla mieluiten laimean epäorgaanisen emäksen muodossa ammattimie- ii 37 751 87 hen hyvin tuntemin menetelmin.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä. Elatusalustat A, B, C jne. ovat kuten yllä. Jollei muuta ilmoiteta kaikki menetelmät toteutetaan huoneenlämpötilassa (n.22°C) 5 ja paineessa 1 atm.

Esimerkki 1

Actinomadura yumaense NRRL 12515:n vinoagarista talteenotetuilla pestyillä itiöillä inokuloitiin 500 ml kolvi, jossa oli 100 ml steriiliä elatusalustaa B. Kolvi 10 inkuboitiin pyörivässä ravistelulaitteessa kaksi vuorokaut ta 28°C:ssa.

Tästä viljelmästä siirrostettiin sitten 5 %:n inoku-laatti 100 ml:aan steriiliä elatusalustaa C 500 ml kolvissa ja inkuboitiin viisi vuorokautta 28°C:ssa pyörivässä 15' ravistelulaitteessa.

Antibioottinen teho tutkittiin päivittäin bioanaly-soimalla Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Bacillus subti-lis ja Streptococcus faecal is suhteen ja tehoa matolääkkee-nä seurattiin bioanalysoimalla vapaasti elävän sukkulama-20 don Caenorhabbitis elegans suhteen.

Esimerkki 2

Preparoitiin seitsemän 500 ml kolvia, joista jokainen sisälsi 100 ml seuraavia steriilejä elatusalustoja: Kolvi 1: 100 ml elatusalustaa C

25 Kolvi 2: 100 ml elatusalustaa C, jossa 1,5 % puuvillansie-menjauhoa soijajauhon asemasta Kolvi 3: 100 ml elatusalustaa C, jossa 1,5 % liukoisia liha-aineksia soijajauhon asemasta Kolvi 4: 100 ml elatusalustaa D 30 Kolvi 5: 100 ml elatusalustaa E Kolvi 6: 100 ml elatusalustaa F Kolvi 7: 100 ml elatusalustaa G

Jokainen näistä kolveista inokuloitiin elatusalustassa B viljellyn Actinomadura yumaens NRRL 12515:n 5 %:sella 35 inokulaatilla. Kolvit inkuboitiin sitten pyörivässä ravistelulaitteessa 4-6 vuorokautta 28°C:ssa.

38 751 87

Jokainen yllä kuvatuista viljelmistä osoittautui aktiiviseksi tutkittaessa niistä abtibioottinen teho esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja tutkittaessa niiden anti-kokkidioosivaikutus Eimeria tenellaan kananpojan munuaisis-5 ta valmistetuissa kudosviljclmissä.

Esimerkki 3

Inkuloitiin Actinomadura yumaense NRRL 12515:n pakastetuilla fermentointiviljelmäsoluilla 500 ml kolvi, jossa oli 100 ml steriiliä elatusalustaa B. Sitten kolvi 10 inkuboitiin neljä vuorokautta 32°C:ssa pyörivässä ravis-telulaitteessä.

Tästä viljelmästä siirrostettiin 5 %:inen inoku-laatti 500 ml kolvissa olevaan 100 ml:aan steriiliä elatusalustaa H ja inkuboitiin viisi vuorokautta 28°C:ssa 15 pyörivässä ravistelulaitteessa.

Antibakteerinen teho todettiin kuten esimerkissä 1 ja antikokkidioositeho kuten esimerkissä 2.

Antibioottinen teho analysoitiin myös ohutkerroskro-matografisesti silikageelilevyillä, jotka kehitettiin 20 etyyliasetaatti-kloroformissa (tilavuus tilavuus-suhde 70:30).

Esimerkki 4 100 ml steriiliä elatusalustaa A 500 ml kolvissa inokuloitiin Actinomadura yumaense NRRL 12515:n vinoaga-25 rista talteenotetuilla pestyillä itiöillä. Kolvi inkuboi tiin kaksi vuorokautta 32°C:ssa pyörivässä ravistelulaitteessa.

Sitten tästä viljelmästä siirrostettiin 5 %:inen inokulaatti 500 ml kolvissa olevaan 100 ml:aan steriiliä 50 elatusalustaa H ja inkuboitiin kaksi vuorokautta 32°C:ssa pyörivässä ravistelulaitteessa.

Sitten tästä viljelmästä siirrostettiin 5 %:inen inokulaatti 500 ml kolvissa olevaan 100 ml:aan tuoretta steriiliä elatusalustaa H ja inkuboitiin kuusi vuorokautta 35 28°C:ssa pyörivässä ravistelulaitteessa.

Antibakteerinen teho todettiin kuten esimerkissä 1.

li 39 751 8 7

Esimerkki 5

Kaksi 500 ml kolvia, jotka kumpikin sisälsivät 100 ml steriiliä elatusalustaa A, inokuloitiin Actinomadura yumaense NRRL 12515:n pakastetulla ymppiviljelmällä ja 5 inkuboitiin kaksi vuorokautta 32°C:ssa pyörivässä ravi s tel ula it teessä .

Sitten molempien kolvien sisältö yhdistettiin ja lisättiin 12 litraan tuoretta steriiliä elatusalustaa A 20 litran kolvissa. Tämä viljelmä inkuboitiin sitten kaksi 10 vuorokautta 28°C:ssa ilmastaen.

Tämän kolvin sisältö siirrettiin 300 litran ymppi-tankkiin, jossa oli 288 litraa steriiliä elatusalustaa A ja tätä viljelmää ilmastettiin ja sekoitettiin 25 tuntia 32°C:ssa.

15 25 tunnin inkuboinnin päätyttyä nämä 300 litraa ymppi- viljelmää siirrettiin 1500 litran fermenttoriin, jossa oli 1200 litraa steriiliä elatusalustaa C. Tätä viljelmää inkuboitiin ilmastaen ja sekoittaen 115 tuntia 28°C:ssa.

Fermentointinesteestä analysoitiin antibioottinen 20 aktiivisuus ohutkerroskromatografisesti silikageelilevyil- lä, jotka kehitettiin etyyliasetaatti-kloroformissa (tila-vuus/tilavuus-suhteessa 70:30). Vaihtoehtoisesti useita näistä kehitetyistä levyistä bioanalysoitiin Bacillus subtiliksen suhteen ja voitiin todeta niissä antibioottinen 25 teho.

Esimerkki 6

Tyypillinen elatusalusta, jota käytettiin primääri-inokulaatin viljelyssä, valmistettiin seuraavan reseptin mukaan: 30 lihauutetta 0,3 %

(S

Bacto trypton'ia 0,5 % glukoosia 1,0 % hiivauutetta 0,5 %

Bacto -agaria 0,15 % 35 vettä q.s. 100 % 40 7 5 1 87

Inokuloitiin Actinomadura yumaense NRRL 12515:n vinoagarista talteenotetuilla pestyillä tai myseeleillä 500 ml kolvissa oleva 100 ml yllä mainittua steriloitua elatusalustaa. Kolvi asetettiin pyörivään ravistelulait-5 teeseen ja sekoitettiin voimakkaasti 48 tuntia 32°C:ssa.

Saaduilla kolvi-inokulaatilla (100 ml) inokuloitiin 1 litra samaa steriiliä elatusalustaa 2 litran kolvissa. Tätä ino-kulaattia ilmastettiin steriilillä ilmalla samalla kun viljelyä jatkettiin 48 tuntia 28°C:ssa. Sitten tällä yhden 10 litran viljelmällä inokuloitiin 30 litran fermentointi- tankki, jossa oli samaa steriiliä elatusalustaa, ja tätä tankkia ilmastettiin steriilillä ilmalla ja inkuboitiin 42 tuntia 28°C:ssa.

Esimerkki 7 15 Valmistettiin fermentointielatusalusta seuraavan reseptin mukaan: dekstroosia 1,5 % glyserolia 1,5 % soijajauhoa 1,5 % 20 kalsiumkarbonaattia 0,1 % natriumkloridia 0,3 % vettä q.s. 100 % pH säädettiin arvoon 7,0 6-n natriurahydroksidiliuoksella ja elatusalusta steriloitiin. Kolmenkymmenen litran 25 inokulaatti-osalla, joka oli valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, inokuloitiin 250 litraa yllä mainittua elatusalustaa 300 litran fermenttorissa. Pinnalle puhallettiin steriiliä ilmaa ja massaa sekoitettiin juoksupyörä-sekoittimella pyörimisnopeudella 220 kierr/min. Fermentointi 30 kesti 97 tuntia 32°C:ssa, jonka jälkeen massa otettiin talteen.

Esimerkki 8

Valmistettiin fermentointielatusalusta seuraavan reseptin mukaan: 35

II

41 75187 dekstroosia 3,0 % soijajauhoa 1,5 % kalsiumkarbonaattia 0,1 % natriumkloridia 0,3 % 5 vettä q.s. 100 % pH säädettiin arvoon 7,0 6-n natriumhydroksidiliuok-sella ja elatusalusta steriloitiin. 300 litralla inokulaat-tia, joka oli valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, inokuloitiin 300 litraa yllä mainittua elatusalustaa 10 fermenttorissa. Pinnalle puhallettiin steriiliä ilmaa.

Massaa sekoitettiin juoksupyöräsekoittimella pyörimisnopeudella 100 kierr/min. Fermentointi kesti 115 tuntia 32°C:ssa, jonka jälkeen massa otettiin talteen.

Esimerkki 9 15 1. Fermentointimassan (100 litraa) pH säädettiin arvoon 4,0 käyttäen 6-n HCl:ää. Sitten hapotettua massaa ja yhtä suuri tilavuus metyleenikloridia sekoitettiin 1-2 tuntia. Massan ja metyleenikloridin seos suodatettiin sitten käyttäen piimaata suodatusapuaineena. Metyleeni-20 kloridiuute eristettiin ja konsentroitiin vakuumissa n. kahdeksi litraksi osaksi puhdistettuja antibioottisia aineita.

2. Osaksi puhdistettujen antibioottisten aineiden kromatografia silikageelillä.

25 Lasikolonni, jonka halkaisija oli 7 cm, täytettiin 91 cm:n korkeuteen Woelm Silica Gel TSC:llä. Epäpuhdas konsentraatti (ks. kohta 1 yllä), jonka tilavuus oli n.

2 litraa, sai tihkua silikageelikolonniin. Sitten kolonni kehitettiin ensin kolmella litralla metyleenikloridia ja 30 sitten metyleenikloridi-etyyliasetaatilla (tilavuussuhtees sa 1:1) siten, että saatiin kaikkiaan 126 fraktiota, joista jokaisen tilavuus oli 80 ml. Tämän jälkeen kehitettiin edelleen etyyliasetaatti-etanolilla (7:3) ja saatiin vielä 87 fraktiota.

35 Fraktiot 58-87, joissa oli runsaasti antibioottia C23024^ , yhdistettiin ja konsentroitiin vakuumissa jään- 42 751 87 nökseksi, joka painoi 90,4 g. Tämä jäännös liuotettiin seokseen, jossa oli 600 ml dietyylieetteriä ja 600 ml hek-saania. Saatu suspensio suodatettiin ja muodostui kirkas suodos. Tämä konsentroitiin vakuumissa, kunnes alkoi muo-5 dostua kiteitä. Tätä suspensiota seisotettiin yli yön. Kiteinen aine C23024<k otettiin talteen suppilossa, pestiin kylmällä eetterillä, kuivattiin ilmassa ja saatiin 33,1 g kiteistä C23024<)\:a. Lisäksi saatin 12,4 g C23024ck :a konsentroimalla edelleen yhdistettyjä suodosta ja pesunes-10 teitä.

Fraktiot 177-203, jotka oli saatu eluoimalla etyy-liasetatti-etanolilla ja joihin C23024/3 oli rikastunut, yhdistettiin ja konsentroitiin vakuumissa ja saatiin 6,7 g osittain puhdasta C23024^:a ja jatkettiin kuten yllä.

15 Fraktiot 204-213, jotka oli saatu eluoimalla etyyli asetaatti-etanolilla ja joihin L-C23024 ioota oli rikastunut, yhdistettiin ja konsentroitiin vakuumissa tahnaksi, jota uutettiiin useita kertoja metanolilla. Metanoliuute uutettiin mety-leenikloridilla ja tämä uute kaadettiin Woelmin silikagee-20 liä sisältävään kolonniin. Kolonni pestiin metyleenikloridil- la ja eluoitiin sitten metyleenikloridi-etyyliasetaatilla (2:3). Fraktiointia ohjattiin ohutkerroskromatografiän avulla ja aktiiviset fraktiot yhdistettiin, käsiteltiin puuhiilellä, konsentroitiin ja uutettiin useita kertoja hep-25 taanilla. Lopullinen heptaaniuute pidettiin 0°C:ssa 48 tuntia ja kiteet eristettiin emäliuoksesta suodattamalla.

Tämä emäliuos liuotettiin metyleenikloridiin ja muodostuneen liuoksen annettiin tihkua lasikolonniin, joka oli täytetty Woelm silikageelillä. Sitten kolonni eluoitiin 30 peräkkäin 2 litralla metyleeniä, 8 litralla metyleeniklo- ridi-etyyliasetaattia (1:1) ja 4 litralla etyyliasetaatti-metanolia (9:1). Eluaatti otettiin talteen fraktioina, joiden antibioottinen koostumus tutkittiin Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin vakuumissa ja saatiin 35 jäännös, joka sisälsi LL-C23024 ioota.

Il 43 751 87

Esimerkki 10 3. Silikageelillä puhdistetun C23024P:n lisäpuhdistus

SephadexRLH20 sai turvota heksaanin, metyleenikloridin ja metanolin 10:5:1-seoksessa. Lasikolonni, jonka halkaisi-5 ja oli 5 cm, täytettiin geelillä 86 cm:n korkeuteen. Panos eli 3 g puhdistettua LL-C23024P:a liuotettiin seokseen, jossa oli 10 ml metyleenikloridia, 1 ml metanolia ja 10 ml heksaania, ja liuoksen annettiin tihkua geelikolonniin.

Sitten kolonni 3 kehitettiin liuotinseoksella, joka koos-10 tumukseltaan oli sama kuin lisättäessä antibiootti kolonniin.

Fraktiot otettiin talteen fraktiokerääjällä. Jokaisen fraktion tilavuus kahdessakymmenessäkolmessa ensimmäisessä fraktiossa oli 17 ml. Ohutkerroskromatografiän mukaan fraktiot 17-26 sisälsivät C23024p:a. Nämä fraktiot yhdis-15 tettiin ja konsentroitiin vakuumissa ja saatiin 1269 mg puhdasta, amorfista LL-C23024 /3 :a.

Esimerkki 11 LL-C23023β :n kiteyttäminen natriumsuolana 2,4 g puhdistettua LL-C23024 P :a, joka oli valmistet-20 tu kuten yllä kohdissa B ja C on kuvattu, liuotettiin seokseen, jossa oli 500 ml dietyylieetteriä, 160 ml heksaania ja 25 ml metyleenikloridia. Saatu liuos siirrettiin erotussuppiloon, jossa oli 300 ml tislattua vettä. Lisättiin tiputtaen laimeaa HCl:ää (1-n), kunnes pH-arvoksi tuli 25 2,0-2,5 ravistelun ja laskeutumisen jälkeen. Hapan vesipi toinen faasi hylättiin ja hapolla käsitelty orgaaninen kerros pestiin kolmasti peräkkäin 400 ml:n erillä vettä. Sekoitettiin pestyä orgaanista kerrosta ja teelusikallista Darco G-60 -jauhetta 15 minuuttia ja suodatettiin celiten läpi.

30 Orgaaninen kerros, josta väri oli poistettu, kaadettiin 500 ml:n päälle tislattua vettä ja lisättiin tiputtaen 5-n natriumhydroksidiliuosta, kunnes pH-arvoksi tuli 11,0-11,5 ravistelun ja laskeutumisen jälkeen. Alkalinen vesifaasi hylättiin ja jäljelle jäänyt orgaaninen kerros pestiin kah-35 desti 400 ml:n erillä vettä. Pesty orgaaninen kerros kui- 751 87 44 vattiin natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin sitten vakuumissa tilavuuteen 150 ml. Tätä konsentraattia seisotettiin suojattuna useita tunteja. Kiteinen aine LL-C23024/3 otettiin talteen suppilossa, pestiin kylmällä bentseenillä, 5 kuivattiin ilmassa ja saatiin 402 mg LL-C23024p:n kiteistä suolaa. Tällä näytteellä suoritettiin mikroanalyysejä ja määritettiin valikoituja spektriarvoja.

Analyysi: C^H^O^Na

Laskettu: C 59,70 H 8,33 0 29,46 tuhkaa 2,49 10 Saatu: C 61,55 H 8,79 tuhkaa 3,31 N 0

Sulamispiste (Fisher-Johnin laite): 174°C FDMS = 924, - +3,2° (metanolissa)

Esimerkki 12 LL-C23024 iootan puhdistus 15 Suuritehoinen nestekromatografialaite (Waters Prep.

500A) varustettiin silikageelipatruunalla paineessa 38,5 kp/cm . Panos, jona oli 5,0 g esimerkissä 3 saatua raaka-ainetta, liuotettiin 50 ml:aan heptaani-etyyliasetaat-tia (45,55) ja ruiskutettiin silikageelikolonniin. Sitten 20 kolonni kehitettiin samalla liuotinseoksella virtausnopeudella 200 ml/min ja otettiin talteen 40 fraktiota, joista jokaisen tilavuus oli 200 ml. Fraktiot 21-32 yhdistettiin, konsentroitiin jäännökseksi ja jäännöstä hierrettiin hek-saanissa ja haihdutettiin kuiviin ja saatiin LL-C23024 25 ioota puhtaana. Yllä kuvattu menettely toistettiin neljästi ja saatiin kaikkiaan 280 mg amorfista LL-C23024 ioota.

90 mg:n osa amorfisesta LL-C23024 iootasta liuotettiin 10 ml:aan vettä ja pH säädettiin arvoon 2,5 0,1-n kloori-vetyhapolla. Eetterikerros pestiin vedellä, pH säädettiin 30 arvoon n. 11 0,1-n natriumhydroksidiliuoksella, erotettiin ja pestiin jälleen vedellä. Eetterifaasi kuivattiin natrium-sulfaatin päällä, suodatettiin ja konsentroitiin jäännökseksi. Tämän jäännöksen liuos eetteri-heksaanissa sai hitaasti haihtua, jolloin muodostui valkoinen kiintoaine.

li 45 75187 Tämän valkoisen kiintoaineen ominaisuudet olivat: Alkuaineanalyysi: C 61,79 H 8,84 tuhkaa 0,32 = +27° (c = 0,724 metanolissa)

Kenttädesorptiomassaspektrometria: (M+Na)+ = m/e 5 953, joten laskennollinen molekyylipaino on 930.

Claims (7)

1. 46 751 87 Patenttivaatimus Uusi menetelmä tunnettujen antibioottien LL-C23024-alfa(o6) (= X-14868A) , LL-C23024beeta (/*)(= X-14868C) ja LL-
2. 5 C23024ioota(L) (= X-14868B) valmistamiseksi, OMe Me O- Me U OMe OH '= *· 0 Me * ^OMe O j,je O-IyJo 0H H Me11 Me H Me H H H COOH
3. 15 X-14868 A = LL-C23024alfa (oi) OMe 20 OH OH 1 Me 1 OMe f O Me Me
4. 25. OH ί i * Me H Me H H H OH COOH Me X-14868C = LL-C2 302 4beeta( β) OMe
5. 3. A5Me iin>Me (¾ Hi H Me H Me H H H OMe C02H Me X-14868B = LL-C23024ioota(£) II 47 7 5 1 87 tunnettu siitä, että fermentoidaan aerobisesti mikro-organisimia Actinomadura yumaense NRRL 12515 nestemäisessä elatusalustassa, joka sisältää hiilen ja typen assimiloituvia lähteitä sekä epäorgaanisia suoloja, pitä-5 mällä fermentointiviljelmä lämpötilassa 25-35°C 24-150 tuntia, jonka jälkeen antibioottinen aine eristetään sinänsä tunnetulla tavalla. 48 751 87 Ett nytt förfarande för framställning av kända antibiotika LL-C23024alfa Ipi) ( = X-14868A), LL-C23024beta-5 (/3)(= X-14868C) och LL-C23024iota (I) ( = X-14868B) , OMe Me° 0,‘ OMe 0H
6. 10 VV"^ \ «e. ...Me I OH H k h Me H He H J J °nJ COOH Me H H OH 15 X-14868 A = LL-C23024alfa (tC) OMe -VV 20 \/0 OH OH 1 Me Ξ * OMe O Me . ΧτΏτντΰγΤΤΓ /rotyTo^o^ ^•o/=£'o't JvoT e (OH ,iu Me H Me H H H qh ^ J 1 Me COOH' X-14868C = LL-C23024beeta (/?) OMe /^V^OMe ?Me ? Ο™»®
7. 35. OH H li H Me H Me H H H OMe C02H Me X-14868B = LL-C23024ioota(L) II