NL8204069A - Antibacteriele middelen ll-c23024beta en jota en het microoerganisme actinomadura yumaense nrrl 12515. - Google Patents

Description

f 1 VO 36 T5

AntibacteriSle middelen LL-C2302^$ en jota en het microorganisme Actino-madura yumaense NRRL 12515.

De uitvinding heeft betrekklng op antibacteriele en anticoccidi-ale middelen aangeduid met 1.1-02302^, en jota, alsmede op een nieuv microorgani sme Actinomadura yumaense sp. nov. of mutant en daar-van.

5 De uitvinding heeft verder betrekking op een nieuwe verkvij ze voor het produceren van de antibiotica 11-02302^, β en jota door fer-mentatie onder beheerste omstandigheden van het nieuwe microorganisms Actinomadura yumaense sp. nov.

Het antibioticum LL-C23Q2ha{ heeft de structuur volgens formu-10 le 1 van het formuleblad.

Het antibioticum 11-02302^ volgens de onderhavige uitvinding verschilt van bekende verbindingen door zijn fysische en chemische eigenschappen, waaronder, zonder beperking daartoe, zijn microanar-lyse, optische rotatie, infraroodspectrum, ^C-kernmagnetische resonan-15 tiespectrum en ^H-keramagnetisch resonantiespectrum.

Antibioticum LL-C2302U/3 heeft de gepostuleerde structuur volgens formule 2 van het formueblad, waarin R1 en Rg verschillend zijn en elk gekozen is uit de groep waterstof en methyl.

De bovenstaande gepostuleerde structuur is gebaseerd op de ele-20 mentairanalyse, optische rotatie, velddesorptiemassaspectroscopie- molecuulgewicht, smeltpunt, infraroodspectrum (IR), ^C-kernmagnetische 13 resonantiespectrum ( C-HMR), en protonenmagnetische resonantiespectrum (1H-NMR), zoals gedetailleerd beschreven in de voorbeelden en getoond in de bijgaande figuren: 25 Fig.1: IR-spectrum van 11-02302^/3 in KBr; 13

Fig.2: C-NMR-spectrum van LL-C2302U 3; 20 MHz in CDCl^j interne TMS-referentie-equi valent;

Fig.3: ^H-NMR-spectrum van LL-C2302U /&; 80 MHz in CDCl^, interne TMS-referentie-equivalent.

8204069 » * - 2 -

Tabel A

1? JC-NMR-spectrum van LL-C2302^/3 (dpm relatief ten opsichte van IMS)

Chemische verschuiving (dpm) Aantal koolstofatomen 5 10,5 1 11,0 1 12,2 1 17.0 1 17.7 1 10 17,9 · 1 22.3 1 26.1 1 26.8 1 27.6 1 15 30,2 1 32,0 1 33.3 1 33.7 2 33.8 2 20 36,5 1 36.8 1 39.0 1 39.9 1 ^5,5 2 25 57,1 1 59.1 1 60,7 1 . 66,9 1 6 7,6 1 30 70,2 1 71.3 1 72.9 1 7^,9 1 75.1 1 35 79,9 1 8204069 % 4 - 3 -

Tabel A (vervolg) 80,8 1 82,1 2 · 8^,5 1 5 8^,7 1 85,6 1 86,9 1 95.8 1 96.9 1 10 97,7 1 107,5 1

179,2 JL

totaal aantal koolstofatomen U6 LL-C2302k jota is een nieuw polyether-antibioticum met zeer 15 sterke anticoccidiale activiteit. Het is tenminste 10-maal zo sterk als de meeste andere bekende polyethers. Gegevens van het velddesorp- tiemassaspectrum tonen dat het een molecuulgevicht van 930 heeft, het- welk samen met zijn koolstof-13-kemTnagnetisch resonantiespectrum 13 ( JC-NMR) het voorstel van een voorlopige molecuulformule CU8H82°17 20 toelaat. Het blijkt dat LL-2302U jota vier methoxygroepen, dezelide suiker die in het polyetherantibioticum X-11+868A (Amerikaans octrooi 1+.278.663) is waargenomen., en een carboxylgroep heeft. Het enige andere bekende polyetherantibioticum met een molecuulgewicht van 930 is het antibioticum A28695B (hydroxyseptamycine), zie J. Antibiotics 25 33(2) : 252 (1980), dat in structuur en biologische eigenschappen sig nificant anders is. De bovenstaand vermelde waarnemingen zijn geba-seerd op de elementairanalyse, optische rotatie, het berekende molecuulgewicht door velddesorptiemassaspectroscopie, het infraroodspectrum CER), het ^C-NMR-spectrum, en het protonenkernmagnetische resonantie-30 spectrum (1H-NMR), zoals gedetailleerd beschreven in de voorbeelden en getoond in de bijgaande figuren:

Fig. 1+: IR-spectrum van LL-C23021+ jota in KBr;

Fig.5: ^H-UMR-spectrum van LL-C23021+ jota; 80 MHz in CDCl^, interne TMS-referentie-equivalent; 13 35 Fig.6: C-NMR-spectrum van LL-C23024 jota; 20 MHz in CDCl^, in terne TMS-referentie-equivalent; 8204069 13 » ί - k -

Fig.7A: C-NMR-spectrum van LL-C2302U jota (uitgebreide schaal; 0-50 dpm); 20 MHz in CDCl^, interne TMS-referentie- equivalent; 13

Fig.8B: C-NMR-spectrum van LL-C2302U jota (uitgebreide schaal: 5 50 - 110 dpm); 20 MHz in CDCl^, interne TMS-referentie- equivalent.

Ds^C-NMR-spectra van LL-C2302U jota werden verkregen in gedeu-tereerde chloroform (CDCl^) bij een veldsterkte van 20 MHz. De pieken met hun bijbehorende chemische verschuivingen in delen per miljoen ten 10 opzichte van tetramethylsilaan (TMS) en het geschatte aantal koolstof-atomen per piek zijn samengevat in tabel B. Er werden pieken vaargeno-men voor chloroform bij 75,77,0 en 78,6.

Tabel B

Chemische Aantal koolstof— Chemische Aantal koolstof- verschuiving atomen verschuiving atomen 10.6 1 59,9 1 10.9 1 60,8 2 n,7 1 68,5 1 l6,U 1 68,8 1 20 17,6 1 71,3 1 18,0 1 72,2 1 21.7 1 76,1 1 22.9 1 76,9 1 2U,1 1 78,5 1 25 28,2 1 81,0 1 31.2 2 81,3 1 32.2 1 81,8 1 33,h 1 8U,8 1 33.8 2 85,3 1 30 3^,2 1 85,6 1 36,7 1 86,8 1 37.2 1 88,5 1 39 Λ 1 95,9 1 10.3 1 97,9 1 35 11,5 1 99,6 1 8204069 -5-.

% «

Tabel B (vervolg) 1*5,5 1 107,2 1

1*7 ,6 1 173,0 __L

56,8 1 Totaal 1+8 5 De antibiotica LL-C23Q2kat,/3 en jota zijn organische carbon- zuren en derhalve in staat tot het vormen van zouten met niet-toxische farmaceutisch aanvaardbare kationen. Derhalve kunnen zouten, gevormd door mengen van bet antibiotische vrije zuur met stoecbiometrische boeveelbeden kationen, bij voorkeur in een neutraal oplosmiddel, vorden 10 gevonnd met kationen zoals natrium, kalium, calcium, magnesium en ammonium, alsmede organische aminekationen zoals tri(lage alkyl)amine (b.v. triethylamine, triethanolamine), procaine en dergelijke. De kat-ionzouten van het antibioticum LL-C2302k/3 zijn in het algemeen kristal-lijne vaste stoffen, betrekkelijk onoplosbaar in water en oplosbaar in 15 de meeste gebruikelijke organische oplosmiddelen zoals methanol, ethyl-acetaat, aceton, chloroform, heptaan, ether en benzeen. Voor de doelein-den van deze uitvinding is het antibiotische vrije zuur equivalent aan zijn farmaceutisch aanvaardbare niet-toxische zouten.

De antibiotica LL-C2302U/3 en jota zijn in vitro actief tegen 20 gram-positieve bacterien waxmeer ze worden getest door de standaard agarverdunningsprocedure. De resultaten zijn vermeld als minimale inhi-berende concentraties (MIC) in microgram/cm in de tabellen C en D.

De antibiotica LL-C2302l*/3 en jota zijn niet actief tegen gram-negatie-ve organismen in concentraties van 256 microgram/cm of minder.

25 Tabel C

In vitro antibacteriele activiteit van LL-C2302U

Organisme minimale inhiberende ccn- centratie (mcg/cm^)

Staphylococcus aureus Smith 6h 30 " " SSC 80-11 6h " " SSC 80-32 61+ " " SSC 80-38 oh " " LL-11+ 61+ " " LL-1+5 61+ 35 " " LL-27 128 " " ATCC 25923 61+ 8204069 • * - 6 -

Tabel C (vervolg)

Streptococcus pyogenes C203 1 " /3-hemolytisch Keller T623 8 " pneumoniae 78-1 8 5

Tabel D

In vitro antibacteriele activiteit van LL-C23021* jota

Organisme minimale inhiberende con- centratie (mcg/cm^) LL-C23024 jota 10 _ ___

Enterococcus OSU 75-1 1

Enterococcus SM 77-15 1

Staphylococcus aureus SSC 79-18 1

Staphylococcus aureus FU 79-19-2 2 15. Micrococcus lutea PCI 1001 .1

Staphylococcus aureus Smith 0,5

Staphylococcus aureus AICC 25923 0,5

Zoals aangetoond door de bovenstaande gegevens inhiberen de antibiotica LL-C2302Uoc,en jota de groei van bepaalde gram-positieve 20 baeterien en zijn derhalve bruikbaar als topicaal of oppervlak-antisep-ticum in wasoplossingen voor de huid, apparatuur, muren, vloeren enz.

Qok is gevonden dat de antibacteriele middelen LL-C2302hot, yS en jota in vivo actief zijn als anticoccidiale middelen voor pluimvee zoals door de volgende tests is aangetoond.

25 Twee dagen voor inenting, werd een medicinale voeding met ver- schillende geneesmiddelgehaltes aan verscheidene groepen een dag oude testkuikens voorgezet. De gedurende de gehele test toegepaste pluimvee-voeding werd als volgt bereid: voormengsel van vitamines en aminozuren 0,5% 30 sporen mineralen 0,1% natriumchloride 0,3% dicalciumfosfaat 1,2% gemalen kalksteen 0,5% gestabiliseerd vet ^,0% 35 gedehydrateerd alfalfa, 17% eiwit 2,0% 8204069 - τ - maisglutenmeel, kl% eivit 5,0# menhaden-vismees, 60% eivit 5,0# sojabonenoliemeel, bk% eivit 30,0# gemalen gele mais, fijn tot 100 # 5 Het voormengsel van vitaznines en aminozuren in de bovenstaand vermelde voediagssamenstelling verd uit de volgende samenstelling be-reid. De hoeveelheidsaanduidingen hebben betrekking op eenheden per kg van de gerede voedings s amenst elling.

Gebutyleerd hydro xytolueen 125,0 mg 10 dl-methionine 500,0 mg vitamine A 3300,0 I.E.

vitamine 1100,0 I.C.E.

riboflavine b,k mg vitamine E 2,2 I.E.

15 niacine 27,5 mg pantotheenzuur 8,8 mg cholinechloride 500,0 mg folinezuur 1,^3 mg menadionnatriumbisulfaat 1,1 mg 20 vitamine 11,0 meg gemalen gele mais, fijn tot 5,0 g

De testkuikens verden daarna ingeent door directe inenting in de krop van elk kuiken met een gemengd entmateriaal van 5000 sporen-houdende ocJcysten van Eimeria acervulina en een voldoende aantal oocys-25 ten van Eimeria tenella om een sterftecijfer van 85 - 100# in de niet behandelde controledieren te verkrijgen. De kuiken verd vrije toegang tot voeding en vater gegeven gedurende de gehele testperiode. Zeven da-gen na de inenting verden de testen beeindigd en verden de vogels gevo-gen, aan lijkschouven ondervorpen en verden hun darmen op beschadigingen 30 onderzocht. De resultaten staan in de tabellen E en F en laten zien dat een betere overleving van geinfecteerde kuikens verd verkregen wan-neer 10 dpm of minder van de antibiotica LL-C2302b/3 of jota in het di-eet verd toegediend. De resultaten tonen ook een significants onderdruk-king van aan Eimeria tenella en Eimeria acervulina te vijten darmbe-35 schadigingen.

8204069 - 8 -

S3 aJ

<υ a bQ ·Η

-Ρ'Η^ΟΟΟΟ Ο Ο Ο Ο I Ο Ο Ο Ο Ο I

1) to ? Ο Ο Ο Ο Ο Ο I Ο Ο,

g .Η Vt Η Η Η ΗΗΗ ΗΗ I

Η 4> 03 aJ Ο Η Λ <β <υ a bO 03 · ο oj W > <υ ο> bO Η Cd cd in Η Μ +3 (U Η G G η ν _ 0) (UCCOOOO Ο Ο Ο Ο I t-oot— ο ν' ο ·Η 0) Ο VO Ο Ο Ο I CO VQ 1 •Η h π +* Η ΗΗΗ

3 4) U

χ CLt 4J · > w S3 •Η Η ¢)

Η I

Η £3 t 8 Η 43

cd ft VO

<d aj * , , _

H bO OOOVO OOOOO Ο Ο O t- £- O

1¾ G OOQOH· Ο Ο O CM O OOVO-3-CMp

·Η·Η HH HHHHHH H

WO >

0 O

HO H

<D O U <U

,α ·η <u bO

<d +j > cd

Eh C OH

cd 03 Η H „! cd cd a-3

5. 3 , I

CM 03 ΙΑ ΙΛ ΙΛ ΙΛ U"\ ΜΛ ΙΛ U"\ ΙΛ Lf\ ΙΑ ΙΛ l/\ LT\ C

O bO HHHHHH HHHHHH O

0Π S 03 °

CM cd H

O bO 03 * 1 H bO g J -Η O £ J D > g g +3

§ O

o c2 •H 0)+3 d +3 ·Η 03 Ο -P :<U *d

rf Cd -H

• Η Η173 ΙΑ O LA O OOOOO O LA O A Ο O ^

+3 c +3 HH CM VQ on S CM Η H g -P

goojS h a ao cd o xs ft ‘d s3 tj s c o c cd ο -η - > 3 .2 -8 -P β «J s 3 · ·δ £

bO

G n· -3· -3· -3· -=>; ‘d • H CM CM CM CM CVJ » Η Ο O Q O Q ,, g h on on on on n

•H CM CM CM CM CM

,nooo#<o ο o U I I I O I I g > i-3 Η H a Η H -rt 8204069 - 9 - cd a ο ·Η t 1 α Ό h a c o « ·η ooooo 22 J2 a cd ο o vp 99

•rt h Η Η Η H

0 © 0 ,id > *rl h S3 P %

•rt © S

i -h

H W

© CO

'OH Ό © aJ

•H 60 H

S OH

> 60 ©

H SC

d © -ri <U

a] 60 Ό P

•rt Cd »rt _ _ _ xj +>>000000 op

•rt C Cd Η Ο O CM O

O © p h Η Η H

O 0 0¾ o has o 4) © ·Η

•rt ' ft P W

p § a

Η I

0 a 60 ©

cd C M

+> -H «0

0 > P

fe-o <oc oooo 22 HO OOVOOJ oo

H-3- hO HH HH

0 CV1 Oh P O > © a on oft

E-ι CM

O

p

n*3 —H

cd

S P

3 C

o cd

•η cd ΐΛΐηιηΐΛ OO

t & Η Η H

•h go

p cd H

•rt 60 O

P P 60 C -H 0 cd D > S3 cd >

O

•η a P ft

cd O

0

H

cd P

> 0 W :o •rt Ό

P

o j- ia

A

C LA Ο LA O LA C—

•rt Η Η H

O

•H

"cd h

P

C

O

o c 0 o 8204069 - 10 -

De volgende tests demonstreren de nematocide activiteit. Voorbeeld A

Evaluatie van testsamenstellingen voor nematocide activiteit onder toepassing van vrij-levende hermafroditiscbe microben etende nematoden 5 Caenorhabditis elegans II.

In de volgende tests verd C. elegans gebruikt om de nematocide activiteit van de fermentatiebouillon en de oogstprut, bereid met de procedure volgens de uitvinding, vast te stellen. Dit organisme werd ook gebruikt om LL-C2302b^ en LL-C2302^ te evalueren teneinde de 10 nematodde activiteit daarvan vast te stellen.

In deze tests was de fermentatiebouillon bet mengsel van fermenta-tievloeistof en vast materiaal, genomen voordat bet vaste materiaal, d.w.z. de oogstprut, van de vloeistof werd gescbeiden. De oogstprut was bet na de scheiding achterblijvende vaste materiaal.

15 Voor evaluatie van de oogstprut, werd de vaste oogstprut gedis- pergeerd in een verhouding van 1 : 1 in gedestilleerd water. De fermentatiebouillon werd als zodanig gebruikt en bevatte zowel vloeistof als vast materiaal.

In de thans beschreven evaluaties, werd C. elegans bevaard in 20 een C. briggsae bewaarmedium. Het bewaarmedium is in de bandel verkrijg-baar bij Grant Island Biological Comapny, Grant Island, New York, en beeft de volgende samenstellingen: C. briggsae bewaarmedium^ *3

Component mg/dm 25 ANORGANISCHE ZOUTEN:

CaCl2.2H20 220,50

CuC12.2H20 6,50

Fe(lffll+)2(S01;)2.6H20 58,80 KH2P0^ 1225,50 30 Κ0Η (a)

MnClg.UHgO 22,20

ZnCl2 10,20 ANDERE COMPONENTEN: N-acetylglucosamine 15,00 35 adenosine-3'-(2')-fosforzuur.HgO 365,00 8204069 - n - cytidine-S’-^')-fosforzuur 323,00 D-glucose 1315,00 glut athion, gereduceerd 201,00 guanosine-3,-(2'J-PO^Na^.HgO 363,00 5 magnesiumcitraat.55^0 (dibasisch) 915,00 kaliumcitraat.H^O 136,00 DL-thiocticzuur 3,75 thymine 126,00 uridine-3'-(2')-fosforzuur 321,00 10 AMrUOZUREN: L-alanine 139 5,00 L-arginine 9T5,00 L-aspartinezuur 1620,00 L-cystelne HCl.H^O 28,00 15 L-glutamaat (Na) .HgO 550,00 L-glutamine 1163,00 glycine 722,00 L-histidine 283,00 L-isoleucine 861,00 20 L-leucine 1139,00 L-lysine HC1 1283,00 L-methionine 389,00 - L-fenylalanine 803,00 L-proline 653,00 25 L-serine 788,00 L-threonine 717,00 L-tryptofaan 181,00 L-tyrosine 272,00 L-valine 1020,00 30 VTTAiMIITEN: p-aminobenzoezuur 7,50 biotine 3,75 cholinediwaterstofcitraat 88,50 cyanooob alanine (B ) 3,75 35 folinaat (Ca) 3,75 8204069 - 12 - myo-inositol 6U,50 niacine 7,50 niacinamide 7,50 pantethine 3,75 5 pantothenaat (Ca) 7,50 pterolyglutaminezuur 7,50 pyridoxalfosfaat 3,75 pyridoxamine 2HC1 3,75 pyridoxine HC1 7,50 10 riboflavine^'-PO^iNa) .2Hg0 7,50 thiamine HC1 7,50

Referenties: (1) Hansen, E.L., Proc. Soc. Exp. Bio. & Med. 12130 - 393 (1966).

15 Opmerkingen: (a) naar behoefte ter instelling van de pH op 5,9 + 0,1.

Een putjesplaat met een reeks kleine putjes werd voor de evalua- . 3 ties gebruikt. Men bracht aseptisch 25 cm fermentatiebouillon, 1 : 1 20 water/oogstprutsuspensie, of een waterig/acetonoplossing van LL-C2302hoc of LL-C2302U/3 dat 31,25 tot 500 dpm van de testverbinding bevatte, in . 3 afzonderlijke putjes. Aan elk putje werd daarna 25 car van het C. elegans bewaarmedium toegevoegd, dat 10 - 20 itolwassen wormen plus larven van verscheidene leeftijden plus eieren bevatte. De platen wer-25 den daarna in een zuurkast gezet en bQ uren na de inenting onderzocht om de snelheid en mate van nematocide-activiteit van de testsamenstel-lingen vast te stellen. De verkreben gegevens staan hieronder. Wanneer voor de fermentatiebouillon activiteit werd waargenomen, werd de bouillon verder verdund tot een 1 : k bouillon tot C. elegans verhouding.

30 Tabel G

Samenstelling Concentratie, dpm, Nematocide activiteit of verdunning na U8 uren fermentatiebouillon D = 1 : 1 8 (geen motiliteit) D = 1 : b 8204069 - 13 -

Tabel G (vervolg) oogstprut LL-C2302U* 500 dpm 7 250 dpm 7 5 125 dpm 7 62,5 dpm 6 31,25 dpm 0 LL-C2302ly3 500 dpm 7 250 dpm 0 10 De activiteitsaanduiding die in deze evaluaties is gebruikt, was als volgt: 8 * geen motiliteit (schijnbare dood) 7 = in hoge mate verminderde motiliteit 6 = verminderde motiliteit 15 0 = normale motiliteit voor de soort.

Voorbeeld B

Evaluatie van LL-C2302Uc<, als nematocide middel tegen infectieve lar-ven van herkauwemematoden.

Evaluatie van LL-C2302Uoi als nematocide middel tegen de infec-20 tieve larven van herkauwemematoden: Haemonhmus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus axei, T. colubriformis; en tegen de azijnaalworm, Turbatrix aceti, werd bepaald onder toepassing van de bovenstaand vermelde nematodesoorten in plaats van C. elegans.

De verkregen gegevens staan in onderstaande tabel.

25 Derde stadium ommantelde larven.

Tabel H

In vitroa Activiteit tegen (na U8 uren) concentratie van H. contort. 0. circum. T. axei T.colub. T.aceti LL-C2302lw< , dpm 30 500 8 31° 813 8 6 250 7 8b 8b 7 6 125 7 7 7 6 6 62,50 7 6 7 66 31,25 6 6 066 35 0 (controle) 0 0 000 a Uitgevoerd in weefselcultuurplaten met 96 putjes, X1U868A bereid in 8204069 - ll* - ο dubbel-gedestilleerd water: 25 udm van LL-C2302l*cf-oplossing en 25 5 ' ydm nematodecultuur werden per putje toegevoegd.

De activiteiten-aanduidingen varen: 8 = geen motiliteit (schijnbare dood) 5 T = sterk venainderde motiliteit 6 = venainderde motiliteit , 0 = normals motiliteit voor de soort binnen 2k uren.

10 Voorbeeld C

Evaluatie van nematocide activiteit van bet antibioticum LL-C2302UOC tegen Nematospiroides dubius en Aspicularis tetraptera in muizen.

In de volgende tests werden witte Swiss-Webster vrouvt jesmuizen geinfecteerd met Nematospiroides dubius en Aspicularis tetraptera en 15 gedurende 3 weken vastgehouden om de infecties te laten rijpen.

Na deze periode werden de muizen willekeurig in groepen van vier verdeeld, en werden de groepen in afzonderlijke kooien geplaatst. Medi-cinale voedingen, die ongeveer 31,25 dpm tot ^000 dpm testverbinding bevatten, werden daarna aan de muizen gedurende 1 week ad libitum aan-20 geboden. Water werd eveneens gedurende de testperiode ad libitum gege-ven. Tijdens de behandelingsperiode werden de excrementen van de muizen onderzocht om vast te stellen of ze wormen bevatten. Bij alle behande-lingsgroepen werden wormen in de excrementen aangetroffen, hetwelk een nematocide activiteit bij alle concentraties van de verbinding tegen 25 beide nematoden aangeeft. Aan het einde van de 1 week durende behande-ling met medicinale voeding, werden de muizen aan een lijkschouwing onderworpen, en werd de inhoud van hun darmen op wormen onderzocht.

De verkregen gegevens zijn onderstaand weergegeven als procentuele vermindering van wormen in vergelijking met gelnfecteerde controles die 30 geen medische behandeling hadden ondergaan.

In deze tests werden ruve fermentatiebouillons, verkregen voor het oogsten van de prut, die 1000 tot kOOO dpm van het nematocide antibioticum bevatten, geevalueerd. Ook werden muizen geevalueerd, waarvan de voeding behandeld was met 31,25 tot 500 dpm I*L-C2302koc, opgelost in 35 een 1 : 1 mengsel van aceton en water.

- 15 -

Testsamenstelling Dieet Activiteit {% reductie) cone. 4®“ teg“ N. dubius A. tetraptera *fermentatiebouillon k.000 73 5 met LL-C2302UQC 2.000 U4 53 LL-C2302MX 1.000 65 33 500 70 SA**

250 63 SA

125 6l SA

10 62,5 29 SA

31,25 32 SA

* a hoeveelheid LL-C2302Uo£ niet bepaald O. = lichte activiteit: Verhoogd aantal pinvormen gevonden oij faeces-onderzoek.

15 dost * Vergeleken met gelnfecteerde controles die geen medicatie hadden gehad.

De nieuwe antibacteriele en anticoccidiale middelen volgens de uitvinding worden gevormd tijdens het kweken onder beheerste omstandig-heden van Actinomadura yumaense sp. nov.

20 Een representatieve stam vandit microorganisme werd geisoleerd uit een in Yuma County, Arizona verzameld bodemmonster en vordt bewaard in de cultuurverzameling van de Lerle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, Rev York, onder cultuurgetal LL-C2302k. Een levenskrachtige cultuur van deze representatieve stam is gedeponeerd 25 bij het Culture Collection Laboratory, Northern Regional Center, U.S.

Department of Agriculture, Peoria, Illinois 6l60b, en is aan zijn perma-nente verzameling toegevoegd onder het toegangscijfer NRRL 12515-Taxonomische karakterisering van NRRL 12515

De stam NRRL 12515 is taxonomisch gekarakteriseerd en geidentifi-30 ceerd als het type stam van een nieuwe soort van het genus Actinomadura bekend als Actinomadura yumaense sp. nov.

Aan de cultuurkenmerken, fysiologische kenmerken* en morfologi-sche kenmerken van de representatieve stam NRRL 12515 verden waarnemin-gen verricht onder toepassing van gedetailleerde methoden door 35 E.B.Shirling en D.Gottlieb, "Methods for characterization of

Streptomyces species", Internat. J. Syst. Bacteriol. l6: 313 - 3^0 - 16 - (1966), en R.E.Gordon et al., "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica. and the nocardin strain", Internat. J. Syst. Bacteriol. 2b: 5^· - 63 (197*0. In dit onderzoek toegepaste media werden gekozen uit de media, die aanbevolen waren door T.G.Pridham et al., "A selection of media 5 for maintenance and taxonomic study of StreptomycetesAntibiotics Ann., biz. 9*+7 - 953 (1956/1957); G.F.Gauze et al., "Problems in the classification of antagonistic actinomycetes," State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Mowcos (1957); en R.E.Gordon et al., supra, voor het taxonomische onderzoek van actinomyceten en bodembacte-10 rien. De chemische samenstelling van de celwanden van het microorganisme werd vastgesteld onder toepassing van de methode van H.A.Lechevalier et al,, "Chemical composition as a criterion in the classification of actinomycetes," Adv. Appl. Microbiol. lU: U7 — 72 (1971)· Fosfolipide-patronen werden vastgesteld onder toepassing van de methode volgens 15 M.P.Lechevalier et al., "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phopholipid composition,'/ Biochem. Syst. Ecol. 5: 2b9 - 260 (1977). Details zijn vermeld in de tabellen I - N, en een algemene beschrijving van de cultuur wordt..onderstaand gegeven. De onderstreepte beschrijvends kleuren zijn overgenomen van K.L.Kelly en D.B.Judd, "Color. Universal 20 Language and Dictionary of Names," U.S. Nat. Bur. Stand., Spec. Publ.

UlQ, Washington, D.C. (1976) en de bijgaande Inter-Society Color Council, Natl. Bur.Stand. Centroid Color Charts.

De voor deze nieuve soort, zoals vertegenvoordigd door de stam NRRL 12515 waargenomen gegevens, werden vergeleken met de gegevens, 25 die gepubliceerd zijn voor de bekende soorten van het genus Actinomadura (M. Goodfellow et al., "Numerical Taxonomy of Actinomadura and related actinomycetes," J. Gen. Microbiol. 122: 95 - 111 (1979); L.H.Huang, "Actinomadura macra sp. nov., the producer of antibiotic CP-l7,*+33 en CP-l7,^3^," Internat. J, Syst. Bacteriol. 30: 565 - 568 (1980); 30 J.Meyer, "New species of the genus Actinomadura/ Z. Allgem. Mikrobiol. 19: 37 - ^ (1979); H.Nomura en Y.Ohara, "Distribution of actinomycetes in soil. XI. Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier, et al.," J. Ferment, Technol. 90l - 912 (1971); en T.P.Preobrazhenskaya et al., "Key for identification of the species of 35 the genus Actinomadura," The 3iology of Actinomycetes and Related - IT -

Organisms 12: 30 -38 (1977)). De kveek NRRL 12515 heeft een geringe gelijkenis met Actinomadura pelletieri, maar lijkt op geen enkele andere beschreven soort en verschilt in een aantal eigenschappen van A. pelletieri. Daarom is stem NRRL 12515 als de type Stan aangeduid van een 5 nieuve soort, geheten Actinomadura yumaense, sp. nov., genoemd naar de verzamelplaats van het bodemmonster vaaruit de type stam was gelso-leerd.

Sporen worden gevormd in korte spiraalketens (maximale lengte 10 ongeveer 20 sporen per keten) op vertakte, nagenoeg kransstandige luchtsporoforen. De sporen zijn eivormig, 0,6 - 0,8 ym bij 1,0 tot 1,1 ym, met een glad oppervlak.

Celwands arnenstelling

Hydrolysaten van hele cellen van deze cultuur bevatten madurose 15 (3-0-methyl-D-galactose) en het meso-isomeer van diaminopimelinezuur (DAP). De cultuur heeft ook een type P-1 fosfolipidepatroon en geen ander diagnostisch fosfolipide dan een beetje fosfatidylglycerol. Deze eigenschappen zijn alle zeer typerend voor leden van het genus Actinomadura.

20 Hoeyeelheid groei

Een goede groei wordt vaargenomen op Bennett's agar, Gauze No,2 agar, NZ-amine-zetmeel-glucose-agar (ATCC medium 172), tomatenpastei-havermeel-agar, en gistextract-moutextract-agar; matige groei werd vaargenomen op Benedict's agar, Czapek's sucrose-agar, glycerol-aspara-25 gine-agar, Hickey-Tresner-agar, en havermee1-agar; slechte groei wordt vaargenomen op calciummalaat-agar, Gauze No.1 agar, en anorganische zouten-zetmeel-agar.

Vegetatief mycelium

Op media vaarop een goede groei plaats vond, verd vaargenomen, 30 dat het vegetatieve mycelium omhoog kvam en zich oprolde, en dat het in het algemeen gelig-grijze kleurnuances had.

Luchtmycelium en sporenkleur

De luchtmycelia en/of de sporenmassa's hadden eec vitte tot 261 lichtgrijze kleur. De luchtmycelia-produktie is op de meeste media 35 licht.

- 18 -

Oplosbare pigmenten

Afwezig op vele media; geel pigment op Benedict’s en glycerol-asparagine-agars; geel-groen pigment op calciummalaat-agar; groenig- bruin pigment op NZ-amine-zetmeel-glucose-agar; oranje pigment op 5 Bennettt's en gistextract-moutextract-agars.

Fysiologische reacties

Geen melaninepigmenten op pepton-ijzer-agar en tyrosine-agar (ISO-7); sterke peptonisatie van lakmoesmelk; sterke proteolyse van voedingsgelatine; matige reductie van nitraat; geen hydrolyse van ade-10 nine of guanine; sterke hydrolyse van hypoxanthine, tyrosine en xanthine; zvakke hydrolyse van zetmeel; hydrolyse van esculine; variabele hydrolyse van ureum. Geen groei bij U°C,10°C, of 55°C; matige groei bij 25°C en U5°C; goede groei bij 32°C en 37°C. Koolhydraatgebruik, zoals bepaald met de methode volgens T.G.Pridham en D.Gottlieb, "The 15 utilization of carbon compounds by some actinomycetales as an aid for species determination,1' J. Bacteriol. 56: 107 - ll1* (19^8): goed ge-bruik van glucose, glycerol en trehalose; matig gebruik van maltose en sucrose; slecht gebruik van fructose, galactose, inositol, mannose, en melezitose; geen gebruik van adonitol, arabinose, dulcitol, lactose, 20 mannitol, melibiose, raffinose, rhamnose, salicine, sorbitol en xylose. Zuurproduktie uit koolhydraten volgens de methode van Gordon, et al., supra: goede zuurproduktie uit glucose, glycerol, maltose, sucrose en trehalose; zwakke zuurprodukt uit galactose, inositol en mannose. Gebruik van organische zuren volgens de methode van Gordon et al., supra: 25 gebruik van acetaat, malaat, propionaat, pyruvaat, succinaat en tar-traat; geen gebruik van benzoaat, citraat, lactaat, rnucaat en oxalaat.

- 19 - 4) r-J Η Η me υ 2 £ •r- ·Η (U ® S,

U H .h3<5CH Jh HM

γλ 3 <D in U <U 0 0 o <0 v bC & bC to to u

CO Η Ϊ £ -H « k Μ -H

OJ 2 +j δ 6C c -P 8 2 _ι h .51 ,a Μ ·η δ 33 0 Jd r-l ,C ^ »αι 0 c η p ο 0 12 δ 2 't

It Λ ·Η η δ >4 ·Η Η Ο δ ·Η Μ 3 2 η <8 & Sq η >η ό μ| η S* 3 4) . £ ^ S · · · * Ο · δ δ Ον Η Ο ΟΝ Η OJ OS Ο

^ (¾ αο 00 ON 00 3d C~- COON

ο § 4)

^ 3 S

4 -μ 2 ,ο s ρ CQ 4) δ >4 ο 1 60 ·ο 00 ^ - , - —4 Hj ·Η Ο ιΗ Ο β S3 γ~Η 3 Ο,.Η Η 3 δ δ δ δ δ δ Ο ft δ >4 δ δ 4) 4) δ 4) ^ ” φ Ο tO 00 6000 6060 • 4« ι/Ν 2ΐ

Oj I -Ρ ΐΛ i +J ·* ·Η ·Η CNJ 60 Ο β> 05 Η. >*

.* 0) +J | I ω δ 6C ·« · I

Μ η £ 43 ·<-3 >4 ·Η 6C W Ο έ> W

j S CQ Ο ·Η δ a6£.H4JONg-'-5 λ- ,_ι aj ·η 4) ^ ?η δ ο ·η η ·η if ‘Γ1 (Ε c Ό·Η +3 Β6£Λ ι—I rH δ C -Λ fc.

s ο hS+j-p uoomIomooc Ζ ΰ Η · 0«·Η & · Μ 2i Η υ 2 15 <w <D o-3*k a 00 ·ο·ηηλ

..5 L· w vn (DftCC p ON ·* ¢) · C\J Jxj GO

H c 0 So-h-H δ H -H -omc* oo-H

.§ cL (U ftH 3 W -H 4) rl On 2, Γ2 P H

Η « ΪΓ tt) 04)kk δ δ Ο O *60 0¾

Si 03 .HO «ί,Ο δ 60 Ο ί^ ^δδ-Η ^δ· 'S 5 q_4 jj 4j .* δ *h >4 60 δ δ *h *h -p δ δ -μ

(2SL O J2 ¢) · 6£ Λ 43 60 -H 60 Η Η Λ -Η δ ,3 VO

^ 0 -P .2 00 .HO δ δ Η Α δ δ CJ rl 60OCNJ

δ β δ·Η Η Ον Η Μ 6 δ +>δΟοοδδ·ΗΜ e. (11 >45 δδ ^ +3 δ >4 Ο +3 -Ρ η Λ) 0·η6£·* *«δ δ^08κδ^Λ·*0 .Η g τ3δ ^ φ -η δ ή ή Η5δ ύ 3 δ·π gos δ ·η δ +3 Οι-μΒδ,δδ-ρδδ ρ η η αι 43 >4 ·Η Ο ιΗ Ο δ Λ Ο > Ο OJ3 W δ 3 ο Η Ρ(®·ηίΜ« ίι« ί<·Ρ δϋΛ!δ3Ρ»δδίΟ·Η a 4) ϋ·Ηθ iaO C3 60 40 r—t eJ 3 0L> *rH f-H 5 5 v !*

.η O * 6* >4 3 δ Ή >> 60δΟΗ60 43 *H

Jj S, «εδΗ>ί4δΗδδδΗ 60 δ δ δ δ ·Η « U & 455^ <ϋ6£+3-Ρ43>ίί54δΟ-Ρ60·Ρδ43Ν1δ < J SSSc.Η +3^+3 3+3 Οδ·Η+3-Ρ-Ρ·^·Η ^ S δϋϋΐϋ+ί.δδδδδΟδ-μΛδΟ-Ρδ-ρδ-ΗΗ § 1 a a 3 &£<§ a-a-sli-s ssi *a-s aas > ^ 43 S Λ δ o i ί 5 s 1 2 « ΐ 3 δ +3 ο 9 δ λ ο -ρ

h δ* 43 +3 43 jJ

3 λι.ηΜ ΛΛ Λ JC60 60 Η >φ.Η Τδ ϋδ ΟΌ Ο-Η-Η +J δΟ+3 δ ιϋ4}60δδ 9-¾¾ 1_ι ο >η δ Ο Η Η «Η Η Ο

ρ S3MS ¢0 COM43M60 MgS

Ο C

6C I

«I 2 ,- rs u , 2 .

3 >4 1 0 M

j- 60 3 43 >4 12 Η δ (Ο δ u 2,2 5j (jj G A ?-i Λ .. μ ricnr”OJ εηδδ “ a I · · s Μ p .h +3 - ScQ OO Η δ £h Π 0 +3 e - S3 Oil δ3·Η+3 3 a Ρδ>, OH Ό (U -Ηδ δδ δδδ 3 <H δ C CHAP δ-ΗΡίΡ o ^ C C Ηδδδ 3 δ 3 δ ^iPPSi η (11 rti δ aJU3t460 δ60δ60 iH δ ·Η 60 H 2 pq W οδοδ οδΟδ 60>+— δ - 20 -

G

β *d

•r-l G

3 G

G & J

42 u

tf H 6( U

•Η U ·Η (¾ HU H A _ 0 60 0 Ο Ό

«1 6( G G

6fl (OH

G H G G ,X 60

05 ¢) N U O G

Ο M *rs £ ft H

O G H G CQ i>

HOG O

^ Ό se| Ό

H 00 O <=0 U B S

a t- a\ t— +> Gv. o·».

β O 00 -3- •Η O “ *

β G OH

G V

,2 G I X I

(0

60 G VO O

•H <0 O * a ό ft ο h

G <0 G G G CQ

0 0 0 0 G

<U ki 4> <ϋ ft 60 60 60 00 o a IA G 00 I <U Η Ο ·Η g -p ό la > a

M| Ι-ΡΟΛΗΙ OiG G

• H +J · ·η·Η AJ O O · 6* H U Ο ^ 0 n^j--h>gg g o a - g ^

60 60 ·ηΒ«) OH Φ0Ο+) JOH

H -ft H>CJ6C«'G 60 4- 05 ft U

0+3 G N G U ft+3 O 05 CQ

> ,c G 60 P ··<+·+> OOG <5

G Ο ·η 6CO OHH+3 +3 H

0 G H · ·Η +3 ON U ON ·Η " U

> G 0 HG O IS u cn G 03 .

^ 0O \Q ·Η -P *> >5 63·η 0 GG ·“ Ό >> G Η ·Η a ·Η C ·Η ·Η 0 U U 00

M US ·> G |S U +3 0 G +3 G 60 *“3 Λ G H G

O +3 -H fit O 43 O > 43 6C SG ·αυ H A43 u « G O G O *· HG+3 g > 0 ο Ο · oJ 60 3 M G G 6C G U >> U a)

43 « G f, ΙΛ·Η Η Ο Μ·Η·Η 43 G -PCD

G U H 60\O HU UO G H G G G G » G

e+ N 060060ft > U G e-lGP mu 00 0 +3 0 -H 60 *H 03 6C 43 G cn G+3

H-P fl O ^ +3Ή+3 « Ό G U

G+3 H -P S 43 +3 43 — C · 6( G U

G-H O+J ο G 0 Η UOQ-H a -G 4*i H

0G G G 43 GSGU SOsH O G . G

H 0.H0O3CQ 03 U OU G U GaJ

4G ·* 60 G G ,Γ: β G 6C >4"6£ <H 00 GG

cn ftGH-HlsHls urn -P G ·η·η

«0 ο jo G U 6CG60U6C O G ·Η A

0 -H 0 6C U U U ·Η ·Η 60 ·Η ·Η < Ό 43 03

+3 β >j60 60 +3+>60+3PHOGPG G

+30 G ·Η ·Η 43 -P +ϊ ·η 0 Ο Ο ·Η·Η C 0 "U

G Η 0Η-Ρ0ΰ6Οβ·Ρ0ΛΗ·ΗΗ G G +3-P

HO +3 0 G ·Η Η ·Η H G >> bOGU > O ,¾ G

ft Jb4 (D 60 S H ft N ft6CS 04^6(0 ft GO

0 03 +3 JA

H G

60 ft 0 M

O O !> "-3 H ^ ·Η

O G ·" H

ft 0 G U

G _ U 4rf

Q S G X

S G O U G

Ο Ή ft G U

-p G Η O ft G

χ; 60 0 0 G U O

Ο Τ3 ·ηΌ Ό HOOPft

0 0 +30 u SbAM

HO GOO SMC

03 60 S 00 00 -P -¾ « «ί Λ Λ «> ft 0 O G ·<-)

1 G G G -H

H J H nO G

I 0

H 0 G

US G I G

0 0 -P G G G 60 II

43 S UG 60 +>G +3-P

0+3 M 60 G Ml 0O

03 0 IG H GH GG

H CO 0 1 0 ft 0 G G 03 qi cu 0GU+3+) - -

GC-pcn suexx S M

60 U SO J-,+3G00 GU

GPGGO 0 GU +3-PG rj A

OGGIG > a > mGG Ό G

£ O 60 N H G OG -PO60 0 «

GNGS60 43 +> JS 60 S G S O

- 21 -Tabel K

jysiologische reacties van Actinomadura yumaense NRRL 12515

Medium Incubatie- Hoeveel- Fysiologische reactie periode heid groei pepton-ij zer- 7 dagen goed lichte bruinkleuring a®ar lb dagen goed licbte bruinkleuring tyrosine-agar 7 dagen - matig geen pigment lU dagen goed gelig pigment 10 lakmoesmeik lb dagen goed goede peptonisatie 28 dagen goed sterke peptonisatie voedingsgelatine lk dagen goed licbte proteolyse 28 dagen goed totale proteolyse nitraatbouillon lU dagen goed zeer zwakke reductie 15 28 dagen goed matige reductie adenine-agar lU dagen goed geen hydrolyse 21 dagen goed geen hydrolyse guanine-agar lk dagen goed geen hydrolyse 21 dagen goed geen hydrolyse 20 hypoxanthine- 1¼ dagen goed totale hydrolyse 21 dagen goed totale hydrolyse tyrosine-agar 1^ dagen goed sterke hydrolyse 21 dagen goed sterke hydrolyse xanthine-agar lb dagen goed matige hydrolyse 25 21 dagen goed sterke hydrolyse NZ-amine met op- 5 dagen slechte of geen groei bij 4°C, losbare zetmeel 10°C en 55°C; matige groei bij.

en glucose-agar 25°C; 28°C en i+5°C; goede groei

(ATCC Med. No. bij 32°C en 37°C

172) ureumbouillon 28 dagen goed ontleding variabel esculinebouillon lU dagen goed hydrolyse 28 dagen goed hydrolyse zetmeelagar 5 dagen goed geen hydrolyse 10 dagen goed geen hydrolyse 35 8204069 - 22 -

Tabel L

Koolstofbrongebruik van Actinomadura yumaense NRRL 12515 op ISP-9 koolhydraatgebruikmaking

Ineubatie: 28 dagen Temperatuur: 28°C

5

Koolstofbron Gebruik adonitol 1-arabinose dulcitol 10 fructose slecbt d-galactose slecbt d-glucose goed glycerol goed i-inositol slecbt 15 lactose matose redelijk d-mannitol ή-mannose slecbt d-melezitose slecbt 20 d-melibiose d-raffinose 1-rhamnose salicine sorbitol 25 sucrose redelijk d-trehalose goed d-xylose negatieve controle 820 4 0 6 9 - 23 -Tabel Μ

Zuurproduktie uit verscheidene koolhydraten door Actinomadura yumaense NEEL 12515 op Gordon's basaal anorganiscii stik-stofmedium

5 Incubatie: 28 dagen Temperatuur: 28°C

Koolstofbron Zuurproduktie _ 7 dagen 28 dagen adonitol 1-arabinose 10 dulcitol fructose d-galactose - + d-glucose +++ +++ glycerol ++ +++ 15 i-inositol - + lactose maltose - +++ d-mannitol d-mannose - + 20 d-melezitose d-melibioee d-raffinose 1-rhamnose salicine 25 sorbitol sucrose - +++ d-trehalose - +++ d-xylose negatieve controle 30 +++ = sterk positieve responsie ++ = matige positieve responsie + = geringe positieve responsie - = negatieve responsie 8204069

- 2k -Tabel N

Gebruik van organische zuren door Actinomadura yumaense NEEL 12515 op Gordon's modificatie van Koser's basaal agar (Koser's citraatagar)

5 Incubatie: 28 dagen Temperatuur: 28°C

Koolstofbron Gebruik acetaat + benzoaatr, citraat 10 lactaat malaat + slijmzuur oxalaat propionaat + 15 pyruvaat + succinaat + tartraat + + = positieve responsie - = negatieve responsie

Opgemerkt wordt dat de term Actinomadura yumaense niet beperkt 20 is tot de stain Actinomadura yumaense NEEL 12515 of tot stammen die volledig aan de bovenstaande groeikarakteristieken en microscopische karakteristieken beantwoorden, die slechts ter toelichting zijn gege-ven. De hier beschreven Actinomadura yumaense onrvat alle stammen van Actinomadura yumaense die de antibiotica 11-02302^^, en jota pro-25 duceren en die niet scherp kunnen worden onderscheiden van Actinomadura yumaense NEEL 12515 en zijn subculturen, waaronder mutanten en varian-ten daarvan. De term "mutanten” omvat de natuurlijke (spontane) mutanten van dit organisme alsmede geinduceerde mutanten, die uit dit orga-nisme zijn verkregen door verscheidene mutagene middelen die aan de 30 deskundigen bekend zijn, waaronder blootstelling aan rontgenstraling, ultraviolette straling, stikstofmosterd, actinofagen, nitrosaminen en dergelijke. Het wordt eveneens gewenst en beoogd dat inter- en intra-specifieke genetische recombinanten worden omvat, die door aan de deskundigen bekende genetische technieken zijn verkregen, b.v. door con-35 jugatie, transductie en genetische manipulatietechnieken.

8204069 - 25 -

Het kveken van Actinomadura yumaense kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid ran raste of rloeibare cultuurmedia. Media die voor de produktie van de antibiotica LL-C2302U¢£, en jota bruikbaar zijn, omvatten een assimileerbare bron van stikstof zoals eiwit, eivit-5 hydrolysaat, polypeptiden, aminozuren, maisveekvloeistof, enz., en anorganische anionen en kationen, zoals kalium, natrium, ammonium, calcium, sulfaat, carbonaat, fosfaat, chloride enz. Sporenelementen zoals boor, molybdeen, koper enz. worden als verontreinigingen van an-dere bestanddelen van de media toegevoerd. Beluchting in tanks en 10 flessen vordt gerealiseerd door steriele lucht door of op het oppervlak van het fermentatiemedium te leiden. Een mechanische roerder zorgt voor verdere agitatie in tanks. Naar behoefte kan een antischuimmiddel zoals varkensreuzelolie of een siliconenontschuimer worden toegevoegd.. Actinomadura yumaense wordt gegroeid en bevaard op agarhellin-15 gen, b.v. Bennett's agar, gistmoutagar, of ATCC medium 172. ATCC medium 172 heeft de voorkeur. De helling wordt geent met een cultuur van Actinomadura yumaense en bij 28 - 37°C, bij voorkeur bij ongeveer 32°C, gedurende ongeveer 7 dagen gelncubeerd. Deze uitgangsculturen kunnen door serie-overbrengingen op verse agarhellingen worden bevaard, of 20 er kan een plug van de agarhoudende mycelia van de goed gegroeide agar-helling worden gebruikt voor het enten van vloeibare media.

Schudflesinentingen van Actinomadura yumaense worden bereid 3 · 3 voor 100 cm stenel vloeistofmediurn m 500 cm flessen ir. te enten met door schrapen of wassen uit een agarhelling van de cultuur verkre- 25 gen sporen. Voorbeelden van geschikte entmedia zijn:

Medium A

rundvleesextract 0,3%

Bacto®trypton^ 0,5¾ glucose 1,0% 30 gistertract 0,5% water q.s. 100¾ ( een pepton, merkprodukt van Difco Laboratories, Detroit, Michigan.)

De pH wordt met een verdunde base, b.v. natriumhydroxyde inge-steld op 6,8 - 7,2.

35 8204069 - 26 -

Medium B

glucose 1 $ zetmeel 2 $ gistextract 0,5$ 5 N-Z amine A®2 0,5$ calciumcarbonaat 0,1$ water 100 $

Casexne digest, merkprodukt van Sheffield Chemical Co., Div. Nat'1 Dairy Products Corp., Norwich, N.Y.) 10 Medium B heeft de voorkeur.

De flessen worden bij een temperatuur van 25 - 35°C, bij voor-keur bij 32°C gelncubeerd en gedurende 1 - U dagen heftig geagiteerd op een roterende schudmachine. Dit entmateriaal wordt daarna gebruikt voor het inenten van een fermentatiecultuur, of kan deze cultuur wor-15 den bevroren en bewaard om entmateriaal voor latere entculturen te verschaffen.

De volgende media zijn voorbeelden van media die geschikt zijn voor de fermentatie van Actinomadura yumaense voor de produktie van de antibiotica LL-C2302UdC,^3 en jota.

20 Medium C

glucose 1,5$ glycerol 1,5$ sojameel-3 " 1,5$ calciumcarbonaat 0,1$ 25 natriumchloride 0,3$ water q.s, 100 $ (J Kan worden vervangen door katoenzaadmeel of oplosbare vleesbestand-delen met gelijk effect.)

Medium D

30 glucose 3 $ sojameel 1,5$ calciumcarbonaat 0,1 $ natriumchloride 0,3$ water q.s. 100 $ 3204069 - 27 -

Medium E

zetmeel 1 $ melasse 2 $ sojameel 1,5$ 5 calciumcarbonaat 0,1$ water q.s. 100 $

Medium F

glucose 3 $ oplosbare vleesbestanddelen 2,5$ 10 natriumchloride 0,2$ calciumcarbonaat 0,1$ water q.s. 100 $

Medium G

glucose 3 $ 15 sojameel 0,5$ ammoniumsulfaat 0,3$ natriumchloride 0,2$ calciumcarbonaat 0,1$ water q.s. 100 $

20 Medium H

glucose 3 $ ammoniumsulfaat 0,3$ dibasisch kaliumfosfaat 0,1$ calciumcarbonaat 0,2$ 25 natriumchloride 0,1$ water q.s. 100 $

Medium D heeft de voorkeur.

De fermentatie kan worden uitgevoerd in 100 cm^ media in een 500 cm^ fles, die ingeent is met 3 - 10$ (v/v) van een op de boven-30 staand beschreven wijze bereide entcultuur en gedurende 2k - 72 uren onder beluchting geincubeerd bij 25 - 35°C, bij voorkeur bij ongeveer 32°C. Monsters van de fermentatiecultuur kunnen worden ingevroren en bewaard voor later gebruik als entmateriaal voor entculturen.

Anderzijds kan de fermentatie worden uitgevoerd in grotere fer-35 mentatietanks, die voorzien zijn van beluchtings- en agitatiemiddelen.

3 2 3 4 0 6 9 - 28 -

Elke tank vordt ingeent met 3 - 10# (v/v) entmateriaal, dat op de boven- staand beschreven wijze is bereid. Er wordt beluckt met een snelheid 3 3 van 0,5 - 2,0 dm stenele lucht per dm bouillon per minuut en het fermentatiemediun wordt door een roerder met een toerental van 200 -5 !+00 omw./min geagiteerd. De temperatuur wordt gehouden op 25 - 35°C, bij voorkeur op 32°C. De fermentatie wordt voortgezet totdat antibioticum zich in bet fermentatiemedium opboopt, gewoonlijk na 100 - 150 urea, op welk moment bet antibioticum wordt geoogst.

Het antibioticum kan worden geoogst en gezuiverd overeenkomstig 10 de in bet Amerikaanse octrooischrift 1+.278.663 bescbreven metboden, of overeenkomstig de volgende procedure:

De ruwe fermentatiebouillon, die de bele cellen bevat, bereid op de bovenstaand bescbreven wijze, wordt gemengd met een gelijke volu-mehoeveelbeid van een willekeurig niet-koolwaterstof, met water niet 15 mengbaar organisch oplosmiddel. De voorkeur bebben methyleenchloride of ethylacetaat. De organiscbe fase wordt afgescbeiden en onder vermin-derde druk geconcentreerd tot een olieacbtige siroop.

De olieacbtige siroop wordt opgelost in methyleencbloride en toegevoegd aan een kolom van silicagel, alumina, Sephadex LH-20® 20 (Pharmacia Fine Chemicals Div. van Pharmacia, Inc., Piscataway, H.J.), of magnesiumaluminiumsilicaat. Voorbeelden van geschikte oplosmiddelen voor het ontwikkelen van de kolom zijn diethylether, ethylacetaat, een 1 : 1 tot 1 : 7 (v/v) mengsel van methyleenchloride : ethylether, 10 - h0% aceton in methyleencbloride, 2 - 10# lagere alcohol (de voor-25 keur heeft methanol) in methyleencbloride, 2 - 15# acetonitrile in methyleenchloride, of 2 - 15# dioxan in methyleenchloride. Methyleenchloride : ethylacetaat 1 : 1 (v/v) heeft de voorkeur. Fracties worden ver-zameld en gecontroleerd op de aanwezigheid van antibacteriele werkzaam-heid door bioanalyse tegen een gevoelig organisme, b.v. Bacillus subti-30 lis. Actieve fracties worden gecombineerd en onder verminderde druk geconcentreerd tot een residu. Dit residu wordt opgelost in een organisch oplosmiddel, b.v. tert-butanol (geprefereerd), kenzeen, of p-di-oxan, en gevriesdroogd.

De gevriesdroogde vaste stof wordt opgelost in een geschikt or-35 ganisch oplosmiddel, b.v. methyleenchloride, hexaan, methyleenchloride : 8204069 - 29 - ethylacetaat, diethylether, hexaan : ethylacetaat, hexaan : chloroform, of hexaan : ether. Diethylether heeft de voorkeur. Deze oplossing wordt geschud met water en de pH wordt ingesteld op een pH van 1,5 -1+,0, bij voorkeur ongeveer 2,5, met een willekeurig verdund anorganisch 5 zuur. De organische fase wordt afgescheiden, gewassen met water om even-tuele overmaat zuur te verwijderen, gedroogd boven een geschikt droog-middel, gefiltreerd, en onder verminderde druk geconcentreerd tot een residu.

Dit residu wordt opgelost in een geschikt oplosmiddel en de op-10 lossing laat men langzaam verdampen, bij voorkeur bij ongeveer 1+°C.

Voorbeelden van geschikte oplosmiddelen zijn methyleenchloride, hexaan, methyleenchloride : ethylacetaat, diethylether, hexaan : ethylacetaat, hexaan : chloroform, of hexaan : ether. Hexaan : ether 5 : 2 (v/v) heeft de voorkeur. De verkregen kristalien worden verzameld en gewas-15 sen, bij voorkeur bij ongeveer ^0°C, met een willekeurige koolwater-stof die bij matige temperatuur kookt, b.v. hexaan of heptaan, en aan de lucht gedroogd teneinde als eindprodukt het antibioticum X-11868a in de vorm van het vrije zuur te verkrijgen,

Wanneer het produkt in de vorm van een zout gewenst is, kan het 20 vrije zuur door behandeling met het geschikte kation, bij voorkeur in de vorm van een verdunde anorganische base, worden omgezet overeenkom-stig de aan de deskundigen bekende procedures.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe. De media A, B, C enz. zijn zoals bovenstaand gedefinieerd. Tenzij anders is aange-25 geven werden alle procedures uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer (22°C) en bij een .druk van 1 atm.

Voorbeeld I

Gewassen sporen van een agarhelling van Actinomadura yumaense 3 3 NERL 12515 werden gebruikt om :een 500 cm fles te enten, die 100 cm 30 steriel medium B bevatte. De fles werd gedurende 2 dagen bij 28°C ge- incubeerd op een roterende schudinrichting.

Een 5%'s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht 3 3 in 100 cm steriel medium C in een 500 cm fles en gedurende 5 dagen bij 28°C geincubeerd op een roterende schudinrichting.

35 De aanwezigheid van antibiotische activiteit werd dagelijks ge- volgd door bioanalyse tegen Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Bacillus 8204069 - 30 - subtilis, en Streptococcus faecalis en anthelmintische activiteit werd gevolgd door bioanalyse tegen de vrij levende nematode Caenorhabditis elegans.

Voorbeeld II

• 3 3 5 Men bereidde zeven flessen van 500 cm , die elk 100 cmJ bevatte van een van de volgende steriele media: “3

Fles 1: 100 cur medium C o fles 2: 100 cm medium C met 1,5? katoenzaadmeel in plaats van soja-meel

10 fles 3: 100 cm medium C met 1,5% oplosbare vleesbestanddelen in plaats van sojameel fles U: 100 cm^ medium D

3

fles 5: 100 cm medium E

fles 6: 100 cmr medium F •3 15 fles 7: 100 cm medium G.

Deze flessen werden elk geent met een 5%'s entmateriaal van Actinomadura yumaense NRBL 12515, dat in medium B was gegroeid. De flessen werden daarna gedurende k - 6 dagen bij 28°C geincubeerd op een roterende schudinrichting.

20 Elk van de bovenstaande culturen bleek actief te zijn bij analy se op antibiotische werkzaamheid als in. voorbeeld I en bij analyse op anticoccidiale activiteit tegen Eimeria tenella in weefselculturen van kuikennieren.

Voorbeeld III

25 Ingevroren fermentatiecultuurcellen van Actinomadura yumaense 3 . 3 NEEL 12515 werden gebruikt om een 500 cm fles te enten die 100 cm steriel medium B bevatte. De fles werd daarna gedurende 1+ dagen bij 32°C geincubeerd op een roterende schudinrichting.

Een 5$'s entmateriaal van deze cultuur werd daarna overgebracht 3 · 3 30 m 100 cm steriel medium H m een 500 cm fles en gedurende 5 dagen bij 28°C geincubeerd op een roterende schudinrichting.

Antibacteriele werkzaamheid werd op de in voorbeeld I beschreven wijze bevestigd en anticoccidiale werkzaamheid werd op de in voorbeeld II beschreven wijze bevestigd.

35 De aanwezigheid van antibiotische werkzaamheid werd ook aange- 8204069 - 31 - toond door dunnelaagchromat ografie over silicagelplaten, ontvikkeld in ethylacetaat : chloroform TO : 30 (v/v).

Voorbeeld IV

~ 3 3

Men entte 100 cm stenel medium A in een 500 cm fles met ge- 5 vassen sporen van een agarhelling van Actinomadura yumaense NREL 12515.

De fles verd gedurende 2 dagen bij 32°C geincubeerd op een roterende s chudinri chting.

Een 5/S’s entmateriaal van deze cultuur verd daarna overgebracht . 3 3 m 100 cm stenel medium H in een 500 cm fles en gedurende 2 dagen 10 bij 32°C geincubeerd op een roterende schudinrichting.

Een 5#’s entmateriaal van deze cultuur verd daarna overgebracht • 3 3 m een 500 cm fles die 100 cmJ vers steriel medium H bevatte en gedurende 6 dagen bij 28°C geincubeerd op een roterende schudinrichting.

De antibacteriele verkzaamheid verd op de in voorbeeld I be-15 schreven wijze bevestigd.

Voorbeeld V

3 · 3

Men entte tvee flessen van 500 cm die elk 100 cm stenel medium A bevatte, met een ingevoerde entcultuur van Actinomadura yumaense NRRL 12515 en incubeerde gedurende 2 dagen bij 32°C op een roterende 20 schudinrichting.

De inhoud van de tvee flessen verd daarna verenigd en toege- 3 ... 3 voegd aan 12 dm vers stenel medium A in een 20 dm fles. Deze cultuur verd daarna gedurende 2 dagen bij 28°C onder beluchting geincubeerd.

De inhoud van deze fles verd daarna overgebracht in een 300 dm^

O

25 enttank die 288 dnr steriel medium A bevatte en deze cultuur verd be-lucht en geagiteerd gedurende 25 uren bij 32°C.

Aan het eind van de 25 uren durende incubatie, verden de 300 dm^ 3 3 entcultuur overgebracht m een 1500 dm fermentor, die 1200 dm·1 steriel medium C bevatte. Deze cultuur verd onder beluchting en agitatie gedu-30 rende 115 uren bij 28°C geincubeerd.

De fermentatiebouillon werd geanalyseerd op antibiotische verkzaamheid door dunnelaagchromatografie over silicagelplaten, die ontvik-keld verden in ethylacetaat : chloroform TO : 30 (v/v). Als alternatief verden verscheidene van de ontvikkelde platen ondervorpen aan bioanaly-35 se tegen Bacillus subtilis, vaarbij de aanvezigheid van antibiotische 8 2 0 £ 0 6 9 - 32 - werkzaamheid werd aangetoond.

Voorbeeld VI

Een typerend medium, dat gebruikt werd voor het groeien van bet primaire entmateriaal, werd overeenkomstig de volgende formulering 5 samengesteld: rundvleesextract 0,3%

Bacto® -trypton 0,5% glucose 1,0% gistextract 0,3% 10 Bacto ® -agar 0,15# water q,.s. 100 %

Door wassen of schrapen uit een agarhelling van Actinomadura yumaense NRRL 12515 verkregen sporen en mycelia werden gebruikt om een 500 cm fles, die 100 cm van het bovenstaande gestenliseerde medium 15 bevatte, te enten. De fles werd op een roterende schudinrichting ge- plaatst en gedurende bQ uren heftig bij 32°C geagiteerd. Het resulteren- de entmateriaal (100 cm^) in de fles werd gebruikt om 1 dm^ van het- 3 zelfde steriele medium m een 2 dm fles te enten. Dit entmateriaal werd met steriele lucht belucht terwijl de groei gedurende kQ uren 20 bij 28°C werd voortgezet. Deze 1 dm-3 cultuur werd daarna gebruikt om een 30 cm^ fermentortank die hetzelfde steriele medium bevatte, te enten, en deze tank werd met steriele lucht belucht en gedurende k2 uren bij 28°C geincubeerd.

Voorbeeld VII

25 Men bereidde een fermentatiemedium overeenkomstig de volgende formulering: dextrose 1,3% · glycerol 1,5% sojameel 1,3% 30 calciumcarbonaat 0,1# nat riumchlori de 0,3% water q.s. 100 %

De pH werd met 6 N natriumhydroxyde ingesteld op 7,0 en het me- 3 dium werd gestenliseerd. Een 30 dm portie van het volgens voorbeeld 35 I bereide entmateriaal werd gebruikt om 250 dm^ van het bovenstaand 8204069 - 33 - q beschreven medium in eea 300 dm' ? fermentor te enten. Men liet steriele lucht bij de prut en agiteerde de prut met een roerder welke een toeren-tal van 220 onw./min had. Fermentatie werd uitgevoerd gedurende 97 uren bij 32°C, waarna de prut verd geoogst.

5 Voorbeeld VIII

Men bereidde een fermentatiemedium overeenkomstig de volgende formulering: dextrose 3,0# sojameel 1,3% 10 calciumcarbonaag 0,1# natriumchloride 0,3# water q.s. 100 %

De pH werd met 6 N natriumhydroxyde ingesteld op 7>0 en het me- 3 dium werd gestenliseerd. Een 300 dm portie van het volgens voorbeeld • · . 3 15 I bereide entmatenaal werd gebruikt om 3000 dm van het bovenstaand vermelde medium in een fermentor te enten. Men liet steriele lucht toe bij de prut. De prut werd geagiteerd door een roerder met een toerental van 100 omw./min. Fermentatie werd uitgevoerd gedurende 115 uren bij 32°C waarna de prut werd geoogst.

20 Voorbeeld IX

1. De fermentatieprut (100 dm^) werd met 6 N HC1 ingesteld op een pH van k,0. De zure prut werd daarna gedurende 1 - 2 uren geroerd met een gelijke volumehoeveelheid methyleenchloride. Het mengsel van prut en methyleenchloride werddaaraa gefiltreerd onder toepassing van diato- 25 meeenaarde als filtreerhulpmiddel. Het methyleenchloride-extract werd weggetrokken en onder verminderde druk geconcentreerd tot ongeveer 2 3 . ...

dm van gedeeltelijk gezuiverde antibiotica.

2. Chromatografie van de gedeeltelijk gezuiverde antibiotica over silicagel.

30 Een glazen kolom met een diameter van 7 cm werd gepakt tot- een hoogte van 91 cm met Woelm silicagel TSC. Het ruwe concentraat (zie boven onder 1) met een volume van ongeveer 2 dm^ liet men in de kolom .... . 3 van silicagel sijpelen. De kolom werd daarna eerst ontwikkeld met 3 dm methyleenchloride, gevolgd door methyleenchloride : ethylacetaat (1:1 35 volumeverhouding) waarbij een totaal van 126 fracties werd verkregen, q elk met een volume van 80 cm . Dit werd daarna verder ontwikkeld onder 8204069 -3^- toepassing van ethylacetaat-ethanol (7:3) waarbij nog eens 87 frac-ties werden verkregen.

De fracties 58 - 87* die rijk waren aan 02302^¾ , werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd tot een residu dat 90,k g 5 woog. Dit residu werd opgelost in een mengsel van 600 cnr diethylether en 600 cm hexaan. De verkregen suspensie werd gefiltreerd waarbij een helder filtraat werd verkregen. Het heldere filtraat werd onder vermin-derde druk geconcentreerd tot dat zich kristallen begonnen te vormen. Deze suspensie liet men gedurende een nacht verouderen. Het kristallij-10 ne C2302U werd op een druppeltrechter verzameld, gewassen met koude ether en aan de lucht gedroogd, waarbij 33,1 g kristallijn C2302U werd verkregen. Een extra hoeveelheid C2302U van 12,U g werd verkregen door verdere volumevermindering van de gecombineerde wasvloeistof en filtraat.

15 De fracties 177 - 203 van de elutie met ethylacetaat-ethanol die verrijkt waren aan C2302k/S, werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij 6,7 g van gedeeltelijk gezuiverd C2302U/3 werd verkregen, dat op de bovenstaand beschreven wijze werd behandeld.

De fracties 20k - 213 van de eLutie met ethylacetaat-ethanol, •20 die verrijkt waren aan LL-C2302U jota, werden verenigd en onder vermin-derde druk geconcentreerd tot een pasta en herhaalde malen met methanol geextraheerd. Het methanolextract werd geextraheerd met methyleen-chloride, dat op een kolom werd gebracht die Woelm silicagel bevatte.

De kolom werd gewassen met methyleenchloride en daarna geelueerd met 25 methyleenchloride : ethylacetaat (2 : 3). De afgetapte materialen werden door dunndaagchromatografie gevolgd en de actieve fracties werden verenigd, behandeld met houtskool, geconcentreerd en herhaalde malen geextraheerd met heptaan. Het uiteindelijke heptaanextract werd gedurende b8 uren bij 0°C gekoeld en de kristallen werden door filtratie 30 van de moedervloeistof verwijderd.

Deze moedervloeistof werd opgelost in methyleenchloride en liet men in een glazen kolom sijpelen, die gepakt was met Woelm silicagel.

De kolom werd daarna achtereenvolgens geelueerd met 2 dm methyleens o o 8 dmr methyleenchloride : ethylacetaat (1 : 1) en U dmJ ethylacetaat : 35 methanol (9 : 1). Het eluaat werd in fracties verzameld en de fracties 8204069 - 35 - werden op hun antibiotische 3amenstelling onderzocht. De actieve frac-ties werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij een residu werd verkregen dat LL-C23024 jota bevatte.

Voorbeeld X

5 3. Verdere zuivering van C2302y3 van de chromatografie op s-licagel.

Men liet Sephadex^LH20 opzwellen in een mengsel van hexaan-methyleenchloride-methanol (10 : 5 : 1). Een glazen kolom met een diameter van 5 cm werd met de gel gepakt tot een hoogte van 86 cm. De charge, 3 g gezuiverd LL-C23024/tf werd opgelost in 10 cm^ methyleenchlo-10 ride, 1 cm^ methanol en 10 cm^ hexaan en kreeg de gelegenheid om in de gelkolom te sijpelen. De kolom 3 werd daarna ontwikkeld met oplosmiddel met dezelfde samenstelling als gebruikt was voor het afleveren van het antibioticum aan de kolom. Met behulp van een collector werden fracties verzameld. De eerste 23 fracties hadden elk een volume van 17 cm^. De 15 fracties 17 - 26 bevatten volgens dunnelaagchromatografie C23024/3.

Deze fracties werden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd waarbij zuiver amorf LL-C2302U/3 werd verkregen in een hoeveelheid van 1269 mg.

Voorbeeld XI

20 Kristallisatie van LL-C2302ly3 als natriumzout.

Gezuiverd LL-C23024 (2,4 g), bereid zoals beschreven in de sec- ties B en C, werd opgelost in een mengsel van 500 cm^ diethylether, l6o car hexaan en 25 car methyleenchloride. De verkregen oplossing werd 3 overgebracht op een scheitrechter die 300 cm gedestilleerd water be-25 vatte. Men voegde druppelsgewijs verdunde HC1 (1 N) toe totdat de pH na schudden en bezinken een waarde van 2,0 - 2,5 bereikte. De zure wa-terige fase werd weggegooid en de met zuur behandelde organische laag werd driemaal achter elkaar gewassen met 400 cur water. De gewassen organische laag werd geroerd met een theelepel met Darco G βθ-poeder gedu-30 rende 15 minuten en door Celite gefiltreerd. De ontkleurde organische •3 laag werd op 500 cm gedestilleerd water gebracht en men voegde drup-pelsgewijze 5 N NaOH toe totdat de pH na schudden en bezinken een waarde van 11,0 - 11,5 bereikte. De basische waterfase werd weggegooid en de resterende organische laag werd tweemaal gewassen met porties water 35 van 400 cm . De gewassen organische laag werd boven natriumsulfaat ge- 8204069 - 36 - droogd en daarna onder venninderde druk geconcentreerd tot een -volume 3 van 150 cm . Men liet dit concentraat verscheidene uren in een zuurkast staan. Het kristallijne LL-C2302k/3 werd op een treclxter verzameld, met koude hexaan gewassen en aan de lucht gedroogd, waarbij k02 mg van 5 het kristallijne zout van LL-C2302U/3 werd verkregen. Dit monster werd gebruikt voor microanalyses en gekozen spectraalgegevens.

Analyse: berekend voor C^H^O^Na: C 59,70; H 8,33; 0 29, k6; as 2,k9$; gevonden : C 6l,55; H 8,79; as 3,31^; N, 0.

10 MP. (Fisher-Johns apparaat = 17 k (FDMass Spec) = 92k s +3,2,in methanol.

Voorbeeld XII

Zuivering van LL-C2302k jota.

Een Waters Prep. 500A h.p.l.c. (high performance liquid chroma- 15 tography) instrument werd voorzien van een silicagelpatroon onder een druk van 38 bar. De charge, die 5,0 g van het uit voorbeeld III afkom-• · 3 stige ruwe materiaal was, werd opgelost m 50 cm heptaan :ethylace- taat (k5 : 55) en werd in de kolom van silicagel gelnjecteerd. De kolom werd daarna ontwikkeld met hetzelfde oplosmiddelmengsel met een stroom- 3 3 20 snelheid van 200 cnr/min waarbij kO fracties van k00 cm werden verzameld. De fracties 21-32 werden verenigd, geconcentreerd tot een resi-du, fijngewreven met hexaan en verdampt, waarbij men zuiver LL-C2302k jota kreeg. De bovenstaande procedure werd viermaal herhaald waarbij men een tot ale verenigde hoeveelheid van 280 mg amorf LL-C2302k jota 25 verkreeg.

Een portie amorf LL-C2302k jota van 90 mg werd opgelost in 10 3 3 cm diethylether, gemengd met 10 cm water, en met 0,1 N zoutzuur mge-steld op een pH van 2,5. De etherlaag werd gewassen met water, met 0,1 N natriumhydroxyde ingesteld op een pH van ongeveer 11, afgescheiden 30 en opnieuw gewassen met water. De etherfase werd boven natriumsulfaat gedroogd, gefiltreerd, en geconcentreerd tot een residu. Een oplossing van dit residu in ether-hexaan liet men langzaam verdampen, waarbij men een amorfe witte vaste stof verkreeg.

Deze amorfe witte vaste stof had de volgende eigenschappen: 2 c 35 elementairanalyse: C 61,79; H 8,8k; as 0,32; JplJ-q ~ +27 (C 0,72k, 8 2 0 a 0 6 9 - 37 - methanol); velddesorptiemassaspectrometrie: (M+Na)+ = m/e 953, het berekende mole-cuulgewicht is dus 930.

820 4 06 9

Claims (14)

1. Biologisch zuivere cultuur van Actinomadura yumaense sp. nov. welke cultuur in staat is tot het produceren van de antibiotica LL-C2302en jota in verzamelbare hoeveelheden na fermentatie in een vloeibaar voedingsmedium dat assimileerbare bronnen van koolstof, stik- 5 stof en anorganische zouten bevat-

2. Biologisch zuivere cultuur volgens conclusie 1, waarin genoemde Actinomadura yumaense sp. nor. Actinomadura yumaense NRBL 12515 is.

3. Biologisch zuivere cultuur van het microorganisme Actinomadura yumaense sp. nov. volgens conclusie 1 of 2, waarin het microorganisme 10 spontaan gemuteerd is zodat het microorganisme genetisch gewijzigd is maar nog wel het vermogen heeft om de antibiotica LL-C2302^ a( en jota te synthetiseren. U. Biologisch zuivere cultuur van het microorganisme Actinomadura yumaense sp. nov. volgens conclusie 1 of 2, waarin het microorganisme 15 aan mutagene middelen is onderworpen zodat het microorganisme genetisch gewijzigd is maar nog wel het vermogen heeft om de antibiotica LL-C2302^ct ,/3 en jota te synthetiseren.

5, Het antibioticum LL-C2302U waarin de vrijwel zuivere vorm (a) een optische rotatie /«7^ van +32° + 2 (0,^95$, methanol) 20 en fjxj^ van +U6° + 2 (0,Uh-0^, chloroform) heeft, (b) een elementairanalyse {%) van ongeveer C 61,55; H 8,79 heeft; (c) een smeltpunt van ongeveer 171 - 173° C heeft; (d) een molecuulgewicht volgens velddesorptiemassaspectroscopie 25 van 902 heeft; (e) een koolstof-13-kernmagnetisch resonantiespectrum in gedeu-tereerd chloroform bij 80 MHz heeft dat nagenoeg is zoals getoond im fig.2; (f) een infraroodabsorptiaspectrum in KBr heeft, dat nagenoeg 30 is zoals getoond in fig.1; en (g) een protonenkeramagnetisch resonantiespectrum in gedeute-reerd chloroform bij 20 MHz heeft, dat nagenoeg is zoals getoond in 8204069 - 39 - fig.3. ·

6. Farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout van het antibioticum LL-C23024/3 volgens conclusie 5.

7. Het antibioticum LL-C2302U jota, vaarin de nagenoeg zuivere 5 vorm 26 (a) een optische rotatie £%]*£ - +27 (C 0,72U, methanol) heeft; (b) een elementairanalyse (%) van ongeveer C 61,79; H 8,8U heeft; (c) een molecuulgewicht volgens velddesorptiemassaspectroscopie van 930 heeft; en 13 10 (d) een C-kernmagnetisch resonantiespectrum in gedeutereerd chloroform bij 80 MHz heeft dat nagenoeg is zoals getoond in fig.6, 7 en 8; (e) een inftraroodabsorptiespectrum in KBr heeft, dat nagenoeg is zoals getoond in fig.U; en 15 (f) een protonenkernaagnetisch resonantiespectrum in gedeute reerd chloroform bij 20 MHz heeft, dat nagenoeg is als getoond in fig.5.

8. Farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout van het antibioticum LL-C2302^ jota volgens conclusie 7·

9. Werkvijze voor de bereiding van de antibiotica LL-C2302k<£, /3 20 en jota, omvattende een aerobe fermentatie van Actinomadura yumaense sp. nov. of een mutant daarvan in een vloeibaar medium dat assimileer-bare bronnen van koolstof, stikstof en anorganische zoutsn bevat, tot-dat een aanzienlijke antibiotische verkzaamheid is verleend aan de fermentatiebouillon, en daarna winning van het antibioticum daaruit.

10. Werkvijze volgens conclusie 9, vaarin de temperatuur van de fer- mentatiecultuur gedurende 2k - 150 uren op 25 - 35°C vordt gehouden.

11. Werkvijze volgens conclusie 9 of 10, vaarin de Actinomadura yumaense sp. nov. Actinomadura yumaense NRRL 12515 is.

12. Werkvijze voor het beheersen van protozoeninfecties in varmbloe-30 dige dieren, omvattende een orale toediening aan de dieren van een protozoacidaal werkzame hoeveelheid van de verbinding LL-C2302U^ of LL—02302^ jota.

13. Werkvijze volgens conclusie 12, waarbij de warmbloedige dieren vlees producerende dieren zijn, de infectie coccidiosis is en het anti- 35 coccidiale middel toegediend vordt aan de dieren in de voeding of het 8204069 1 ->0 - ( drinkwater, bevattende 2,5 ~ 120 dpm van het anticoecidiale middel. lk, Samenstelling voor bet beheersen van coccidiosisinfecties in pluimvee, omvattende een eetbare drager en ongeveer 0,000025 gew.jS tot ongeveer 0,06 gev.% van de verbinding LL-C3202lyS, LL-C2302U jota of 5 de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan.

15. Samenstelling volgens conclusie lU, vaarin de eetbare drager drinkwater is en dit 2,5 - 120 dpm van het anticoecidiale middel bevat.

16. Werkvijze voor het beheersen van nematodes in varmbloedige die-ren en in de bodem die de nematodes bevatten, door orale introductie 10 in de dieren of applicatie op grond die van nematodes is vergeven, van een nematocide verkzame hoeveelheid van een verbinding LL-C2302kec, LL-C2302^2 of fannaceutisch aanvaardbare zouten van deze verbindingen, mengsels van de verbindingen of zouten, of fermentatiebouillons of vaste oogstprut, waaruit de nematocide antibiotica vorden verkregen. 8204069