NL194396C

NL194396C - Antibiotica producerende micro-organismen en werkwijze ter bereiding van antibiotica.

Info

Publication number: NL194396C
Application number: NL8204069A
Authority: NL
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1981-10-22
Filing date: 1982-10-21
Publication date: 2002-03-04
Also published as: ES8308359A1; GB2108113B; IT1197433B; GB2147808A; JPH0824593B2; FI823603A0; SE456588C; FR2515207B1; CH661283A5; SE8205992D0; JPH05219980A; FI75187C; SE8205992L; AU558914B2; IE54813B1; FR2515207A1; ES516718A0; CA1198386A; GB2147808B; DK161332C

Description

1 194396

Antibiotica producerende micro-organismen en werkwijze ter bereiding van antibiotica

De uitvinding heeft betrekking op een reincultuur van een Actinomadura-sooft die in staat is tot het produceren van antibiotisch werkzame zure polycyclische ethers.

5 Een cultuur van Actinomadura verrucosospora is bekend uit het Amerikaanse octrooischrift 4.195.079. Deze Actinomadura-soort produceert een antibioticum dat in het octrooischrift wordt aangeduid als verbinding 51.532 behorend tot de zure polycyclische ethers; verdere structuurgegevens van verbinding 51.532 ontbreken in het octrooischrift. Het vrije zuur van verbinding 51.532 heeft een optische rotatie [a]0^ van -11,0° in chloroform, terwijl het natriumzout een [a]D25 van -29,9° in chloroform heeft.

10 Uit de Europese octrooiaanvrage 0 035 119 zijn antibiotisch werkzame zure polycyclische ethers bekend, daarin aangeduid als X-14868A, X-14868B en X-14868C, welke kunnen worden verkregen door fermentatie van de stam Nocardia X-14868 ATCC 31585.

Gevonden is nu een nieuwe Actinomadura-soort, die in staat is tot het produceren van andere polycyclische ether-antibiotica. De reincultuur volgens de uitvinding wordt gekenmerkt doordat de Actinomadura-15 soort de soort Actinomadura yumaense sp. nov. is, die de antibiotica als X-14868A, X-14868B en X-14868C produceert

De uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze ter bereiding van de antibiotica als X-14868A, X-14868B en/of X-14868C door aerobe fermentatie en winning van de in het fermentatiemedium gevormde antibiotica, welke werkwijze wordt gekenmerkt doordat men het micro-organisme Actinomadura yumaense 20 sp. nov. kweekt

Het antibioticum X-14868A heeft de structuur volgens de formule van het formuleblad, waarin R1 en R2 ieder een methylgroep voorstellen. Het symbool R staat in deze verbinding voor een waterstofatoom. Het ammoniumzout van deze verbinding is inmiddels onder de naam maduramicine. De brutoformule is ^47^80^17- 25 Het antibioticum X-14868C heeft de structuur volgens de formule van het formuleblad, waarin R en R1 ieder een waterstofatoom voorstellen en R2 een methylgroep voorsteft. De brutoformule van X-14868C is ^4β^7βΟΐ7·

Het antibioticum X-14868B is eveneens een polycyclische ether dat voldoet aan de formule van het formuleblad, waarin R, R1 en R2 ieder een methylgroep voorstellen. De brutoformule Is Ο^Η^,Ο^.

30 De in de Europese octrooiaanvrage 35 119 genoemde antibiotica X-14868A, X-14868B en X-14868C hebben een optische rotatie [a]D in chloroform van resp. +40,6°, -1-46,1° en +49,6°. Zij kunnen volgens die publicatie worden verkregen door fermentatie van de stam Nocardia X-14868 ATCC 31585. Deze stam produceert een luchtmycelium van touwachtige plukjes, waarbij geen sporen werden aangetroffen; verder bevat de celwand arabinose. In beide opzichten verschilt de nieuwe Actinomadurasoori van deze 35 Nocardia-s&am. Ook het verbruik van koolstofbronnen is verschillend.

De antibiotica X-14868A, X-14868B en X-14868C zijn actief bevonden tegen een aantal gram-positieve bacteria, coccidiën en nemathoden. Zij worden ook gevormd tijdens het kweken onder beheerste omstandigheden van Actinomadura yamaense sp. nov., welke het voorwerp is van de onderhavige uitvinding.

Een representatieve stam van dit micro-organisme werd geïsoleerd uit een in Yuma County, Arizona 40 verzameld bodemmonster en wordt bewaard in de cultuurverzameling van de Lerie Laboratories Division, American Cyanamid Company, Peart River, New York, onder cultuumummer X-14868. Een levenskrachtige cultuur van deze representatieve stam is gedeponeerd bij het Culture Collection Laboratory, Northern Regional Center, U S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, en is aan de permanente verzameling toegevoegd onder het toegangsnummer NRRL12515.

45

Taxonomische karakterisering van NRRL 12515

De stam NRRL 12515 is taxonomisch gekarakteriseerd en geïdentificeerd als het type stam van een nieuwe soort van het genus Actinomadura aangeduid als Actinomadura yumaense sp. nov.

Aan de cultuurkenmerken, fysiologische kenmerken en morfologische kenmerken van de representatieve 50 stam NRRL 12515 werden waarnemingen verricht onder toepassing van methoden van E.B. Shirting en D. Gottlieb, ’’Methods for characterization of Streptomyces species”, Internat J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966), en R.e. Gordon et at, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardin strain”, Internat J. Syst. Bacteriol. 24:54-63 (1974). in ait onderzoek toegepaste media werden gekozen uit de media, die aanbevolen waren door T.G. Pridham et al., ”A selection of media for maintenance and taxonomie study of 55 Streptomycetes”, Antibiotics Ann., biz. 947-953 (1956/1957); G.F. Gauze et at, ’’Problems in the classification of antagonistic actinomycetes”, State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Moscow (1957); en R.E. Gordon et al. (zie boven), voor het taxonomische onderzoek van actinomyceten en bodembacteriên.

194396 2

De chemische samenstelling van de celwanden van het micro-organisme werd vastgesteld onder toepassing van de methode van H.A. Lechevalier et al., ’’Chemical composition as a criterion in the classification of actinomycetes”, Adv. Appl. Microbiol. 14: 47-72 (1971). Fosfolipidepatronen werden vastgesteld onder toepassing van de methode volgens M.P. Lechevalier et al., ’’Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: 5 phopholipid composition”, Biochem. Syst. Ecol. 5:249-260 (1977). Details zijn vermeld in de tabellen 1-6, en een algemene beschrijving van de cultuur wordt onderstaand gegeven. De onderstreepte beschrijvende kleuren zijn overgenomen van K.L. Kelly en D.B. Judd, "Color, Universal Language and Dictionar of Names”, U.S. Nat. Bur. Stand., Spec. Publ. 440, Washington, D.C. (1976) en de bijgaande Inter-Society Color Council, Natl. Bur. Stand. Centroid Color Charts.

10 De voor deze nieuwe soort, zoals vertegenwoordigd door de stam NRRL 12515, waargenomen gegevens kunnen vergeleken worden met de gegevens die gepubliceerd zijn voor de bekende soorten van het genus Actinomadura (M. Goodfellow et al., ’’Numerical Taxonomy of Actinomadura and related actinomycetes”, J. Gen. Microbiol. 122: 95-111 (1979); L.H. Huang, ’’Actinomadura macra sp. nov., the producer of antibiotic CP-47,433 en CP-47,434", Internat. J. Syst. Bacteriol. 30:565-568 (1980); J. Meyer, "New species of the 15 genus Actinomadura", Z. Allgem. Mikrobiol. 19: 37-44 (1979); H. Nomura en Y. Ohara, ’’Distribution of actinomycetes in soil. XI. Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier, et al.”, J. Ferment. Technol. 49: 904-912 (1971); en T.P. Preobrazhenskaya et al„ ’’Key for identification of the species of the genus Actinomadura”, The Biology of Actinomycetes and Related Organisms 12:30-38 (1977)). De cultuur NRRL 12515 heelt een geringe gelijkenis met Actinomadura pelletieri, maar lijkt op geen enkele andere 20 beschreven soort en verschilt in een aantal eigenschappen van A. pelletieri. Daarom is stam NRRL 12515 als de typestam aangeduid van een nieuwe soort, geheten Actinomadura yumaense, sp. nov., genoemd naar de verzamelplaats van het bodemmonster waaruit de type stam was geïsoleerd.

Micromorfoiogie 25 Sporen worden gevormd in korte spiraalketens (maximale lengte ongeveer 20 sporen per keten) op verlakte, nagenoeg kransstandige luchtsporoforen. De sporen zijn eivormig, 0,6-0,8 pm bij 1,0 tot 1,4 pm, met een glad oppervlak.

Celwandsamenstelling 30 Hydrolysaten van hele cellen van deze cultuur bevatten madurose (3-0-methyl-D-galactose) en het meso-isomeer van diaminopimelinezuur (DAP). De cultuur heeft ook een type P-1 fosfollpidepatroon en geen ander diagnostisch fosfolipide dan enig fosfatidylglycerol. Deze eigenschappen zijn alle zeer typerend voor leden van het genus Actinomadura.

35 Hoeveelheid groei

Een goede groei wordt waargenomen op Bennett’s agar, Gauze No. 2 agar, NZ-amine-zetmeel-glucose-agar (ATCC medium 172), tomatenpuree-havermeel-agar, en gistextract-moutextract-agar; matige groei werd waargenomen op Benedict’s agar, Czapek's sucrose-agar, glycerol-asparagine-agar, Hickey-Tresner-agar, en havermeel-agar; slechte groei wordt waargenomen op calciummalaat-agar, Gauze No. 1 agar, en 40 anorganische zouten-zetmeel-agar.

Vegetatief mycelium

Op media waarop een goede groei plaats vond, werd waargenomen, dat het vegetatieve mycelium omhoog kwam en zich oprolde, en dat het in het algemeen, gelig-grijze kleurnuances had.

45

Luchtmycelium en sporenkleur

De luchtmycelia en/of de sporenmassa’s hadden een witte tot 264 lichtgrijze kleur. De luchtmycelia-productie is op de meeste media licht.

50 Oplosbare pigmenten

Afwezig op vele media; geel pigment op Benedict’s en glycerol-asparagine-agars; geel-groen pigment op calciummalaat-agar, groenig-bruin pigment op NZ-amine-zetmeel-glucose-agar; oranje pigment op Bennett’s en gistextract-moutextract-agars. 1 i

Fysiologische reacties

Geen melaninepigmenten op pepton-ijzer-agar en tyrosine-agar (ISO-7); sterke peptonisatie van lakmoes-melk; sterke proteolyse van voedingsgelatine; matige reductie van nitraat; geen hydrolyse van adenine of 3 194396 guanine; sterke hydrolyse van hypoxanthine, tyrosine en xanthine; zwakke hydrolyse van zetmeel; hydrolyse van esculine; variabele hydrolyse van ureum. Geen groei bij 4°C, 10°C of 55°C; matige groei bij 25°C en 45°C; goede groei bij 32DC en 37°C. Koolhydraatgebruik, zoals bepaald met de methode volgens T.G. Pridham en D. Gottlieb, ’The utilization of carbon compounds by some actinomycetales as an aid for 5 species determination", J. Bacteriol. 56:107-114 (1948): goed gebruik van glucose, glycerol en trehalose; matig gebruik van maltose en sucrose; slecht gebruik van fructose, galactose, inositol, mannose, en melezitose; geen gebruik van adonitol, arabinose, dulcitol, lactose, mannitol, melibiose, raffinose, rhamnose, salicine, sorbitol en xylose. Zuurproductie uit koolhydraten volgens de methode van Gordon, et al., (zie boven): goede zuurproductie uit glucose, glycerol, maltose, sucrose en trehalose; zwakke zuurproductie uit 10 galactose, inositol en mannose. Gebruik vein organische zuren volgens de methode van Gordon et al., (zie boven): gebruik van acetaat, malaat, propionaat, pyruvaat, succinaat en tartraat; geen gebruik van benzoaat, citraat, lactaat, mucaat en oxalaat TABEL 1 15---

Cultuurkenmerken van Actinomadura yumaense NRRL12515

Incubatie: 14 dagen Temperatuur 28°C

Medium Hoeveelheid Luchtmyce- Oplosbaar Reverse kleur 20 groei lium en/of pigment sporen

Benedict's agar matig tot platte, gelig 89. lichtgeel 25 slecht poederach tige kolonies; luchtmycelia wit tot 264. lichtgrijs 30 Bennett’s agar goed geen oranje 81. donkergrijs luchtmycelia; gelig bruin opgerolde vegetatieve groei 93.

35 gelig grijs tot 80. grijzig gelig bruin calciummalaat-agar slecht platte groei; geelgroen 90. groenig schaarse geel 40 witte luchtmycelia

Czapek’s sucrose-agar slecht tot platte groei; geen 89. lichtgeel matig matige luchtmycelia 45 vegetatieve groei 90. grijzig geel

Gauze No. 1 agar slecht kleurloze geen kleurloos platte groei; 50 schaarse witte luchtmycelia 194396 4 TABEL 1 (vervolg)

Cultuurkenmerken van Actinomadura yumaense NRRL 12515 5 Gauze No. 2 agar goed omhooggeko- geen 72. donker men oranje-geel opgerolde kolonies; vegetatieve 10 mycelia 93.

gelig grijs; matige luchtmycelia, 92. gelig wit 15 glycerolasparagine-agar slecht tot platte, geel 89. lichtgeel matig poederach tige kolonies; witte luchtmycelia 20 Hickey-Tresner-agar matig platte geen 90 grijzig geel wasachtige kolonies; 90. grijzig geel; schaarse 25 luchtmycelia, wit tot 264. lichtgrijs anorganische zouten-zetmeel- slecht platte, geen kleurloos agar kleurloze, 30 poederach- tige kolonies; witte luchtmycelia NZ-amine-zetmeel-glucose-agar goed sterk groenig bruin 78. donker 35 opgerolde geligbruin groei, 61. grijzig gelig bruin tot 65. bruinig zwart 40 matige luchtmycelia, wit tot 264. lichtgrijs havermeel-agar matig platte geen 90. grijzig geel 45 wasachtige groei, 90. grijzig geel; matige luchtmycelia, 50 wit 5 194396 TABEL 1 (vervoig)

Cultuurkenmerken van Actinomadura yumaense NRRL12515 5 tomatenpasta-havermeel-agar goed platte geen 90. grijzig geel wasachtige groei; 91. donker grijzig geel; spoor 10 van witte iuchtmyceiia gistextract-moutextract-agar goed omhooggeko- oranje 78. donker men, gelig bruin wasachtige, 15 opgerolde kolonies, 93. gelig grijs tot 80. grijzig gelig bruin; 20 geen

Iuchtmyceiia TABEL 2 25 Micromorfologie van Actinomadura yumaense NRRL 12515

Medium Luchtmyce- Sporenvorm Sporen· Sporen- lium en/of grootte oppervlak sporen- 30 dragende structuren

Czapek’s sucrose-agar luchtsporofo- eivormig 0,6-0,8 pm glad ren; vertakt, x bijna 1,0-1,4 pm 33 kransstandig; dragen betrekkelijk korte spiraalketens 40 van rijpe sporen 1 TABEL 3

Fysiologische reacties van Actinomadura yumaense NRRL 12515 gQ Medium Incubatieperiode Hoeveelheid Fysiologische groei reactie pepton-ijzer-agar 7 dagen goed lichte bruinkleuring 14 dagen goed lichte bruinkleuring tyrosine-agar 7 dagen matig geen pigment gg 14 dagen goed gelig pigment lakmoesmelk 14 dagen goed goede peptonisatie

, ' I

194396 6 TABEL 3 (vervolg)

Fysiologische reacties van Actinomadura yumaense NRRL 12515 5 28 dagen goed sterke peptonisatie voedingsgelatine 14 dagen goed lichte proteolyse 28 dagen goed totale proteolyse nitraatmedium 14 dagen goed zeer zwakke reductie 10 28 dagen goed matige reductie adenine-agar 14 dagen goed geen hydrolyse 21 dagen goed geen hydrolyse guanine-agar 14 dagen goed geen hydrolyse 21 dagen goed geen hydrolyse 15 hypoxanthine-agar 14 dagen goed totale hydrolyse 21 dagen goed totale hydrolyse tyrosine-agar 14 dagen goed sterke hydrolyse 21 dagen goed sterke hydrolyse xanthine-agar 14 dagen goed matige hydrolyse 20 21 dagen goed sterke hydrolyse NZ-amine met oplosbare zetmeel en 5 dagen slechte of geen groei bij 4°C, 10°C en glucose-agar (ATCC Med. No. 172) 55°C; matige groei bij 25eC; 28eC en

45°C; goede groei bij 32°C en 37°C

ureummedium 28 dagen goed ontleding variabel 25 esculinemedium 14 dagen goed hydrolyse 28 dagen goed hydrolyse zetmeel-agar 5 dagen goed geen hydrolyse 10 dagen goed geen hydrolyse 30 TABEL 4

Verbruik van koolstofbronnen door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op ISP-9 koolhydraatmedium

Incubatie: 28 dagen Temperatuur. 28°C

35 Koolstofbron Gebruik adonitol l-arabinose dulcitol - fructose slecht *0 d-galactose slecht d-glucose goed glycerol goed

Hnositol slecht lactose 45 matose redelijk d-mannitol d-mannose slecht d-melezitose slecht d-melibiose 50 d-raffinose l-rhamnose salidne sorbitol sucrose redelijk 33 d-trehalose goed 7 194396 TABEL 4 (vervolg)

Verbruik van koolstofbronnen door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op ISP-9 koolhydraatmedium 5 d-xylose - negatieve controle ~ TABEL 5 10 Zuurproductie uit verscheidene koolhydraten door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op Gordon's basaal anorganisch stikstofmedium

Incubatie: 28 dagen Temperatuur 28°C

Koolstofbron Zuurproductie 15 7 dagen 28 dagen adonitol - “ l-arabinose - - duldtol - - fructose - - 20 d-galactose - + d-glucose +++ +++ glycerol ++ +++ i-inositol - + lactose 25 maltose - +++ d-mannitol - - d-mannose - + d-melezltose - - d-melibiose 30 d-raffinose - - l-rhamnose - - salidne - - sorbitol - - sucrose - +++ 35 d-trehalose - +++ d-xylose negatieve controle 40 +++ = sterk positieve respons ++ = matige positieve respons + = geringe positieve respons — - negatieve respons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 TABEL 6 2 j. _ 3

Gebruik van organische zuren door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op Gordon’s modificatie van 4

Koser's basaal agar (Koser’s cltraatagar) 5 _____ — 6

Incubatie: 28 dagen Temperatuur 28°C

7

Koolstofbron Gebruik 8 acetaat + 9 benzoaat 10 citraat 11 lactaat malaat + 194396 8 TABEL 6 (vervolg)

Gebruik van organische zuren door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op Gordon's modificatie van Koser*s basaal agar (Koser’s citraatagar) 5 --- slijmzuur oxalaat propionaat + pyruvaat + 10 sucdnaat + tartraat + + = positieve respons - = negatieve respons 15 Opgemerkt wordt dat de term Actinomadura yumaense niet beperkt is tot de stam Actinomadura yumaense NRRL 12515 of tot stammen die volledig aan de bovenstaande groeikarakteristieken en microscopische karakteristieken beantwoorden, die slechts ter toelichting zijn gegeven. De hier beschreven Actinomadura yumaense omvat alle stammen van Actinomadura yumaense die de antibiotica X-14868A, B en C produceren en die qua groeikarakteristieken en microscopische karakteristieken niet scherp kunnen worden 20 onderscheiden van Actinomadura yumaense NRRL 12515 en zijn subculturen, waaronder mutanten en varianten daarvan. De term "mutanten” omvat de natuurlijke (spontane) mutanten van dit organisme alsmede geïnduceerde mutanten die uit dit organisme zijn verkregen door mutagene middelen die aan de deskundigen bekend zijn, waaronder blootstelling aan röntgenstraling, ultraviolette straling, stikstofmosterd, actinofagen en nitrosaminen. Het wordt eveneens gewenst en beoogd dat inter- en intra-spedfieke 25 genetische recombinanten worden omvat, die door aan de deskundigen bekende genetische technieken zijn verkregen, bijvoorbeeld door conjugatie, transductie en genetische manipulatietechnieken.

Het kweken van Actinomadura yumaense kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid van vaste of vloeibare cultuurmedia. Media die voor de productie van de antibiotica X-14868A, B en C bruikbaar zijn, omvatte een assimileerbare bron van stikstof zoals eiwit, eiwithydrolysaat, polypeptiden, aminozuren, 30 maïsweekvloeistof, enz., en anorganische anionen en kationen, zoals kalium, natrium, ammonium, calcium, sulfaat, carbonaat, fosfaat, chloride enz. Sporenelementen zoals boor, molybdeen, koper enz. worden als verontreinigingen van andere bestanddelen van de media toegevoerd. Beluchting in tanks en flessen wordt gerealiseerd door steriele lucht door of op het oppervlak van het fermentatiemedium te leiden. Een mechanische roerder zorgt voor verdere agitatie in tanks. Naar behoefte kan een antischuimmiddel zoals 35 varkensreuzelolie of een siliconenontschuimer worden toegevoegd.

Actinomadura yumaense wordt gekweekt en bewaard op schuine agar, bijvoorbeeld Bennett’s agar, gistmoutagar, of ATCC medium 172. ATCC medium 172 heeft de voorkeur. De agar wordt geënt met een cultuur van Actinomadura yumaense en bij 28-37°C, bij voorkeur bij ongeveer 32°C, gedurende ongeveer 7 dagen geïncubeerd. Deze uitgangsculturen kunnen door serie-overbrengingen op verse agar worden 40 bewaard, of er kan een hoeveelheid agar met mycelia van de goed begroeide agar worden gebruikt voor het enten van vloeibare media.

Entmateriaal voor schudflessen van Actinomadura yumaense wordt bereid door 100 cm9 steriel vloeistofmedium in 500 cm3 flessen in te enten met door schrapen of wassen van een agarcultuur verkregen sporen. Voorbeelden van geschikte entmedla zijn: 45

Medium A

rundvleesextract 0,3% 50 Bacto® trypton1 0,5% glucose 1.0% gistextract 0,5% water q.s. 100% 55 (1 een pepton, merkproduct van Difco Laboratories, Detroit, Michigan.)

De pH wordt met een verdunde base, b.v. natriumhydroxide ingesteld op 6,8-7,2.

g 194396

Medium B

glucose 1% zetmeel 2% 5 gistextract 0,5% N-Z amine A®2 0,5% calciumcarbonaat 0,1% water 100% 10 (2 Caseïne digest, merkproduct van Sheffield Chemical Co., Div. Naf1 Dairy Products Corp., Norwich, N.Y.)

Medium B heeft de voorkeur.

De flessen worden bij een temperatuur van 25-35°C, bij voorkeur bij 32°C geïncubeerd en gedurende 1-4 dagen krachtig geschud op een roterende schudmachine. Dit entmateriaal wordt daarna gebruikt voor het beênten van een fermentatiecultuur; ook kan deze cultuur worden bevroren en bewaard om entmateriaal 15 voor latere entculturen te verschaffen.

De volgende media zijn voorbeelden van media die geschikt zijn voor de fermentatie van Actinomadura yumaense voor de productie van de antibiotica X-14868A, B en C.

20 Medium C

glucose 1,5% glycerol 1,5% sojameel3 1,5% 25 calciumcarbonaat 0,1% natriumchloride 0,3% water q.s. 100% (3 Kan worden vervangen door katoenzaadmeel of oplosbare vleesbestanddelen met gelijk effect.) 30

Medium D

glucose 3% 35 sojameel 1,5% calciumcarbonaat 0,1% natriumchloride 0,3% water q.s. 100% 40

Medium E

zetmeel 1% melasse 2% 45 sojameel 1,5% calciumcarbonaat 0,1% water q.s. 100% 1

Medium F

glucose 3% oplosbare vleesbestanddelen 2,5% natriumchloride 0,2% 55 calciumcarbonaat 0,1% water q.s. 100% 194396 10

Medium G

glucose 3% 5 sojameel 0,5% ammoniumsuHaat 0,3% natriumchloride 0,2% calciumcarbonaat 0,1% 10 MediumH ,00% glucose 3% ammoniumsuHaat 0,3% dibasisch kaliumfosfaat 0,1% 15 natriumchloride 0,2% calciumcarbonaat 0,1% water q.s. 100%

Medium D heeft de voorkeur.

20 De fermentatie kan worden uitgevoerd in 100 cm3 media in een 500 cm3 fles, die beënt is met 3-10% (v/v) van een op de bovenstaand beschreven wijze bereide eetcultuur en gedurende 24-72 uren onder beluchting geïncubeerd bij 25-35°C, bij voorkeur bij ongeveer 32°C. Monsters van de fermentatiecuituur kunnen worden ingevroren en bewaard voor later gebruik als entmateriaal voor entculturen.

Anderzijds kan de fermentatie worden uitgevoerd in grotere fermentatietanks, die voorzien zijn van 25 beluchtings- en agitatiemiddelen.

Elke tank wordt beënt met 3-10% (v/v) entmateriaal, dat op de bovenstaand beschreven wijze is bereid. Er wordt belucht met een snelheid van 0,5-2,0 dm3 steriele lucht per dm3 fermentatiemedium per minuut en het fermentatiemedium wordt door een roerder met een toerental van 200-400 omw./min. geroerd. De temperatuur wordt gehouden op 25-35°C, bij voorkeur op 32°C. De fermentatie wordt voortgezet totdat 30 antibioticum zich in het fermentatiemedium ophoopt, gewoonlijk na 100-150 uren, waarna het antibioticum wordt geoogst.

Het antibioticum kan worden geoogst en gezuiverd overeenkomstig de in het Amerikaanse octrooischrift 4.278.663 beschreven methoden, of overeenkomstig de volgende procedure:

Het ruwe fermentatiemengsel, dat de hele cellen bevat, bereid op de bovenstaand beschreven wijze, 35 wordt gemengd met een gelijke volumehoeveelheid van een met water niet mengbaar organisch oplosmiddel. De voorkeur hebben methyleenchloride en ethylacetaat. De organische fase wordt afgescheiden en onder verminderde druk geconcentreerd tot een olieachtige siroop.

De olieachtige siroop wordt opgelost in methyleenchloride en toegevoegd aan een kolom van silicagel, alumina, Sephadex LH-20® (Pharmacia Fine Chemicals Div. van Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.), of 40 magnesiumaluminiumsilicaat. Voorbeelden van geschikte oplosmiddel voor het ontwikkelen van de kolom zijn diëthylether, ethylacetaat en mengsels van methyleenchloride met diêthylether, aceton, lagere alcohol (de voorkeur heeft methanol), acetonitril of dioxaan. Methyleenchloride: ethylacetaat 1:1 (v/v) heeft de voorkeur. Fracties worden verzameld en gecontroleerd op de aanwezigheid van antibacteriêle werkzaamheid door bioanalyse tegen een gevoelig organisme, b.v. Bacillus subtills. Actieve fracties worden gecombi-45 neerd en onder verminderde druk geconcentreerd tot een residu. Dit residu wordt opgelost In een organisch oplosmiddel, b.v. tert-butanol (geprefereerd), kenzeen, of p-dioxaan, en gevriesdroogd.

De gevriesdroogde vaste stof wordt opgelost in een geschikt organisch oplosmiddel, bijv. methyleenchloride, hexaan, methyleenchloride: ethylacetaat, diêthylether, hexaan: ethylacetaat, hexaan: chloroform, of hexaan: ether. Diëthylether heeft de voorkeur. Deze oplossing wordt geschud met water en de pH wordt 50 ingesteld op 1,5-4,0, bij voorkeur ongeveer 2,5, met een willekeurig verdund anorganisch zuur. De organische fase wordt afgescheiden, gewassen met water om eventuele overmaat zuur te verwijderen, gedroogd boven een geschikt droogmiddel, gefiltreerd, en onder verminderde druk geconcentreerd.

Het residu wordt opgelost in een geschikt oplosmiddel en de oplossing laat men langzaam verdampen, bij voorkeur bij ongeveer 4°C. Voorbeelden van geschikte oplosmiddelen zijn methyleenchloride, hexaan, 55 ethylacetaat, diëthylether, chloroform en mengsels daarvan. Hexaan: ether 5:2 (v/v) heeft de voorkeur. De verkregen kristallen worden verzameld en gewassen, bij voorkeur bij ongeveer 40°C, met een willekeurige koolwaterstof die bij matige temperatuur kookt, bijvoorbeeld hexaan of heptaan, en aan de lucht gedroogd 11 194396 tsneiPidc a!S SindprCuliCi het antibioticum ΙΠ de VOi 111 V£u1 höt vrijö £UUf ιθ VörKrijQöl ·

Wanneer het product in de vorm van een zout gewenst is, kan het vrije zuur door behandeling met het geschikte kation, bij voorkeur in de vorm van een verdunde anorganische base, worden omgezet overeenkomstig de aan de deskundigen bekende procedures.

5 De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe. De media A, B, C enz. zijn zoals bovenstaand gedefinieerd. Tenzij anders is aangegeven werden alle procedures uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 22°C) en bij een druk van 1 atm.

Voorbeeld l 10 Gewassen sporen van een schuine agar van Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden gebruikt om een 500 cm3 fles te beênten, die 100 cm3 steriel medium B bevatte. De fles werd 2 dagen bij 28°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.

Een 5%’s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht in 100 cm9 steriel medium C in een 500 cm3 fles en gedurende 5 dagen bij 28°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.

15 De aanwezigheid van antibiotische activiteit werd dagelijks gevolgd door bioanalyse tegen Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Bacillus subtilis, en Streptococcus faecalis, en de anthelmintische activiteit werd gevolgd door bioanalyse tegen de vrij levende nematode Caenorhabdltis elegans.

Voorbeeld II

20 Men bereidde zeven flessen van 500 cm3, die elk 100 cm3 bevatte van een van de volgende steriele media: Fles 1:100 cm3 medium C

fles 2:100 cm3 medium C met 1,5% katoenzaadmeel in plaats van sojameel fles 3: 100 cm3 medium C met 1,5% oplosbare vleesbestanddelen in plaats van sojameel fles 4:100 cm3 medium D 25 fles 5:100 cm3 medium E fles 6:100 cm3 medium F fles 7:100 cm3 medium G.

Deze flessen werden elk beênt met een 5%'s entmateriaal van Actinomadura yumaense NRRL 12515, dat in medium B was gegroeid. De flessen werden daarna gedurende 4-6 dagen bij 28°C geïncubeerd op 30 een roterende schudinrichting.

Elk van de bovenstaande culturen bleek actief te zijn bij analyse op antibiotische werkzaamheid als in voorbeeld I en bij analyse op anticoccidiale activiteit tegen Eimeria tenella in weefseiculturen van kuiken-nleren. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Voorbeeld III

2

Ingevroren fermentatiecultuurcellen van Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden gebruikt om een 500 3

cm3 fles te enten die 100 cm3 steriel medium B bevatte. De fles werd daarna gedurende 4 dagen bij 32°C

4 geïncubeerd op een roterende schudinrichting.

5

Een 5%'s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht in 100 cm3 steriel medium H in een 6 500 cm3 fles en gedurende 5 dagen bij 28°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.

7

Antibacteriële werkzaamheid werd op de in voorbeeld I beschreven wijze bevestigd en anticoccidiale 8 werkzaamheid werd op de in voorbeeld II beschreven wijze bevestigd.

9

De aanwezigheid van antibiotische werkzaamheid werd ook aangetoond door dunneiaagchromatografie 10 over silicagelplaten, ontwikkeld in ethylacetaat chloroform 70:30 (v/v).

11 12

Voorbeeld IV

13

Men entte 100 cm3 steriel medium A In een 500 cm3 fles met gewassen sporen van een agarcultuur van 14

Actinomadura yumaense NRRL 12515. De fles werd gedurende 2 dagen bij 32°C geïncubeerd op een 15 roterende schudinrichting.

16

Een 5%'s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht in 100 cm3 steriel medium H in een 500 cm3 fles en gedurende 2 dagen bij 32°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.

Een 5%'s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht in een 500 cm3 fles die 100 cm3 vers steriel medium H bevatte en gedurende 6 dagen bij 28°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.

De antibacteriële werkzaamheid werd op de in voorbeeld I beschreven wijze bevestigd.

194396 12

Voorbeeld V

Men entte twee flessen van 500 cm3 die elk 100 cm3 steriel medium A bevatte, met een ingevroren entcultuur van Actinomadura yumaense NRRL 12515 en incubeerde gedurende 2 dagen bij 32°C op een roterende schudinrichting.

5 De inhoud van de twee flessen werd daarna verenigd en toegevoegd aan 12 dm3 vers steriel medium A in een 20 dm3 fles. Deze cultuur werd daarna gedurende 2 dagen bij 28°C onder beluchting geïncubeerd.

De inhoud van deze fles werd daarna overgebracht in een 300 dm3 enttank die 288 dm3 steriel medium A bevatte en deze cultuur werd belucht en geagiteerd gedurende 25 uren bij 32°C.

Aan het eind van de 25 uren durende incubatie, werden de 300 dm3 entcultuur overgebracht in een 1500 10 dm3 fermentor, die 1200 dm3 steriel medium C bevatte. Deze cultuur werd onder beluchting en agitatie gedurende 115 uren bij 28°C geïncubeerd.

Het fermentatiemengsel werd geanalyseerd op antibiotische werkzaamheid door dunnelaag-chromatografie over silicagelplaten, die ontwikkeld werden in ethylacetaat: chloroform 70:30 (v/v). Als alternatief werden verscheidene van de ontwikkelde platen onderworpen aan bioanalyse tegen Bacillus 15 subtills, waarbij de aanwezigheid van antibiotische werkzaamheid werd aangetoond.

Voorbeeld VI

Een medium voor het groeien van het primaire entmateriaal werd overeenkomstig de volgende formulering samengesteld: 20 rundvleesextract 0,3%

Bacto®-trypton 0,5% glucose 1,0% gistextract 0,5% 25 Bacto®-agar 0,15% water q.s. 100%

Door wassen of schrapen van een agarcultuur van Actinomadura yumaense NRRL 12515 verkregen sporen en mycelia werden gebruikt om een 500 cm3 fles, die 100 cm3 van het bovenstaande gesteriliseerde 30 medium bevatte, te enten. De fles werd op een roterende schudinrichting geplaatst en 48 uren bij 32°C krachtig geschud. Het resulterende entmateriaal (100 cm3) in de fles werd gebruikt om 1 dm3 van hetzelfde steriele medium in een 2 dm3 fles te enten. Dit entmateriaal werd met steriele lucht belucht terwijl de kweek 48 uren bij 28°C werd voortgezet. Deze 1 dm3 cultuur werd daarna gebruikt om een 30 cm fermentortank die hetzelfde steriele medium bevatte, te beênten, en deze tank werd met steriele lucht belucht en 35 gedurende 42 uren bij 28°C geïncubeerd.

Voorbeeld VII

Men bereidde een fermentatiemedium overeenkomstig de volgende formulering: .. dextrose 1,5% 40 glycerol 1,5% sojameel 1,5% calciumcarbonaat 0,1% natriumchloride 0,3% water q.s. 100%

De pH werd met 6 N natriumhydroxide ingesteld op 7,0 en het medium werd gesteriliseerd. Een 30 dm3 portie van het volgens voorbeeld I bereide entmateriaal werd gebruikt om 250 dm3 van het bovenstaand beschreven medium in een 300 dm3 fermentor te beënten. Het fermentatiemengsel werd steriel belucht en 50 met 220 omw./min. geroerd. De fermentatie werd uitgevoerd gedurende 97 uren bij 32°C, waarna het vaste materiaal werd geoogst

Voorbeeld VIII

Men bereidde een fermentatiemedium overeenkomstig de volgende formulering: ^ dextrose 3,0% sojameel 1,5% 13 194396 dextrose 3,0% calciumcartx>naat 0,1% natriumchloride 0,3% 5 water q.s. 100%

De pM werd met 6 N natriumhydroxide ingesteld op 7,0 en het medium werd gesteriliseerd. Een 300 dm1 portie van het volgens voorbeeld I bereide entmateriaal werd gebruikt om 3000 dm1 van het bovenstaand vermelde medium in een fermentor te enten. Het fermentatiemengsel werd steriel belucht en met 100 10 omwjmin. geroerd. De fermentatie werd uitgevoerd gedurende 115 uren bij 32°C waarna het vaste materiaal werd geoogst.

Voorbeeld IX

15 1. Het vaste fermentatiemateriaal (100 dm1) werd met 6 N HCI ingesteld op een pH van 4,0. Het zure mengsel werd daarna 1-2 uren geroerd met een gelijke volumehoeveelheid methyleenchloride. Het mengsel werd daarna gefiltreerd onder toepassing van diatomeeênaarde als filtreerhulpmiddel. Het methyleenchloride-extract werd afgezogen en onder verminderde druk geconcentreerd tot ongeveer 2 dm1 van gedeeltelijk gezuiverde antibiotica.

20 2. Chromatografie van de gedeeltelijk gezuiverde antibiotica over silicagel. Een glazen kolom met een diameter van 7 cm werd tot een hoogte van 91 cm gevuld met Woelm silicagel TSC. Het ruwe concentraat (zie boven onder 1) met een volume van ongeveer 2 dm1 methyleenchloride, gevolgd door methyleenchloride : ethylacetaat (1:1 volumeverhouding), waarbij een totaal van 126 fracties werd verkregen, elk met een volume van 80 cm1. De kolom werd daarna verder ontwikkeld onder toepassing van ethylacetaat-ethanol 25 (7:3) waarbij nog eens 87 fracties werden verkregen.

De fracties 58-87, die rijk waren aan X-14868A, werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd tot een residu dat 90,4 g woog. Dit residu werd opgenomen in een mengsel van 600 cm1 diëthylether en 600 cm1 hexaan. De suspensie werd gefiltreerd waarbij een helder filtraat werd verkregen. Het heldere filtraat werd onder verminderde druk geconcentreerd totdat zich kristallen begonnen te vormen. Na een 30 nacht staan werd het kristailijne X-14868A op een filtertrechter verzameld, gewassen met koude ether en aan de lucht gedroogd, waarbij 33,1 g kristallijn X-14868A werd verkregen. Een extra hoeveelheid X-14868A van 12,4 g werd verkregen door verdere volumevermindering van de gecombineerde wasvloeistof en filtraat.

De fracties 177-203 van de elutie met ethylacetaat-ethanol, die rijk waren aan X-14868C, werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij 6,7 g van gedeeltelijk gezuiverd X-14868B 35 werd verkregen, dat op de bovenstaand beschreven wijze werd behandeld.

De fracties 204-213 van de elutie met ethylacetaat-ethanol, die verrijkt waren aan X-14868B, werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd tot een paste en meermalen met methanol geëxtraheerd. Het methanolextract werd geëxtraheerd met methyleenchloride, dat op een kolom werd gebracht die Woelm silicagel bevatte. De kolom werd gewassen met methyleenchloride en daarna geëlueerd met 40 methyleenchloride: ethylacetaat (2:3). De fracties werden met dunnelaagchromatografie gevolgd en de actieve fracties werden verenigd, behandeld met houtskool, geconcentreerd en meermalen geëxtraheerd met heptaan. Het uiteindelijke heptaanextract werd 48 uren bij 0°C gekoeld en de kristallen werden door filtratie van de moederloog gescheiden.

Deze moederloog werd opgelost in methyleenchloride en op een glazen kolom gebracht, die gepakt was 45 met Woelm silicagel. De kolom werd daarna achtereenvolgens geëlueerd met 2 dm1 methyleenchloride, 8 dm1 methyleenchloride: ethylacetaat (1:1) en 4 dm1 ethylacetaat: methanol (9:1). Het eluaat werd In fracties verzameld en de fracties werden op hun antibiotische samenstelling onderzocht De actieve fracties werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij een residu werd verkregen dat X-14868B bevatte.

50

Voorbeeld X

Verdere zuivering van X-14868C van de chromatografie op silicagel.

55 Een glazen kolom met een diameter van 5 cm werd tot een hoogte van 86 cm met de gel gevuld. De charge, 3 g gezuiverd X-14868C, werd opgelost in 10 cm1 methyleenchloride, 1 cm1 hexaan en werd in de gelkolom gebracht De kolom werd daarna ontwikkeld met hetzelfde oplosmiddelmengsel. Met behulp van

Claims

194396 14 een collector werden fracties verzameld. De eerste 23 fracties hadden elk een volume van 17 cm3. De fracties 17-26 bevatten volgens dunnelaagchromatografie X-14868C. Deze fracties werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd waarbij zuiver amorf X-14868C werd verkregen in een hoeveelheid van 1269 mg. 5 Voorbeeld XI Kristallisatie van X-14868C als natriumzout Gezuiverd X-14868C (2,4 g), bereid zoals beschreven in voorbeeld IX werd opgelost in een mengsel van 10 500 cm3 diëthylether, 160 cm3hexaan en 25 cm3 methyleenchloride. De verkregen oplossing werd overgebracht in een scheitrechter die 300 cm3 gedestilleerd water bevatte. Men voegde druppelsgewijs verdunde HCI (1 N) toe totdat de pH na schudden en bezinken een waarde van 2,0-2,5 bereikte. De zure waterfase werd weggegooid en de met zuur behandelde organische laag werd driemaal met telkens 400 cm3 water gewassen. De gewassen organische laag werd 15 minuten met een theelepel geroerd met Darco 15 G 60-poeder en door Ceite gefiltreerd. De ontkleurde organische laag werd in 500 cm3 gedestilleerd water gebracht en men voegde druppelsgewijze 5 N NaOH toe totdat de pH na schudden en bezinken een waarde van 11,0-11,5 bereikte. De basische waterfase werd weggegooid en de resterende organische laag werd tweemaal gewassen met porties water van 400 cm3. De gewassen organische laag werd boven natriumsulfaat gedroogd en daarna onder verminderde druk geconcentreerd tot een volume van 150 cm3. 20 Men liet dit concentraat verscheidene uren in een zuurkast staan. Het kristallijne X-14868C werd op een trechter verzameld, met koude hexaan gewassen en aan de lucht gedroogd, waarna 402 mg van het kristallijne zout van X-14868C werd verkregen. Analyse: berekend voor C^H^O^Na: C 59,70; H 8,33; O 29,46; as 2,49%; 25 gevonden: C 61,55; H 8,79; as 3,31%; N, O. MP. (Fisher-Johns apparaat =174 [FDMass Spec) = 924 [α]2^ = +3,2 in methanol. Voorbeeld XII 30 Zuivering van X-14868B. Een Waters Prep. 500A HPLC (high performance liquid chromatography) instrument werd voorzien van een silicagelkolom onder een druk van 38 bar. De charge, die 5,0 g van het uit voorbeeld lil afkomstige ruwe materiaal was, werd opgelost in 50 cm3 heptaan : ethylacetaat (45:55) en werd in de kolom geïnjec-35 teerd. De kolom werd daarna ontwikkeld met hetzelfde oplosmiddelmengsel met een stroomsnelheid van 200 cm3/min waarbij 40 fracties van 400 cm3 werden verzameld. De fracties 21-32 werden verenigd, geconcentreerd tot een residu, met hexaan behandeld en verdampt, waarbij men zuiver X-14868B verkreeg. De bovenstaande procedure werd viermaal herhaald waarbij men een totale hoeveelheid van 280 mg amorf X-14868B verkreeg. 40 Een portie amorf X-14868B van 90 mg werd opgelost in 10 cm3 diëthylether, gemengd met 10 cm3 water, en met 0,1 N zoutzuur ingesteld op een pH van 2,5. De etherlaag werd gewassen met water, met 0. 1.N natriumhydroxide ingesteld op een pH van ongeveer 11, afgescheiden en opnieuw gewassen met water. De etherfase werd boven natriumsulfaat gedroogd, gefiltreerd, en geconcentreerd tot een residu. Een oplossing van dit residu in ether-hexaan liet men langzaam verdampen, waarbij men een amorfe witte vaste 45 stof verkreeg. Deze amorfe witte vaste stof had de volgende eigenschappen: elemental ranalyse: C 61,79; H 8,84; as 0,32; [af6!, = +27 (C 0,724, methanol); velddesorptiemassaspectrometrie: (M+Na)+ = mIe 953, het berekende molecuulgewicht is dus 930. 50

1. Reincultuur van een Actinomadura-soort die in staat is tot het produceren van een antibiotisch werkzame polycyclische ether, met het kenmerk, dat de Actinomadura-soori Actinomadura yumaense sp. nov. is, die 55 de antibiotica X-14868A, X-14868B en X-14868C produceert.

2. Reincultuur volgens conclusie 1, met het kenmerk dat de Actinomadura yumaense NRRL 12515 is.

3. Werkwijze ter bereiding van de antibiotica X-14868A, X-14868B en/of X-14868C door aerobe fermentatie 15 194396 en winning van de in het fermentatiemedium gevormde antibiotica, met het kenmerk, dat men bij de aerobe * fermentatie Actinomadura yumaense sp. nov. gebruikt

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de Actinomadura yumaense de stam Actinomadura yumaense NRRL 12515 is. Hierbij 1 blad tekening