HU190814B

HU190814B - Process for preparing new polyether type antibiotics

Info

Publication number: HU190814B
Application number: HU823370A
Authority: HU
Inventors: David P Labeda; Joseph J Goodman; Donald B Borders; Raymond T Testa; John H Martin; Sidney Kantor; Robert L Kennett; Irwin B Wood
Original assignee: American Cyanamid Co,Us
Priority date: 1981-10-22
Filing date: 1982-10-21
Publication date: 1986-11-28
Also published as: NL194396C; ES8308359A1; GB2108113B; IT1197433B; GB2147808A; JPH0824593B2; FI823603A0; SE456588C; FR2515207B1; CH661283A5; SE8205992D0; JPH05219980A; FI75187C; SE8205992L; AU558914B2; IE54813B1; FR2515207A1; ES516718A0; CA1198386A; GB2147808B

Description

A találmány tárgya új fermentációs eljárás az új antibiotikus hatású LL-C23 024a, és β és v jelzésű anyagok előállítására az új Actinomadura yumaense sp. nov. vagy mutánsainak szabályozott körülmények között végzett fermentációjával.

Az (I) általános képletben R és R, jelentése azonos, jelentésük hidrogénatom vagy metilcsoport vagy R jelerttése hidrogénatom és Rj jelentése metilcsoport.

Az LL-C23 024a szerkezete az (I) általános képlet szerinti, a képletben R jelentése hidrogénatom, R, jelentése metilcsoport.

A találmány szerinti eljárással előállított LLC23 024β jelölésű antibiotikum fizikai és kémiai jellemzőiben, ezek között például mikroanalízisének eredményében, optikai forgatóképességében, infravörös spektrumában, ^I3C-magmágneses rezonancia spektrumában, ¹H-magmágneses rezonancia spektrumában tér el a korábban ismert antibiotikumoktól.

Az LL-C23 024β jelzésű antibiotikum szerkezete az (I) általános képlet szerinti, a képletben R és R, jelentése azonosan, hidrogénatom.

A szerkezetet illető előző feltételezést az elemi analízis, a téremissziós tömegspektroszkópiás vizsgálat eredményeként kapott molekulatömeg, az olvadáspont, az infravörös spektrum, a ¹³C-magmágneses rezonancia spektrum (¹³C-NMR spektrum) és a proton-magmágneses rezonancia spektrumnak (Ή-NMR spektrum) a később ismertetésre kerülő példákban és a mellékelt ábrákban szereplő eredményeire alapoztuk.

Az 1. ábra az LL-C23 024β jelzésű antibiotikum infravörös spektrumát mutatja kálium-bromidban;

a 2. ábra az LL-C23 024β jelzésű antibiotikum ¹³C-NMR spektruma 20 MHz frekvencián deuterokloroformban, belső standardként tetrametilszilán (TMS) alkalmazásával; a 3. ábra az LL-C23 024fi jelzésű anyag

Ή-NMR spektruma 80 MHz frekvencián deuterokloroformban, belső standardként TMS alkalmazásával.

1. Táblázat

LL-C23 024β jelzésű antibiotikum ™C-NMR spektruma ppm TMS-re vonatkoztatva

Kémiai eltolódás (ppm) Szénatomok száma

10.5 1

11,0 1

12,2 1

17,0 1

17.7 1

17,9 1

22,3 1

26,1 1

26.8 1

27.6 1

30.2 1

32,0 1

33.3 1

33.7 2

33.8 2

1. Táblázat (folytatás)

Kémiai eltolódás (ppm)	Szénatomok száma
36,5	1
36,8	1
39,0	1
39,9	1
45,5	2,
57,1	1
59,1	1
60,7	1
66,9	1
67,6	1
70,2	1
71,3	1
72,9	1
74,9	1
75,1	1
79,9	1
80,8	1
82,1	2
84,5	1
84,7	1
85,6	1
86,9	1
95,8	1
96,9	1
97,7	1
107,5	1
179,2	I
Összes szénatom	46

Az LL-C23 024 v új, coccidiumokkal szemben igen aktív poliéter antibiotikum. Hatása az ismert poliéter antibiotikumokénak legalább tízszerese. Téremissziós tömegspektroszkópiás adatok alapján molekulatömege 930, ez az adat a vegyűletre kapott ^I3C-NMR spektrummal egybevetve a C^HgjO,, molekulaképlet feltételezésére vezet. Az LL-C23 024 v szerkezete az (I) általános képlet szerinti, a képletben R és R, jelentése metilcsoport. Az egyetlen eddig közölt 930 molekulatömegű poliéter antibiotikum a J. Antibiotics, 33, (2), 252 (1980) irodalmi helyen ismertetett A28 695B jelzésű antibiotikum (hidroxi-szeptamicin), melynek szerkezete és biológiai tulajdonságai jelentősen eltérnek az LL-C23 024 v jelzésű antibiotikumétól.

Az előbbiekben ismertetett megállapításainkat az elemi analízis, az optikai forgatóképesség, a téremissziós tömegspektroszkópiás eredményekből számított molekulasúly, az infravörös spektrum, a ¹ ’C-NMR spektrum és a ’H-NMR spektrumnak a később ismertetésre kerülő példákban és a mellékelt ábrákban szereplő eredményeire alapoztuk.

A 4. ábra az LL-C23 024 v jelzésű antibiotikum infravörös spektrumát mutatja kálium-bromidban; az 5. ábra az LL-C23 024 v jelzésű antibiotikum

Ή-NMR spektrumát mutatja 80 MHz frekvencián deuterokloroformban, belső standardként

TMS-t alkalmazva;

a 6. ábrán az LL-C23 024 v jelzésű antibiotikum ^,3C-NMR spektrumát mutatja 20 MHz frekvencián deuterkloroformban, belső standardként TMS-t alkalmazva;

190 814 a 7. ábra az LL-C23 024 v jelzésű antibiotikum ^l3C -NMR spektrumát mutatja - kiterjesztett méréshatár: 0-50 ppm - 20 MHz frekvencián, deuterokloroformban, belső standardként TMS-t alkalmazva; és a 8. ábra az LL-C23 024 v jelzésű antibiotikum ¹³C-NMR spektrumát mutatja - kiterjesztett méréshatár: 50-110 ppm - 20 MHZ frekvencián, deuterokloroformban, belső standarként TMS-t alkalmazva.

Az LL-C23 024 v jelzésű antibiotikum ¹³C-NMR spektrumát deuterokloroformban 20 MHz frekvencián kaptuk. A kapott csúcsok TMS-re vonatkoztatott kémiai eltolódása - ppm-ben megadva és az egyes csúcsok becsült szénatomszáma a 2. táblázatban szerepel. Kloroformra észlelt csúcsok:

75,4, 77,0, 78,6.

2. Táblázat

Kémiai eltolódás

Szénatomok száma

10,6

10.9

11,7

16.4

17.6 18,0

21.7

22.9

24.1

28.2

31.2

32.2

33.4

33.8

34.2

36.7

37.2

39.4

40.3

44.5

45.5

47.6

56.8

59.9

60,8

68,5

68,8 71,3 72,2	1 1 1	Mikroorganizmus	(μ/ml)
öU Staphylococcus aureus, Smith	640
76,1	I	Staphylococcus aureus, SSC 80-11	640
76,9	1	Staphylococcus aureus, SSC 80-32	640
78,5	1	Staphylocuccus aureus, SSC 80-38	640
81,0	1	₅₅ Staphylococcus aureus, LL-14 Staphylococcus aureus, LL-45	640
81,3	1	640
81,8	1	Staphylococcus aureus, LL-27	1280
84,8	1	Staphylococcus aureus, ATCC
85,3	1	25 923	640
85,6	1	Streptococcus pyogenes, C203 ⁶⁰ Streptococcus β-hemolytic Keller	10
86,8	I
88,5	1	T623	80
95,9	1	Streptococcus pneumoniae, 78-1	80
97,9	1	Enterococcus, SSC-80-62	640
99,6	1	Enterococcus, SSC-80-63 65	1280

2. Táblázat (folytatás)

Kémiai eltolódás	Szénatomok száma
107,2	1
173,0	1
Összesen:	48

o Az LL-C23 024a, és β és v jelzésű antibiotikumok szerves karbonsavak, így nem toxikus, gyógyászati célra alkalmas kationokkal só képezhető belőlük. így a szabad sav formájú antibiotikumokból célszerűen közömbös oldószerben sztöchiomet15 rikus mennyiségű kationnal, például nátrium-, kálium-, kalcium-, magnézium- és ammóniumionokkal, valamint szerves aminok kationjaival, mint tri(rövidszénláncú)alkil-aminnal - például trietilaminnal, trietanol-aminnal -, prokainnal és hason20 lókkal elegyítve sók képződnek.

Az LL-C23 024β jelzésű antibiotikum kationokkal képzett sói általában vízben viszonylag oldhatatlan, a legtöbb jól ismert szerves oldószerben, például metil-alkoholban, etil-acetátban, aceton25 bán, kloroformban, heptánban, éterben és benzolban oldódó szilárd kristályos anyagok.

A találmány célját illetően a szabad sav formájú antibiotikum egyenértékű a belőle képzett gyógyászati célra alkalmas, nem toxikus sóval.

Az LL-C23 024 és v jelölésű antibiotikumok standard agar-higításos módszerrel vizsgálva grampozitív baktériumok ellen in vitro aktívnak bizonyultak.

Eredményeinket a minimális gátló koncentráció (MGK) pg/ml egységben való megadásával a 3. és a 4. táblázatokban ismertetjük. Az LL-C23 024 és v jelzésű antibiotikumok 2560 gg/ml vagy ennél alacsonyabb koncentrációban nem hatásosak gram negatív organizmusokkal szemben.

3. Táblázat

Az LL-C23 024β jelzésű antibiotikum in vitro antibakteriális aktivitása

Minimális gátló

190 814

4. Táblázat

Az LL-C23 024 v jelzésű antibiotikum in vitro antibakteriális aktivitása

Mikroorganizmus	Minimális gátló koncentráció (úg/ml)
Enterococcus, OSU 75-1	10
Enterococcus, SM 77-15	10
Staphylococcus aureus, SSC 79-18	10
Staphylococcus aureus, FU 79-19-2	20
Micrococcus lutea, PCI 1001	10
Staphylococcus aureus, Smith Staphylococcus aureus, ATCC	5
25 923	5

Amint azt a táblázatokban ismertetett adatok mutatják, az LL-C23 024α, β és v jelzésű antibiotikumok bizonyos Gram-pozitív baktériumok növekedését gátolják, így helyi alkalmazásra vagy felülettisztításra szolgáló antiszeptikus anyagként használhatók bőr, eszközök, fal, padló stb. lemosására szolgáló oldatokban.

Ezen kívül az LL-C23 024α, β v jelzésű antibakteriális hatású anyagokat in vivő hatásosnak találtuk - mint azt a következő vizsgálattal bemutatjuk - baromfiban coccidiumok ellen.

Két nappal a befertőzés előtt 1 napos kísérleti csirkéknek különböző mennyiségű gyógyszerrel elkevert tápot adtunk. A kísérlet folyamán mindvégig a következőképpen összeállított tápot adtuk:

Vitamin-aminosav premix	0,5%
Nyomelemek	0,1%
Nátrium-klorid	0,3%
Dikalcium-foszfát	1,2%
őrölt mészkő	0,5%
Stabilizált zsír	4,0%
Vízmentes lucerna,
17% fehérjetartalmú	2,0%
Búza gluten-liszt,
41% fehérjetartalmú	5,0%

Menhaden halból készült halliszt,

60% fehérje tartalmú 5,0% '

Szójaliszt, olajat tartalmazó, 44% fehérje tartalmú 30,0%

Takarmánykukorica, finomra őrölt kiegészítésül 100%-ra

Az előbbi tápban szereplő vitamin-aminosav premix a következő összetételű - a megadott menynyiségek 1 kg kész tápra vonatkoznak.

Butelizett hidroxi-toluol 125,0 mg dl-Metonin 500,0 mg

A-vitamin 3300,0 N.E.

D_? vitamin 1100,0 N.E.

Riboflavin 4,4 mg

E vitamin 2,2 N.E.

Niacin 27,5 mg

Pantoténsav 8,8 mg

Kolin-kloríd 500,0 mg

Folsav 1,43 mg

Menadion-nátrium-hidrogén-szulfát 1,1 mg B, ₂ vitamin 0,11 mg

Takarmánykukorica, finomra őrölt, kiegészítésül 5,0 g-ra ne _r ° A kísérleti csirkéket ezután minden egyes csirke takarmányába bekevert 5000 spórázott Eímeria acervulina oocystát és annyi Eimeria tenella oocystát tartalmazó kevert inokulummal fertőzzük be, hogy a kezeletlen kontrolban 85-100% mortalitást ³θ idézzen elő. A csirkék táp- és folyadékfogyasztását a kísérleti időszakban nem korlátoztuk. A befertőzést követő hetedik napon a kísérletet befejeztük, az állatokat lemértük, felboncoltuk, megvizsgáltuk a beleiken található sérüléseket. Az eredményeket ³⁵ az 5. és a 6. táblázatban ismertetjük, és bemutatjuk, hogy a tápban lOppm vagy még kevesebb LLC23 024β vagy v jelzésű antibiotikum alkalmazása esetén is megnő a fertőzött állatok élettartama. Az eredmények azt mutatják, hogy jelentősen csök⁴⁰ kennek az állatok belein az Eimeria tenella és az Eimeria acervulina hatására létrejövő sérülések is.

5. Táblázat

LL-C23 024 jelzésű antibiotikum coccidium ellenes hatásának értékelése csirkéken végzett kísérletben

Vegyület	Koncentráció a tápban, ppm	Kísérleti állatok száma	Túlélés, %	Csökkent sérülést mutató
E. tenella	E. acervulina
LL-C23 024β	15	3	100	100	100
LL-C23 024β	10	5	100	60	100
LL-C23 024β	5	5	80	0	100
FNK*	0	15	46,6	0	0
LL-C23 024β	120	15	100	100	100
	60	15	100	100	100
	30	15	100	100	100
	0	15	20	0	0
	NNK	15	100	-	-
LL-C23 024β	20	15	100	87	100
	15	15	100	60	100
	10	15	60	0	0

190 814

5. Táblázat (folytatás)

Vegyület	Koncentráció a tápban, ppm	Kísérleti állatok száma	Túlélés, %	Csökkent sérülést mutató
E. tenella	E. acervulina
	5	15	47	7	0
	0	15	27	0	0
	NNK	15	100	-	-

FNK* = fertőzött, nem kezelt kontroll

6. táblázat

LL-C23 024β jelölésű antibiotikum coccidium ellenes hatásának értékelése csirkéken végzett kísérletben

Koncentráció a tápban (ppm)	Kísérleti állatok száma	Túlélés, %	Csökkent sérülést mutató állatok, %
E. tenella	E. acervulina
15	5	100	100	100
10	5	100	100	100
5	5	60	20	60
0	15	20	0	0
15	10	100	100	100
7,5	10	100	70	100

A következő kísérletek a nematocid aktivitást mutatják be.

A Példa

Kísérleti készítmények nematocid aktivitásának értékelése a szabadon élő himnős mikróbapusztitó ne mát ódára, a Caenorhabditis elegáns Il-re gyakorolt hatás vizsgálatával

A következő kísérletben C. elegáns alkalmazásával vizsgáljuk a találmány szerinti eljárással kapott fermentlé és a fennentléből kiszűrt sejttömeg nematocid aktivitását. Ugyanezt az organizmust használjuk az LL-C23 024a és az LL-C23 024β jelzésű antibiotikumok nematocid aktivitásának vizsgálatára.

Ezekben a kísérletekben fermentlé alatt a fermentációs folyadék és a szilárd anyag elegyét értjük, mielőtt a szilárd anyagot kiszűrjük belőle, azaz mielőtt a sejttömeget a folyadéktól elválasztjuk. A sejttömeg az elválasztás után visszamaradó szilárd anyag.

A sejttömeg aktivitásának vizsgálatára az összegyűjtött szilárd anyagot 1 :1 arányban desztillált vízben vesszük fel. A fermentlevet a vizsgálathoz eredeti állapotában használjuk.

Az itt ismertetésre kerülő vizsgálatban a C. elegánst C. briggsae fenntartó táptalajban tartjuk fenn. Ez a fenntartó táptalaj a Grant Island Biological Company (Grant Island, New York) gyártmánya, kereskedelmi forgalomban kapható, össze-

Kálium -dihidrogén-foszfát	1225,50
Káliumhidroxid	(a)
Mangán-klorid-víz (1/4)	22,20
Cink-klorid	10,20
EGYÉB ÖSSZETEVŐK
N-acetil-glükóz-amin	15,00
Adenozin-3'-(2')-foszforsav-víz (1 /1)	365,00
Citidin-3'-(2')-foszforsav	323,00
D-glükóz	1315,00
Glutátion, redukált	204,00
Guanozin-3'-(2')PO₄Na₂-víz (1/1)	363,00
Magnézium-citrát-viz (1/5) (dibázikus)	915,00
Kálium-citrát-víz (1/1)	486,00
DL-tioktánsav	3,75
Timin	126,00
Uridin-3'-(2')-foszforsav	324,00
AMINOSAVAK
L-alanin	1395,00
L-arginin	975,00
AMINOSAVAK
L-aszparaginsav	1620,00
L-cisztein HCl-víz (1/1)	28,00
L-glutamát (Naj-viz (1/1)	550,00
L-glutamin	1463,00
Glicin	722,00
L-hisztidin	283,00
L-izoleucin	861,00
L-leucin	1439,00
L-lizin HC1	1283,00
L-metionin	389,00
L-fenilalanin	803,00
L-prolin	653,00
L-szerin	788,00
L-treonin	717,00
L-triptofán	184,00
L-tirozin	272,00
L-valin	1020,00
VITAMINOK
p-aminc-benzoesav	7,50

tétele a következő:

C. briggsae fenntartó táptalaj (1) összetevők mg/1

SZERVETLEN SÓK

Kalcium-klorid-víz (1/2) 220,50

Réz(II)-klorid-víz (1/2) 6,50

Vas(II)-diammónium-diszulfát-víz (1/6) 58,80

-5190 814

Biotin	3,75
Kolin-dihidrogén-citrát	88,50
Cianokobalamin (B¹²)	3,75
Folinát (Ca)	3,75
Mio-inosit	64,50
Niacin	7,50
Niacinamid	7,50
Pantetin	3,75
VITAMINOK
Pantotenát (Ca)	7,50
Pteroil-glutaminsav	7,50
Piridoxál-foszfát	3,75
Piridoxamin 2HC1	3,75
Piridoxin HC1	7,50
Riboflavin- 5'-PO₄(Na). 2H₂O	7,50
Tiamin HC1	7,50

Irodalmi hivatkozás:

(1) Hansen, E. L., Proc. Soc. Exp. Bio. and Med. 121, 30-393 (1966).

Megjegyzés (a) a pH 5,9 ± 0,1 értékre beállításához szükséges mennyiségben.

A kiértékeléshez kis lyukak sorozatát tartalmazó lyukasztott agar-lemezt használunk. Az egyes lyukakba sterilen 25 ml fermentlevet vagy 25 ml 1 : 1 arányban vízzel hígított sejttömeget vagy 31,25-500 ppm LL-C23 024a vagy LL-C23 024β vizsgálandó vegyület vizes/acetonos oldatát mérjük. Ezután minden lyukba 25 ml C. elegáns fenntartó táptalajt mérünk, mely 10-20 kifejlett férget, ezenkívül különböző lárvákat és tojásokat tartalmaz. Ezután a lemezeket fülkébe helyezzük, és 48 órás inokulálást követően megállapítjuk a vizsgált készítmény nematocid aktivitásának sebességét és mértékét. A kapott eredményeket a következőkben, a 7. táblázatban ismertetjük. Abban az esetben, ha a fermentlevet aktívnak találjuk, azt tovább hígítjuk, hogy 1 :4 arányú fermentlé : C. elegáns tenyészet elegyet kapjunk.

7. Táblázat

Készítmény	Koncentráció (ppm) vagy hígítás (H)	Nematocid aktivitás 48 óra elteltével
Fermentlé	Η = 1 : 1	8 (nincs mozgás)
	H = 1 :4	8
Sejttömeg		8
LL-C23 024a	500	7
	250	7
	125	7
	62,5	6
	31,25	0
LL-C23 024β	500	7
	250	0

Az aktivitás értékelésénél használt jelölések magyarázata :

Jelölés:

= nincs mozgás (nyilvánvaló pusztulás) = jelentősen csökkent mozgékonyság = csökkent mozgékonyság = a fajra jellemző normális mozgékonyság

B Példa

LL-C23 024a készítmény nematocid hatásának értékelése kérődzők nematodáinak fertőző lárváira** gyakorolt hatás alapján

Az LL-C23 024a készítmény kérődzők nematódáinak fertőző lárváival szemben kifejtett nematocid hatását az előzőekben leírt módon, a C. elegáns helyébe Haemonhmus contortust, Ostertagia circumcinctat, Trichostrongylus axeit, vagy T. Colubriformist helyettesítve, illetve Turbatrix aceti nevű ecetféreg elleni hatását is vizsgáltuk, a C. elegáns helyébe ezt helyettesítve.

A kapott eredményeket a 8. táblázatban ismertetjük.

**Harmadik állapotban lévő betokosodott lárvák

C Példa

LL-C23 024a jelzésű antibiotikum nematocid aktivitásának értékelése Nematospiroides dubius és Aspicularis tetraptera ellen egérben

A következő kísérletben Swiss-Webster nőstény fehér egereket fertőztünk meg Nematospiroides dubius-szal és Aspicularis tetrapterával, és három hétig tovább tartottuk az egereket, hogy a fertőzés teljesen kifejlődjön. A háromhetes időszak után az egereket véletlenszerű kiválasztással négy egyedből álló csoportokra osztottuk, és a csoportokat külön ketrecekben helyeztük el. Az egereket ezt követően egy héten át 31,25 ppm-4000 ppm vizsgálandó gyógyszert tartalmazó táppal etettük ad libitum. A vizsgálati időszakban vizet is ad libitum fogyasztottak az állatok. A vizsgálati időszak folyamán az egerek ürülékében vizsgáltuk a féregtartalmat. Minden kísérleti csoportban észleltünk féregürítést, így a vizsgált vegyületek minden koncentrációjának és mindkét nematoda elleni aktivitásának vizsgálata lehetséges volt. Az egyhetes gyógyszeres táp etetési időszak elteltével az egereket felboncoltuk és béltraktusuk tartalmát féregre vizsgáltuk. A kapott eredményeket a 9. táolázatban ismertetjük a kezelt állatokban talált féregszámnak a fertőzött kezeletlen állatokban talált féregszámhoz viszonyított százalékos csökkenésével kifejezve.

190 814

8. Táblázat

In vitro* LL-C23 024a koncentrációja ppm		Aktivitás (48 óra elteltével)
H. Contort.	O. Circum. T. Axei ellen	T. Colub.	T. Aceti

500	8	8^b	8^b .	8	6
250	7	8^b	8^b	7	6
125	7	7	7	6	6
625	7	6	7	6	6
31,25	6	6	0	6	6
0 (Kontroll)	0	0	0	0	0

^a,A vizsgálatot 96 lyuku szövettenyészet-lemezen végezzük, az LL-C23 024a vegyületet kétszer desztillált vízben oldjuk; 25 μΐ LL-C23 024α oldatot és 25 μΐ nematóda tenyészetet adunk egy-egy lyukba.

Aktivitás jelölése: _n = nincs mozgás (nyilvánvaló pusztulás) = jelentősen csökkent mozgékonyság = csökkent mozgékonyság 20 = a fajra jellemző normális mozgékonyság ^b> 24 órán belül

Ezekben a kísérletekben a sejttömeg kinyerése előtti nyers, 1000-4000 ppm nematocid hatású an- 25 tibiotikumot tartalmazó fermentlevet vizsgáltuk. Ugyancsak vizsgáltuk a 31,25-500 ppm LLC23 024a anyagot tartalmazó tápot, a vizsgálandó anyagot aceton, víz 1 : 1 arányú elegyében oldva vittük be a tápba.

Az LL-C23 024a jelzésű antibiotikum hatása Meloidogyne incognita gyökércsomó nematóda lárvákra” in vitro vizsgálatban (mikrotiter lemezek ; 50 ml teljes térfogat). A vizsgálatot az A példában leírthoz hasonlóan végezzük.

9. Táblázat

Vizsgált vegyület	Koncentráció a tápban (ppm)	Aktivitás (% csökkenés)*** N. dubius A. tetraptera ellen
♦ LL-C23 024a	4000	73	_
tenyészet	2000	44	53
fermentleve	1000	65	33
LL-C23 024a
jelzésű anyag
	500	70	SA**
	250	63	SA
	125	61	SA
	62,5	29	SA
	31,25	32	SA

* az LL-C23 024a mennyiségét nem határoztuk meg.

*· gyenge aktivitás, a székletvizsgálat során megnövekedett számú végbélgilisztát találtunk.

·♦* a fertőzött, gyógyszerrel nem kezelt kontrolihoz hasonlítva.

10. Táblázat

Koncentráció” PPm	Aktivitás”
24 óra	48 óra
1”	₂d)	l<t,	2^d)
300	8		8
150	7		8	—
75	6	6	7	7
37,5	0	0	0	0
18,75	0	0	0	0
0	0	0	0	0

^a) A lárvák többsége J₂S fejlettségi állapotú és 40 paradicsomgyökérről származik.

^b) Az aktivitás jelölésére alkalmazott számok jelentése azonos a 7. táblázatnál megadottal.

^c> Desztillált vizes oldat. ^d) 1 és 2 párhuzamos vizsgálatokat jelölnek.

Az LL-C23 024a v és β jelzésű antibiotikumok in vitro antibakteriális hatását all. táblázatban mutatjuk be.

11. Táblázat

Mikroorganizmus

Minimális gátló koncentráció (pg/ml) LL-C23 024a LL-C23 024v LL-C23 024β

Gram-pozitív coccusok

Streptococcus faecium ATCC 8043 Staphylococcus aureus 82 ATCC 6538P Micrococcus luteus PCI ATCC 9341 Gram-pozitív pálcák

Bacillus megaterium 164 ATCC 8011 Bacillus sp. E ATCC 27859 Bacillus subtilis NRRL 558 Bacillus sp. TA ATCC 27 860

0,31 6,25 12,5	1,57 6,25 12,5	0,79 62,5 250
12,5	7,5	125
0,39	0,79	6,25
12,5	25	250
6,25	12,5	125

11, Táblázat (folytatás)

Mikroorganizmus	Minimális gátló koncentráció (pg/ml)
LL-C23 024a LL-C23 024v LL-C23 024β
Gram-pozitív fonalak Mycobacterium phlei Streptomyces cellulosae 097 ATCC 3313	12,5 25 250 25 25 500

A 12. táblázatban az LL-C23 024a és v jelzésű antibiotikumok és ismert poliéter antibiotikumok coccidium ellenes hatását hasonlítjuk össze.

12. táblázat

A hatóanyag
státusza¹*	neve	márkaneve	alkalmazott mennyiség (ppm)²·
Kísérleti	LL-C23 024a LL-C23 024v Carriomycin Lonomycin Septamycin		7,5 15 120 60 ~ 125 60~ 125
Kifejtesztés	Narasin		80-100
alatt	Salinomycin	Coxistac^R	60—100
Elfogadott	Lasalocid	Avatec^K	75- 125
	Monensin	Coban^R	99—121

** Az „elfogadott” megjelölés az amerikai egyesült államokbeli alkalmazást jelenti, a „kifejlesztés alatt” jelölés pedig a piaci forgalmazást megelőző laboratóriumi és szántóföldi vizsgálatok folytatását.

²* A „kísérleti” és a „kifejlesztés alatt” csoportokra az értékeket a hatásosság alapján adtuk meg, a valós piaci alkalmazásnál változhatnak.

Találmányunk szerint a? új antibakteriális és coccidium ellenes hatású anyagokat Actinomadura yumaense sp. nov. szabályozott körülmények között végzett tenyésztésével állítjuk elő.

Fenti mikroorganizmust képviselő törzset az arizona állambeli Yuma megyéből származó talajmintából izoláltuk, és az American Cyanamid Company, Lederle Laboratories Division, Pearl River, New York törzsgyüjteményében LL-C23 024 szám alatt helyeztük letétbe. Ugyanezt a törzset élő formában helyeztük letétbe az U. S. Department of Agriculture, Northern Régiónál Center, Preoria Illinois 61 604 törzsgyűjteményében, ahol az NRRL 12 515 bejelentési számot kapta.

Az NRRL 12 515 jelölésű törzs taxonómiai jellemzői

Az NRRL 12 515 jelzésű törzs taxonómiai jellemzését elvégeztük, és az Actinomadura nemzetség új fajaként, mint Actinomadura yumaense sp. nov. azonosítottuk.

Az NRRL 12 515 jelzésű törzs tenyésztési, fiziológiai, morfológiai jellemzőit vizsgáltuk Shírling, E. B. és D. Gottlieb [Methods fór characterization of Streptomyces species, Intemat. J. Syst. Bacteriol., 16, 131-140 (1966)] és Gordon, R. E. és munkatársai [Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardia strain, Intemat. J. Syst. Bacteriol,

24, 54-63 (1974)] által részletesen megadott módIO szerek szerint. A táptalajokat a Pridham, T. G. és munkatársai [A selection of média fór maintenance and taxinomic study of Streptomycetes, Antibiotics Ann. 947-953 (1956/1957)] és Gauze, G. F. és munkatársai [Problems in the classification of antago15 nistic actinomycetes, State Publishing House fór Medical Literature, Medgiz, Moscow (1957)] és Gordon, R. E. és munkatársai [Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardia strain, Intemat. J. Syst. Bacteriol, 24,54-63 (1974) aktino20 micéták és talajbaktériumok vizsgálata] által ajánlottak közül választottuk ki. A mikroorganizmus sejtfalának kémiai összetételét Lechevalier, H. A. és munkatársai [Chemical composition as a criterion in the classification of actinomycetes, Adv.

Appl. Microbiol., 14, 47-72 (1971)] módszerével határoztuk meg. A foszfolipid vizsgálatokat Lechevalier, Μ. P. és munkatársai [Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition, Biochem. Syst. Ecol., 5, 249-260 (1977)] módszeré30 vei végeztük. A részletes adatokat és eredményeket a 14-19. táblázatokban ismertetjük, a tenyészet általános leírását pedig az alábbiakban adjuk meg. A színek megjelölését Kelly, K. L. és D. B. Judd [Color Universal Language and Dictionary of Na35 mes, U. S. Nat. Búr. Stand., Spec. Publ. 440, Washington, D. C. (1976)] valamint az Inter-Society Color Council, Natl. Búr. Stand. Centroid Color Charts ajánlásai szerint végeztük.

Az NRRL 12 515 törzs által képviselt új faj ész40 lelt adatait összehasonlítottuk az Actinomadura nemzetség ismert fajainak közölt adataival [lásd Goodfellow, M. és munkatársai, Numerical Taxonomy of Actinomadura and related actinomycetes,

J. Gén. Microbiol. 122, 95-111 (1979); Huang, ₄₅ L. H. Actinomadura macra sp. nov., the producer of antibiotic CP-47 433 és CP-47 434, Intemat. J. Syst. Bacteriol. 30, 565-568 (1980); Meyer, J., New species of the genus Actinomadura, Z. Allgem. Mikrobiol. 19, 37-44 (1979); Nomura, H. és Y.

Obara, Distribution of actinomycetes in soil. XI. Somé new species of the genus Actinomadura, Lechevalier et al., J. Ferment. Technoi. 49, 904-912 (1971) és Preobrazhenskaya, T. P. és munkatársai, Key fór Identification of the species of the genus ₅₅ Actinomadura, The Biology of Actinomycetes and Related Organisms, 12, 30-38 (1977) irodalmi helyeken], Az NRRL 12 515 törzs tenyészete kismértékű hasonlatosságot mutat az Actinomadura pelletierivel, de a többi közölt faj egyikével sem mutat hasonlóságot és számos jellemzőjében eltér az A.

⁶⁰ peletieritől is. Ezért az NRRL 12 515 törzset egy új faj, az Actinomadura yumaense típus-törzseként tekintendő, a faj a nevét arról a helyről kapta, ahol azt a talajt gyűjtöttük, melyből a törzset izoláltuk.

. 190 814

Mikromorfológiai jellemzők

A spórák rövid spirális láncokban - a láncok maximális hossza mintegy 20 spóra/lánc elágazó, majdnem örvös lég-spórahordozón képződnek. A spórák tojás alakúak, méretük 0,6-0,8 μ · 1,0-1,4 μ, felületük sima.

Sejtfal-összetétel

A tenyészet teljes-sejt-hidrolizátuma madurózt (3-0-metil-D-galaktózt) és a diamino-pimelinsav (DAP) mezo-izomerjét tartalmazza. A tenyészet foszfolipid összetétele P-l típusú és kevés foszfatidilglicerinen kívül más meghatározó foszfolipidet nem tartalmaz. Ezek a jellemzők igen tipikusak az Actinomadura nemzetség tagjaira.

A növekedés mértéke

Jó növekedést észleltünk Bennet agaron, Gauze

2. agaron, NZ-amin-keményítő-glükóz agaron (ATCC 172. táptalaj), paradicsompüré-zabliszt agaron és élesztőkivonat-malátakivonat agaron; mérsékelt növekedést észleltünk Benedict agaron, Czapek szacharózos agaron, glicerin-aszparagin agaron, Hickey-Tresner agaron és zabliszt agaron; gyenge növekedést észleltünk kalcium-malát agaron, Gauze 1. agaron és szervetlen só-keményítő agaron.

Vegetatív micélium

Azokon a táptalajokon, amelyeken a tenyészet jól növekedett, kidomborodó, kürtösen csavart vegetatív micélium növekedését észleltük, mely általában sárgás-szürke színárnyalatú volt.

A légmicélium és a spóra színe

A légmicélium és/vagy spóra-tömeg színe a fehértől a 264. világos szürke színig terjedő. A légmicéliumok képződése a legtöbb táptalajon gyenge.

Oldható pigmentek

Sok táptalajon nincs oldható pigment. Benedict agaron és a glicerin-aszparagin agaron sárga, kalciummalát agaron sárgás-zöld, NZ-amin-keményítőglükóz agaron zöldes-barna, Bennett agaron és élesztőkivonat-malátakivonat agaron narancsszínű pigment jelentkezik.

Fiziológiás reakciók

Nincs melanin-pigment pepton-vas agaron és tirozin agaron (ISO-7); a lakmusz-tejet erősen peptonizálja; az étkezési zselatinban erős proteolízist vált ki; a nitrátot enyhén redukálja, az adenint és a guanint nem hidrolizálja; a hipoxantint, tirozint és xantint erősen hidrolizálja; a keményítőt gyengén hidrolizálja; az eszkulint hidrolizálja; a karbamidot változó mértékben hidrolizálja. Nem növekszik 4 °C, 10 °C, és 55 °C hőmérsékleten, mérsékelten növekszik 25 °C és 45 °C hőmérsékleten, jól növekszik 32 °C és 37 °C hőmérsékleten. Szénhidrát-hasznosítása Pridham, T. G. és D. Gottlieb [The utilization of carbon compunds by somé actinomycetales as an aid fór species determination, J. Bacteriol. 56, 107-114 (1948)] módszerével vizsgálva : jól hasznosítja a glükózt, glicerint és trehalózt, mérsékelten hasznosítja a maltózt, és szacharózt, gyengén hasznosítja a fruktózt, galaktózt, inozitot, mannózt és melezitózt, nem hasznosítja az adonitot, arabinózt, dulcitot, laktózt, mannitot, melibiózt, raffmózt, ramnózt, szalicint, szorbitot és xilózt. Gordon és munkatársai (lásd az előbbiekben) módszerével vizsgálva a szénhidrátokból való savtermelést; a törzs jó savtermelést mutat glükózból, glicerinből, maltózból, szacharózból, és trehalózból, gyenge savtermelést mutat galaktózból, inozitból és mannózból. A szerves savak hasznosítása Gordon és munkatársai módszerével (lásd az előbbiekben) vizsgálva; a törzs acetátot, malátot, propionátot, piruvátot, szukcinátot és tartarátot hasznosít, benzoát, citrát, laktat, mukát és oxalát hasznosítására nem képes.

Megjegyezzük, hogy az Actinomadura yumaense faj nem korlátozódik az Actinomadura yumaense NRRL 12 515 törzsre vagy azokra a törzsekre, melyek az eddigiekben ismertetett tenyésztési és mikroszkópos jellemzőknek teljes mértékben megfelelnek, ezeket a jellemzőket csak a törzs bemutatás 45 céljából adtuk meg. Találmányunkban Actinomadura yumaense alatt valamennyi Actinomadura yumaer.se törzset értjük, amely LL-C23 024α, β vagy iota jelzésű antibiotikumot termel és nem különböztethető meg határozottan az Actinomadura 50 yumaense NRRL 12 515 törzstől vagy abból származó tenyészetektől, beleértve a törzs mutánsait és variánsait is. Mutánson a törzs természetes (spontán) és különféle, szakember számára ismert mutagénekkel, például röntgen-sugárzással, ultraibolya55 sugárzással, nitrogén-mustárral, aktinofággal, nitrózaminokkal és hasonlókkal kiváltott mutánsait is értjük.

190 814

14. Táblázat

Actinomadura yumaense NRRL 12 515 tenyésztési jellemzői

Inkubáció: 14 nap_Hőmérséklet: 28 *C

Táptalaj	Növekedés mértéke	Légmicélium és/vagy spóra	Oldható pigment	Színváltozás
Benedict agar	Mérsékelt- gyenge	Lapos, porszerű telepek, fehértől 264. világos szürkéig terjedő színű légmicéliumok	Sárgás	89. halványsárga
Bennet agar	Jó	Nincs légmicélium, kürtösen csavart vegetatív növekedés 93. sárgás-szürkétől 80. szürkés-sárgás-barnáig terjedő színű	Narancsszínű	81. sötét szürkéssárgás-barna
Kalciummalát agar	Gyenge	Lapos tenyészet, ritkás fehér légmicéliumok	Sárga-zöld	90. zöldes-sárga
Czapek sza- charózos agar	Gyenge- mérsékelt	Lapos tenyészet, mérsékelt légmicélium képzés, vegetatív növekedés 90. szürkés-sárga színű	Nincs	89. halványsárga
Gauze 1. sz. agar	Gyenge	Színtelen lapos tenyészet, ritkás fehér légmicéliumok	Nincs	Színtelen
Gauze 2. sz. agar	Jó	Domború, kürtösen csavarodott telepek, 93. sárgás-szürke vegetatív micélium, kevés 92. sárgás-fehér színű légmicélium	Nincs	72. sötét narancs-sárga
Glicerin- aszparagin agar	Gyenge- mérsékelt	Lapos, poros telepek, fehér légmícéliumok	Sárga	89. halványsárga
Hickey-Tresner agar	Mérsékelt	90. szürkés-sárga színű lapos, viaszos telepek, fehértől 264. világos szürkéig terjedő színű ritkás légmicéliumok	Nincs	90. szürkés- sárga
Szervetlen sókeményítő agar	Gyenge	Lapos, színtelen, poros telepek, fehér légmicéliumok	Nincs	Színtelen
NZ-aminkeményítőglükóz agar	Jó	Sűrű, kürtösen csavarodott növekedés, 61. szürkés-sárgás-bamától 65. barnás-feketéig terjedő szín, kevés, fehértől 264. világos szürkéig terjedő színű légmicélium	Zöldes-barna	78. sötét sárgás barna
Zabliszt agar	Mérsékelt	Lapos viaszos növekedés, 90. szürkés-sárga szín, kevés fehér légmicélium	Nincs	90. szürkés- sárga
Paradicsom- püré-zabliszt agar	Jó	Lapos viaszos növekedés, 91. sötét szürkés-sárga szín, nyomokban fehér légmicéliumok	Nincs
Élesztőkivonat-malátakivonat agár	Jó	Domború, viaszos, kürtösen csavarodott telepek, 93. sárgás-szürkétől 80. szürkés-sárgás barnáig terjedő színűek, légmicélium nincs	Narancs	78. sötét sárgásbarna

-101 . 190 814

75. Táblázat

Actinomadura yumaense NRRL 12 515 mikromorfológiai jellemzői

Táptalaj	Légmicélium és/vagy spóratermő szerkezete	Spóra alakja	Spóra mérete	Spóra felülete
Czapek szacharózos agar	Elágazó, majdnem örvös lég-spórahordozók, melyek érett spórákból álló, viszonylag rövid spirális láncokból állnak	Tojás alakú	0,6-0,8 μ 1,0-1,4 μ	Sima

16. Táblázat

Actinomadura yumaense NRRL 12 515 fiziológiai reakciói

Táptalaj	Inkubációs idő	Növekedés mértéke	Fiziológiás reakció
Pepton-vas agar	7 nap	Jó	Enyhe bámulás
	14 nap	Jó	Enyhe bámulás
Tirozin agar	7 nap	Mérsékelt	Nincs pigment
	14 nap	Jó	Sárgás pigment
Lakmusz-tej	14 nap	Jó	Jó peptonizálás
	28 nap	Jó	Erős peptonizálás
Étkezési zselatin	14 nap	Jó	Enyhe proteolízis
	28 nap	Jó	Teljes proteolízis
Nitrátos táptalaj	14 nap	Jó	Igen gyenge redukálás
	28 nap	Jó	Mérsékelt redukálás
Adenin agar	14 nap	Jó	Nincs hidrolízis
21 nap	Jó	Nincs hidrolízis
Guanin agar	14 nap	Jó	Nincs hidrolízis
21 nap	Jó	Nincs hidrolízis
Hipoxantin agar	14 nap	Jó	Teljes hidrolízis
	21 nap	Jó	Teljes hidrolízis
Tirozin agar	14 nap	Jó	Erős hidrolízis
21 nap	Jó	Erős hidrolízis
Xantin agar	14 nap	Jó	Enyhe hidrolízis
	21 nap	Jó	Erős hidrolízis
NZ-amin, oldható keményítő és glükóz agar (ATCC 172. sz. táptalaj)	5 nap	4 °C, 10 °C és 55 °C hőmérsékleten gyenge vagy semmi növekedés, 25 ’C, 28 ’C és 45 °C hőmérsékleten mérsékelt növekedés, 32 °C és 37 °C hőmérsékleten jó növekedés
Karbamid tartalmú táptalaj	28 nap	Jó	Különböző mértékű bomlás
Eszkulin tartalmú táptalaj	14 nap	Jó	Hidrolízis
28 nap	Jó	Hidrolízis
Keményítő agar	5 nap	Jó	Nincs hidrolízis
	10 nap	Jó	Nincs hidrolízis

-111

190 814

17. Táblázat

Actinomadura yumaense NRRL 12 515 szénhidrát-hasznosítása ISP-9 szénhidrát-hasznosítás vizsgálatára szolgáló táptalajon

Inkubáció: 28 nap	Hőmérséklet: 28 °C
Szénhidrát forrás	Hasznosítás
Adonit
1-Arabinóz	-
Dulcit	-
Fruktóz	Gyenge
d-Galaktóz	Gyenge
d-Glükóz	Jó
Glicerin	Jó
Izoinozit	Gyenge
Laktóz	-
Maltóz	Közepes
d-Mannit	-
d-Mannóz	Gyenge
d-Melezitóz	Gyenge
d-Melibióz	-
d-Raffinóz	-
1-Ramnóz	- ·
Szalicin	-
Szorbit	-
Szacharóz	Közepes
d-Trehalóz	Jó
d-Xilóz	-
Negatív kontroll	-
18.	Táblázat
Actinomadura yumaense NRRL 12 515
savtermelése különböző szénhidrátokból Gordon
féle szervetlen nitrogén alaptáptalajon
Inkubáció: 28 nap	Hőmérséklet: 28 ’C
	Savtermelés*
Szénhidrátforrás
	7 nap 28 nap
Adonit	_ —
1-Arabinóz	- -
Dulcit	_ -
Fruktóz	_ -
d-Galaktóz	+
d-Glükóz	+ + + + + +
Glicerin	+ + + + 4^-
Izoinozit	- +
Laktóz	- -
Maltóz	+ + +
d-Mannit
d-Mannóz	— +
d-Melezitóz
d-Melibióz	- -
d-Raffinóz	- -
1-Ramnóz	- _
Szalicin	- -
Szorbit	- -
Szacharóz	+ + +
d-Trehalóz	+ + +

18. Táblázat (folytatás)

Szénhidrátforrás	Savtermelés*
7 nap	28 nap
d-Xilóz	—	-
Negatív kontroll	—	—

*: + + + ~ erős pozitív válasz + + = mérsékelt pozitív válasz + = gyenge pozitív válasz - = negatív válasz

19. Táblázat

Actinomadura yumaense NRRL 12515 szerves sav hasznosítása Gordon által módosított Kóser-féle agaros alaptáptalajon (Kóser-féle citrát agar)

Inkubáció: 28 nap	Hőmérséklet: 28 ’C
Szénforrás	Hasznosítás*
Acetát	+
Benzoát	-
Citrát	-
Laktát	—
Malát	+
Mucinsav	-
Oxalát	-
Propionát	+
Piruvát	+
Szukcinát	+
Tartarát	+

*: + = pozitív reakció - = negatív reakció

Az Actinomadura yumaense tenyésztése sokféle szilárd vagy folyékony táptalajon végezhető. Az LL-C23 024α, β és v jelzésű antibiotikumok termelésére azok a táptalajok alkalmasak, amelyek asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást, például fehérjét, fehéijehidrolizátumot, polipeptideket, aminosavakat, kukoricalekvárt stb. és szervetlen anionokat és kationokat, például kálium-, nátrium-, ammónium-, kalcium-, szulfát-, karbonát-, foszfát-, klorid-ionokat tartalmaznak. A nyomelemeket, mint például bőrt, molibdént, rezet és egyebeket az egyéb táptalajösszetevőkből származó szennyezésből eredően tartalmazza a táptalaj. A levegőztetés tartályban és palackban steril levegő tenyészeten való átbocsátásával vagy felületére való juttatásával történik. Tartályban a tenyészetet mechanikus keverő vei is keverjük. Habzásgátlóként szükség esetén disznózsírt vagy szilikon-habzásgátlót alkalmazunk.

Az Actinomadura yumaense törzset ferdeagaron tenyésztjük és tartjuk fenn, például Bennett agaron, élesztő-maláta agaron vagy ATCC 172. sz. táptalajon, előnyösen ATCC 172. sz. táptalajon. A ferdeagart Actinomadura yumaense tenyészettel oltjuk be és 28-37 ’C hőmérsékleten, előnyösen 32 ’C hőmérsékleten körülbelül 7 napig inkubáljuk. Ez a törzstenyészet friss ferdeagarokra való sorozatos

-121 . 190*814 átoltásokkal fenntartható vagy a jól kifejlett tenyészetből vett, miléciumot tartalmazó agar darabbal folyékony táptalajt olthatunk be.

Actinomadura yumaense rázott tenyészet készítésére 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril folyékony táptalajt ferdeagar tenyészetről belekapart vagy belemosott spórákkal oltunk be és inokulálunk. A következőkben az erre a célra alkalmas folyékony táptalajokra adunk példákat :

A Táptalaj

Marhahúskivonat 0,3%

Bacto® tryptone¹ 0,5%

Glukóz 1,0%

Élesztőkivonat 0,5%

Víz kiegészítésűi 100%-ra

*. A Difco Laboratories (Detroit, Michigan) lajstromozott védjeggyel bíró pepton készítménye.

A táptalaj pH-ját híg bázissal, például nátriumhidroxiddal 6,8-7,2 értékre állítjuk be.

B Táptalaj

Glükóz l %

Keményítő 2%

Élesztőkivonat 0,5%

N-Z Amine A®² 0,5%

Kalcium-karbonát 0,1%

Víz kiegészítésül 100%-ra ². A Sheffield Chemical Co. (Div. Nat’l. Dairy Products Corp., Norwich, N. Y.) lajstromozott védjeggyel bíró emésztett kazein készítménye.

Az előbbiekben ismertetett két táptalaj közül a B táptalaj az előnyösebb.

A lombikokat 1-4 napon át 25-35 °C, előnyösen 32 °C hőmérsékleten inkubáljuk és rotációs rázógépen erősen rázatjuk. Ezt a tenyészetet használjuk fermentációs tenyészet inokulumaként vagy lefagyasztva tároljuk és későbbi törzstenyészet inokuíumaként alkalmazzuk.

A következőkben példákat adunk azokra a táptalajokra, melyet az Actinomadura yumaense LLC23 024α, β és v antibiotikumot termelő fermentációk táptalajául szolgálhatnak.

C Táptalaj

Glükóz 1,5%

Glicerin 1,5%

Szójaliszt³ 1,5%

Kalcium-karbonát 0,1%

Nátrium-klorid 0,3 %

Víz kiegészítésül 100%-ra ³. Azonos eredmény elérése mellett helyettesíthető gyapotmagliszttel vagy húskivonattal.

D Táptalaj Glükóz	3%
Szójaliszt	1,5%
Kalcium-karbonát	0,1%
Nátrium-klorid	0,3%
Víz kiegészítésül	100%-ra
E Táptalaj
Keményítő	1%
Melasz	2%
Szójaliszt	1,5%
Kalcium-karbonát	0,1%
Víz kiegészítésül	100%-ra
F Táptalaj
Glükóz	3%
Húskivonat	2,5%

Nátrium-klorid θ»2%

Kalcium-karbonát 0,1 %

Víz kiegészítésül 100%-ra

G Táptalaj

Glükóz 3%

Szójaliszt θ,5%

Ammónium-szulfát 0,3%

Nátrium-klorid 0,2%

Kalcium-karbonát 0,1 %

Víz kiegészítésül 100%-ra

H Táptalaj

Glükóz 3 %

Ammónium-szulfát 0,3%

Dikálium-hidrogén-foszfát 0,1 %

Kalcium-karbonát 0,2%

Nátrium-klorid 0,1%

Víz kiegészítésül 100%-ra

A C-H táptalajok közül a D táptalaj a legelőnyösebb.

A fermentáció úgy is kivitelezhető, hogy 500 mles lombikban lévő 100 ml táptalajt 3-10 térf.% előzőekben leírt módon készített törzstenyészettel oltunk be és 25-35 °C, előnyösen 32 °C hőmérsékleten 24-72 órán át levegőztetve inkubáljuk. A fermentációs tenyészetből vett minták lefagyasztva tárolhatók és a későbbiekben törzstenyészethez inokulumként használhatók.

Ugyancsak elvégezhető a fermentáció levegőztetést és keverést biztosító szerelvényekkel ellátott nagyobb méretű fermentorokban is. Egy-egy fermentort 3-10 térf.% az előzőekben leirt módon készített inokulummal oltunk be. A levegőztetés mértékét 0,5-2,0 1 steril levegő/liter táptalaj/perc értéken tartjuk és a fermentlevet 200-400 fordulat/perc fordulatszámú keverővei keverjük. A hőmérsékletet 25—35 °C, előnyösen 32 °C hőmérsékleten tartjuk. A fermentációt az antibiotikum táptalajban való felgyülemléséig, általában 100-150 órán át folytatjuk, majd az antibiotikumot kinyerjük.

Az antibiotikum kinyerését és tisztítását a 4 278 663 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban megadott eljárással végezzük, vagy a következőkben ismertetésre kerülő megoldás izerint járunk el.

Az előzőekben ismertetett eljárással előállított, teljes sejteket tartalmazó nyers fermentlevelet azonos térfogatú nem szénhidrogén típusú, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel keverjük össze. Előnyösek a metilén-klorid és az etil-acetát. A szerves fázist elválasztjuk és vákuumban olajosra pároljuk.

A kapott olajat metilén-kloridban oldjuk és szilikagél-, alumínium-, Sephadex LH-20-^R (Pharmacia Inc., Pharmacia Fine Chemicals Div., Piscataway, N. Y.) vagy magnézium-alumínium-szilikát oszlopra visszük. Az oszlop elválására alkalmas oldószerek például a dietil-éter, az etil-acetát, metilénklorid, etil-éter (1 : 1)-(1 : 7) térfogat arányú elegye, 10-40% acetont tartalmazó metilén-klorid,

2-10% rövidszénláncú alkoholt, előnyösen metanolt, tartalmazó metilén-klorid, 2-15% acetonitrilt tartalmazó metilén-klorid vagy 2-15% dioxánt tartalmazó metilén-klorid, előnyösen metilén-klorid, etil-acetát 1 : 1 térfogat arányú elegye. A frakciókat gyűjtjük és antibakteriális aktivitásukat a bennük várt antibiotikumra érzékeny mikroorganiz13

-131

190 814 mussal, például Bacillus szubtilis-szel végzett biológiai módszerrel vizsgáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. Az így kapott maradékot valamely szerves oldószerben, például terc-butil-alkoholban, benzolban vagy p-dioxánban, előnyösen terc-butil-alkoholban oldjuk és fagyasztva szárítjuk.

A fagyasztva-szárítás révén kapott szilárd anyagot alkalmas szerves oldószerben, például metilénkloridban, hexánban, metilén-klorid és etil-acetát elegyében, dietil-éterben, hexán és etil-acetát elegyében, hexán és kloroform elegyében vagy hexán és éter elegyében feloldjuk. Előnyösen dietil-étert használunk. Az így kapott oldatot vízzel kirázzuk, pH-ját híg ásványi savval 1,5-4,0 értékre, előnyösen 2,5-re állítva. A szerves fázist elválasztjuk, a savfelesleg eltávolítására vízzel mossuk, alkalmas szárítószeren szárítjuk, szűrjük majd vákuumban szárazra pároljuk.

A kapott maradékot alkalmas oldószerben feloldjuk, és hagyjuk, hogy az oldószer lassan párologjon el, ezt előnyösen 4 ’C körüli hőmérsékleten érjük el. Alkalmas oldószerek például a metilénklorid, a hexán, a metilén-klorid-etil-acetát elegy, a dietil-éter, a hexán-etil-acetát elegy, a hexánkloroform elegy vagy a hexán-éter elegy, előnyösen hexán-éter 5 :2 térfogat arányú elegye. A kapott kristályokat összegyűjtjük, mossuk, előnyösen 40 ’C hőmérsékleten valamely közepes forráspontú szénhidrogénnel, például hexánnal vagy heptánnal, és levegőn szárítjuk. Ily módon az LL-C23 024a jelölésű antibiotikumot nyerjük szabad sav formájában.

Ha só formájú terméket kívánunk, a szabad savat a megfelelő kationnal, azt előnyösen híg szervetlen bázis formájában alkalmazva, szakember számára ismert eljárással sóvá alakíthatjuk.

A következő példák a találmány megvilágítására szolgálnak. Az alkalmazott táptalajokat az A, B, C stb. táptalajt az előzőekben ismertettük. Ha más megjelölés nem szerepel, minden eljárást szobahőmérsékleten - közelítőleg 22 ’C-on - és légköri nyomáson végzünk.

1. Példa

500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril B táptalajt Actinomadura yumaense NRRL 12 515 ferdeagar tenyészetéről mosott spórával beoltunk, majd rotációs rázógépen rázatva 2 napon át inkubáljuk.

Ezt követően 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril C táptalajt az előbbi tenyészetből kivett 5% inokulummal beoltunk és rotációs rázógépen rázatva 28 ’C hőmérsékleten 5 napon át inkubáljuk.

Az antibiotikus aktivitás jelenlétét Staphylococcus aureus ATCC 6538 P-re, Bacillus subtilisre és Streptococcus feacalisra gyakorolt biológiai hatás, a féreghajtó aktivitást Caenorhabditis elegánsra kifejtett biológiai hatás vizsgálatával ellenőriztük.

1. Lombik: 100 ml C táptalaj.

2. Lombik: 100 ml C táptalaj, melyben a szójalisztet 1,5% gyapotmagliszttel helyettesítettük.

3. Lombik: 100 ml C táptalaj, melyben a szójalisztet 1,5% húskivonattal helyettesítettük.

4. Lombik: 100 ml D táptalaj.

5. Lombik: 100 ml E táptalaj.

6. Lombik: 100 ml F táptalaj.

7. Lombik: 100 ml G táptalaj.

A lombikok mindegyikét B táptalajon tenyésztett Actinomadura yumaense NRRL 12 515 tenyészetből vett 5% inokulummal oldjuk be, majd rotációs rázógépen rázatva 28 ’C hőmérsékleten 4-6 napon át inkubáljuk.

A fenti tenyészetek mindegyikét aktívnak találtuk az 1. példában megadott antibiotikus aktivitásra vizsgálva és csirke-veseszövet-tenyészetben lévő Eimera tenella ellen coccidium ellenes aktivitásra vizsgálva.

3. Példa

500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril B táptalajt fagyasztott fermentációs tenyészetből származó Actinomadura yumaense NRRL 12 515 sejtekkel oltunk be, majd 32 ’C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 4 napon át inkubáljuk.

Ezután a tenyészetből származó 5% inokulummal beoltunk 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril H táptalajt és 28 ’C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 5 napon át inkubáljuk.

Az antibakteriális hatást az 1. példában, a coccidium ellenes hatást a 2. példában megadott módon határozzuk meg.

Az antibiotikus aktivitás jelenlétét vékonyrétegkromatográfiás eljárással, etil-acetát, kloroform ⁷0 : 30 térfogat arányú futtatóeleggyel kifejlesztett szilikagél lemezen is vizsgáljuk.

4. Példa

500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril A táptalajt Actinomadura yumaense NRRL 12 515 ferdeagar tenyészetéről lemosott spórával oltunk be, majd 32 ’C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 2 napon át inkubáljuk.

Ebből a tenyészetből származó 5% inokulummal oltunk be 500 ml-es lombikban lévő 100 ml steril H táptalajt, majd a beoltott táptalajt 32 ’C hőmérsékleten rotációs rázógépen 2 napon át inkubáljuk.

A H táptalajon kifejlődött tenyészetből vett 5% inokulummal ezután 500 ml-es lombikban lévő friss, steril H táptalajt oltunk be és 28 ’C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 6 napon át inkubáljuk.

Az antibakteriális hatást az 1. példában megadott módon vizsgáljuk.

2. Példa db 500 ml-es lombikba a következő steril táptalajok 100-100 ml-ét tartalmazza:

5. Példa db 500 ml-es, 100-100 ml steril A táptalajt tartalmazó lombikot Actinomadua yumaense NRRL

-141 .190814

515 fagyasztott törzstenyészetével beoltunk és 32 ’C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 2 napig inkubáljuk.

A két lombik tartalmát egyesítjük és 20 literes palackban lévő 121 friss, steril A táptalajt oltunk be vele. A 20 literes palackban lévő tenyészetet ezután 28 ’C hőmérsékleten levegőztetve 2 napon át inkubáljuk.

A palack tartalmát ezután 300 literes, 2881 steril A táptalajt tartalmazó anyakultúra tartályba viszszűk, 32 ’C hőmérsékleten 25 órán át levegőztetjük és keveijük.

A 25 órás inkubálás elteltével a 3001 anyakultúrát 1500 literes, 12001 steril C táptalajt tartalmazó fermentorba visszük. Ezt a tenyészetet 28 ’C hőmérsékleten 115 órán át levegőztetve és keverve inkubáljuk.

A fermentlé antibiotikus aktivitását vékonyrétegkromatográfiás eljárással vizsgáljuk, szilikagéllemezen etil-acetát, kloroform 70 : 30 térfogat arányú elegyét használva futtatóként. Alternatív megoldásként a megfuttatott lapok közül néhánynak Bacillus szubtilisra kifejtett biológiai hatását is megvizsgáltuk, a vizsgálat antibiotikus aktivitás jelenlétét mutatta.

6. Példa

A primer inokulum tenyésztésére szolgáló jellegzetes táptalajt a következő összetevőkből készítünk :

Marhahús kivonat 0,3%

Bacto® - tryptone 0,5%

Glükóz 1,0%

Élesztőkivonat 0,5%

Bacto® agar 0,15%

Víz kiegészítésül 100%-ra

500ml-es lombikban lévő, fenti összetevőkből álló steril táptalajt Actinomadura yumaense NRRL 12 515 ferdeagar tenyészetről lemosott vagy lekapart spórával és miléciummal oltunk be, majd a lombikot rotációs rázógépbe helyezve 32 ’C hőmérsékleten 48 órán át erőteljesen rázatjuk. A kapott 100 ml inokulummal 2 literes palackban lévő 1 1 azonos összetételű táptalajt oltunk be. Ezt az inokulumot steril levegővel levegőztetve 28 ’C hőmérsékleten 48 órán át inkubáljuk. A kapott 1 1 tenyészettel 30 literes fermentorban lévő azonos steril táptalajt oltunk be és steril levegővel levegőztetve 28 ‘C hőmérsékleten 42 órán át inkubáljuk a tenyészetet.

7. példa

Az alábbi összetevőkből fermentációs táptalajt készítünk:

Dextróz 1,5%

Glicerin 1,5%

Szójaliszt 1,5%

Kalcium-karbonát 0,1 %

Nátrium-klorid 0,3%

Víz kiegészítésül 100%-ra

A táptalaj pH-ját 6 n nátrium-hidroxiddal 7,0 értékre állítjuk, majd a táptalajt sterilezzük. 300 literes fermentorban lévő 2501 fenti táptalajt az

1. példában megadott eljárással készült inokulum 30 literével oltunk be. A tenyészetbe steril levegőt ⁵ vezetünk és 220 fordulat/perc fordulatszámú keverővei keverjük. A fermentációt 32 ’C hőmérsékleten 97 órán át folytatjuk, majd a sejttömeget összegyűjtjük.

8. Példa

Az alábbi összetevőkből fermentációs táptalajt készítünk:

Dextróz 3,0%

Szójaliszt 1,5%

Kalcium-karbonát 0,1%

Nátrium-klorid 0,3%

Víz kiegészítésül 100%-ra ²⁰ A táptalaj pH-ját 6n nátrium-hidroxiddal 7,0 értékre állítjuk, majd a táptalajt sterilezzük. 30001 így készült táptalajt fermentorban 3001, az 1. példában leírt eljárással készült inokulummal oltunk be. A tenyészetet steril levegővel levegőztetjük és

100 fordulat/perc fordulatszámú keverővei keverjük. A fermentációt 32 ’C hőmérsékleten 115 órán át folytatjuk, majd a sejttömeget összegyűjtjük.

9. Példa

1. A fermentléből kinyert 1001 sejttömeg pH-ját 6 n hidrogén-kloriddal pH 4,0 értékre állítjuk. Ezután a savas sejttömeget azonos térfogatú metilén35 kloriddal 1-2 órán át keverjük. A sejttömeg-metilén-klorid elegyet szűrő segédanyagként kovaföldet használva leszűrjük. A metilén-kloridos extraktumot elválasztjuk és vákuumban bepároljuk, így körülbelül 21 részlegesen tisztított antibiotikumot nyerünk.

2. A részlegesen tisztított antibiotikum kromatografálása szilikagélen.

cm átmérőjű üvegoszlopot 91 cm magasságig megtöltünk Woelm szilikagél TSC-vel. Az e példa 45 1. részében leírt eljárással nyert körülbelül 21 térfogatú nyers koncentrátumot az oszlopra öntve hagyjuk abba beszívódni. Ezt követően az oszlopot először 3 1 metilén-kloriddal majd annyi 1 : 1 térfogat arányú metilén-klorid, etil-acetát eleggyel eluáljuk, 50 hogy 126, egyenként 80-80 ml térfogatú frakciót gyüjthessünk. Ezután 7 :3 térfogatarányú etilacetát-etil-alkohol eluens elegyet használva még 87 frakciót szedünk.

Az LL-C23 024a-ban gazdag 58-87. frakciókat 55 egyesítjük, vákuumban bepároljuk, 90,4 g maradékot kapunk. Ezt a maradékot 600 ml dietil-éter és 600 ml hexán elegyében feloldjuk. A kapott szuszpenziót tisztára szűrjük. A tiszta szúrletet vákuumban a kristályosodás megindulásáig pároljuk be, 60 majd egy éjszakán át állni hagyjuk. A kapott kristályos LL-C23 024a jelzésű anyagot tölcséren gyűjtjük, hideg éterrel mossuk, levegőn szárítjuk; így

33,1 g kristályos anyagot kapunk. További 12,4g LL-C23 024a jelzésű anyagot kapunk az elegyített ₆₅ mosófolyadék és szűrlet további bepárlásával.

-151 .190 814

Az LL-C23 024β jelzésű anyagban feldúsult, az etil-acetát-etil-alkoholos eluálásból származó 177-203. frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, az előzőekben leírt módon kezeljük, ily módon 6,7 g részlegesen tisztított LL-C23 024β jelölésű anyagot kapunk.

Az etil-acetát, etil-alkoholos eluálásból származó, LL-C23 024 v tartalmú 204-213. frakciókat egyesítjük és vákuumban pépesre bepároljuk, ismételten extraháljuk metil-alkohollal, majd a metilalkoholos extraktumot metilén-kloriddal extraháljuk. A metilén-kloridos extraktumot Woelm szilikagéllel töltött oszlopra visszük, az oszlopot metilén-kloriddal mossuk, majd metilén-klorid-etilacetát 2 : 3 arányú elegyével eluáljuk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiás eljárással vizsgáljuk, az aktív frakciókat összegyűjtjük, aktívszénnel kezeljük, bepároljuk és ismételten extraháljuk heptánnal. A kapott heptános extraktumot 48 órán át 0 ’C hőmérsékletre hűtve tartjuk, majd a kristályokat kiszűrjük az anyalúgból.

Az anyalúgot ezután metilén-kloridban oldjuk, Woelm szilikagéllel töltött oszlopra öntjük és hagyjuk beszívódni. Az oszlopot egymást követően 21 metilén-kloriddal, 81 metilén-klorid-etil-acetát 1 : 1 arányú eleggyel és 41 etil-acetát-metil-alkohol 9 : 1 arányú eleggyel eluáljuk. Az eluátumot frakciónként szedjük és ellenőrizzük antibiotikum-tartalmukat. Az aktív frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, a kapott maradék LL-C23 024 v jelzésű anyagot tartalmaz.

10. példa

3. Az LL-C23 024β jelölésű anyag további tisztítása szilikagélen végzett kromatográfiával Sephadex® LH20-at hexán-metilén-klorid-metil-alkohol 10 : 5 : 1 arányú elegyében megduzzasztunk. 5 cm átmérőjű üvegoszlopot 86 cm magasságig megtöltünk a géllel. A 3 g LL-C23 024β jelölésű tisztított anyagot 10 ml metilén-kloridban, 1 ml metil-alkoholban és 10 ml hexánban oldjuk, az oszlopra töltjük és hagyjuk a gélbe beszívódni. Ezt követően az oszlopot a minta felvitelére használttal azonos oldószereleggyel eluáljuk, a frakciókat frakciószedő segítségével gyűjtjük. 23, egyenként 17 ml-es frakciót szedünk. Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat bizonysága szerint a 17-26. frakciók tartalmazzák az LL-C23 024β jelzésű anyagot. Ezeket a frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, ily módon 1269 mg tiszta amorf LL-C23 024β jelzésű anyagot kapunk.

11. példa

LL-C23 024$ jelzésű anyag kristályosítása nátriumsó formájában

2,4 g, a 2 és 3 szakasz szerinti eljárással készített, tisztított LL-C23 024β jelzésű anyagot 500 ml dietil-éter, 160 ml hexán és 25 ml metilén-klorid elegyében oldunk. A kapott oldatot 300 ml desztillált vizet tartalmazó választótőlcsérbe visszük. Cseppenként addig adunk hozzá híg hidrogén-kloridoldatot (1 n) amíg a kirázott és elválasztott oldat pH-ja a 2,0-2,5 értéket eléri. A savas vizes fázist döntjük és a savval kezelt szerves fázist háromszor mossuk 400-400 ml vízzel. A vízzel kimosott szerves fázisba teáskanálnyi Darco G-60 port teszünk és 15 perc múlva celiten átszűrjük. A színtelenített szerves fázist 500 ml desztillált vizet tartalmazó váíasztótölcsérbe visszük, addig csepegtetünk hozzá 5 n nátrium-hidroxidot, míg a kirázott, elválasztott vizes oldat pH-ja a 11,0—11,5 értéket eléri. A lúgos vizes fázist elöntjük, a szerves fázist nátrium-szulfáon szárítjuk, majd vákuumban 150 ml térfogatra bepároljuk. Ezt a koncentrátumot néhány órán át mikében állni hagyjuk. Az LL-C23 024β jelölésű anyag kristályait tölcséren gyűjtjük, hideg hexánra! mossuk, levegőn szárítjuk, ily módon 402 mg kristályos LL-C23 024β-βόΐ kapunk. Ezt a mintát használtuk mikroanalízisre és egyes spektrumok felvételére.

Elemzési eredmények a C^H^OuNa képletre: Számított: C% = 59,70, H% = 8,33 O% = 29,46, hamu% = 2,49

Mért: C% =61,55, H% = 8,79, hamu% = 3,31 N. O.

Olvadáspont, Fisher-Johns készülékkel mérve, 174’C;

Téremissziós tömegspektrum: 924; [α]^ = + 3,2 metanolban.

12. Példa

LL-C23 024 v jelzésű anyag tisztítása

Waters Prep. 500A típusú nagynyomású folyadékkromatográfot szilikagél töltettel látunk el, nyomása 3,79 · 10® Pa. A 3. példa szerinti eljárással előállított 5,0 g nyersterméket 50 ml heptán, etilacetát 45 : 55 arányú elegyben oldunk, a szilikagél oszlopra injektáljuk. Az oszlopot azután az anyag oldására használttal azonos oldószereleggyel eluáljuk 200 ml/perc áramlási sebességet alkalmazva, az eluálás során 40, egyenként 200 ml-es frakciót szedünk. A 21-32. frakciókat egyesítjük, szárazra töményítjük, hexánban eldörzsöljük, bepároljuk, ily módon tiszta LL-C23 024 v jelzésű anyagot nyerünk. A leírt eljárást négyszer ismételjük, összesen 280 mg amorf LL-C23 024 v jelzésű anyagot kapunk.

mg amorf LL-C23 024 v jelzésű anyagot dietil-éterben oldunk, 10 ml vízzel elegyítjük, pH-ját 0,1 n hidrogén-kloriddal 2,5 értékre állítjuk. Az éteres réteget vízzel mossuk, pH-ját 0,1 n nátriumhidroxiddal 11 értékre állítjuk, elválasztjuk, majd ismét vízzel mossuk. Az éteres fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, leszűrjük, szárazra töményítjük. Az így kapott anyagot éter, hexán elegyben oldjuk, az oldószert lassan hagyjuk elpárologni, fehér amorf szilárd anyagot nyerünk.

A kapott amorf anyag jellemzői a következők:

Elemzési eredmények: C% = 61,79, H% = 8,84, hamu% = 0,32; [a]“ = + 27 (C 0,724, metanolban);

Téremissziós tömegspektrum: (M +Na)⁺ = m/e 953, az ennek alapján számított molekulatömeg 930.

-161 190 814 »

13. Táblázat

Az LL-C23 024a, β és v jelzésű vegyületek nátriumsójának fizikai jellemzői és elemzésük eredményei

Claims

1. Eljárás az új (I) általános képletű LLC23 024α, β és v jelzésű antibiotikumok - a képletben R és R, azonos, jelentésük hidrogénatom vagy metilcsoport vagy R jelentése hidrogénatom és Rí jelentése metilcsoport - és gyógyászati célra alkalmas sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy Actinomadura yumaense NRRL 12 515 törzset vagy annak az (I) általános képletű vegyületek előállítására képes valamely mutánsát vagy variánsát asszimilálható szenet, nitrogént és szervetlen sókat tartalmazó folyékony táptalajon levegőztetve fermentálunk, majd a kapott antibiotikumot kinyerjük a fermentléből. (Elsőbbsége: 1982. 10. 21.)

2. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozó, R helyettesítőként hidrogénatomot, R, helyettesítőként metilcsoportot tartalmazó LLC23 024a jelzésű antibiotikum és gyógyászati célra alkalmas sói előállítására, azzal jellemezve, hogy Actinomadura yumaense NRRL 12 515 törzset vagy annak az LL-C23 024a jelzésű antibiotikum termelésére alkalmas valamely mutánsát vagy variánsát asszimilálható szenet, nitrogént és szervetlen sókat tartalmazó folyékony táptalajon levegőztetve fermentálunk, majd a kapott antibiotikumot kinyerjük a fermentléből. (Elsőbbsége: 1981. 10. 22.)

3. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozó, R és R, helyettesítőként hidrogénatomot tartalmazó LL-C23 024β jelzésű antibiotikum és gyógyászati célra alkalmas sói előállítására, azzal jellemezve, hogy Actinomadura yumaense NRRL 12 515 törzset vagy annak az LL-C23 024β jelzésű antibiotikum termelésére alkalmas valamely mutánsát vagy variánsát asszimilálható szenet, nitrogént és szervetlen sókat tartalmazó folyékony táptalajon levegőztetve fermentálunk, majd a kapott antibiotikumot kinyerjük a fermentléből. (Elsőbbsége: 1982. 04. 28.)

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fermentációs tenyészetet 24—150 órán át 25—35 ’C hőmérsékleten tartjuk. (Elsőbbsége:

1982. 10. 21.)

5. A 2. igénypont szerinti eljárás azzaljellemezve, hogy a fermentációs tenyészetet 24—150 órán át 25-35°C hőmérsékleten tartjuk. (Elsőbbsége:

1981. 10. 22.)

6. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fermentációs tenyészetet 24—150 órán át 25—35 ’C hőmérsékleten tartjuk. (Elsőbbsége:

1982. 04. 28.)

7. Eljárás nematódák ellen hatásos állatgyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 2. vagy 5. igénypont szerint előállított LL-C23 024a jelzésű vegyületet vagy gyógyászati célra alkalmas sóját vagy sóinak keverékét vagy a megfelelő fermentlevet vagy a fermentléből nyert sejttömeget állatgyógyászati célra alkalmas hordozó és/vagy segédanyaggal keverjük öszsze. (Elsőbbsége: 1981. 10. 22.)

8. Eljárás nematódák ellen hatásos, talaj kezelésére alkalmas készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 0,0018-5,01% a 2. vagy 5. igénypontok szerint előállított LLC23 024a jelzésű vegyületet vagy gyógyászati célra alkalmas sóját vagy sóinak keverékét vagy a megfelelő fermentlevet vagy a fermentléből kinyert sejttömeget agrotechnikai célra alkalmas hordozó és/vagy segédanyaggal keverjük össze. (Elsőbbsége: 1981. 10. 22.)

9. Eljárás baromfi-coccidiosis ellen hatásos készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 0,000025-0,061%, a 2. vagy 5. igénypontok szerint előállított LL-C23 024a jelzésű vegyületet vagy gyógyászati célra alkalmas sóit ehető hordozóanyaggal keverjük össze. (Esőbbsége: 1981.

10. 22.)