NL194396C - Antibiotics producing microorganisms and method for preparing antibiotics. - Google Patents

Antibiotics producing microorganisms and method for preparing antibiotics. Download PDF

Info

Publication number
NL194396C
NL194396C NL8204069A NL8204069A NL194396C NL 194396 C NL194396 C NL 194396C NL 8204069 A NL8204069 A NL 8204069A NL 8204069 A NL8204069 A NL 8204069A NL 194396 C NL194396 C NL 194396C
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
actinomadura
fractions
agar
antibiotics
washed
Prior art date
Application number
NL8204069A
Other languages
Dutch (nl)
Other versions
NL8204069A (en
NL194396B (en
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/313,849 external-priority patent/US4407946A/en
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of NL8204069A publication Critical patent/NL8204069A/en
Publication of NL194396B publication Critical patent/NL194396B/en
Application granted granted Critical
Publication of NL194396C publication Critical patent/NL194396C/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00Antiparasitic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00Antiparasitic agents
    • A61P33/02Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/03Actinomadura

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

1 1943961 194396

Antibiotica producerende micro-organismen en werkwijze ter bereiding van antibioticaAntibiotics producing microorganisms and method for preparing antibiotics

De uitvinding heeft betrekking op een reincultuur van een Actinomadura-sooft die in staat is tot het produceren van antibiotisch werkzame zure polycyclische ethers.The invention relates to a pure culture of an Actinomadura sooft capable of producing antibiotic-active acidic polycyclic ethers.

5 Een cultuur van Actinomadura verrucosospora is bekend uit het Amerikaanse octrooischrift 4.195.079. Deze Actinomadura-soort produceert een antibioticum dat in het octrooischrift wordt aangeduid als verbinding 51.532 behorend tot de zure polycyclische ethers; verdere structuurgegevens van verbinding 51.532 ontbreken in het octrooischrift. Het vrije zuur van verbinding 51.532 heeft een optische rotatie [a]0^ van -11,0° in chloroform, terwijl het natriumzout een [a]D25 van -29,9° in chloroform heeft.A culture of Actinomadura verrucosospora is known from U.S. Pat. No. 4,195,079. This Actinomadura species produces an antibiotic referred to in the patent as compound 51,532 belonging to the acidic polycyclic ethers; further structure data of compound 51,532 are missing in the patent. The free acid of compound 51,532 has an optical rotation [a] 0 ^ of -11.0 ° in chloroform, while the sodium salt has a [a] D25 of -29.9 ° in chloroform.

10 Uit de Europese octrooiaanvrage 0 035 119 zijn antibiotisch werkzame zure polycyclische ethers bekend, daarin aangeduid als X-14868A, X-14868B en X-14868C, welke kunnen worden verkregen door fermentatie van de stam Nocardia X-14868 ATCC 31585.European patent application 0 035 119 discloses antibiotic-active acidic polycyclic ethers, designated herein as X-14868A, X-14868B and X-14868C, which can be obtained by fermentation of the strain Nocardia X-14868 ATCC 31585.

Gevonden is nu een nieuwe Actinomadura-soort, die in staat is tot het produceren van andere polycyclische ether-antibiotica. De reincultuur volgens de uitvinding wordt gekenmerkt doordat de Actinomadura-15 soort de soort Actinomadura yumaense sp. nov. is, die de antibiotica als X-14868A, X-14868B en X-14868C produceertA new Actinomadura species has now been found, capable of producing other polycyclic ether antibiotics. The pure culture according to the invention is characterized in that the Actinomadura species the Actinomadura yumaense sp. Nov. which produces the antibiotics such as X-14868A, X-14868B and X-14868C

De uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze ter bereiding van de antibiotica als X-14868A, X-14868B en/of X-14868C door aerobe fermentatie en winning van de in het fermentatiemedium gevormde antibiotica, welke werkwijze wordt gekenmerkt doordat men het micro-organisme Actinomadura yumaense 20 sp. nov. kweektThe invention also relates to a method for preparing the antibiotics such as X-14868A, X-14868B and / or X-14868C by aerobic fermentation and recovery of the antibiotics formed in the fermentation medium, which method is characterized in that the microorganism is Actinomadura yumaense 20 ECTS Nov. breeds

Het antibioticum X-14868A heeft de structuur volgens de formule van het formuleblad, waarin R1 en R2 ieder een methylgroep voorstellen. Het symbool R staat in deze verbinding voor een waterstofatoom. Het ammoniumzout van deze verbinding is inmiddels onder de naam maduramicine. De brutoformule is ^47^80^17- 25 Het antibioticum X-14868C heeft de structuur volgens de formule van het formuleblad, waarin R en R1 ieder een waterstofatoom voorstellen en R2 een methylgroep voorsteft. De brutoformule van X-14868C is ^4β^7βΟΐ7·The antibiotic X-14868A has the formula formula formula, wherein R1 and R2 each represent a methyl group. The symbol R in this compound stands for a hydrogen atom. The ammonium salt of this compound is now under the name maduramicin. The gross formula is the antibiotic X-14868C has the structure of the formula sheet wherein R and R 1 each represent a hydrogen atom and R 2 represents a methyl group. The gross formula of X-14868C is ^ 4β ^ 7βΟΐ7 ·

Het antibioticum X-14868B is eveneens een polycyclische ether dat voldoet aan de formule van het formuleblad, waarin R, R1 en R2 ieder een methylgroep voorstellen. De brutoformule Is Ο^Η^,Ο^.The antibiotic X-14868B is also a polycyclic ether that satisfies the formula sheet formula, wherein R, R1 and R2 each represent a methyl group. The gross formula is Ο ^ Η ^, Ο ^.

30 De in de Europese octrooiaanvrage 35 119 genoemde antibiotica X-14868A, X-14868B en X-14868C hebben een optische rotatie [a]D in chloroform van resp. +40,6°, -1-46,1° en +49,6°. Zij kunnen volgens die publicatie worden verkregen door fermentatie van de stam Nocardia X-14868 ATCC 31585. Deze stam produceert een luchtmycelium van touwachtige plukjes, waarbij geen sporen werden aangetroffen; verder bevat de celwand arabinose. In beide opzichten verschilt de nieuwe Actinomadurasoori van deze 35 Nocardia-s&am. Ook het verbruik van koolstofbronnen is verschillend.The antibiotics X-14868A, X-14868B and X-14868C mentioned in European patent application 35 119 have an optical rotation [a] D in chloroform of resp. + 40.6 °, -1-46.1 ° and + 49.6 °. According to that publication, they can be obtained by fermentation of the strain Nocardia X-14868 ATCC 31585. This strain produces an aerial mycelium of rope-like tufts, where no traces were found; the cell wall also contains arabinose. The new Actinomadurasoori differs from these 35 Nocardias in both respects. The consumption of carbon sources is also different.

De antibiotica X-14868A, X-14868B en X-14868C zijn actief bevonden tegen een aantal gram-positieve bacteria, coccidiën en nemathoden. Zij worden ook gevormd tijdens het kweken onder beheerste omstandigheden van Actinomadura yamaense sp. nov., welke het voorwerp is van de onderhavige uitvinding.The antibiotics X-14868A, X-14868B and X-14868C have been found to be active against a number of gram-positive bacteria, coccidia and nemathodes. They are also formed during the cultivation under controlled conditions of Actinomadura yamaense sp. Nov., which is the subject of the present invention.

Een representatieve stam van dit micro-organisme werd geïsoleerd uit een in Yuma County, Arizona 40 verzameld bodemmonster en wordt bewaard in de cultuurverzameling van de Lerie Laboratories Division, American Cyanamid Company, Peart River, New York, onder cultuumummer X-14868. Een levenskrachtige cultuur van deze representatieve stam is gedeponeerd bij het Culture Collection Laboratory, Northern Regional Center, U S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, en is aan de permanente verzameling toegevoegd onder het toegangsnummer NRRL12515.A representative strain of this microorganism was isolated from a soil sample collected in Yuma County, Arizona 40 and is kept in the culture collection of the Lerie Laboratories Division, American Cyanamid Company, Peart River, New York, under cult number X-14868. A vigorous culture of this representative strain has been deposited at the Culture Collection Laboratory, Northern Regional Center, US Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, and has been added to the permanent collection under accession number NRRL12515.

4545

Taxonomische karakterisering van NRRL 12515Taxonomic characterization of NRRL 12515

De stam NRRL 12515 is taxonomisch gekarakteriseerd en geïdentificeerd als het type stam van een nieuwe soort van het genus Actinomadura aangeduid als Actinomadura yumaense sp. nov.The strain NRRL 12515 is taxonomically characterized and identified as the strain type of a new species of the genus Actinomadura referred to as Actinomadura yumaense sp. Nov.

Aan de cultuurkenmerken, fysiologische kenmerken en morfologische kenmerken van de representatieve 50 stam NRRL 12515 werden waarnemingen verricht onder toepassing van methoden van E.B. Shirting en D. Gottlieb, ’’Methods for characterization of Streptomyces species”, Internat J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966), en R.e. Gordon et at, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardin strain”, Internat J. Syst. Bacteriol. 24:54-63 (1974). in ait onderzoek toegepaste media werden gekozen uit de media, die aanbevolen waren door T.G. Pridham et al., ”A selection of media for maintenance and taxonomie study of 55 Streptomycetes”, Antibiotics Ann., biz. 947-953 (1956/1957); G.F. Gauze et at, ’’Problems in the classification of antagonistic actinomycetes”, State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Moscow (1957); en R.E. Gordon et al. (zie boven), voor het taxonomische onderzoek van actinomyceten en bodembacteriên.Observations were made on the cultural characteristics, physiological characteristics and morphological characteristics of the representative strain NRRL 12515 using methods of E.B. Shirting and D. Gottlieb, "Methods for characterization of Streptomyces species," Internat J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340 (1966), and R.e. Gordon et al, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardial strain," Internat J. Syst. Bacteriol. 24: 54-63 (1974). Media used in the study were selected from the media recommended by TG Pridham et al., "A selection of media for maintenance and taxonomy study of 55 Streptomycetes", Antibiotics Ann., biz. 947-953 (1956/1957); GF Gauze et at, "Problems in the classification of antagonistic actinomycetes", State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Moscow (1957), and RE Gordon et al. (See above), for the taxonomic investigation of actinomycetes and soil bacteria.

194396 2194396 2

De chemische samenstelling van de celwanden van het micro-organisme werd vastgesteld onder toepassing van de methode van H.A. Lechevalier et al., ’’Chemical composition as a criterion in the classification of actinomycetes”, Adv. Appl. Microbiol. 14: 47-72 (1971). Fosfolipidepatronen werden vastgesteld onder toepassing van de methode volgens M.P. Lechevalier et al., ’’Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: 5 phopholipid composition”, Biochem. Syst. Ecol. 5:249-260 (1977). Details zijn vermeld in de tabellen 1-6, en een algemene beschrijving van de cultuur wordt onderstaand gegeven. De onderstreepte beschrijvende kleuren zijn overgenomen van K.L. Kelly en D.B. Judd, "Color, Universal Language and Dictionar of Names”, U.S. Nat. Bur. Stand., Spec. Publ. 440, Washington, D.C. (1976) en de bijgaande Inter-Society Color Council, Natl. Bur. Stand. Centroid Color Charts.The chemical composition of the cell walls of the microorganism was determined using the method of H.A. Lechevalier et al., "Chemical composition as a criterion in the classification of actinomycetes," Adv. Appl. Microbiol. 14: 47-72 (1971). Phospholipid patterns were determined using the method according to M.P. Lechevalier et al., "Chemotaxonomy or aerobic actinomycetes: 5 phopholipid composition," Biochem. Syst. Ecol. 5: 249-260 (1977). Details are given in Tables 1-6, and a general description of the culture is given below. The underlined descriptive colors are taken from K.L. Kelly and D.B. Judd, "Color, Universal Language and Dictionar of Names," US Nat. Bur. Stand., Spec. Publ. 440, Washington, DC (1976) and the accompanying Inter-Society Color Council, Natl. Bur. Stand. Centroid Color Charts.

10 De voor deze nieuwe soort, zoals vertegenwoordigd door de stam NRRL 12515, waargenomen gegevens kunnen vergeleken worden met de gegevens die gepubliceerd zijn voor de bekende soorten van het genus Actinomadura (M. Goodfellow et al., ’’Numerical Taxonomy of Actinomadura and related actinomycetes”, J. Gen. Microbiol. 122: 95-111 (1979); L.H. Huang, ’’Actinomadura macra sp. nov., the producer of antibiotic CP-47,433 en CP-47,434", Internat. J. Syst. Bacteriol. 30:565-568 (1980); J. Meyer, "New species of the 15 genus Actinomadura", Z. Allgem. Mikrobiol. 19: 37-44 (1979); H. Nomura en Y. Ohara, ’’Distribution of actinomycetes in soil. XI. Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier, et al.”, J. Ferment. Technol. 49: 904-912 (1971); en T.P. Preobrazhenskaya et al„ ’’Key for identification of the species of the genus Actinomadura”, The Biology of Actinomycetes and Related Organisms 12:30-38 (1977)). De cultuur NRRL 12515 heelt een geringe gelijkenis met Actinomadura pelletieri, maar lijkt op geen enkele andere 20 beschreven soort en verschilt in een aantal eigenschappen van A. pelletieri. Daarom is stam NRRL 12515 als de typestam aangeduid van een nieuwe soort, geheten Actinomadura yumaense, sp. nov., genoemd naar de verzamelplaats van het bodemmonster waaruit de type stam was geïsoleerd.The data observed for this new species, as represented by the strain NRRL 12515, can be compared with the data published for the known species of the genus Actinomadura (M. Goodfellow et al., Numerical Taxonomy of Actinomadura and related actinomycetes, "J. Gen. Microbiol. 122: 95-111 (1979); LH Huang," Actinomadura macra sp. Nov., the producer of antibiotic CP-47.433 and CP-4734 ", Internat. J. Syst. Bacteriol 30: 565-568 (1980), J. Meyer, "New species of the genus Actinomadura", Z. Allgem Mikrobiol. 19: 37-44 (1979), H. Nomura and Y. Ohara, Distribution. or actinomycetes in soil XI. Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier, et al. ", J. Ferment. Technol. 49: 904-912 (1971); and TP Preobrazhenskaya et al." "Key for identification of the species of the genus Actinomadura ”, The Biology of Actinomycetes and Related Organisms 12: 30-38 (1977). The culture NRRL 12515 has a slight resemblance to Actinomadura pelletieri, but does not resemble any other species described and differs in a number of properties from A. pelletieri. Therefore, strain NRRL 12515 is designated as the type strain of a new species, called Actinomadura yumaense, sp. Nov., named after the collection site of the soil sample from which the strain type was isolated.

Micromorfoiogie 25 Sporen worden gevormd in korte spiraalketens (maximale lengte ongeveer 20 sporen per keten) op verlakte, nagenoeg kransstandige luchtsporoforen. De sporen zijn eivormig, 0,6-0,8 pm bij 1,0 tot 1,4 pm, met een glad oppervlak.Micro-morphology Tracks are formed in short spiral chains (maximum length about 20 tracks per chain) on lacquered, almost wreath-like aerial tracks. The spores are egg-shaped, 0.6-0.8 µm at 1.0 to 1.4 µm, with a smooth surface.

Celwandsamenstelling 30 Hydrolysaten van hele cellen van deze cultuur bevatten madurose (3-0-methyl-D-galactose) en het meso-isomeer van diaminopimelinezuur (DAP). De cultuur heeft ook een type P-1 fosfollpidepatroon en geen ander diagnostisch fosfolipide dan enig fosfatidylglycerol. Deze eigenschappen zijn alle zeer typerend voor leden van het genus Actinomadura.Cell wall composition Whole cell hydrolysates of this culture contain madurose (3-O-methyl-D-galactose) and the meso isomer of diaminopimelic acid (DAP). The culture also has a type P-1 phospholpid pattern and no diagnostic phospholipid other than any phosphatidyl glycerol. These traits are all very typical of members of the genus Actinomadura.

35 Hoeveelheid groei35 Amount of growth

Een goede groei wordt waargenomen op Bennett’s agar, Gauze No. 2 agar, NZ-amine-zetmeel-glucose-agar (ATCC medium 172), tomatenpuree-havermeel-agar, en gistextract-moutextract-agar; matige groei werd waargenomen op Benedict’s agar, Czapek's sucrose-agar, glycerol-asparagine-agar, Hickey-Tresner-agar, en havermeel-agar; slechte groei wordt waargenomen op calciummalaat-agar, Gauze No. 1 agar, en 40 anorganische zouten-zetmeel-agar.Good growth is observed on Bennett’s agar, Gauze No. 2 agar, NZ amine starch glucose agar (ATCC medium 172), tomato puree oatmeal agar, and yeast extract malt extract agar; moderate growth was observed on Benedict's agar, Czapek's sucrose agar, glycerol asparagine agar, Hickey-Tresner agar, and oatmeal agar; poor growth is observed on calcium malate agar, Gauze No. 1 agar, and 40 inorganic salt-starch agar.

Vegetatief myceliumVegetative mycelium

Op media waarop een goede groei plaats vond, werd waargenomen, dat het vegetatieve mycelium omhoog kwam en zich oprolde, en dat het in het algemeen, gelig-grijze kleurnuances had.On media on which good growth took place, it was observed that the vegetative mycelium was rising and rolling up, and that it generally had yellowish-gray hues.

4545

Luchtmycelium en sporenkleurAerial mycelium and spore color

De luchtmycelia en/of de sporenmassa’s hadden een witte tot 264 lichtgrijze kleur. De luchtmycelia-productie is op de meeste media licht.The aerial mycelia and / or the trace masses had a white to 264 light gray color. The aerial mycelia production is light on most media.

50 Oplosbare pigmenten50 Soluble pigments

Afwezig op vele media; geel pigment op Benedict’s en glycerol-asparagine-agars; geel-groen pigment op calciummalaat-agar, groenig-bruin pigment op NZ-amine-zetmeel-glucose-agar; oranje pigment op Bennett’s en gistextract-moutextract-agars. 1 iAbsent on many media; yellow pigment on Benedicts and glycerol asparagine agars; yellow-green pigment on calcium malate agar, greenish-brown pigment on NZ amine starch glucose agar; orange pigment on Bennett’s and yeast extract-malt extract-agars. 1 i

Fysiologische reactiesPhysiological reactions

Geen melaninepigmenten op pepton-ijzer-agar en tyrosine-agar (ISO-7); sterke peptonisatie van lakmoes-melk; sterke proteolyse van voedingsgelatine; matige reductie van nitraat; geen hydrolyse van adenine of 3 194396 guanine; sterke hydrolyse van hypoxanthine, tyrosine en xanthine; zwakke hydrolyse van zetmeel; hydrolyse van esculine; variabele hydrolyse van ureum. Geen groei bij 4°C, 10°C of 55°C; matige groei bij 25°C en 45°C; goede groei bij 32DC en 37°C. Koolhydraatgebruik, zoals bepaald met de methode volgens T.G. Pridham en D. Gottlieb, ’The utilization of carbon compounds by some actinomycetales as an aid for 5 species determination", J. Bacteriol. 56:107-114 (1948): goed gebruik van glucose, glycerol en trehalose; matig gebruik van maltose en sucrose; slecht gebruik van fructose, galactose, inositol, mannose, en melezitose; geen gebruik van adonitol, arabinose, dulcitol, lactose, mannitol, melibiose, raffinose, rhamnose, salicine, sorbitol en xylose. Zuurproductie uit koolhydraten volgens de methode van Gordon, et al., (zie boven): goede zuurproductie uit glucose, glycerol, maltose, sucrose en trehalose; zwakke zuurproductie uit 10 galactose, inositol en mannose. Gebruik vein organische zuren volgens de methode van Gordon et al., (zie boven): gebruik van acetaat, malaat, propionaat, pyruvaat, succinaat en tartraat; geen gebruik van benzoaat, citraat, lactaat, mucaat en oxalaat TABEL 1 15---No melanin pigments on peptone-iron agar and tyrosine agar (ISO-7); strong peptonization of litmus milk; strong proteolysis of diet gelatin; moderate reduction of nitrate; no hydrolysis of adenine or 3 194396 guanine; strong hydrolysis of hypoxanthine, tyrosine and xanthine; weak hydrolysis of starch; hydrolysis of esculin; variable hydrolysis of urea. No growth at 4 ° C, 10 ° C or 55 ° C; moderate growth at 25 ° C and 45 ° C; good growth at 32 ° C and 37 ° C. Carbohydrate use, as determined by the method according to T.G. Pridham and D. Gottlieb, "The utilization of carbon compounds by some actinomycetals as an aid for 5 species determination", J. Bacteriol. 56: 107-114 (1948): good use of glucose, glycerol and trehalose; moderate use of maltose and sucrose; poor use of fructose, galactose, inositol, mannose, and melezitose; no use of adonitol, arabinose, dulcitol, lactose, mannitol, melibiosis, raffinose, rhamnose, salicin, sorbitol and xylose. Acid production from carbohydrates according to the Gordon method , et al. (see above): good acid production from glucose, glycerol, maltose, sucrose and trehalose; weak acid production from galactose, inositol and mannose. Use organic acids according to the method of Gordon et al., (see above) : use of acetate, malate, propionate, pyruvate, succinate and tartrate, no use of benzoate, citrate, lactate, mucate and oxalate TABLE 1 15 ---

Cultuurkenmerken van Actinomadura yumaense NRRL12515Cultural characteristics of Actinomadura yumaense NRRL12515

Incubatie: 14 dagen Temperatuur 28°CIncubation: 14 days Temperature 28 ° C

Medium Hoeveelheid Luchtmyce- Oplosbaar Reverse kleur 20 groei lium en/of pigment sporenMedium Amount Air Myce - Soluble Reverse color 20 growth lium and / or pigment spores

Benedict's agar matig tot platte, gelig 89. lichtgeel 25 slecht poederach tige kolonies; luchtmycelia wit tot 264. lichtgrijs 30 Bennett’s agar goed geen oranje 81. donkergrijs luchtmycelia; gelig bruin opgerolde vegetatieve groei 93.Benedict's agar moderate to flat, yellowish 89. pale yellow poorly powdery colonies; aerial mycelia white to 264. light gray 30 Bennett's agar good no orange 81. dark gray aerial mycelia; yellowish brown rolled up vegetative growth 93.

35 gelig grijs tot 80. grijzig gelig bruin calciummalaat-agar slecht platte groei; geelgroen 90. groenig schaarse geel 40 witte luchtmycelia35 yellowish gray to 80. grayish yellowish brown calcium malate agar poor flat growth; yellow green 90. greenish scarce yellow 40 white mycelia

Czapek’s sucrose-agar slecht tot platte groei; geen 89. lichtgeel matig matige luchtmycelia 45 vegetatieve groei 90. grijzig geelCzapek's sucrose agar poor to flat growth; none 89. pale yellow moderate moderate aerial mycelia 45 vegetative growth 90. grayish yellow

Gauze No. 1 agar slecht kleurloze geen kleurloos platte groei; 50 schaarse witte luchtmycelia 194396 4 TABEL 1 (vervolg)Gauze No. 1 agar poor colorless no colorless flat growth; 50 scarce white aerial mycelia 194396 4 TABLE 1 (continued)

Cultuurkenmerken van Actinomadura yumaense NRRL 12515 5 Gauze No. 2 agar goed omhooggeko- geen 72. donker men oranje-geel opgerolde kolonies; vegetatieve 10 mycelia 93.Cultural characteristics of Actinomadura yumaense NRRL 12515 5 Gauze no. 2 agar well raised 72. colonies dark orange-yellow rolled up; vegetative mycelia 93.

gelig grijs; matige luchtmycelia, 92. gelig wit 15 glycerolasparagine-agar slecht tot platte, geel 89. lichtgeel matig poederach tige kolonies; witte luchtmycelia 20 Hickey-Tresner-agar matig platte geen 90 grijzig geel wasachtige kolonies; 90. grijzig geel; schaarse 25 luchtmycelia, wit tot 264. lichtgrijs anorganische zouten-zetmeel- slecht platte, geen kleurloos agar kleurloze, 30 poederach- tige kolonies; witte luchtmycelia NZ-amine-zetmeel-glucose-agar goed sterk groenig bruin 78. donker 35 opgerolde geligbruin groei, 61. grijzig gelig bruin tot 65. bruinig zwart 40 matige luchtmycelia, wit tot 264. lichtgrijs havermeel-agar matig platte geen 90. grijzig geel 45 wasachtige groei, 90. grijzig geel; matige luchtmycelia, 50 wit 5 194396 TABEL 1 (vervoig)yellowish gray; moderate aerial mycelia, 92. yellowish white glycerol paragin agar poor to flat, yellow 89. pale yellow moderate powdery colonies; white aerial mycelia 20 Hickey-Tresner agar moderately flat none 90 grayish yellow waxy colonies; 90. grayish yellow; scarce air mycelia, white to 264. light gray inorganic salts-starch-poorly flat, no colorless agar colorless, powdery colonies; white aerial mycelia NZ amine starch glucose agar good strong greenish brown 78. dark 35 rolled-up yellowish brown growth, 61. grayish yellowish brown to 65. brownish black 40 moderate aerial mycelia, white to 264. light gray oatmeal agar moderately flat none 90. grayish yellow 45 waxy growth, 90. grayish yellow; moderate aerial mycelia, 50 white 5 194396 TABLE 1 (transport)

Cultuurkenmerken van Actinomadura yumaense NRRL12515 5 tomatenpasta-havermeel-agar goed platte geen 90. grijzig geel wasachtige groei; 91. donker grijzig geel; spoor 10 van witte iuchtmyceiia gistextract-moutextract-agar goed omhooggeko- oranje 78. donker men, gelig bruin wasachtige, 15 opgerolde kolonies, 93. gelig grijs tot 80. grijzig gelig bruin; 20 geenCultural characteristics of Actinomadura yumaense NRRL12515 5 tomato paste oatmeal agar good flat none 90. grayish yellow waxy growth; 91. dark grayish yellow; trace 10 of white air myceia yeast extract-malt extract agar well-up 78. dark, yellowish-brown waxy, rolled-up colonies, 93. yellowish gray to 80. grayish yellowish brown; 20 none

Iuchtmyceiia TABEL 2 25 Micromorfologie van Actinomadura yumaense NRRL 12515Air myceia TABLE 2 25 Micromorphology of Actinomadura yumaense NRRL 12515

Medium Luchtmyce- Sporenvorm Sporen· Sporen- lium en/of grootte oppervlak sporen- 30 dragende structurenMedium Air myce - Trace shape Traces · Traceium and / or surface area bearing structures

Czapek’s sucrose-agar luchtsporofo- eivormig 0,6-0,8 pm glad ren; vertakt, x bijna 1,0-1,4 pm 33 kransstandig; dragen betrekkelijk korte spiraalketens 40 van rijpe sporen 1 TABEL 3Czapek's sucrose-agar air-sporoidal 0.6-0.8 µm smooth; branched, x nearly 1.0-1.4 µm 33 crowned; carry relatively short spiral chains 40 of mature spores 1 TABLE 3

Fysiologische reacties van Actinomadura yumaense NRRL 12515 gQ Medium Incubatieperiode Hoeveelheid Fysiologische groei reactie pepton-ijzer-agar 7 dagen goed lichte bruinkleuring 14 dagen goed lichte bruinkleuring tyrosine-agar 7 dagen matig geen pigment gg 14 dagen goed gelig pigment lakmoesmelk 14 dagen goed goede peptonisatiePhysiological reactions of Actinomadura yumaense NRRL 12515 gQ Medium Incubation period Quantity Physiological growth reaction pepton-iron-agar 7 days good light brown coloring 14 days good light brown coloring tyrosine agar 7 days moderate no pigment gg 14 days good yellowish pigment litmus milk 14 days good good peptonization

, ' I, "I

194396 6 TABEL 3 (vervolg)194396 6 TABLE 3 (continued)

Fysiologische reacties van Actinomadura yumaense NRRL 12515 5 28 dagen goed sterke peptonisatie voedingsgelatine 14 dagen goed lichte proteolyse 28 dagen goed totale proteolyse nitraatmedium 14 dagen goed zeer zwakke reductie 10 28 dagen goed matige reductie adenine-agar 14 dagen goed geen hydrolyse 21 dagen goed geen hydrolyse guanine-agar 14 dagen goed geen hydrolyse 21 dagen goed geen hydrolyse 15 hypoxanthine-agar 14 dagen goed totale hydrolyse 21 dagen goed totale hydrolyse tyrosine-agar 14 dagen goed sterke hydrolyse 21 dagen goed sterke hydrolyse xanthine-agar 14 dagen goed matige hydrolyse 20 21 dagen goed sterke hydrolyse NZ-amine met oplosbare zetmeel en 5 dagen slechte of geen groei bij 4°C, 10°C en glucose-agar (ATCC Med. No. 172) 55°C; matige groei bij 25eC; 28eC enPhysiological reactions of Actinomadura yumaense NRRL 12515 5 28 days good strong peptonization food gelatin 14 days good light proteolysis 28 days good total proteolysis nitrate medium 14 days good very weak reduction 10 28 days good moderate reduction adenine agar 14 days good no hydrolysis 21 days good no hydrolysis guanine agar 14 days good no hydrolysis 21 days good no hydrolysis 15 hypoxanthine agar 14 days good total hydrolysis 21 days good total hydrolysis tyrosine agar 14 days good strong hydrolysis 21 days good strong hydrolysis xanthine agar 14 days good moderate hydrolysis 20 21 good hydrolysis days of NZ amine with soluble starch and 5 days of poor or no growth at 4 ° C, 10 ° C and glucose agar (ATCC Med. No. 172) 55 ° C; moderate growth at 25 ° C; 28 ° C and

45°C; goede groei bij 32°C en 37°C45 ° C; good growth at 32 ° C and 37 ° C

ureummedium 28 dagen goed ontleding variabel 25 esculinemedium 14 dagen goed hydrolyse 28 dagen goed hydrolyse zetmeel-agar 5 dagen goed geen hydrolyse 10 dagen goed geen hydrolyse 30 TABEL 4urea medium 28 days good decomposition variable 25 esculin medium 14 days good hydrolysis 28 days good hydrolysis starch-agar 5 days good no hydrolysis 10 days good no hydrolysis 30 TABLE 4

Verbruik van koolstofbronnen door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op ISP-9 koolhydraatmediumConsumption of carbon sources by Actinomadura yumaense NRRL 12515 on ISP-9 carbohydrate medium

Incubatie: 28 dagen Temperatuur. 28°CIncubation: 28 days Temperature. 28 ° C

35 Koolstofbron Gebruik adonitol l-arabinose dulcitol - fructose slecht *0 d-galactose slecht d-glucose goed glycerol goed35 Carbon source Use adonitol l-arabinose dulcitol - fructose bad * 0 d-galactose bad d-glucose good glycerol good

Hnositol slecht lactose 45 matose redelijk d-mannitol d-mannose slecht d-melezitose slecht d-melibiose 50 d-raffinose l-rhamnose salidne sorbitol sucrose redelijk 33 d-trehalose goed 7 194396 TABEL 4 (vervolg)Hnositol poor lactose 45 matose reasonable d-mannitol d-mannose poor d-melezitose poor d-melibiosis 50 d-raffinose l-rhamnose salidne sorbitol sucrose reasonable 33 d-trehalose good 7 194396 TABLE 4 (continued)

Verbruik van koolstofbronnen door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op ISP-9 koolhydraatmedium 5 d-xylose - negatieve controle ~ TABEL 5 10 Zuurproductie uit verscheidene koolhydraten door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op Gordon's basaal anorganisch stikstofmediumConsumption of carbon sources by Actinomadura yumaense NRRL 12515 on ISP-9 carbohydrate medium 5 d-xylose - negative control ~ TABLE 5 10 Acid production from various carbohydrates by Actinomadura yumaense NRRL 12515 on Gordon's basic inorganic nitrogen medium

Incubatie: 28 dagen Temperatuur 28°CIncubation: 28 days Temperature 28 ° C

Koolstofbron Zuurproductie 15 7 dagen 28 dagen adonitol - “ l-arabinose - - duldtol - - fructose - - 20 d-galactose - + d-glucose +++ +++ glycerol ++ +++ i-inositol - + lactose 25 maltose - +++ d-mannitol - - d-mannose - + d-melezltose - - d-melibiose 30 d-raffinose - - l-rhamnose - - salidne - - sorbitol - - sucrose - +++ 35 d-trehalose - +++ d-xylose negatieve controle 40 +++ = sterk positieve respons ++ = matige positieve respons + = geringe positieve respons — - negatieve respons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 TABEL 6 2 j. _ 3Carbon source Acid production 15 7 days 28 days adonitol - “l-arabinose - - duldtol - - fructose - - 20 d-galactose - + d-glucose +++ +++ glycerol ++ +++ i-inositol - + lactose 25 maltose - +++ d-mannitol - - d-mannose - + d-melezltose - - d-melibiosis 30 d-raffinose - - l-rhamnose - - salidne - - sorbitol - - sucrose - +++ 35 d-trehalose - + ++ d-xylose negative control 40 +++ = strong positive response ++ = moderate positive response + = low positive response - - negative response 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 TABLE 6 2 y. _ 3

Gebruik van organische zuren door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op Gordon’s modificatie van 4Use of organic acids by Actinomadura yumaense NRRL 12515 on Gordon's modification of 4

Koser's basaal agar (Koser’s cltraatagar) 5 _____ — 6Koser's basic agar (Koser's clatata tagar) 5 _____ - 6

Incubatie: 28 dagen Temperatuur 28°CIncubation: 28 days Temperature 28 ° C

77

Koolstofbron Gebruik 8 acetaat + 9 benzoaat 10 citraat 11 lactaat malaat + 194396 8 TABEL 6 (vervolg)Carbon source Use 8 acetate + 9 benzoate 10 citrate 11 lactate malate + 194396 8 TABLE 6 (continued)

Gebruik van organische zuren door Actinomadura yumaense NRRL 12515 op Gordon's modificatie van Koser*s basaal agar (Koser’s citraatagar) 5 --- slijmzuur oxalaat propionaat + pyruvaat + 10 sucdnaat + tartraat + + = positieve respons - = negatieve respons 15 Opgemerkt wordt dat de term Actinomadura yumaense niet beperkt is tot de stam Actinomadura yumaense NRRL 12515 of tot stammen die volledig aan de bovenstaande groeikarakteristieken en microscopische karakteristieken beantwoorden, die slechts ter toelichting zijn gegeven. De hier beschreven Actinomadura yumaense omvat alle stammen van Actinomadura yumaense die de antibiotica X-14868A, B en C produceren en die qua groeikarakteristieken en microscopische karakteristieken niet scherp kunnen worden 20 onderscheiden van Actinomadura yumaense NRRL 12515 en zijn subculturen, waaronder mutanten en varianten daarvan. De term "mutanten” omvat de natuurlijke (spontane) mutanten van dit organisme alsmede geïnduceerde mutanten die uit dit organisme zijn verkregen door mutagene middelen die aan de deskundigen bekend zijn, waaronder blootstelling aan röntgenstraling, ultraviolette straling, stikstofmosterd, actinofagen en nitrosaminen. Het wordt eveneens gewenst en beoogd dat inter- en intra-spedfieke 25 genetische recombinanten worden omvat, die door aan de deskundigen bekende genetische technieken zijn verkregen, bijvoorbeeld door conjugatie, transductie en genetische manipulatietechnieken.Use of organic acids by Actinomadura yumaense NRRL 12515 on Gordon's modification of Koser * s basic agar (Koser's citrate agar) 5 --- slime acid oxalate propionate + pyruvate + 10 sucdnate + tartrate + + = positive response - = negative response 15 It is noted that the term Actinomadura yumaense is not limited to the strain Actinomadura yumaense NRRL 12515 or to strains that fully meet the above growth characteristics and microscopic characteristics, which are given for illustrative purposes only. The Actinomadura yumaense described here includes all strains of Actinomadura yumaense that produce the antibiotics X-14868A, B and C and which cannot be distinguished sharply from Actinomadura yumaense NRRL 12515 and its subcultures, including mutants and variants thereof. The term "mutants" includes the natural (spontaneous) mutants of this organism as well as induced mutants derived from this organism by mutagenic agents known to those skilled in the art, including exposure to X-rays, ultraviolet radiation, nitrogen mustard, actinophages and nitrosamines. also desirable and contemplated to include inter- and intra-specific genetic recombinants obtained by genetic techniques known to those skilled in the art, for example, by conjugation, transduction, and genetic engineering techniques.

Het kweken van Actinomadura yumaense kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid van vaste of vloeibare cultuurmedia. Media die voor de productie van de antibiotica X-14868A, B en C bruikbaar zijn, omvatte een assimileerbare bron van stikstof zoals eiwit, eiwithydrolysaat, polypeptiden, aminozuren, 30 maïsweekvloeistof, enz., en anorganische anionen en kationen, zoals kalium, natrium, ammonium, calcium, sulfaat, carbonaat, fosfaat, chloride enz. Sporenelementen zoals boor, molybdeen, koper enz. worden als verontreinigingen van andere bestanddelen van de media toegevoerd. Beluchting in tanks en flessen wordt gerealiseerd door steriele lucht door of op het oppervlak van het fermentatiemedium te leiden. Een mechanische roerder zorgt voor verdere agitatie in tanks. Naar behoefte kan een antischuimmiddel zoals 35 varkensreuzelolie of een siliconenontschuimer worden toegevoegd.Culturing Actinomadura yumaense can be performed with a variety of solid or liquid culture media. Media useful for the production of antibiotics X-14868A, B and C included an assimilable source of nitrogen such as protein, protein hydrolyzate, polypeptides, amino acids, corn soaking fluid, etc., and inorganic anions and cations such as potassium, sodium, ammonium, calcium, sulfate, carbonate, phosphate, chloride, etc. Trace elements such as boron, molybdenum, copper, etc. are supplied as contaminants to other components of the media. Aeration in tanks and bottles is achieved by passing sterile air through or on the surface of the fermentation medium. A mechanical stirrer ensures further agitation in tanks. An anti-foaming agent such as pork lard oil or a silicone defoamer can be added as required.

Actinomadura yumaense wordt gekweekt en bewaard op schuine agar, bijvoorbeeld Bennett’s agar, gistmoutagar, of ATCC medium 172. ATCC medium 172 heeft de voorkeur. De agar wordt geënt met een cultuur van Actinomadura yumaense en bij 28-37°C, bij voorkeur bij ongeveer 32°C, gedurende ongeveer 7 dagen geïncubeerd. Deze uitgangsculturen kunnen door serie-overbrengingen op verse agar worden 40 bewaard, of er kan een hoeveelheid agar met mycelia van de goed begroeide agar worden gebruikt voor het enten van vloeibare media.Actinomadura yumaense is grown and stored on oblique agar, for example Bennett's agar, yeast malt agar, or ATCC medium 172. ATCC medium 172 is preferred. The agar is inoculated with a culture of Actinomadura yumaense and incubated at 28-37 ° C, preferably at about 32 ° C, for about 7 days. These starting cultures can be stored on fresh agar by serial transfers, or an amount of mycelia agar from the well-grown agar can be used to inoculate liquid media.

Entmateriaal voor schudflessen van Actinomadura yumaense wordt bereid door 100 cm9 steriel vloeistofmedium in 500 cm3 flessen in te enten met door schrapen of wassen van een agarcultuur verkregen sporen. Voorbeelden van geschikte entmedla zijn: 45Grafting material for Actinomadura yumaense shake is prepared by inoculating 100 cm 3 of sterile liquid medium into 500 cm 3 bottles with spores obtained by scraping or washing an agar culture. Examples of suitable graft medla are: 45

Medium AMedium A

rundvleesextract 0,3% 50 Bacto® trypton1 0,5% glucose 1.0% gistextract 0,5% water q.s. 100% 55 (1 een pepton, merkproduct van Difco Laboratories, Detroit, Michigan.)beef extract 0.3% 50 Bacto® trypton1 0.5% glucose 1.0% yeast extract 0.5% water q.s. 100% 55 (1 a peptone, branded product from Difco Laboratories, Detroit, Michigan.)

De pH wordt met een verdunde base, b.v. natriumhydroxide ingesteld op 6,8-7,2.The pH is adjusted with a diluted base, e.g. sodium hydroxide set to 6.8-7.2.

g 194396194396 g

Medium BMedium B

glucose 1% zetmeel 2% 5 gistextract 0,5% N-Z amine A®2 0,5% calciumcarbonaat 0,1% water 100% 10 (2 Caseïne digest, merkproduct van Sheffield Chemical Co., Div. Naf1 Dairy Products Corp., Norwich, N.Y.)glucose 1% starch 2% 5 yeast extract 0.5% NZ amine A®2 0.5% calcium carbonate 0.1% water 100% 10 (2 Casein digest, branded product of Sheffield Chemical Co., Div. Naf1 Dairy Products Corp., Norwich, NY)

Medium B heeft de voorkeur.Medium B is preferred.

De flessen worden bij een temperatuur van 25-35°C, bij voorkeur bij 32°C geïncubeerd en gedurende 1-4 dagen krachtig geschud op een roterende schudmachine. Dit entmateriaal wordt daarna gebruikt voor het beênten van een fermentatiecultuur; ook kan deze cultuur worden bevroren en bewaard om entmateriaal 15 voor latere entculturen te verschaffen.The bottles are incubated at a temperature of 25-35 ° C, preferably at 32 ° C and shaken vigorously on a rotary shaker for 1-4 days. This seeding material is then used to inoculate a fermentation culture; this culture can also be frozen and stored to provide seed material for later seed cultures.

De volgende media zijn voorbeelden van media die geschikt zijn voor de fermentatie van Actinomadura yumaense voor de productie van de antibiotica X-14868A, B en C.The following media are examples of media suitable for the fermentation of Actinomadura yumaense for the production of the antibiotics X-14868A, B and C.

20 Medium CMedium C

glucose 1,5% glycerol 1,5% sojameel3 1,5% 25 calciumcarbonaat 0,1% natriumchloride 0,3% water q.s. 100% (3 Kan worden vervangen door katoenzaadmeel of oplosbare vleesbestanddelen met gelijk effect.) 30glucose 1.5% glycerol 1.5% soybean meal3 1.5% calcium carbonate 0.1% sodium chloride 0.3% water q.s. 100% (3 Can be replaced with cottonseed flour or soluble meat components with equal effect.) 30

Medium DMedium D

glucose 3% 35 sojameel 1,5% calciumcarbonaat 0,1% natriumchloride 0,3% water q.s. 100% 40glucose 3% 35 soybean meal 1.5% calcium carbonate 0.1% sodium chloride 0.3% water q.s. 100% 40

Medium EMedium E

zetmeel 1% melasse 2% 45 sojameel 1,5% calciumcarbonaat 0,1% water q.s. 100% 1starch 1% molasses 2% 45 soybean meal 1.5% calcium carbonate 0.1% water q.s. 100% 1

Medium FMedium F

glucose 3% oplosbare vleesbestanddelen 2,5% natriumchloride 0,2% 55 calciumcarbonaat 0,1% water q.s. 100% 194396 10glucose 3% soluble meat components 2.5% sodium chloride 0.2% 55 calcium carbonate 0.1% water q.s. 100% 194396 10

Medium GMedium G

glucose 3% 5 sojameel 0,5% ammoniumsuHaat 0,3% natriumchloride 0,2% calciumcarbonaat 0,1% 10 MediumH ,00% glucose 3% ammoniumsuHaat 0,3% dibasisch kaliumfosfaat 0,1% 15 natriumchloride 0,2% calciumcarbonaat 0,1% water q.s. 100%glucose 3% 5 soybean meal 0.5% ammonium sulphate 0.3% sodium chloride 0.2% calcium carbonate 0.1% 10 MediumH, 00% glucose 3% ammonium sulphate 0.3% dibasic potassium phosphate 0.1% sodium chloride 0.2% calcium carbonate 0.1% water qs 100%

Medium D heeft de voorkeur.Medium D is preferred.

20 De fermentatie kan worden uitgevoerd in 100 cm3 media in een 500 cm3 fles, die beënt is met 3-10% (v/v) van een op de bovenstaand beschreven wijze bereide eetcultuur en gedurende 24-72 uren onder beluchting geïncubeerd bij 25-35°C, bij voorkeur bij ongeveer 32°C. Monsters van de fermentatiecuituur kunnen worden ingevroren en bewaard voor later gebruik als entmateriaal voor entculturen.The fermentation can be carried out in 100 cm 3 of media in a 500 cm 3 bottle inoculated with 3-10% (v / v) of a food culture prepared as described above and incubated for 24-72 hours under aeration at 25- 35 ° C, preferably at about 32 ° C. Samples from the fermentation culture can be frozen and stored for later use as seeding material for seed cultures.

Anderzijds kan de fermentatie worden uitgevoerd in grotere fermentatietanks, die voorzien zijn van 25 beluchtings- en agitatiemiddelen.On the other hand, the fermentation can be carried out in larger fermentation tanks, which are provided with aeration and agitation agents.

Elke tank wordt beënt met 3-10% (v/v) entmateriaal, dat op de bovenstaand beschreven wijze is bereid. Er wordt belucht met een snelheid van 0,5-2,0 dm3 steriele lucht per dm3 fermentatiemedium per minuut en het fermentatiemedium wordt door een roerder met een toerental van 200-400 omw./min. geroerd. De temperatuur wordt gehouden op 25-35°C, bij voorkeur op 32°C. De fermentatie wordt voortgezet totdat 30 antibioticum zich in het fermentatiemedium ophoopt, gewoonlijk na 100-150 uren, waarna het antibioticum wordt geoogst.Each tank is inoculated with 3-10% (v / v) grafting material prepared in the manner described above. Aeration is carried out at a rate of 0.5-2.0 dm3 of sterile air per dm3 of fermentation medium per minute and the fermentation medium is passed through a stirrer at a speed of 200-400 rpm. stirred. The temperature is kept at 25-35 ° C, preferably at 32 ° C. The fermentation is continued until antibiotic accumulates in the fermentation medium, usually after 100-150 hours, after which the antibiotic is harvested.

Het antibioticum kan worden geoogst en gezuiverd overeenkomstig de in het Amerikaanse octrooischrift 4.278.663 beschreven methoden, of overeenkomstig de volgende procedure:The antibiotic can be harvested and purified according to the methods described in U.S. Patent No. 4,278,663, or according to the following procedure:

Het ruwe fermentatiemengsel, dat de hele cellen bevat, bereid op de bovenstaand beschreven wijze, 35 wordt gemengd met een gelijke volumehoeveelheid van een met water niet mengbaar organisch oplosmiddel. De voorkeur hebben methyleenchloride en ethylacetaat. De organische fase wordt afgescheiden en onder verminderde druk geconcentreerd tot een olieachtige siroop.The crude fermentation mixture, which contains whole cells prepared in the manner described above, is mixed with an equal volume amount of an organic solvent immiscible with water. Preferred are methylene chloride and ethyl acetate. The organic phase is separated and concentrated under reduced pressure to an oily syrup.

De olieachtige siroop wordt opgelost in methyleenchloride en toegevoegd aan een kolom van silicagel, alumina, Sephadex LH-20® (Pharmacia Fine Chemicals Div. van Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.), of 40 magnesiumaluminiumsilicaat. Voorbeelden van geschikte oplosmiddel voor het ontwikkelen van de kolom zijn diëthylether, ethylacetaat en mengsels van methyleenchloride met diêthylether, aceton, lagere alcohol (de voorkeur heeft methanol), acetonitril of dioxaan. Methyleenchloride: ethylacetaat 1:1 (v/v) heeft de voorkeur. Fracties worden verzameld en gecontroleerd op de aanwezigheid van antibacteriêle werkzaamheid door bioanalyse tegen een gevoelig organisme, b.v. Bacillus subtills. Actieve fracties worden gecombi-45 neerd en onder verminderde druk geconcentreerd tot een residu. Dit residu wordt opgelost In een organisch oplosmiddel, b.v. tert-butanol (geprefereerd), kenzeen, of p-dioxaan, en gevriesdroogd.The oily syrup is dissolved in methylene chloride and added to a column of silica gel, alumina, Sephadex LH-20® (Pharmacia Fine Chemicals Div. Of Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.), or 40 magnesium aluminum silicate. Examples of suitable solvents for developing the column are diethyl ether, ethyl acetate and mixtures of methylene chloride with diethyl ether, acetone, lower alcohol (preferred is methanol), acetonitrile or dioxane. Methylene chloride: ethyl acetate 1: 1 (v / v) is preferred. Fractions are collected and checked for the presence of antibacterial activity by bioanalysis against a sensitive organism, e.g. Bacillus subtills. Active fractions are combined and concentrated under reduced pressure to a residue. This residue is dissolved in an organic solvent, e.g. tert-butanol (preferred), kenzene, or p-dioxane, and freeze-dried.

De gevriesdroogde vaste stof wordt opgelost in een geschikt organisch oplosmiddel, bijv. methyleenchloride, hexaan, methyleenchloride: ethylacetaat, diêthylether, hexaan: ethylacetaat, hexaan: chloroform, of hexaan: ether. Diëthylether heeft de voorkeur. Deze oplossing wordt geschud met water en de pH wordt 50 ingesteld op 1,5-4,0, bij voorkeur ongeveer 2,5, met een willekeurig verdund anorganisch zuur. De organische fase wordt afgescheiden, gewassen met water om eventuele overmaat zuur te verwijderen, gedroogd boven een geschikt droogmiddel, gefiltreerd, en onder verminderde druk geconcentreerd.The freeze-dried solid is dissolved in a suitable organic solvent, e.g., methylene chloride, hexane, methylene chloride: ethyl acetate, diethyl ether, hexane: ethyl acetate, hexane: chloroform, or hexane: ether. Diethyl ether is preferred. This solution is shaken with water and the pH is adjusted to 1.5-4.0, preferably about 2.5, with any dilute inorganic acid. The organic phase is separated, washed with water to remove any excess acid, dried over a suitable drying agent, filtered, and concentrated under reduced pressure.

Het residu wordt opgelost in een geschikt oplosmiddel en de oplossing laat men langzaam verdampen, bij voorkeur bij ongeveer 4°C. Voorbeelden van geschikte oplosmiddelen zijn methyleenchloride, hexaan, 55 ethylacetaat, diëthylether, chloroform en mengsels daarvan. Hexaan: ether 5:2 (v/v) heeft de voorkeur. De verkregen kristallen worden verzameld en gewassen, bij voorkeur bij ongeveer 40°C, met een willekeurige koolwaterstof die bij matige temperatuur kookt, bijvoorbeeld hexaan of heptaan, en aan de lucht gedroogd 11 194396 tsneiPidc a!S SindprCuliCi het antibioticum ΙΠ de VOi 111 V£u1 höt vrijö £UUf ιθ VörKrijQöl ·The residue is dissolved in a suitable solvent and the solution is allowed to evaporate slowly, preferably at about 4 ° C. Examples of suitable solvents are methylene chloride, hexane, ethyl acetate, diethyl ether, chloroform and mixtures thereof. Hexane: ether 5: 2 (v / v) is preferred. The obtained crystals are collected and washed, preferably at about 40 ° C, with any hydrocarbon boiling at a moderate temperature, for example hexane or heptane, and air-dried 11 194396 tsneiPidc a! SindprCuliCi the antibiotic VOi 111 V £ u1 höt vrijö £ UUf ιθ VörKrijQöl ·

Wanneer het product in de vorm van een zout gewenst is, kan het vrije zuur door behandeling met het geschikte kation, bij voorkeur in de vorm van een verdunde anorganische base, worden omgezet overeenkomstig de aan de deskundigen bekende procedures.If the product is desired in the form of a salt, the free acid can be converted by treatment with the appropriate cation, preferably in the form of a diluted inorganic base, in accordance with the procedures known to those skilled in the art.

5 De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe. De media A, B, C enz. zijn zoals bovenstaand gedefinieerd. Tenzij anders is aangegeven werden alle procedures uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 22°C) en bij een druk van 1 atm.The following examples illustrate the invention. The media A, B, C etc. are as defined above. Unless otherwise indicated, all procedures were performed at room temperature (about 22 ° C) and at a pressure of 1 atm.

Voorbeeld l 10 Gewassen sporen van een schuine agar van Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden gebruikt om een 500 cm3 fles te beênten, die 100 cm3 steriel medium B bevatte. De fles werd 2 dagen bij 28°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.Example 1 Washed traces of an oblique agar from Actinomadura yumaense NRRL 12515 were used to inoculate a 500 cm 3 bottle containing 100 cm 3 of sterile medium B. The bottle was incubated at 28 ° C for 2 days on a rotary shaker.

Een 5%’s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht in 100 cm9 steriel medium C in een 500 cm3 fles en gedurende 5 dagen bij 28°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.A 5% seed material from this culture was then transferred to 100 cm 3 of sterile medium C in a 500 cm 3 bottle and incubated for 5 days at 28 ° C on a rotary shaker.

15 De aanwezigheid van antibiotische activiteit werd dagelijks gevolgd door bioanalyse tegen Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Bacillus subtilis, en Streptococcus faecalis, en de anthelmintische activiteit werd gevolgd door bioanalyse tegen de vrij levende nematode Caenorhabdltis elegans.The presence of antibiotic activity was monitored daily by bioanalysis against Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Bacillus subtilis, and Streptococcus faecalis, and anthelmintic activity was monitored by bioanalysis against the free-living nematode Caenorhabdltis elegans.

Voorbeeld IIEXAMPLE II

20 Men bereidde zeven flessen van 500 cm3, die elk 100 cm3 bevatte van een van de volgende steriele media: Fles 1:100 cm3 medium CSeven 500 cm3 bottles were prepared, each containing 100 cm3 from one of the following sterile media: Bottle 1: 100 cm3 medium C

fles 2:100 cm3 medium C met 1,5% katoenzaadmeel in plaats van sojameel fles 3: 100 cm3 medium C met 1,5% oplosbare vleesbestanddelen in plaats van sojameel fles 4:100 cm3 medium D 25 fles 5:100 cm3 medium E fles 6:100 cm3 medium F fles 7:100 cm3 medium G.bottle 2: 100 cm3 medium C with 1.5% cottonseed flour instead of soybean meal bottle 3: 100 cm3 medium C with 1.5% soluble meat constituents instead of soybean meal bottle 4: 100 cm3 medium D 25 bottle 5: 100 cm3 medium E bottle 6: 100 cm3 medium F bottle 7: 100 cm3 medium G.

Deze flessen werden elk beênt met een 5%'s entmateriaal van Actinomadura yumaense NRRL 12515, dat in medium B was gegroeid. De flessen werden daarna gedurende 4-6 dagen bij 28°C geïncubeerd op 30 een roterende schudinrichting.These bottles were each inoculated with a 5% inoculum of Actinomadura yumaense NRRL 12515, which had grown in medium B. The bottles were then incubated for 4-6 days at 28 ° C on a rotary shaker.

Elk van de bovenstaande culturen bleek actief te zijn bij analyse op antibiotische werkzaamheid als in voorbeeld I en bij analyse op anticoccidiale activiteit tegen Eimeria tenella in weefseiculturen van kuiken-nleren. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16Each of the above cultures was found to be active in analysis for antibiotic activity as in Example 1 and in analysis for anticoccidial activity against Eimeria tenella in tissue cultures of chickens. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Voorbeeld IIIEXAMPLE III

22

Ingevroren fermentatiecultuurcellen van Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden gebruikt om een 500 3Frozen fermentation culture cells from Actinomadura yumaense NRRL 12515 were used to make a 500 3

cm3 fles te enten die 100 cm3 steriel medium B bevatte. De fles werd daarna gedurende 4 dagen bij 32°Ccm 3 of a bottle containing 100 cm 3 of sterile medium B. The bottle was then left at 32 ° C for 4 days

4 geïncubeerd op een roterende schudinrichting.4 incubated on a rotary shaker.

55

Een 5%'s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht in 100 cm3 steriel medium H in een 6 500 cm3 fles en gedurende 5 dagen bij 28°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.A 5% seed material from this culture was then transferred to 100 cm 3 of sterile medium H in a 6 500 cm 3 bottle and incubated for 5 days at 28 ° C on a rotary shaker.

77

Antibacteriële werkzaamheid werd op de in voorbeeld I beschreven wijze bevestigd en anticoccidiale 8 werkzaamheid werd op de in voorbeeld II beschreven wijze bevestigd.Antibacterial activity was confirmed in the manner described in Example I and anticoccidial activity was confirmed in the manner described in Example II.

99

De aanwezigheid van antibiotische werkzaamheid werd ook aangetoond door dunneiaagchromatografie 10 over silicagelplaten, ontwikkeld in ethylacetaat chloroform 70:30 (v/v).The presence of antibiotic activity was also demonstrated by thin layer chromatography on silica gel plates developed in ethyl acetate chloroform 70:30 (v / v).

11 1211 12

Voorbeeld IVEXAMPLE IV

1313

Men entte 100 cm3 steriel medium A In een 500 cm3 fles met gewassen sporen van een agarcultuur van 14100 cm 3 of sterile medium A was inoculated into a 500 cm 3 bottle with washed traces of an agar culture of 14

Actinomadura yumaense NRRL 12515. De fles werd gedurende 2 dagen bij 32°C geïncubeerd op een 15 roterende schudinrichting.Actinomadura yumaense NRRL 12515. The bottle was incubated for 2 days at 32 ° C on a rotary shaker.

1616

Een 5%'s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht in 100 cm3 steriel medium H in een 500 cm3 fles en gedurende 2 dagen bij 32°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.A 5% seed material from this culture was then transferred to 100 cm 3 of sterile medium H in a 500 cm 3 bottle and incubated for 2 days at 32 ° C on a rotary shaker.

Een 5%'s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht in een 500 cm3 fles die 100 cm3 vers steriel medium H bevatte en gedurende 6 dagen bij 28°C geïncubeerd op een roterende schudinrichting.A 5% inoculum of this culture was then transferred to a 500 cm3 bottle containing 100 cm3 of fresh sterile medium H and incubated for 6 days at 28 ° C on a rotary shaker.

De antibacteriële werkzaamheid werd op de in voorbeeld I beschreven wijze bevestigd.The antibacterial activity was confirmed in the manner described in Example I.

194396 12194396 12

Voorbeeld VExample V

Men entte twee flessen van 500 cm3 die elk 100 cm3 steriel medium A bevatte, met een ingevroren entcultuur van Actinomadura yumaense NRRL 12515 en incubeerde gedurende 2 dagen bij 32°C op een roterende schudinrichting.Two 500 cm3 bottles, each containing 100 cm3 of sterile medium A, were inoculated with a frozen seed culture of Actinomadura yumaense NRRL 12515 and incubated for 2 days at 32 ° C on a rotary shaker.

5 De inhoud van de twee flessen werd daarna verenigd en toegevoegd aan 12 dm3 vers steriel medium A in een 20 dm3 fles. Deze cultuur werd daarna gedurende 2 dagen bij 28°C onder beluchting geïncubeerd.The contents of the two bottles were then combined and added to 12 dm 3 of fresh sterile medium A in a 20 dm 3 bottle. This culture was then incubated for 2 days at 28 ° C with aeration.

De inhoud van deze fles werd daarna overgebracht in een 300 dm3 enttank die 288 dm3 steriel medium A bevatte en deze cultuur werd belucht en geagiteerd gedurende 25 uren bij 32°C.The contents of this bottle were then transferred to a 300 dm3 seed tank containing 288 dm3 sterile medium A and this culture was aerated and agitated for 25 hours at 32 ° C.

Aan het eind van de 25 uren durende incubatie, werden de 300 dm3 entcultuur overgebracht in een 1500 10 dm3 fermentor, die 1200 dm3 steriel medium C bevatte. Deze cultuur werd onder beluchting en agitatie gedurende 115 uren bij 28°C geïncubeerd.At the end of the 25-hour incubation, the 300 dm 3 seed culture was transferred to a 1500 dm 3 fermentor containing 1200 dm 3 of sterile medium C. This culture was incubated under aeration and agitation for 115 hours at 28 ° C.

Het fermentatiemengsel werd geanalyseerd op antibiotische werkzaamheid door dunnelaag-chromatografie over silicagelplaten, die ontwikkeld werden in ethylacetaat: chloroform 70:30 (v/v). Als alternatief werden verscheidene van de ontwikkelde platen onderworpen aan bioanalyse tegen Bacillus 15 subtills, waarbij de aanwezigheid van antibiotische werkzaamheid werd aangetoond.The fermentation mixture was analyzed for antibiotic activity by thin layer chromatography on silica gel plates developed in ethyl acetate: chloroform 70:30 (v / v). Alternatively, several of the developed plates were subjected to bioanalysis against Bacillus subtills, demonstrating the presence of antibiotic activity.

Voorbeeld VIExample VI

Een medium voor het groeien van het primaire entmateriaal werd overeenkomstig de volgende formulering samengesteld: 20 rundvleesextract 0,3%A medium for growing the primary seeding material was formulated in accordance with the following formulation: beef extract 0.3%

Bacto®-trypton 0,5% glucose 1,0% gistextract 0,5% 25 Bacto®-agar 0,15% water q.s. 100%Bacto®-trypton 0.5% glucose 1.0% yeast extract 0.5% Bacto®-agar 0.15% water q.s. 100%

Door wassen of schrapen van een agarcultuur van Actinomadura yumaense NRRL 12515 verkregen sporen en mycelia werden gebruikt om een 500 cm3 fles, die 100 cm3 van het bovenstaande gesteriliseerde 30 medium bevatte, te enten. De fles werd op een roterende schudinrichting geplaatst en 48 uren bij 32°C krachtig geschud. Het resulterende entmateriaal (100 cm3) in de fles werd gebruikt om 1 dm3 van hetzelfde steriele medium in een 2 dm3 fles te enten. Dit entmateriaal werd met steriele lucht belucht terwijl de kweek 48 uren bij 28°C werd voortgezet. Deze 1 dm3 cultuur werd daarna gebruikt om een 30 cm fermentortank die hetzelfde steriele medium bevatte, te beênten, en deze tank werd met steriele lucht belucht en 35 gedurende 42 uren bij 28°C geïncubeerd.Spores and mycelia obtained by washing or scraping an agar culture of Actinomadura yumaense NRRL 12515 were used to inoculate a 500 cm 3 bottle containing 100 cm 3 of the above sterilized medium. The bottle was placed on a rotary shaker and shaken vigorously for 48 hours at 32 ° C. The resulting inoculum (100 cm 3) in the bottle was used to inoculate 1 dm 3 of the same sterile medium into a 2 dm 3 bottle. This seeding material was aerated with sterile air while the culture was continued for 48 hours at 28 ° C. This 1 dm 3 culture was then used to inoculate a 30 cm fermenter tank containing the same sterile medium, and this tank was aerated with sterile air and incubated at 28 ° C for 42 hours.

Voorbeeld VIIEXAMPLE VII

Men bereidde een fermentatiemedium overeenkomstig de volgende formulering: .. dextrose 1,5% 40 glycerol 1,5% sojameel 1,5% calciumcarbonaat 0,1% natriumchloride 0,3% water q.s. 100%A fermentation medium was prepared in accordance with the following formulation: dextrose 1.5% glycerol 1.5% soybean meal 1.5% calcium carbonate 0.1% sodium chloride 0.3% water q.s. 100%

De pH werd met 6 N natriumhydroxide ingesteld op 7,0 en het medium werd gesteriliseerd. Een 30 dm3 portie van het volgens voorbeeld I bereide entmateriaal werd gebruikt om 250 dm3 van het bovenstaand beschreven medium in een 300 dm3 fermentor te beënten. Het fermentatiemengsel werd steriel belucht en 50 met 220 omw./min. geroerd. De fermentatie werd uitgevoerd gedurende 97 uren bij 32°C, waarna het vaste materiaal werd geoogstThe pH was adjusted to 7.0 with 6 N sodium hydroxide and the medium was sterilized. A 30 dm3 portion of the seeding material prepared according to Example I was used to inoculate 250 dm3 of the medium described above in a 300 dm3 fermentor. The fermentation mixture was aerated sterile and 50 at 220 rpm. stirred. The fermentation was carried out at 32 ° C for 97 hours, after which the solid material was harvested

Voorbeeld VIIIEXAMPLE VIII

Men bereidde een fermentatiemedium overeenkomstig de volgende formulering: ^ dextrose 3,0% sojameel 1,5% 13 194396 dextrose 3,0% calciumcartx>naat 0,1% natriumchloride 0,3% 5 water q.s. 100%A fermentation medium was prepared in accordance with the following formulation: dextrose 3.0% soybean meal 1.5% 13 194396 dextrose 3.0% calcium carton> 0.1% sodium chloride 0.3% water q.s. 100%

De pM werd met 6 N natriumhydroxide ingesteld op 7,0 en het medium werd gesteriliseerd. Een 300 dm1 portie van het volgens voorbeeld I bereide entmateriaal werd gebruikt om 3000 dm1 van het bovenstaand vermelde medium in een fermentor te enten. Het fermentatiemengsel werd steriel belucht en met 100 10 omwjmin. geroerd. De fermentatie werd uitgevoerd gedurende 115 uren bij 32°C waarna het vaste materiaal werd geoogst.The pM was adjusted to 7.0 with 6 N sodium hydroxide and the medium was sterilized. A 300 dm1 portion of the seeding material prepared according to Example I was used to inoculate 3000 dm1 of the above medium into a fermenter. The fermentation mixture was aerated sterile and at 100 rpm. stirred. The fermentation was carried out at 32 ° C for 115 hours after which the solid material was harvested.

Voorbeeld IXEXAMPLE IX

15 1. Het vaste fermentatiemateriaal (100 dm1) werd met 6 N HCI ingesteld op een pH van 4,0. Het zure mengsel werd daarna 1-2 uren geroerd met een gelijke volumehoeveelheid methyleenchloride. Het mengsel werd daarna gefiltreerd onder toepassing van diatomeeênaarde als filtreerhulpmiddel. Het methyleenchloride-extract werd afgezogen en onder verminderde druk geconcentreerd tot ongeveer 2 dm1 van gedeeltelijk gezuiverde antibiotica.1. The solid fermentation material (100 dm1) was adjusted to pH 4.0 with 6 N HCl. The acid mixture was then stirred for 1-2 hours with an equal volume amount of methylene chloride. The mixture was then filtered using diatomaceous earth as a filter aid. The methylene chloride extract was filtered off with suction and concentrated under reduced pressure to about 2 ml of partially purified antibiotics.

20 2. Chromatografie van de gedeeltelijk gezuiverde antibiotica over silicagel. Een glazen kolom met een diameter van 7 cm werd tot een hoogte van 91 cm gevuld met Woelm silicagel TSC. Het ruwe concentraat (zie boven onder 1) met een volume van ongeveer 2 dm1 methyleenchloride, gevolgd door methyleenchloride : ethylacetaat (1:1 volumeverhouding), waarbij een totaal van 126 fracties werd verkregen, elk met een volume van 80 cm1. De kolom werd daarna verder ontwikkeld onder toepassing van ethylacetaat-ethanol 25 (7:3) waarbij nog eens 87 fracties werden verkregen.2. Chromatography of the partially purified antibiotics on silica gel. A glass column with a diameter of 7 cm was filled to a height of 91 cm with Woelm silica gel TSC. The crude concentrate (see above under 1) with a volume of about 2 dm 1 methylene chloride, followed by methylene chloride: ethyl acetate (1: 1 volume ratio), whereby a total of 126 fractions was obtained, each with a volume of 80 cm 1. The column was then further developed using ethyl acetate-ethanol (7: 3) to give an additional 87 fractions.

De fracties 58-87, die rijk waren aan X-14868A, werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd tot een residu dat 90,4 g woog. Dit residu werd opgenomen in een mengsel van 600 cm1 diëthylether en 600 cm1 hexaan. De suspensie werd gefiltreerd waarbij een helder filtraat werd verkregen. Het heldere filtraat werd onder verminderde druk geconcentreerd totdat zich kristallen begonnen te vormen. Na een 30 nacht staan werd het kristailijne X-14868A op een filtertrechter verzameld, gewassen met koude ether en aan de lucht gedroogd, waarbij 33,1 g kristallijn X-14868A werd verkregen. Een extra hoeveelheid X-14868A van 12,4 g werd verkregen door verdere volumevermindering van de gecombineerde wasvloeistof en filtraat.Fractions 58-87, which were rich in X-14868A, were combined and concentrated under reduced pressure to a residue weighing 90.4 g. This residue was taken up in a mixture of 600 ml of diethyl ether and 600 ml of hexane. The suspension was filtered to give a clear filtrate. The clear filtrate was concentrated under reduced pressure until crystals started to form. After standing overnight, the crystalline X-14868A was collected on a filter funnel, washed with cold ether and air-dried to give 33.1 g of crystalline X-14868A. An additional amount of X-14868A of 12.4 g was obtained by further volume reduction of the combined wash and filtrate.

De fracties 177-203 van de elutie met ethylacetaat-ethanol, die rijk waren aan X-14868C, werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij 6,7 g van gedeeltelijk gezuiverd X-14868B 35 werd verkregen, dat op de bovenstaand beschreven wijze werd behandeld.The fractions 177-203 of the elution with ethyl acetate-ethanol, which were rich in X-14868C, were combined and concentrated under reduced pressure, whereby 6.7 g of partially purified X-14868B were obtained, as described above. was treated.

De fracties 204-213 van de elutie met ethylacetaat-ethanol, die verrijkt waren aan X-14868B, werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd tot een paste en meermalen met methanol geëxtraheerd. Het methanolextract werd geëxtraheerd met methyleenchloride, dat op een kolom werd gebracht die Woelm silicagel bevatte. De kolom werd gewassen met methyleenchloride en daarna geëlueerd met 40 methyleenchloride: ethylacetaat (2:3). De fracties werden met dunnelaagchromatografie gevolgd en de actieve fracties werden verenigd, behandeld met houtskool, geconcentreerd en meermalen geëxtraheerd met heptaan. Het uiteindelijke heptaanextract werd 48 uren bij 0°C gekoeld en de kristallen werden door filtratie van de moederloog gescheiden.Fractions 204-213 of the elution with ethyl acetate-ethanol, enriched in X-14868B, were combined and concentrated under reduced pressure to a paste and extracted several times with methanol. The methanol extract was extracted with methylene chloride, which was placed on a column containing Woelm silica gel. The column was washed with methylene chloride and then eluted with 40 methylene chloride: ethyl acetate (2: 3). The fractions were followed by thin layer chromatography and the active fractions were combined, treated with charcoal, concentrated and extracted several times with heptane. The final heptane extract was cooled at 0 ° C for 48 hours and the crystals were separated from the mother liquor by filtration.

Deze moederloog werd opgelost in methyleenchloride en op een glazen kolom gebracht, die gepakt was 45 met Woelm silicagel. De kolom werd daarna achtereenvolgens geëlueerd met 2 dm1 methyleenchloride, 8 dm1 methyleenchloride: ethylacetaat (1:1) en 4 dm1 ethylacetaat: methanol (9:1). Het eluaat werd In fracties verzameld en de fracties werden op hun antibiotische samenstelling onderzocht De actieve fracties werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij een residu werd verkregen dat X-14868B bevatte.This mother liquor was dissolved in methylene chloride and placed on a glass column packed with Woelm silica gel. The column was then eluted successively with 2 ml of methylene chloride, 8 ml of methylene chloride: ethyl acetate (1: 1) and 4 ml of ethyl acetate: methanol (9: 1). The eluate was collected in fractions and the fractions were tested for their antibiotic composition. The active fractions were combined and concentrated under reduced pressure to give a residue containing X-14868B.

5050

Voorbeeld XExample X

Verdere zuivering van X-14868C van de chromatografie op silicagel.Further purification of X-14868C from silica gel chromatography.

Men liet Sephadex© LH20 opzwellen in een mengsel van hexaan-methyleenchloride-methanol (10:5:1).Sephadex® LH 2 O was allowed to swell in a mixture of hexane-methylene chloride-methanol (10: 5: 1).

55 Een glazen kolom met een diameter van 5 cm werd tot een hoogte van 86 cm met de gel gevuld. De charge, 3 g gezuiverd X-14868C, werd opgelost in 10 cm1 methyleenchloride, 1 cm1 hexaan en werd in de gelkolom gebracht De kolom werd daarna ontwikkeld met hetzelfde oplosmiddelmengsel. Met behulp vanA glass column with a diameter of 5 cm was filled with the gel to a height of 86 cm. The batch, 3 g of purified X-14868C, was dissolved in 10 cm 1 of methylene chloride, 1 cm 1 of hexane and was introduced into the gel column. The column was then developed with the same solvent mixture. Using

Claims (4)

194396 14 een collector werden fracties verzameld. De eerste 23 fracties hadden elk een volume van 17 cm3. De fracties 17-26 bevatten volgens dunnelaagchromatografie X-14868C. Deze fracties werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd waarbij zuiver amorf X-14868C werd verkregen in een hoeveelheid van 1269 mg. 5 Voorbeeld XI Kristallisatie van X-14868C als natriumzout Gezuiverd X-14868C (2,4 g), bereid zoals beschreven in voorbeeld IX werd opgelost in een mengsel van 10 500 cm3 diëthylether, 160 cm3hexaan en 25 cm3 methyleenchloride. De verkregen oplossing werd overgebracht in een scheitrechter die 300 cm3 gedestilleerd water bevatte. Men voegde druppelsgewijs verdunde HCI (1 N) toe totdat de pH na schudden en bezinken een waarde van 2,0-2,5 bereikte. De zure waterfase werd weggegooid en de met zuur behandelde organische laag werd driemaal met telkens 400 cm3 water gewassen. De gewassen organische laag werd 15 minuten met een theelepel geroerd met Darco 15 G 60-poeder en door Ceite gefiltreerd. De ontkleurde organische laag werd in 500 cm3 gedestilleerd water gebracht en men voegde druppelsgewijze 5 N NaOH toe totdat de pH na schudden en bezinken een waarde van 11,0-11,5 bereikte. De basische waterfase werd weggegooid en de resterende organische laag werd tweemaal gewassen met porties water van 400 cm3. De gewassen organische laag werd boven natriumsulfaat gedroogd en daarna onder verminderde druk geconcentreerd tot een volume van 150 cm3. 20 Men liet dit concentraat verscheidene uren in een zuurkast staan. Het kristallijne X-14868C werd op een trechter verzameld, met koude hexaan gewassen en aan de lucht gedroogd, waarna 402 mg van het kristallijne zout van X-14868C werd verkregen. Analyse: berekend voor C^H^O^Na: C 59,70; H 8,33; O 29,46; as 2,49%; 25 gevonden: C 61,55; H 8,79; as 3,31%; N, O. MP. (Fisher-Johns apparaat =174 [FDMass Spec) = 924 [α]2^ = +3,2 in methanol. Voorbeeld XII 30 Zuivering van X-14868B. Een Waters Prep. 500A HPLC (high performance liquid chromatography) instrument werd voorzien van een silicagelkolom onder een druk van 38 bar. De charge, die 5,0 g van het uit voorbeeld lil afkomstige ruwe materiaal was, werd opgelost in 50 cm3 heptaan : ethylacetaat (45:55) en werd in de kolom geïnjec-35 teerd. De kolom werd daarna ontwikkeld met hetzelfde oplosmiddelmengsel met een stroomsnelheid van 200 cm3/min waarbij 40 fracties van 400 cm3 werden verzameld. De fracties 21-32 werden verenigd, geconcentreerd tot een residu, met hexaan behandeld en verdampt, waarbij men zuiver X-14868B verkreeg. De bovenstaande procedure werd viermaal herhaald waarbij men een totale hoeveelheid van 280 mg amorf X-14868B verkreeg. 40 Een portie amorf X-14868B van 90 mg werd opgelost in 10 cm3 diëthylether, gemengd met 10 cm3 water, en met 0,1 N zoutzuur ingesteld op een pH van 2,5. De etherlaag werd gewassen met water, met 0. 1.N natriumhydroxide ingesteld op een pH van ongeveer 11, afgescheiden en opnieuw gewassen met water. De etherfase werd boven natriumsulfaat gedroogd, gefiltreerd, en geconcentreerd tot een residu. Een oplossing van dit residu in ether-hexaan liet men langzaam verdampen, waarbij men een amorfe witte vaste 45 stof verkreeg. Deze amorfe witte vaste stof had de volgende eigenschappen: elemental ranalyse: C 61,79; H 8,84; as 0,32; [af6!, = +27 (C 0,724, methanol); velddesorptiemassaspectrometrie: (M+Na)+ = mIe 953, het berekende molecuulgewicht is dus 930. 50194396 14 a collector, fractions were collected. The first 23 fractions each had a volume of 17 cm 3. Fractions 17-26 contain X-14868C according to thin layer chromatography. These fractions were combined and concentrated under reduced pressure to give pure amorphous X-14868C in an amount of 1269 mg. Example XI Crystallization of X-14868C as sodium salt Purified X-14868C (2.4 g) prepared as described in Example IX was dissolved in a mixture of 500 cm 3 of diethyl ether, 160 cm 3 of hexane and 25 cm 3 of methylene chloride. The resulting solution was transferred to a separatory funnel containing 300 cm 3 of distilled water. Diluted HCl (1 N) was added dropwise until the pH reached 2.0-2.5 after shaking and settling. The acidic aqueous phase was discarded and the acid-treated organic layer was washed three times with 400 cm 3 of water each time. The washed organic layer was stirred with a teaspoon for 15 minutes with Darco 15 G 60 powder and filtered through Ceite. The decoloured organic layer was placed in 500 cm 3 of distilled water and 5 N NaOH was added dropwise until the pH reached 11.0-11.5 after shaking and settling. The basic aqueous phase was discarded and the remaining organic layer was washed twice with 400 ml portions of water. The washed organic layer was dried over sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure to a volume of 150 cm 3. This concentrate was left in a fume cupboard for several hours. The crystalline X-14868C was collected on a funnel, washed with cold hexane and air-dried to give 402 mg of the crystalline salt of X-14868C. Analysis: calculated for C ^ H ^ O ^ Na: C 59.70; H, 8.33; O 29.46; ash 2.49%; Found: C, 61.55; H, 8.79; ash 3.31%; N, O. MP. (Fisher-John's apparatus = 174 [FDMass Spec) = 924 [α] 2 ^ = + 3.2 in methanol. Example XII Purification of X-14868B. A Waters Prep. 500A HPLC (high performance liquid chromatography) instrument was provided with a silica gel column under a pressure of 38 bar. The batch, which was 5.0 g of the crude material from Example 11a, was dissolved in 50 cm 3 of heptane: ethyl acetate (45:55) and injected into the column. The column was then developed with the same solvent mixture at a flow rate of 200 cm 3 / min where 40 fractions of 400 cm 3 were collected. Fractions 21-32 were combined, concentrated to a residue, treated with hexane and evaporated, yielding pure X-14868B. The above procedure was repeated four times to give a total amount of 280 mg of amorphous X-14868B. A 90 mg portion of amorphous X-14868B was dissolved in 10 cm 3 of diethyl ether, mixed with 10 cm 3 of water, and adjusted to pH 2.5 with 0.1 N hydrochloric acid. The ether layer was washed with water, with 0.11 N sodium hydroxide adjusted to a pH of about 11, separated and washed again with water. The ether phase was dried over sodium sulfate, filtered, and concentrated to a residue. A solution of this residue in ether-hexane was allowed to evaporate slowly, yielding an amorphous white solid. This amorphous white solid had the following properties: elemental analysis: C 61.79; H, 8.84; axis 0.32; [α] 6 D = +27 (C 0.724, methanol); field desorption mass spectrometry: (M + Na) + = mIe 953, the calculated molecular weight is therefore 930. 50 1. Reincultuur van een Actinomadura-soort die in staat is tot het produceren van een antibiotisch werkzame polycyclische ether, met het kenmerk, dat de Actinomadura-soori Actinomadura yumaense sp. nov. is, die 55 de antibiotica X-14868A, X-14868B en X-14868C produceert.A pure culture of an Actinomadura species capable of producing an antibiotic-active polycyclic ether, characterized in that the Actinomadura-soori Actinomadura yumaense sp. Nov. 55 which produces the antibiotics X-14868A, X-14868B and X-14868C. 2. Reincultuur volgens conclusie 1, met het kenmerk dat de Actinomadura yumaense NRRL 12515 is.Pure culture according to claim 1, characterized in that the Actinomadura is yumaense NRRL 12515. 3. Werkwijze ter bereiding van de antibiotica X-14868A, X-14868B en/of X-14868C door aerobe fermentatie 15 194396 en winning van de in het fermentatiemedium gevormde antibiotica, met het kenmerk, dat men bij de aerobe * fermentatie Actinomadura yumaense sp. nov. gebruikt3. Process for the preparation of the antibiotics X-14868A, X-14868B and / or X-14868C by aerobic fermentation 194396 and recovery of the antibiotics formed in the fermentation medium, characterized in that in the aerobic fermentation, Actinomadura yumaense sp. . Nov. used 4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de Actinomadura yumaense de stam Actinomadura yumaense NRRL 12515 is. Hierbij 1 blad tekeningMethod according to claim 3, characterized in that the Actinomadura yumaense is the strain Actinomadura yumaense NRRL 12515. Hereby 1 sheet drawing
NL8204069A 1981-10-22 1982-10-21 Antibiotics producing microorganisms and method for preparing antibiotics. NL194396C (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/313,849 US4407946A (en) 1981-10-22 1981-10-22 Process for producing antibiotic X-14868A
US31384981 1981-10-22
US37278482A 1982-04-28 1982-04-28
US37278482 1982-04-28

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NL8204069A NL8204069A (en) 1983-05-16
NL194396B NL194396B (en) 2001-11-01
NL194396C true NL194396C (en) 2002-03-04

Family

ID=26979078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8204069A NL194396C (en) 1981-10-22 1982-10-21 Antibiotics producing microorganisms and method for preparing antibiotics.

Country Status (17)

Country Link
JP (1) JPH0824593B2 (en)
AR (1) AR229058A1 (en)
AU (1) AU558914B2 (en)
CA (1) CA1198386A (en)
CH (1) CH661283A5 (en)
DE (1) DE3238316A1 (en)
DK (1) DK161332C (en)
ES (1) ES8308359A1 (en)
FI (1) FI75187C (en)
FR (1) FR2515207B1 (en)
GB (2) GB2108113B (en)
HU (1) HU190814B (en)
IE (1) IE54813B1 (en)
IL (1) IL66671A (en)
IT (1) IT1197433B (en)
NL (1) NL194396C (en)
SE (2) SE456588C (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR78648B (en) * 1982-07-26 1984-09-27 Bristol Myers Co
DE102006028817A1 (en) * 2006-06-21 2007-12-27 Evonik Degussa Gmbh Processing of Reaction Solutions from Whole Cell Biotransformations

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4278663A (en) * 1980-01-30 1981-07-14 Hoffmann-La Roche Inc. Antibiotic X-14868A, B, C and D

Also Published As

Publication number Publication date
AU8965382A (en) 1983-04-28
DE3238316C2 (en) 1992-01-23
DK161332C (en) 1991-12-09
GB2108113B (en) 1985-08-07
CH661283A5 (en) 1987-07-15
FR2515207A1 (en) 1983-04-29
AR229058A1 (en) 1983-05-31
IT1197433B (en) 1988-11-30
GB2147808A (en) 1985-05-22
DE3238316A1 (en) 1983-06-01
FI75187B (en) 1988-01-29
GB8426115D0 (en) 1984-11-21
DK462082A (en) 1983-04-23
FI823603A0 (en) 1982-10-21
FI823603L (en) 1983-04-23
SE456588C (en) 1998-04-27
SE456588B (en) 1988-10-17
IE54813B1 (en) 1990-02-14
SE8205992L (en) 1983-04-23
GB2147808B (en) 1986-02-19
NL8204069A (en) 1983-05-16
GB2108113A (en) 1983-05-11
FI75187C (en) 1988-05-09
JPH0824593B2 (en) 1996-03-13
IL66671A0 (en) 1982-12-31
NL194396B (en) 2001-11-01
CA1198386A (en) 1985-12-24
JPH05219980A (en) 1993-08-31
FR2515207B1 (en) 1988-10-21
ES516718A0 (en) 1983-09-16
DK161332B (en) 1991-06-24
ES8308359A1 (en) 1983-09-16
IE822542L (en) 1983-04-22
AU558914B2 (en) 1987-02-12
IL66671A (en) 1985-11-29
HU190814B (en) 1986-11-28
SE8205992D0 (en) 1982-10-21
IT8249317A0 (en) 1982-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4407946A (en) Process for producing antibiotic X-14868A
TANAKA et al. Brasilinolide A, a new macrolide antibiotic produced by Nocardia brasiliensis: producing strain, isolation and biological activity
CA1242159A (en) Bbm-2478 antibiotic complex
US4551533A (en) Antibiotic LL-D42067α
NL194396C (en) Antibiotics producing microorganisms and method for preparing antibiotics.
EP0600656A2 (en) Strain of streptomyces for producing antiparasitic compounds and processes therewith
CA1158579A (en) Antibiotic ar-5 complex, derivatives thereof and methods for production thereof
EP1001957B1 (en) Macrolides with antitumor activity
US4824863A (en) Antibiotic A80438
US5290804A (en) Anthelmintic milbemycin analogs of novel microorganisms
US4595770A (en) Antibiotic compound and process for recovery thereof from a fermentation broth
US5188944A (en) Process for the glycosylation of avermectin agylcones
US4393056A (en) Antibiotics tetronolide compounds and process for production thereof
US4510134A (en) Controlling nematodes in animals and soil with nematocidal antibiotics
US4774184A (en) Culture and process for producing antibiotic LL-D42067alpha
EP0637244A1 (en) A STRAIN OF $i(STREPTOMYCES AVERMITILIS) GLYCOSYLATES AVERMECTIN COMPOUNDS
US4908316A (en) Streptomyces sp. N664-30 which produces an ionophore antibacterial agent
US5250422A (en) Biotransformation process for the production of invermectin derivatives
CA2106446A1 (en) Bu-4803t antibiotics
RU1808007C (en) Method of antibiotic production
JPS6127400B2 (en)
US4975531A (en) Sakyomicin E and the derivatives thereof, a process for the preparation thereof and the use thereof
US5215981A (en) Polyether antibiotic mi215-nf3 substance, production process thereof, and agent for control of chicken coccidiosis
CA1320464C (en) Antibiotic a80190
CA2033483A1 (en) Polyether antibiotic mi215-nf3 substance, production process thereof, and agent for control of chicken coccidiosis

Legal Events

Date Code Title Description
BT A notification was added to the application dossier and made available to the public
BT A notification was added to the application dossier and made available to the public
A85 Still pending on 85-01-01
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
BC A request for examination has been filed
CNR Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection)

Free format text: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG

V4 Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent

Free format text: 20021021