DK161332B - Biologisk ren kultur af actinomadura yumaense og dens anvendelse ved en fremgangsmaade til fremstilling af antibiotika ll-c23024-alfa, -beta og -iota - Google Patents

Description

Den foreliggende opfindelse angår en biologisk ren kultur af Actinomadura yumaense, hvilken kultur er ejendommelig ved, at den er Actinomadura yumaense NRRL 12515, og at den kan danne antibiotika LL-C23024-a, ~β og -iota ved fer-5 mentering i et flydende næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen samt uorganisk salte.

Antibiotika LL-C-23024-α, -β og -iota er kendte forbindelser, som har de nedenfor viste strukturformler, og som har antibakteriel og anticoccidel virkning. Disse an-10 tibiotika er kendt fra f.eks. DK patentskrift nr. 149.639, ifølge hvilket de fremstilles ved fermentering af en stamme af arten Nocardia sp. X-14868, ATCC 31585.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotika LL-C23024-a, -β og -iota med 15 nedenstående strukturformler, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man aerobt fementerer Actinomadura yumaense NRRL 12515 i et væskemedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen samt uorganiske salte, indtil en væsentlig antibiotisk aktivitet er til stede i fermentationsvæsken, 20 og at man derefter udvinder de antibiotiske stoffer derfra.

Antibiotiket LL-C23024-a har følgende struktur: JQMe 25

Me* ^V>0Me 0^ Me<^V>Me i/—v /—v /—v γ 30 ÆS O-jt C00H Me

Antibiotiket LL-C23024-/J har følgende struktur: 35

O

DK 161332 B

2 OMe

MeO* Y

Oh 0H f COQH Me 10

Ovennævnte struktur for LL-C23024-6 er baseret på grundstofanalyse, optisk drejning, feltdesorption, massespek-troskopisk molekylevægt, smeltepunkt, infrarødt spektrum (IR), 13 13 15 C-kernemagnetisk resonnans-( C-NMR) -spektrum og protonmagnetisk resonnans-(^H-NMR)-spektrum således som anført i detaljer i eksemplerne og vist på den ledsagende tegning, hvor fig. 1 er LL-C23024-6's IR-spektrum i KBr, fig. 2 er LL-C23024-6's 13C-NMR-spektrum, 20 MHz i 20 CDClg, intern TMS-referensækvivalent, og fig. 3 er ^H-NMR-spektrum for LL-C23024-8, 80 MHz i CDClg, intern TMS-referensækvivalent.

Tabel I

25 11^23024-^3 ^C-NMR-spektrum (ppm i forhold til TMS)

Kemisk skift (ppm) Antal carbonatomer 10,5 1 11,0 1 12,2 1 30 17,0 1 17,7 1 17,9 1 22,3 1 26,1 1 35 26,8 1

DK 161332 B

3 0 Tabel I (forts.)

Kemisk skift (ppm) Antal carbonatomer 27.6 1 30.2 1 32.0 1 5 χ 33.3 1 33.7 2 33.8 2 36.5 1 10 36'8 1 39.0 1 39.9 1 45.5 2 57.1 1 15 59,1 1 60,7 1 66.9 1 67.6 1 70.2 1 20 71,3 1 72.9 1 74.9 1 75.1 1 79.9 1 25 80,8 1 82.1 2 84.5 1 84.7 1 85.6 1 30 86,9 1 95.8 1 96.9 1 97.7 1 107,5 1 35 179,2 1_

Ialt 46 carbonatomer

DK 161332B

4 0 LL-C23024-iota er et polyether-antibiotikum med meget kraftig anticoccidiel aktivitet. Det er mindst 10 gange så kraftigt som de fleste andre kendte polyethere. Feltdesorp-tionsmassespektrale data viser, at det har en molekylevægt på 930, hvilket sammen med det 13C-kernemagnetiske resonnans-5 (13C-NMR)-spektrum tillader et forslag til en foreløbig molekylformel C48H82°17· Senere er strukturen af LL-C23024-iota blevet fastlagt som havende formlen OMe rY“ 10 fko>Me

15 COjH

De ovennævnte iagttagelser er baseret på grundstofanaly- se, optisk drejning, molekylvægt beregnet ved hjælp af felt- 13 2o desorptionsmassespektorskopi, infrarødt (IR) spektrum, C- -NMR-spektrum og protonkernemagnetisk resonnans-(^H-NMR)-spektrum, således som detaljeret anført i eksempler og vist på den ledsagende tegning, på hvilken fig. 4 er LL-C23024-iotas IR-spektrum i KBr, 25 fig. 5 er LL-C23024-iotas 1H-NMR-spektrum, 80 MHz i CDCl^/ intern TMS-referensækvivalent, fig. 6 er LL-C23024-iotas 13C-NMR-spektrum, 20 MHz i CDCl-., intern TMS-ref erensækvivalent, •5 1 Λ fig. 7 er LL-C23024-iotas JC-NMR-spektrum,(udvidet 30 målestok: 0-50 ppm), 20 MHz i CøCl^, intern TMS, og fig. 8 er LL-C23024-iotas ^3C-NMR-spektrum,(udvidet målestok: 50-110 ppm), 20 MHz i CDCl^, intern TMS-referensækvivalent .

13 LL-C23024-iotas C-NMR-spektre er målt i deutero-35 -chloroform (CDCl^) med en feltstyrke på 20 MHz. Spidserne 5

DK 161332 B

° med deres respektive kemiske skift i dele pr. million i forhold til tetramethylsilan (TMS) og det anslåede antal carbonatomer pr. spids er anført i tabel II. Spidserne iagttages for chloroform ved 75,4, 77,0 og 78,6.

5 Tabel II

Kemisk skift Antal C-atomer_Kemisk skift Antal C-atomer 10.6 1 32,2 1 10.9 1 33,4 1 11.7 1 33,8 2 10 16.4 1 34,2 1 17.5 1 36,7 1 18.0 1 37,2 1 21.7 1 39,4 1 22.9 1 40,3 1 24.1 1 44,5 1 28.2 1 45,4 1 31.2 ' 2 47,6 1 56.8 1 81,8 1 20 59,9 1 84,8 1 60.8 2 85,3 1 68.5 1 85,6 1 68.8 1 86,8 1 71.3 1 88,5 1 25 72,2 1 95,9 1 76,1 1 97,9 1 76,9 1 99,6 1 78.5 1 107,2 1 81,0 1 173,0__1 30 81,3 _1_Ialt 48

Antibiotika LL-C23024-a, -β og -iota er organiske carboxylsyrer og er således i stand til at danne salte med ikke-toksiske pharmaceutisk acceptable kationer. Således kan salte, der er dannet ved, at den antibiotiske fri syre 35 er blandet med støkiometriske mængder kationer, bedst i et

O

DK 161332 B

6 neutralt opløsningsmiddel, fås med kationer såsom natrium-, kalium-, calcium-, magnesium- og ammonium- samt organiske aminkationer såsom tri(lavere alkyl)amin, (f.eks. triethyl-amin, triethanolamin), procain og lignende. De kationiske salte af det antibiotiske LL-C23024-/J er almindeligvis kry-stallinske faststoffer, der er forholdsvis uopløselige i vand og opløselige i de fleste almindelige organiske opløsningsmidler, såsom methanol, ethylacetat, acetone, chloroform, heptan, ether og benzen. Ved anvendelse som antibioti-kum imod bakterier og cocci er den fri syre ækvivalent med de pharmaceutisk acceptable, ikke-toksiske salte.

Antibiotika LL-C23024-/? og -iota er aktive in vitro over for gram-positive bakterier, når de afprøves ved hjælp af en standardagarfortyndingsmetode. Resultaterne er anført som minimale inhiberende koncentrationer (MIC) i /xg/ml i tabellerne III og IV. Antibiotika LL-C23024-/3 og -iota er ikke aktive over for gram-negative organismer i koncentrationer på 256 Mg/ml eller mindre.

Tabel III

20 LL-C23024~£1 s antibaktenelle aktivitet in vitro

Minimal inhiberende

Organisme___koncentration (ug/ml)__

Staphylococcus aureus Smith 64 " " SSC 80-11 64 25 » " SSC 80-32 64 " " SSC 80-38 64 " " LL-14 64 " ” LL-45 64 " ·* LL-27 128 on ” " ATCC 25932 64

Streptococcus pyogenes C203 1 " β-hæmolytisk Keller T623 8 " pneumoniae 78-1 8

Enterococcus SSC-80-62 64 _" SSC-80-63_ 128_ 35

O

7

DK 161332 B

Tabel IV

LL-C23024-iotas antibakterielle aktivitet in vitro

Minimal inhiberende kon-

Organisme_centration (pg/ml)_ 5 Enterococcus OSU 75-1 1

Enterococcus SM 77-15 1

Staphylococcus aureus SSC 79-18 1

Staphylococcus aureus FU 79-19-2 2

Micrococcus lutea PCI 1001 1 10 Staphylococcus aureus Smith 0,5

Staphylococcus aureus ATCC 25923_0,5_

Som det fremgår af ovenstående data, inhiberer antibiotika LL-C23024 -/3 og -iota vækst af visse gram-positive bakterier, og de kan således anvendes som et topisk eller over-15 flade-antiseptisk middel i vaskeopløsninger til hud, udstyr, vægge, gulve etc.

Det har også vist sig, at de antibakterielle LL-C23024-a, -β og -iota er aktive in vivo som anticoccidielt middel til fjerkræ, som det fremgår af følgende prøver.

20

To dage før inokulering tilbydes foder med flere forskellige præparatniveauer til forskellige grupper af en dag gamle forsøgskyllinger. Det fjerkræfoder, der anvendes under hele forsøget, fremstilles på følgende måde: 25

Forblanding af vitamin-aminosyre 0,5%

Spormineraler 0,1%

Natriumchlorid 0,3%

Dicalciumphosphat 1,2%

Malet kalksten 0,5% 30 . _

Stabiliseret fedt 4,0%

Dehydratiseret lucerne, 17% protein 2,0%

Majsglutenmel, 41% protein 5,0%

Sildefiskemel, 60% protein 5,0%

Sojabønneoliemel, 44% protein 30,0%

Malet gul majs op til 100,0% 35

O

DK 161332 B

8

Vitamin-aminosyre-forblandingen i ovennævnte foderblanding fremstilles ud fra følgende sammensætning. Mængdeudtrykkene henfører til enheder pr. kg færdig foderblanding.

5 Butyleret hydroxytoluen 125,0 mg dl-Methionin 500,0 mg

Vitamin A 3300,0 I.E.

Vitamin 1100,0 I.C.E.

Riboflavin 4,4 mg 10 Vitamin E 2,2 I.E.

Niacin 27,5 mg

Panthothensyre 8,8 mg

Cholinchlorid 500,0 mg

Folinsyre 1,43 mg 15 Menadion-natriumbisulfat 1,1 mg

Vitamin B.^ 11,0 ug

Malet gul majs op til 5,0 g

Forsøgskyllingerne inokuleres derefter ved direkte 20 inokulation i kroppen på hver kylling med et blandet podestof af 5000 sporedannede oocyster af Eimeria acervulina og et tilstrækkeligt antal oocyster af Eimeria tenella til, at der fås en dødelighed på 85-100% hos ubehandlede kontroldyr. Kyllingerne har fri adgang til foder og vand under hele forsøgsperi-25 oden. Syv dage efter inokulering afsluttes forsøgene, og fuglene vejes, obduceres, og tarmkanalen undersøges for læsioner. Resultaterne findes i tabellerne V og VI nedenfor og viser, at der fås forbedret overlevelse for inficerede kyllinger, når der indgives 10 ppm eller mindre antibiotisk 30 LL-C23024-8 eller -iota med foderet. Resultaterne viser også en signifikant nedgang af læsioner i tarmkanalen på grund af Eimeria tenella og Eimeria acervulina.

35

O

9

DK 161352 B

Tabel V

Bedømmelse af antibiotikum LL“C23024-g som anticoccidielt middel til kyllinger

Kone. Antal Procent fugle med re- 5 i fugle ducerede læsioner foder fra % E. E.

Forbindelse ppm start overlevelse tenella acervulina LL-C230243 15 3 100 100 100 LL-C230243 10 5 100 60 100 10 LL-C230248 5 5 80 0 100 _NNC* 15_46,6_0_0__ LL-C230243 120 15 100 100 100 60 15 100 100 100 30 15 100 100 100 15 0 15 20 0 0 _NNC * 15_100_“_— LL-C230248 20 · 15 100 87 100 15 15 100 60 100 10 15 60 0 0 20 5 15 47 7 0 0 15 27 0 0 _NNC * 15_100_~_— * NNC = ikke-behandlet, ikke-inficeret kontrol

25 Tabel VI

Bedømmelse af antibiotikum LL-C23024-iota som anticoccidielt middel til kyllinger ,, ^ .. , . . ~ . _ Ant. fugle med red. læs.

Koncentration Antal fugle % -2-- i foder (ppm) ved start overlevelse E. tenella E.acervulina 30 15 5 100 1 00 1 00 10 5 100 100 100 5 5 60 20 60 _0__15_20__0__0 15 10 100 100 100 35 7,5_10_100_70_100

DK 161332B

10 o

De følgende prøver viser den nematodicide aktivitet.

5 Bedømmelse af prøvesammensætninger med henblik på nematodicid aktivitet ved anvendelse af fritlevende hermaphroditiske mikro-bivore nematode Caenorhabditis elegans II

Ved de følgende prøver anvendes C. elegans til bestemmelse af den nematodicide aktivitet i fermenteringsnærings-10 væsken og den høstede masse fremstillet ved fremgangsmåden i-følge den foreliggende opfindelse. Denne organisme anvendes også til bedømmelse af LL-C23024-a og LL-C23024-3 med henblik på disses nematodicide aktivitet.

Ved disse prøver er fermenteringsnæringsvæske den 15 blanding af fermenteringsvæske og -faststoffer, der udtages, før faststofferne, dvs. den høstede masse, fraskilles fra væsken. Høstet masse er de faststoffer, der bliver tilbage efter fraskilleisen.

Med henblik på bedømmelse .af høstet masse, disperge-20 res dennes faststoffer i forholdet 1:1 i destilleret vand.

Fermenteringsnæringsvæsken anvendes som den er og indeholder både væske og faststoffer.

Ved de pågældende bedømmelser holdes C. elegans i et C. briggsae vedligeholdelsesmedium. Dette medium, Maintenance 25 Medium, forhandles af Grant Island Biological Company, Grant Island, New York, og har følgende sammensætning: 30 35 11

DK 161332 B

0 (1) C. briggsae Maintenance Medium

Bestanddel_mg/liter_

Uorganiske salte

CaCl2.2H20 220,50 5 CuC12.2H20 6,50

Fe(NH4)2(S04)2*6H20 58,80 KH2P04 1225,50 KOH (a)

MnCl2.4H20 22,20 10 ZnCl2 10,20

Andre bestanddele N-Acetylglucosamin 15,00

Adenosin-3'-(2')-phosphorsyre.H20 365,00

Cytidin-3(21}-phosphorsyre 323,00 15 D-Glucose 1315,00

Glutathion, reduceret 204,00

Guanosin-3(2')-P04Na2.H20 363,00

Magnesiumcitrat.5H20 (dibasisk) 915,00

Kaliumcitrat.H20 485,00 20 DL-1,2-Dithiolan-3-pentansyre 3,75

Thymin 126,00

Uridin-3(2')-phosphorsyre 324,00

Aminosyrer L-Alanin 1395,00 25 L-Arginin 975,00 L-Asparaginsyre 1620,00 L-Cystein.HCl.H20 28,00 L-δlutamat (Na).H20 550,00 L-Glutamin 1463,00 30 Glycin 722,00 L-Histidin 283,00 L-Isoleucin 861,00 L-Leucin 1439,00 L-Lysin.HCl 1283,00 35 L-Msthionin 389,00 L-Phenylalanin 803,00 L-Prolin 653,00

O

DK 161332 B

12

Bestanddel_mg/liter L-Serin 788,00 L-Threonin 717,00 L-Tryptophan 184,00 5 L-Tyrosin 272,00 L-Valin 1020,00

Vitaminer p-Aminobenzoesyre 7,50

Biotin 3,75 10 Cholindihydrogencitrat 88,50 12

Cyanocobalamin (B ) 3,75

Folinat (Ca) 3,75

Myo-inositol 64,50

Niacin 7,50 15 Niacinamid 7,50

Pantethin 3,75

Panto thenat (Ca) 7,50

Pterolyglutaminsyre 7,50

Pyridoxalphosphat . 3,75 20 Py r idoxamin. 2HC1 3,75

Pyridoxin.HC1 7,50

Riboflavin-51 - (PO^ (Na) . 2^0 7,50

Thiamin.HC1 7,50 25 Referencer: (1)E.L. Hansen, Proc. Soc. Exp. Bio. & . Med. 121: 30-393 (1966).

Bemærkning: (a) Efter behov- for at justere til pH 5,9 + 0,1.

30 Til bedømmelserne anvendes en plade med en række små fordybninger. 25 ml fermenteringsnæringsvæske, en vand/ høstet masse-suspension i forholdet 1:1 eller en vandig/acetone-opløsning af LL-C23024-0C eller LL-23024-8 indeholdende fra 31,25 til 500 ppm prøveforbindelse afsættes aseptisk i hver 35 fordybning. Til hver fordybning tilsættes derefter 25 ml af C.elegans-vedligeholdelsesmedium indeholdende 10-20 voksne orme plus larver med varierende alder plus æg. Derefter anbringes

O

13

DK 161332 B

pladerne i stinkskab og undersøges 48 timer efter inokule-ring for at bedømme hurtighed og grad af prøvesammensætningernes nematodicide aktivitet. De opnåede resultater er anført nedenfor. Når der iagttages aktivitet for fermenterings-5 næringsvæsken, fortyndes denne yderligere for at få et forhold på 1:4 mellem næringsvæske og C.elegans.

Tabel VII Kone.

10 ppm el. Nematodicid ak-

Middel_fortynd.__tivitet v. 48 timer.

Fermenteringsnæ- F. = 1:1 8 (ingen mo- ringsvæske F. = 1:4 tilitet) Høstet masse 15 LL-23024-α 500 ppm 7 250 ppm 7 125 ppm 7 62,5 ppm 6 31,25 ppm 0 20 LL-23024-β 500 ppm 7 250 ppm 0

Den aktivitetsskala, der anvendes ved disse bedømmelser, er som følger: 25 Aktivitetsskala: 8 = ingen motilitet (tilsyneladende død) 7 = stærkt reduceret motilitet 6 = reduceret motilitet 0 = normal motilitet for arten 30

Bedømmelse af LL-C23024-a som nematodicid overfor smittefarlige larver af drøvtygger-nematoder

Bedømmelse af LL-C23024-a som nematodicid over for 35 smittefarlige larver af drøvtygger-nematoderne: Haemonhmus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus axei, T. colubriformis, og over for eddikeålormen Turbatrix aceti, be- ! x) forpuppede larver på 3. stadium.

O

DK 161332 B

14 stemmes ved .at der i stedet for C. elegans anvendes de ovennævnte nematodearter.

De opnåede resultater er anført i tabellen nedenfor.

5 Tabel VIII

Kone. in vitroa af _Aktivitet ved 48 timer over for_ LL-C23024-g H. contort. O.circum. T. axei T.colub._T. aceti 500 ppm 8 8^ 8^ 8 6 10 250 ppm 7 8^ 8^ 7 6 125 ppm 7 7 7 6 6 62,50 ppm 76 76 6 31,25 ppm 66 06 6 0 (kontrol) 0_0_0_0_0 a 15 Foretaget i vævsdyrkningsplader med 96 fordybnin ger ,LL-C23024-a fremstillet i dobbelt destilleret vand: 25 μΐ LL-C23024-a-opløsning og 25^ul nematodekultur tilsættes i hver fordybning.

h

Inden 24 timer.

20 Aktivitetsskala: som anført ved tabel VII, side 13.

Bedømmelse af antibiotikum LL-C23024-a's nematodicide aktivitet over for Nematospiroides dubius og Aspicularis tetraptera hos 25 mus

Ved de følgende prøver indficeres hvide Swiss-Web-ster hunmus med Nematospiroides dubius og Aspicularis tetraptera og holdes i tre uger, så at infektionerne kan modne.

Efter denne periode opdeles musene i tilfældige 30 grupper på fire, og grupperne anbringes i separate bure. Foder indeholdende fra ca. 31,25 til 4000 ppm prøveforbindelse tilbydes derefter musene ad libitum i en uge. Der sørges ligeledes for vand ad libitum i forsøgsperioden. Under behandlingsperioden undersøges museekskrementerne for at konstatere, 35 om der passerer orme. Alle behandlingsgrupper viser siq at lade orme passere, hvilket således viser nematodicid aktivitet ved alle forbindelseskoncentrationer over for begge nematode-

DK 161332 B

15 ° arter. Efter 1 uges behandling med præparat-tilsat foder obduceres musene, og indholdet i deres mavetarmkanal undersøges for orme. De opnåede resultater er anført nedenfor som procent reduktion af orme i sammenligning med inficerede kontroldyr, der ikke har fået præparat.

5

Ved disse forsøg bedømmes også rå fermenteringsdyrkningsvæsker opnået før høst af massen og indeholdende 1000-4000 ppm af det nematodicide antibiotikum. Også musefoder behandlet med fra 31,25 til 500 ppm LL-C23024-a opløst i en 1:1 blanding af acetone og vand bedømmes.

10

Aktivitet (% reduktion) ^ ^ _ , over for

Prøve- Kone. i foder _ præparat_ppm_N. dubius A. tetraptera x fermenterings- 4000 73 næringsvæske 2000 44 53 med LL-C23034a 1000 65 33 500 70 SA** 20

250 63 SA

125 61 SA

62,5 29 SA

_31,25_32_SA_ * = mængden af LL-C23024-a ikke bestemt 25 XX = let aktivitet: forøget antal børneorm ved undersøgelse af fæces XXX = sammenlignet med inficerede kontroldyr, der ikke får præparatet 30 De antibakterielle og anticoccidielle forbindelser dannes under dyrkning ved regulerede betingelser af Actinomadura yumaense NRRL 12515.

Denne mikroorganisme er isoleret fra en jordprøve indsamlet i Yuma Couty, Arizona, og opbevares i samlingen hos 35 Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company,

Pearl River, New York, med nr. LL-C23024. En levende kultur ί

DK 161332 B

16 af denne stamme er deponeret hos Culture Collection Laboratory, 0 Northern Regional Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604 og er indgået i dennes permanente samling med nr. NRRL 12515. Stammen er frit tilgængelig og kan erholdes fra denne samling.

Taksonomisk karakteristik af NRRL 12515 5

Stammen NRRL 12515 er blevet taksonomisk karakteriseret og identificeret som hørende til den stammetype af en ny art af slægten Actinomadura, der kendes som Actinomadura yumaense sp. nov.

Der er foretaget observationer af de dyrkningsmæs- 10 sige, fysiologiske og morphologiske træk hos stammen NRRL 12515 ved anvendelse af metoder, der er nøje beskrevet af E.B. Shirling og D. Gottlieb i "Method for characterization of Streptomyces species", Internat. J. Syst. Bac- teriol. 16: 313-340 (1966), og af R.E. Gordon m.fl. i "Nocar-15 dia coeliaca, Nocardia autoyrophica and the nocardin strain", Internat. J. Syst. Bacteriol. 24: 54-63 (19 74) . De medier, der anvendes til denne undersøgelse, er valgt blandt dem, der anbefales af T.G. Pridham m.fl. i "A selection of media for maintenance and taxonomic study of Streptomycetes," Antibiotics Ann., side 947-953 (1956/1957), af G.P. Gauze m.fl. i "Problems in the classification of antagonistic actinomycetes",

State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Moskva (1957), og af R.E. Gordon m.fl. ovenfor, med henblik på taksono-^ misk undersøgelse af Actinomycetes- og jordbakterier. Den kemiske sammensætning af mikroorganismens cellevægge bestemmes ved hjælp af den af H.A. Lechevalier m.fl. beskrevne metode, "Chemical composition as a criterion in the classification of actinomycetes", Adv. Appl. Microbiol. 14: 47-72 (1971).Phospho-lipidmønstre bestemmes ved hjælp af M.P. Lechevalier m.fl.'s metode, "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biocehm. Syst. Ecol. 5: 249-260 (1977). Enkeltheder er anført i tabellerne IV-IX, og en almen beskrivelse af kulturen er anført nedenfor. De understregede beskrivende farver er taget fra K.L- Kelly og D.B. Judd's "Color. Univer-o5 sal Language and Dictionary of Names", U.S. Nat. Bur. Stand., Spec. Publ. 440, Washington, D.C (1976), og de ledsagende

O

DK 161332 B

17

Inter-Society Color Council, Natl. Bur. Stand. Centroid Color Charts .

De data, der iagttages ved denne nye art repræsenteret af stammen NRRL 12515 sammenlignes med offentliggjorte 5 data for kendte arter af stammen Actinomadura [M. Goodfellow m.fl., "Numerical Taxonomy of Actinomadura and related acti-nomycetes", J. Gen. Microbiol. 122: 95-111 (1979), L.H. Huang, "Actinomadura macra sp. nov., the producer of antibiotic CP-47,433 and CP-47,434", Internat. J. Syst. Bacteriol. 30: 10 565-568 (1980), J. Meyer, "New species of the genus Actinoma dura", Z. Allgem. Mikrobiol. 19: 37-44 (1979), H. Nomura og Y. Ohara, "Distribution of actinomycetes in soil. XI, "Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier m.fl. i J. Ferment. Technol. 49: 904-912 (1971), og T.P. Preobrazhen-15 skaya m.fl., "Key for identification of the species of the genus Actinomadura", The biology of Actinomycetes and Related Organisms 12: 30-38 (1977)]. Kulturen NRRL 12515 har en svag lighed med Actinomadura pelletieri, men ligner ikke nogen anden beskrevet art og varierer fra A. pelletieri med hensyn til 20 en række kendetegn. Derfor er stammen NRRL 12515 blevet betegnet som den stammetype af en ny art, der har fået betegnelsen Actinomadura yumaense, sp. nov., opkaldt efter stedet for indsamlingen af den jordprøve, hvorfra stammetypen er isoleret. Mikromorfologi 25 Sporer dannes i korte spiralkæder (maksimal længde ca. 20 sporer pr. kæde) på forgrenede næsten kransstillede luft-sporophore. Sporerne ægformede, 0,6-0,8^u x l,0-l,4^,u, med en glat overflade.

Sammensætning af cellevæg 30 Hele cellehydrolysater af denne kultur indeholder madurose (3-0-methyl-g-galactose) og meso-isomeren af diamino-pimelinsyre (DAP). Kulturen har også et phospholipid-mønster type P-l og intet andet diagnosticerbart phospholipid end en smule phosphatidyl-glycerol. Disse kendetegn er alle meget typiske 35 for medlemmer af slægten Actinomadura.

Vækstmængde

God vækst iagttages på Bennett's agar, Gauze nr. 2

O

DK 161332 B

18 agar, NZ-amin-stivelse- glucose-agar (ATCC-Medium 172), tomat-puré-havremelsagar og gærekstrakt-maltekstrakt-agar; moderat væskt iagttages på Benedict's agar, Czapek's saccharose-agar, glycerol-asparagin-agar, Hickey-Tresner-agar og havremelsagai; 5 ringe vækst iagttages på calciummalat-agar, Gauze nr. 1 agar og uorganiske salte-stivelsesagar.

Vegetativt mycelium På medier, hvor der forekommer god vækst, iagttages, at det vegetative mycelium produceres og sammenrulles og i reg-10 len af farve med gulliggrå nuancer.

Farven på luftmycelium og sporer

Luftmycelie- og/eller sporemasser er hvide til 264: lysegrå af farve. Luftmycelreproduktionen er ringe på de fleste medier.

15 Opløselige pigmenter

Mangler på mange medier; gult pigment på Benedict's agar og glycerol-asparagin-agar; gulgrønt pigment på calciummalat-agar; grønligbrunt pigment på NZ-amin-stivelse-giucose-agar; orangefarvet pigment på Bennett's agar og gærekstrakt-malteks-20 trakt-agar.

Fysiologiske reaktioner

Ingen meianinpigmenter på pepton-jern-agar og tyro-sin-agar (ISO-7); stærk peptonisering af lakmusmælk; stærk proteolyse af næringsgelatine, moderat reduktion af nitrat, in-25 gen hydrolyse af adenin eller guanin, stærk hydrolyse af hypo-xanthin, tyrosin og xanthin, svag hydrolyse af stivelse, hydrolyse af esculin, variabel hydrolyse af urinstof. Ingen vækst ved 4, 10 eller 55°C, moderat vækst ved 25 og 45°C, god vækst ved 32 og 37°C. Kulhydratudnyttelse ifølge T.G. Pridham og 30 D. Gottlieb's, "The utilization of carbon compounds by some actinomycetales as an aid for species determination", J. Bac-teriol. 56: 107-114 (1948): god udnyttelse af glucose, glycerol og trehalose, moderat udnyttelse af maltose og saccharose; dårlig udnyttelse af fructose, galactose, inositol, mannose og 35 melezitose; ingen udnyttelse af adonitol, arabinose, dulcitol, lactose, mannitol, meiibiose, raffinose, rhamnose, salicin, sorbitol og xylose. Syreproduktion ud fra carbonhydrater ved Gor-

O

DK 161332 B

19 don m.fl.'s metode, ovenfor: god syreproduktion ud fra glucose, glycerol, maltose, saccharose og trehalose; ringe syreproduktion ud fra galactose, inositol og mannose. Udnyttelse af organiske syrer ved hjælp af den af Gordon m.fl.

5 beskrevne metode, ovenfor: udnyttelse af acetat, malat, pro- pionat, pyruvat, succinat og tartrat; ingen udnyttelse af ben-zoat, citrat, lactat, mucat og oxalat.

Tabel IX

10 Dyrkningsdata for Actinomadura yumanese NRRL 12515

Inkubation: 14 dage__Temp.: 28°C

Vækst- Opløs. Bagside

Medium_mængde Luftmycelium og/eller sporer pigment farve

Benedict's Moderat Flade pulveragt. kolonier; Gullig 89.

15 agar - ringe luftmycelium hvidt til 264, bleggul lysegrå

Bennett's God Ingen luftmycelier; sammenrullet Orange 81. mørk agar vegetativ vækst, 93. gullig til grålig-gul 80. grålig-gullig-brun lig-brun 20--

Calcium-ma- Ringe Flad vækst; sparsomme hvide luft- Gullig- 90. grøn- lat-agar mycelier grøn lig-gul

Czapek's Ringe Flad vækst; moderate luftmyceli- Intet 89. bleg- saccharo- til mo- er, vegetativ vækst, 90. grålig gul 25 seagar derat gul

Gauze nr. Ringe Farveløs flad va&st; sparsomme Intet Farveløs 1 agar hvide luftmycelier

Gauze nr. God Hævede sammenrullede kolonier; ve- Intet 72. mørk 30 2 agar getative mycelier 93. gulliggrå; orangegul moderate luftmycelier, 92. gullighvide

Glycerol-a- Ringe Flade, puLveragtige kolonier; hvi- Gult 89. bleg- sparagin- til mo- de luftmycelier gul 35 agar derat

O

DK 161332 B

20

Tabel IX (forts.) Vækst- Opløs. Bagside-

Medium_mængde Luftmycelium og/eller sporer pigment farve

Hickey- Moderat Flade voksagtige kolonier, 90. Intet 90. grå- 5 Tresner grålig gule sparsomme luftaryce- lig gul agar lier, hvide til 264 lysegrå

Uorg. sal- Ringe Flade, farveløse, pulveragtige Intet Farve- te-stivel- kolonier, hvide luftmycelier løs se-agar________ 10 NZ-amin-sti- God Svær sammenrullet vækst, 61. grå- Grøn- 78. mørk velse-glu- lig gullig brun til 65. brunlig lig gullig kose-agar sort, moderate luftmycelier, hvi- brun brun de til 264. lysegrå

Havremel- Mode- Flad voksagtig vækst, 90. grålig Intet 90. grålig 15 agar rat gul, spor af hvide luftmycelier gul

Ifcmatpuré- God Flad voksagtig vakst, 91. mørk Intet havremel- grålig gul, spor af hvide luftagar_mycelier_ 20 Gæreks- God Hævede, voksagtige sammenrullede Orange 78. mørk trakt- kolonier, 93. gulliggrå til 80. gullig malteks- grålig gullig brun, intet luft- brun traktagar mycelium

25 Tabel X

Actinomadura yumanese NRRL 12515's mikromorfologi

Luftmycelium og/eller Spore- Spore-

Medium_sporebærende strukturer form Sporestørrelse overf1.

Czapek's Luftsporophore, forgre- Ægfor- 0,6 - 0,8^u Glat 30 saccha- ne, næsten kransstille- met x roseagar de, bærer forh. korte 1,0 - l,4^u spiralkæder af modne _sporer__ 35

O

21 DK 161332 B

Tabel XI

Actinomadura yumaense NRRL 12515's fysiologiske reaktioner

Medium_Inkubationst. Vækstmængde Fysiologisk reaktion

Pepton-jern- 7 dage god Let brunfarvning 5 agar_14 dage_god_Let brunfarvning

Tyrosinagar 7 dage moderat Intet farvestof _14 dage_god_Gulligt pigment_

Lakmusmælk 14 dage god God peptonisering _28 dage_god_Kraftig peptonisering 10 Næringsgela- 14 dage god Let proteolyse tine_28 dage_god_Total proteolyse_

Nitrat-nærings- 14 dage god Meget svag reduktion væske_28 dage_god_Moderat reduktion

Adeninagar 14 dage god Ingen hydrolyse 15__21 dage_god_Ingen hydrolyse_

Guaninagar 14 dage god Ingen hydrolyse __21 dage_god_Ingen hydrolyse_

Hypoxanthin- 14 dage god Total hydrolyse agar_21 dage_god_Total hydrolyse_ 20 Tyrosinagar 14 dage god Kraftig hydrolyse _21 dage_god_Kraftig hydrolyse_

Xanthinagar 14 dage god Moderat hydrolyse _21 dage_god_Kraftig hydrolyse_ NZ-amin m. opl. 5 dage ringe eller ingen vækst ved 4, 25 stivelse- og 10 og 55°C, moderat vækst v. 25, glucoseagar 28 og 45°C, god vækst ved 32 og (ATCC Med. 172)_ 27°C.__

Urinstofnær,v. 28 dage_god_Dekomponering, variabel

Esculin-nær.- 14 dage god Hydrolyse 30 væske_28 dage_god_Hydrolyse_

Stivelsesagar 5 dage god Ingen hydrolyse _10 dage_god_Ingen hydrolyse_ 35

O

DK 161332 B

22

Tabel XII

Actinomadura yumaense NRRL 12515's carbonkildeudnyttelse på ISP-9-kulhydratudnyttels esmedium Inkubation; 28 dage Temperatur; 28°C

5 Carbonkilde Udnyttelse

Adonitol 1-Arabinose -

Dulcitol

Fructose ringe 10 d-Galactose ringe d-Glucose god

Glycerol god i-Inositol ringe

Lactose 15 Maltose ret god d-Mannitol - d-Mannose ringe d-Melezitose ringe d-Melibiose 20 d-Raffinose 1-Rhamnose Saiicin Sorbitol

Saccharose ret god 25 d-Trehalose god d-Xylose Negativ kontrol 30 35

O

DK 161332 B

23

Tabel XIII

Syreproduktion ved hjælp af actinomadura yumaense NRRL 12515 ud fra forskellige carbonhydrater på Gordon's uorganiske ni-trogen-grundmedium

5 Inkubation: 28 dage_Temperatur: 28°C

Syreproduktion_ _Carbonkilde_7 dage_2S dage

Adonitol 1-Arabinose - - 10 Duicitol

Fructose d-Galactose - + d-Glucose +++ +++

Glycerol ++ +++ 15 i-Inositol - +

Lactose

Maltose - +++ d-Mannitol d-Mannose - + 20 d-Melezitose d-Melibiose d-Raffinose l-Khamnose Salicin 25 Sorbitol

Saccharose - +++ d-Trehalose - +++ d-Xylose Negativ kontrol 30 *: +++ = stærkt positiv reaktion ++ = Moderat positiv reaktion + = Let positiv reaktion - = Negativ reaktion 35 24 DK 16 1332 Β

0 Tabel XIV

Udnyttelse af organiske syrer ved hjælp af Actinomadura yuma-ense NRRL 12515 på Gordon's modifikation af Koser's grundagar (Koser's citratagar)

Inkubation: 28 dage_Temperatur: 28°C

5 _Carbonkilde_Udnyttelse*_

Acetat +

Benzoat

Citrat

Lactat 10 Malat +

Slimsyre -

Oxalat

Propionat +

Pyruvat + 15 Succinat +

Tartrat + i: + = positiv reaktion - = negativ reaktion · 20

Dyrkning af Actinomadura yumaense kan foregå i en lang række forskellige faste eller flydende dyrkningsmedier. Medier, der er anvendelige til fremstilling af antibiotika 25 LL-C23024-a, -β og -iota omfatter en assimilerbar nitrogenkilde såsom protein, proteinhydrolysat, polypeptider, aminosyrer, maj s støbevæske, etc., og uorganiske anioner og kationer, såsom kalium, natrium, ammonium, calcium, sulfat, carbonat, phos-phat, chlorid etc. S por grunds tof fer, såsom bor, molybden , kob-30 ber etc., leveres af urenheder fra andre bestanddele i medierne. Luftning i tanke og kolber sker ved at tvinge steril luft igennem eller mod gæringsmediets overflade. Omrøring i tankene sker medet mekanisk skovlhjul. Et antiskumningsmiddel, såsom spækolie eller siliconeafskumningsmiddel, kan tilsættes efter 35 behov.

O

DK 161332 B

25

Actinoxnadura yumaense dyrkes og opbevares på skråt-stillet agar, f.eks. Bennett's agar, gærmaltagar eller ATTC-medium nr. 172. ATCC-medium nr. 1/2 er foretrukket. Den skråtstillede agar inokuleres med en kultur af Actinomadura yuma-ense og inkuberes ved 28-37°c, fortrinsvis ved ca. 32°C, i ca.

7 dage. Disse stamkulturer kan opretholdes ved serievis overføring til frisk skråtstiliet agar, eller der kan anvendes en prop af agaren, der indeholder mycelier fra en veidyrket skråtstiliet agar til inokulering af flydende medier.

Rystekolbeinokulationer af Actinomadura yumaense fremstilles ved at inkuiere 10U ml sterilt flydende medium i 500 ml kolber med afskrab eller vaskevæsker af sporer fra en skråtstiliet agar med kulturen. Eksempler på egnede podemedier er:

15 Medium A

Kødekstrakt 0,3% "Bacto"-trypton1 0,5%

Glucose 1,0% Gæreks trakt 0,5%

Vand indtil 100%

En pepton fra Difco Laboratories, Detroit, Michigan) .

pH indtilies til 6,8-7,2 med fortyndet base, f.eks. natriumhydroxid.

Medium B

Glucose 1 %

Stivelse 2 % Gærekstrakt 0,5% "N-Z Amine A"2 0,5% 30

Calciumcarbonat 0,1%

Vand indtil 100% 2 ( Caseinfordøjelsesprodukt fra Sheffield Chemical Co., D iy. Nat'l. Dairy Products Corp., Norwich, N.Y.).

Medium B er foretrukket.

35

DK 161332 B

26 O Kolberne inkuberes ved en temperatur på 25-35°C, fortrinsvis ved 32°C og omrøres kraftigt på en roterende omryster i 1-4 dage. Dette podestof anvendes derefter til in-okulering af fermenteringskultur, eller kulturen kan fryses og opbevares som podestof til senere podekulturer.

5 Nedenstående medier er eksempler på sådanne, der kan anvendes til fermentering af Actinomadura yuma.ense til fremstilling af antibiotika LL-C23024-ot, -3 og -iota.

Medium C

Glucose 1,5% 10 Glycerol 1,5% 3

Sojamel 1,5%

Calciumcarbonat 0,1%

Natriumchlorid 0,3%

Vand indtil 1U0% o 15 ( Kan erstattes med bomuldsfrømel eller opløselige kødstoffer med lignende virkning)

Medium D

Glucose 3 %

Sojamel 1,5% 20 Calciumcarbonat 0,1%

Natriumchlorid 0,3%

Vand indtil 100%

Medium E

Stivelse 1 % 25

Melasse 2 %

Sojamel 1,5%

Calciumcarbonat 0,1%

Vand indtil 100% 30

Medium F

Glucose 3 %

Opløselige kødstoffer 2,5%

Natriumchlorid o, 2% 35

Calciumcarbonat 0,1%

Vand indtil 100%

DK 161332 B

27

^ Medium G

Glucose 3 %

Sojamel 0,5%

Ammoniumsuifat 0,3%

Natriumchiorid 0,2% 5

Calciumcarbonat 0,1%

Vand indtil 100%

Medium H

Glucose 3 % 10

Ammoniumsuliat 0,3%

Dibasisk kalium-phosphat 0,1%

Calciumcarbonat 0,2%

Natriumciilorid U,l%

Vand indtil 100%

Medium D er det foretrukne.

Fermenteringen udføres i 100 ml medium i en 500 ml kolbe inokuleret med 3-10% (vol/vol) af en podekultur fremstil- 20 o let som beskrevet ovenfor og inkuberet ved 25-35 C, fortrinsvis ved ca. 32°C, i 24-72 timer under luftning. Prøver af gæringskulturen kan fryses og opbevares til senere brug som podestof til podekulturer.

Alternativt kan fermenteringen udføres i større fer-25 menteringstanke udstyret med luftning- og omrøringsorganer.

Hver tank inokuleres med 3-10% (vol/vol) podestof fremstillet som beskrevet ovenfor. Lufttilførsel sker med en hastighed på 0,5-2,0 liter steril luft pr. liter næringsvæske pr. minut, og gæringsmediet omrøres med et skovhjul, der drives med 200-30 400 omdr./min. Temperaturen holdes på 25-35°C, fortrinsvis på 32°C. Fermenteringen fortsættes, indtil antibiotikummet akkumulerer i fermenteringsmediet, i reglen efter 100-150 timer, på hvilke tidspunkt antibiotikummet høstes.

Antibiotikummet kan høstes og renses som beskrevet 35 23

DK 161332 B

0 i USA patentskrift nr. 4.278.663 ovenfor eller ved hjælp af nedenstående metode:

Den rå fermenteringsvæske, der indeholder de hele celler fremstillet som beskrevet ovenfor, blandes med et lige så stort volumen af et hvilket som helst organisk, med vand 5 ikke blandbart opløsningsmiddel, der ikke er et carbonhydrid. Methylenchlorid eller ethylacetat foretrækkes. Den organiske fase fraskilles og inddampes i vakuum til en olieagtig sirup.

Den olieagtige sirup opløses i methylenchlorid og tilsættes til en kolonne af silicagel, aluminiumoxid, "Sephadex® 10 LH-20" (Pharmacia Fine Chemicals Div. of Pharmacia, Inc.,

Piscataway, N.J.) eller magnesiumaluminiumsilicat. Eksempler på egnede opløsningsmidler til eluering af kolonnen er diethyl-ether, ethylacetat, en 1:1-1:7 (vol/vol) blanding af methylenchlorid/ ethy lether , 10-40% acetone i methylenchlorid, 2-10% 15 lavere alkohol (methanol er det foretrukne) i methylenchlorid, 2-15% acetonitril i methylenchilorid eller 2-15% dioxan i methylenchlorid. Methylenchlorid/ethylacetat 1:1 (vol/vol) fore-, trækkes. Fraktioner opsamles og kontrolleres for tilstedeværelse af antibakteriel aktivitet ved hjælp af bioanalyse mod 20 en påvirkelig organisme, f.eks. Bacillus subtilis. Aktive fraktioner forenes og inddampes i vakuum til en remanens. Denne remanens opløses i et organisk opløsningsmiddel, f.eks. t--butanol (foretrukket), benzen eller p-dioxan, og frysetørres.

Det frysetørrede faststof opløses i et passende or-25 ganisk opløsningsmiddel, f.eks. methylenchlorid, hexan, methyl- enchlorid/ethylacetat, diethylether, hexan/ethylacetat, hexan/ chloroform eller hexan/ether. Diethylether er det foretrukne.

Denne opløsning rystes med vand, og pH indstilles på 1,5-4,0, fortrinsvis ca. 2,5 med en hvilken som helst fortyndet mine-30 ralsyre. Den organiske fase fraskilies, vaskes med vand for at fjerne overskydende syre, tørres over et passende tørremiddel, filtreres og inddampes til en remanens i vakuum.

Denne remanens opløses i et passende opløsningsmiddel, og opløsningen får lov at fordampe langsomt, fortrinsvis 35

O

DK 161332 B

29 ved ca. 4°C. Eksempler på egnede opløsningsmidler er methyl-enchlorid, hexan, methylenchlorid/ethyiacetat, diethylether, hexan/ethylacetat, hexan/chloroform eller hexan/ether. Hex- an/ether 5:2 (voi/vol) foretrækkes. De fremkomne krystaller 5 o opsamles og vaskes, fortrinsvis ved ca. 40 C, med et hvilket som helst carbonhydrid med et moderat kogepunkt såsom f.eks.

hexan eller heptan og lufttørres, hvilket som udbytte giver slutproduktet antibiotikum LL-C23024 i form af fri syre.

Hvis produktet ønskes i form af et salt, kan den 10 frie syre omdannes ved behandling med en passende kation, fortrinsvis i form af en fortyndet mineralbase, ved metoder, der er velkendt af fagfolk.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere belyst ved hjælp af eksempler. Medierne a, B, C etc. er de ovenfor 15 definerede. Medmindre andet er anført, sker alle procedurer ved stuetemperatur (ca. 22°c) og et tryk på 1 atm.

Eksempel 1

Vaskede sporer fra en skråtstiliet Actinomadura yu- 20 maense NRRL 12515-agar anvendes til inokulering af en 500 ml kolbe, der indeholder 100 ml sterilt medium B. Kolben inkuberes på en rotationsryster ved 28°C i 2 dage.

Et 5%'s podestof af denne kultur overføres derefter til 100 ml sterilt medium C i en 500 ml-kolbe og inkuberes i 25 5 dage på en rotationsryster.

Tilstedeværelse af antibiotisk aktivitet overvåges dagligt med bioanalyse mod Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Bacillus subtilis og Streptococcus faecalis, og anthelmintisk aktivitet overvåges ved bioanalyse mod den frit levende nema-

UV

tode Caenorhabditis elegans.

35

O

DK 161332 B

30

Eksempel 2 7 500 ml-koiber forberedes, idet hver indeholder 100 ml af et af følgende sterile medier:

Kolbe 1: 10U ml medium C

5

Kolbe 2: luO ml medium C med 1,5% bomuldsfrømel i stedet for sojamelet

Kolbe 3: 100 ml medium C med 1,5% opløselige kødstoffer i stedet for sojamelet Kolbe 4: 100 ml medium D 10 Kolbe 5: 100 ml medium E

Kolbe 6: 100 ml medium F Kolbe 7: 100 ml medium G

Disse kolber inokuleres med et 5%’s podestof af Ac- tinomadura yumaense NRRL 12515 dyrket i medium B. Kolberne

15 O

inkuberes derefter på en rotationsryster ved 28 C i 4-6 dage.

Hver af de ovennævnte kulturer viser sig at være aktive, når de afprøves for antibiotisk aktivitet som i eksempel 1, og når de afprøves for anticoccidiel aktivitet mod Eimeria tenella i vævskulturer af kyllingenyre.

20

Eksempel 3

Frosne gæringskulturceller af Actinomadura yumaense NRRL 12515 anvendes til inokulering af en 500 ml kolbe, der

indeholder 100 mi sterilt medium B. Kolben inkuberes derefter 25 O

ved 32 C i 4 dage på en rotationsryster.

Et 5%'s podestof af denne kultur overføres derefter til 100 mi sterilt medium H i en 500 ml kolbe og inkuberes ved 28°C i 5 dage på en rotationsryster.

Antibakteriel aktivitet bekræftes som i eksempel 1 30 og anticoccidiel aktivitet som i eksempel 2.

Tilstedeværelsen af antibiotisk aktivitet afprøves også ved tyndtlagschromatografi på silicagelplader, der elue-res i ethylacetat/chloroform i forholde 70:30 (vol/vol).

35

O

DK 161332 B

31

Eksempel 4 100 ml sterilt medium A i en 500 ml kolbe inoku-leres med vaskede sporer fra en skråtstillet Actinomadura yumaense NRRL 12515-agar. Kolben inkuberes ved 32°C i 2 da-5 ge på rotationsryster.

Et 5%'s podestof af denne kultur overføres derefter til 100 ml sterilt medium H i en 500 ml kolbe og inkuberes på rotationsryster ved 32°C i 2 dage.

Et 5%"s podestof af denne kultur overføres derefter 10 til en 500 ml kolbe, der indeholder 100 ml frisk sterilt medium H, og inkuberes ved 28°C i 6 dage på rotationsryster.

Antibakteriel aktivitet bekræftes som i eksempel 1.

Eksempel 5 15 To 500 ml kolber, der hver indeholder 100 ml sterilt medium A, inokuleres med en frosset podekultur af Actinomadura yumaense NRRL 12515 og inkuberes ved 32°C i 2 dage på rotationsryster.

Indholdet af de to kolber forenes derefter og til-20 sættes til 12 liter frisk sterilt medium A i en 20 liters flaske , Denne kultur inkuberes derefter i 2 dage ved 28°C under luftning.

Indholdet af denne flaske overføres derefter til en 300 liters podetank, der indeholder 288 liter sterilt medium 25 A, og denne kultur luftes og omrøres i 25 timer ved 32°C.

Efter de 25 timers inkubation overføres de 300 liter podekultur til en 1500 liters gæringstank, der indeholder 1200 liter sterilt medium C. Denne kultur inkuberes under luftning og omrøring i 115 timer ved 28°C.

30 Gæringsvæsken afprøves for antibiotisk aktivitet ved hjælp af tyndtlagschromatografi på silicagelplader, der elueres med ethylacetat/chloroform i forhold 70:30 (vol/vol). Alternativt underkastes flere fremkaldte plader bioanalyse mod Bacillus subtilis, der viser tilstedeværelse af antibiotisk 35 aktivitet.

O

DK 161332 B

32

Eksempel 6

Et typisk medium, der anvendes tii dyrkning af primært podestof, fremstilles med følgende sammensætning: Kødekstrakt 0,3% 5 "BactoH-trypton 0,5%

Glucose 1,0% Gærekstrakt 0,5% ,,Bacto"-agar 0,15%

Vand indtil 100% 10 Vaskede eller skrabede sporer og mycelier fra en skråtstillet Actinomadura yumaense NR3RL 12515-agar anvendes til inokulering af en 500 ml kolbe, der indeholder 100 ml af ovenstående steriliserede medium. Kolben anbringes på en rotationsryster og bevæges kraftigt i 48 timer ved 32°C. Det 15 fremkomne kolbepodestof (100 ml) anvendes til inokulering af en liter af samme sterile medium i en 2 liters flaske. Dette podestof luftes med steril luft, medens dyrkningen fortsættes i 48 timer ved 2b°C. Denne 1-liters kultur anvendes derefter til inokulering af en 30-liters gæringstank, der indeholder 20 samme sterile medium, og denne tank luftes med steril luft og inkuberes ved 28°C i 42 timer.

Eksempel 7

Der fremstilles et gæringsmedium med følgende sam-25 mensætning:

Dextrose 1,5%

Glycerol 1,5%

Sojamel 1,5%

Calciumcarbonat 0,1% 30 Natriumchlorid 0,3%

Vand indtil 100% pH indstilles på 7,0 med 6N natriumhydroxid, og mediet steriliseres. Der fremstilles en portion på 30 liter 35 podestof som beskrevet i eksempel 1, og dette anvendes til inokulering af 250 liter af ovennævnte medium i en 300 liters gæringstank. Steril luftning tilføres til massen, der omrø-

O

DK 161332 B

33 res med et skovlhjul, der drives med 220 omdr./min. Fermenteringen sker ved 32°C i 97 timer, hvorefter massen høstes.

Eksempel 8 5 Der fremstilles et fermenteringsmedium med følgen de sammensætning:

Dextrose 3,0%

Sojamel 1,5%

Calciumcarbonat 0,1% 10 Natriumchlorid 0,3%

Vand indtil 100% pH indtilles på 7,0 med 6N natriumhydroxid, og mediet steriliseres. En portion på 300 liter podestof fremstillet som beskrevet i eksempel 1 anvendes til inokulering 15 af 3000 liter af ovennævnte medium i en gæringstank. Der tilføres steril luftning til massen, der omrøres med et skovlhjul, der drives med 100 omdr./min. Fermenteringen udføres ved 32°C i 115 timer, hvorefter massen høstes.

20 Eksempel 9 1. Fermenteringsmassen fra eksempel 8 (100 liter) indstilles på pH 4,0 ved hjælp af 6N HC1. Den sure masse omrøres derefter i 1-2 timer med samme volumen methylenchlorid. Blandingen af masse og methylenchlorid filtreres derefter, idet 25 der anvendes diatoméjord som filterhjælp. Methylenchloridekstrak-ten aftrækkes og inddampes i vakuum til ca. 2 liter delvis rensede antibiotika.

2. Chromatografi af de delvis rensede antibiotika på silicagel.

30 En glaskolonne med en diameter på 7 cm pakkes til en højde på 91 cm med "Woelm silica Gel TSC". Det rå koncentrat (jfr. i ovenfor) med et volumen på ca. 2 liter får lov til at sive ind i silicagelkolonnen. Derefter fremkaldes kolonnen først med 3 liter methylenchlorid, derefter methylen-35 chlorid/ethylacetat (1:1 efter volumen), hvilket giver i alt 126 fraktioner, hver med et volumen på 80 ml. Der fremkaldes derefter yderligere med ethylacetat/ethanol (7:3), hvil-

O

DK 161332 B

34 ket giver yderligere 87 fraktioner.

Fraktionerne 58-87, der er rige på LL-C23024-a, forenes og inddampes i vakuum til en remanens, der vejer 90,4 g. Denne remanens opløses i en blanding af 600 ml diethylether og 5 600 ml hexan. Den fremkomne suspension filtreres, hvilket giver et klart filtrat. Det klare filtrat inddampes i vakuum, indtil der begynder at dannes krystaller. Suspensionen får lov at modne natten over. Det krystallinske LL-C23024-a opsamles på en tragt, vaskes med kold ether og lufttørres, hvil-10 ket giver 33,1 g krystallinsk LL-C23024-a. Der fås yderligere 12,4 g LL-C23024-a efter yderligere reduktion af voluminet af den forenede vaskevæske og filtratet.

Fraktionerne 177-203 fra eluering med ethylacetat/e-thanol og beriget med LL-C23024-6 forenes og inddampes i vakuum, 15 hvilket giver 6,7 g delvis renset LL-C23024-8, der behandles som ovenfor.

Fraktionerne 204-213 fra eluering med ethylacetat/e-thanol og beriget med LL-C23024 iota forenes og inddampes i vakuum til en pasta og ekstraheres gentagne gange med methanol.

20 Methanolekstrakten ekstraheres med methylenchlorid, der fyldes på en kolonne, der indeholder "Woelm,,-silicagel. Kolonnen vaskes med methylenchlorid og elueres derefter med methylenchlorid/e-thylacetat (2:3). Fraktionerne overvåges af tyndtlagschroma-tografi, og de aktive fraktioner slås sammen, behandles med 25 trækul, inddampes og ekstraheres gentagne gange med heptan.

Den endelige heptanekstrakt afkøles ved 0°C i 48 timer, og krystallerne fjernes ved filtrering fra modervæsken.

Denne modervæske opløses i methylenchlorid og får lov at sive ind i en glaskolonne pakket med "Woelm"-silicagel.

30 Derefter elueres kolonnen først med 2 liter methylenchlorid, dernæ 8 liter methylenchlorid/ethylacetat (1:1) og endelig med 4 liter ethylacetat/methanol (9:1). Eluatet opsamles i fraktioner og overvåges med henblik på deres antibiotiske sammensætning. De aktive fraktioner kombineres og inddampes i vakuum, 35 hvilket giver en remanens, der indeholder LL-C23024 iota.

O

DK 161332 B

35

Eksempel 10 3. Yderligere rensning af LL-C23024-6 fra chromatografi på silicagel.

"Sephadex ®LH20" får lov at kvælde i en blanding af 5 hexan, methylenchlorid og methanol i forholdet 10:5:1. En glaskolonne med en diameter på 5 cm pakkes i en højde af 86 cm med gelen. Chargen, 3 g renset LL-C23024-8, opløses i en blanding af 10 ml methylenchlorid, 1 ml methanol og 10 ml hexan og får lov at sive ind i gelkolonnen. Kolonnen fremkaldes derefter med opløs-10 ningsmiddel med samme sammensætning som det, der anvendes, når antibiotikummet tilføres kolonnen. Fraktionerne opsamles ved hjæl] af en opsamler. Fraktionerne har hver et volumen på 17 ml. Fraktionerne 17 til 26 indeholder LL-C23024-6 som bestemt ved TLC. Diss< fraktioner forenes og inddampes i vakuum, hvilket giver ren amorf 15 LL-C23024, der vejer 1269 mg.

Eksempel 11

Krystallisation af LL-C23024g som natriumsalt 20 Renset LL-C23024-8 (2,4 g) fremstillet som beskrevet i eksempel 10 opløses i en blanding af 500 ml diethylether, 160 ml hexan og 25 ml methylenchlorid. Den fremkomne opløsning overføres til en skilletragt, der indeholder 300 ml destilleret vand. Der tildryppes fortyndet IN saltsyre, indtil 25 pH når en værdi på 2,0-2,5 efter rystning og bundfældning.

Den sure vandige fase kasseres, og det med syre behandlede organiske lag vaskes tre gange efter hinanden med 400 mi-portioner vand. Det vaskede organiske lag omrøres med en teske "Dar-co G-60"-pulver i 15 minutter og filtreres gennem "Celite® "· 30 Det affarvede organiske lag anbringes over 500 ml destilleret vand og der tildryppes 5N NaOH, indtil pH når 11,0-11,5 efter omrystning og bundfældning. Den alkaliske vandfase kasseres, og det tilbageblevne organiske lag vaskes to gange med 400 ml--portioner vand. Det vaskede organiske lag tørres over natri-35 umsulfat og inddampes derefter i vakuum til et volumen på 150 ml. Dette koncentrat henstår i stinkskab i flere timer. Det krystallinske Na-salt af LL-C23024-6 opsamles på en tragt, vaskes

O

DK 161332 B

36 med koldt hexan og lufttørres, hvilket giver 402 mg krystallinsk Na-salt af LL-C23024-3. Denne prøve anvendes til mikroanalyser og udvalgte spektraldata.

Analyse: Beregnet for c^gH^O-^Na: 5 C 59,70, H 8,33, O 29,46, aske 2,49.

Fundet: C 61,55, H 8,79, N O aske 3,31

Smp. (Fisher-Johns apparat) = 174°C.

(Feltdesorptions- massespektiometri)= 924, [a]^ = +3,2° (i methanol).

10 Eksempel 12

Rensning af LL-C23024-iota

Et Waters prep. 500A højtydende væskechromatografi-instrument udstyres med en silicagelpatron under et tryk på ca. 39 kg/cm . Chargen, der er 5,0 g af det rå materiale fra ek-15 sempel 9, opløses i 50 ml heptan/ethylacetat (45:55) og injiceres på kolonnen af silicagel. Kolonnen fremkaldes derefter med den samme opløsningsmiddelblanding med en strømningshastighed på 200 ml/min, idet der opsamles 40 200 ml-fraktioner. Fraktionerne 21-32 kombineres, inddampes til en remanens, tri -20 tureres med hexan og inddampes, hvilket giver ren LL-C23024-iota. Ovennævnte procedure gentages 4 gange, hvilket giver en forenet totalmængde på 280 mg amorf LL-C23024-iota.

En portion på 90 mg amorf LL-C23024-iota opløses i 10 ml diethylether, blandes med 10 ml vand og indstilles på 25 pH 2,5 med 0,1N saltsyre. Etherlaget vaskes med vand, indstilles på pH ca. 11 med 0,1N natriumhydroxid, fraskilles og vaskes igen med vand. Etherfasen tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes til en remanens. En opløsning af denne remanens i ether/hexan får lov langsomt at inddampe, hvil-30 let giver et amorft hvidt faststof.

Dette amorfe hvide faststof har følgende egenskaber:

Grundstofanalyse: C 61,79, H 8,84, aske 0,32.

[a]^5 = +27° (C 0,724, methanol).

Feltdesorptionsmassespektrometri: (M + Na) = m/e 35 953, beregnet molekylvægt er 930.

Claims (4)

1. Biologisk ren kultur af Act inomadura yumaense, kendetegnet ved, at kulturen er Actinomadura 5 yumaense NRRL 12515, og at den kan danne antibiotikum LL-C23024-Q! med strukturformlen Ml« 10 ?*· M j[ * „ ii. Trr^ Me H Me H HH OH

15 COOH M* antibiotikum LL-C23024-)3 med strukturformlen 20 qh OH g foH Η 1 H Me H Me H HR OH COOH 25 wwn og antibiotikum LL-C23024-iota, som senere har vist sig at have følgende strukturformel OM« r€. OM« OH |S.QS** * Μ·α^αΟΜ·Ϊ O 35 \ ΗΜλΕ H it i jf f COjH DK 161332B i udvindelige mængder ved fermentation i et flydende næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen samt uorganiske salte.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotika LL- C23024-a, -β og -iota med formlerne OM« ~ir QMe S Me4A/M* JL m* YYM'fV\ nKyf |^°ΤγΤ° Me

15. OH Η i H Me H Me Η Η H OH COOH Me OMe o QH O« £ 25 [^οη ηΪη Me H Me H HH OH COOH Me OMe rV“

30 OMe OH Μβ |£ ΤϊΤ Me H Η Η H OMe C02H DK 161332 B kendetegnet ved, at man aerobt fermenterer Actino-madura yumaense NRRL 12515 i et væskemedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen samt uorganiske salte, indtil en væsentlig antibiotisk aktivitet er til 5 stede i fermentationsvæsken, og at man derefter udvinder de antibiotiske stoffer derfra.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at temperaturen i fermentationskulturen holdes 10 på 25-35°C i en periode på 24-150 timer.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3 til fremstilling af antibiotikum LL-C23024-a, kendetegnet ved, at man aerobt dyrker Actinomadura yumaense NRRL 12515 i et 15 væskemedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen samt uorganiske salte, indtil en væsentlig antibiotisk aktivitet er til stede i fermentationsvæsken, og at man derefter udvinder det antibiotiske stof derfra.