SE456588C - Biologiskt ren kultur av Actinomadura yumaense NRRL 12515 och förfarande för framställning av antibiotikum LL-C23024 alfa, beta och jota - Google Patents

Description

456 588 och antibiotikum LL-C23024 jota, vilket senare visat sig ha följande strukturformel: OM: i utvínningsbara mängder vid fermentation i ett flytande näringsmedium innehållande assimilerbara källor för kol, kväve samt oorganiska salter. s Mikroorganismen kan vara en spontan naturlig mutant, som är genetiskt förändrad, men har väsentligen samma egenskaper som Actinomadura yumaense NRRL 12515 och fortfarande bibehåller ” förmågan att syntetisera antibiotikum LL-C23024 alfa, beta och jota. Mikroorganismen kan även ha muterats med för fack- mannen kända mutagena medel.

Uppfinningen avser vidare ett förfarande för framställning av antibiotikum LL-C23024 alfa, beta och jota.

Antibiotikum LL-C23024 beta enligt dppfinningen skiljer sig från tidigare kända föreningar på grund av sina fysikaliska och kemiska kännetecken, innefattande men inte begränsade till dess mikroanalys, optiska vridning, IR-spektrum, l3C-kärnmagnetiska resonanssfektrum och IH-kärnmagnetiska resonansspektrum.

Den ovan angivna strukturen för LL-C23024 beta är baserad på elementaranalys, optisk vridning, fältdesorption, 456 588 masspektroskopisk molekylvikt, smältpunkt, IR-spektrum, l3C-kärnmagnetiskt resonansspektrum (l3C-NMR) øch proton- magnetiskt resonansspektrum (IH-NMR), såsom i detalj anges i exemplen och visas i de bifogade figurerna: Fig. I: IR-spektrum för LL-C23024 beta i KBr; 13 Pig. II: C-NMR-spektrum för LL-C23024 beta. 20 MHz i CDCl3, intern TMS-referensekvivalent; Fig. III: lH-NMR-spektrum för LL~C23024 beta. 80 MHz i CDCI3, intern TMS-referensekvivalent. 456 588 Tabell I Boman-spektrum för LL-czaouß (ypm i förhållande :in Tus) Kemisk skift, (gym) Antal kolatomer 10,5 1 11,0 1 12,2 1 17,0 l 17,7 1 17,9 1 22,3 1 26,1 1 26,8 1 27,6 1 30,2 1 32,0 1 33,3 1 33,7 2 33,8 2 36,5 1 36,8 l 39,0 1 39,9 1 45,5 2 57,1 1 59,1 1 60,7 1 66,9 1 67,6 1 70,2 1 71,3 1 72,9 1 74,9 1 75,1 1 79,9 1 80,8 1 82,1 2 84,5 1 84,7 1 85,6 1 86,9 1 95,8 1 96,9 1 97,7 1 107,5 l 179,2 1 Kolatomer, totalt 46 "'./ 456 588 LL-C23024 jota är ett nytt polyeterantibiotikum med mycket potent antikockidial aktivitet. Det är minst tio gånger mer potent än de flesta andra kända polyetrar. Fältdesorptions- masspektrala data visar att det har en molekylvikt av 930.

Det enda andra rapporterade polyeterantibiotikum med en molekylvikt av 930 är antibiotikum A28695B (hydroxisepta- mycih) (J. Antibíotics 33(2): 252 (l980)|, som signifikant skiljer sig till struktur och biologiska egenskaper. Obser- vationerna ovan är baserade på elementaranalys, optisk vrid- ning, beräknad molekylvikt genom fältdesorptionsmasspektro- skopi, IR-spektrum, l3C-NMR-spektrum och protonkärnmagnetiskt resonansspektrum (IH-NMR), såsom i detalj anges i exemplen och visas i bifogade ritningsfigurer: Fig. IV: IR-spektrum för LL-C23024 jota i KBr; rig. v; ln-NMR-spektrum för LL-c23oz4 jaaa. 80 MH: i CDCl3, intern TMS-referensekvivalent; 13 Fig. VI: C-NMR-spektrum för LL-C23024 jota. 20 MHz i CDC13, intern TMS-referensekvivalent; Pig. VII A: l3C-NMR-spektrum för LL-C23024 jota. (utvidgad skala: 0-50 ppm). 20 MHz i CDCI3, intern TMS: Fig. VII B: l3C-NMR-spektrum för LL-C23024 jota. (utvidgad skala: 50-110 ppm). 20 MHz i CDCl intern TMS-referensekvivalent. 3! l3C-NMR-spektra för LL-C23024 jota erhölls i deutererad kloroform (CDCl3) vid en fältstyrka av 20 MHz. Topparna med sina respektiva kemiska skift i delar per miljon i förhål- lande till tetrametylsílan (TMS) och det uppskattade antalet kolatomer per topp anges 1 tabell II. Toppar iakttogs för kloroform vid 75,4, 77,0 och 78,6. 456 588 6 Tabell II Kemiskt skift Antal kolatomer kemiskt skiftLntal kolatomer 10.6 10.9 11.7 l6.U 17.6 18.0 21.7 22.9 2U.l 28.2 31.2 32.2 33- 33. 3U. 36. 37. 39.

H0.

UN. 12.1: °~IU1 O\U1U1LIJJ=N~1NCD-= UI O\ @ F' FJF-*UJI-'bJD-'D-'l-*WÅIO-'I-'MFJFJI-*I-'l-*b-*P-'l-'kfl 59.9 60.8 68.5 68.8 71-3 72.2 76.1 76.9 78.5 81.0 81.3 81.8 88.8 85.3 85.6 86.8 88.5 95.9 97.9 99.6 107.2 173.0 Total .= oolw- w- F- v- v- w- v- vf F- F- P- h- w- v- v- h- r- r- F- ha ny pa o Antibiotikum LL-C23024 alfa, beta och jota är organiska karboxylsyror och kan sålunda bilda salter med icke-toxiska farmaceutiskt godtagbara katjoner. Salterna bildade genom blandning av den antibiotiska fria syran med stökiometriska mängder katjoner, lämpligen i ett neutralt lösningsmedel, kan bildas med katjoner såsom natrium, kalium, kalcium, magnesium och ammonium såväl som med organiska aminkatjoner, såsom 'lv a» 456 588 tri(lägre alky1)amin (t.ex. trietylamin, trietanolamin), prokain och liknande. De katjoniska salterna av antibiotikum LL-C23024 beta är i allmänhet kristallina fasta substanser, relativt olösliga vatten och lösliga i de flesta vanliga organiska lösningsmedlen, såsom metanol, etylacetat, aceton, kloroform, heptan, eter och bensen. För ändamålen enligt uppfinningen är den antibiotiska fria syran ekvivalent med dess farmaceutiskt godtagbara icke-toxiska salter.

Antibiotikum LL-C23024 beta och jota är aktiva in vitro gent- emot grampositiva bakterier vid testning enligt det stan- dardiserade agarutspädningsförfarandet. Resultaten anges såsom minsta inhiberande koncentration (MIC) i pg/ml i tabel- lerna III och IV. Antibiotikum LL-C23024 beta och jota är inte aktiva gentemot gramnegativa organismer vid koncentra- tioner av 256 pg/ml eller därunder. 456 588 Tabell III In vitto antibakteriell aktivitet för LL-czaozmó ÖRGANISM Minsta inhiberande kon- centration (pg/ml) Enterococcus SSC-80-62 " S$C-80-53 Staphylococcus aureus Smith " " SSC 80-ll " " SSC 80-32 H H ssc ao-38 " " LL-lä u u LL_)_|5 n n LL_27 " " ATCC 25923 Streptococcus pyogenes C203 " B-hemblytic Keller T623 " pneumoniae 78-l en eu sd 6ä su en 128 en Öü 128 Tabell IV In vitro antibakteriell aktivitet för LL-C23024 jota Organism minsta inhiberande koncentratëøn (nä/ml) LL-C23024 Jota Enterococcus OSU 75-1 1 Enterococcus SM 77-15 1 Staphylococcus aureus SSC 79-18 1 Staphylococcus aureus FU 79-19-2 2 Mícrococcus Igšgg PCI 1001 1 Stanhylococcus aureus Smith 0,5 Staphvlococcus aureus ATCC 25923 0.5 vi 456 588 Såsom framgår av uppgifterna ovan inhiberar de antibiotiska substanserna LL-C23024 alfa, beta och jota tillväxt av vissa grampositiva bakterier och är sålunda användbara som ett topiskt antiseptikum eller ytantiseptikum i tvättlösningar för hud, utrustning, väggar, golv etc.

Det har även visat sig att de antibakteriella medlen LL-C23024 alfa, beta och jota är aktiva in vivo som ett antikockidialt medel för fjäderfä, såsom demonstreras genom följande tester.

Två dagar före inokulation gavs preparerat fodermedel med olika halter läkemedel till olika grupper av ett dygn gamla testkycklingar. Det vid testet använda fjäderfäfodermedlet framställdes på följande sätt: Vitamin-aminosyra-premix 0,5 % Spârmineral 0,1 % Natriumklorid 0,3 % Dikalciumfosfat l,2 % _Mald kalksten 0,5 % Stabiliserat fett 4,0 % Dehydratiserad alfalfa, 17 % protein 2,0 % Majsglutenmjöl, 41 % protein 5,0 % Menhadenfiskmjöl, 60 % protein 5,0 % Sojabönoljemjöl, 44 % protein 30,0 % Mald gul majs, till 100 % Vitamin-aminosyra-premixen i den ovan angivna fodermedels- kompositionen framställdes enligt följande komposition. Mängd- uttrycken hänför sig till enheter per kg av den färdiga foder- medelskompositionen.

Butylerad hydroxitoluen 125,0 mg DL-metionin 5000, o mg Vitamin A 3300,0 I.U.

Vitamin D ll00,0 I.C.U. 3 Riboflavin 4,4 mg 456 588 10 Vitamin E 2,2 1,0, Niacin 27,5 mg Pantotensyra 8,3 mg Kolinklorid a 500,0 mg Folinsyra , 1,43 mg Menadionnatriumvätesulfat 1,1 mg Vitamin B12 11,0 pg Mald gul majs, till 5,0 g Testkycklingarna inokulerades därefter genom direkt inokule- ring i krävan hos varje kyckling med ett blandat inokulum av 5000 sporulerade oocyster av Eimeria acervulina och ett till- räckligt antal oocyster av Eimeria tenella för att åstadkomma 85-100 % dödlighet hos icke behandlade kontroller. Kyckling- arna gavs fri tillgång till foder och vatten under hela test- perioden. 7 dygn efter inokuleringen avslutades testerna och fåglarna vägdes och dödades och deras mag-tarmkanal under- söktes med avseende på skador. Resultaten anges i tabellerna V och VI nedan och visar att förbättrad överlevnad hos infek- terade kycklingar erhâlles när 10 ppm eller mindre av anti- biotikum LL-C23024 beta eller jota tillföras i dieten. Resul- taten visar även en signifikant hämning av intestinala skador förorsakade av Eimeria tenella och Eimeria acervulina. u: 456 588 ll HÜHHOHUCOX UÜUHUUMÜMGH ÜMUH ~UÜNfiUCNÃUfl ÜXUH H UZZ¥ || || oofi ma ozz 0 0 ßm ma o O ß ßv mfl m O O om ma ofi oofi oo oofl mfl mä ooH ä oofi 3 oN ïàoåolqq nu || oofi md ozz o o o~ mfi o oofi oofl oofi mo om oofi oofi oofi ma om oofi oofi oofi mfl owfi «\«~om~o|qq o o o_o« mfi o «uzz oofl o om m m Q«~o-o|Aq oofl oo ooH m oH Kåomwuaqq oofl oofi oofi m mä @\<~om~u|Au m:flfi:>uwum .W mfiflmcmu .m cmnußn :www Emm .cwuwwfl mcflcmunh HOÜNMW UÜÜMWEME ÜÜÉ HMHmW% W ÜNC>UHHU>@ W umfimww Hmuac A COHUflHUCOUGO¥ ummcfifixuwx hmm Hwwwš vfimfiflflxuoxflvflm Mum Eomwm Qèmcmmuxqfl Edxfluoflnwucm >ø mcflHw®uw> > Hawflmfi 12 Oofi On OOH OH m~> 456 588 OOH OOH OOH OH .ma O O ON ma O Om om Om m m oofl Oofi OOH m OH oofi oofi oofl m md mcflH:>um0m .N maflwcwu .m cmnumn :www Hoømxm mwmxmcflš øwë Hmflmwu w wmG>wHum>© w umfimwm fimucd Åëmm. uwflm fl coflumuucwocøx ummcflfixuæx www fiwuws uflmfiwfixuoxflucm »um sowwm ~»owÅ«~om~o|4A snxfluoflnfiucw >~ m=Huwøpm> H> Hfiwnmà 456 588 13 Följande tester demonstrerar den nematocidala aktiviteten.

Exemgel A Värdering av testkompositioner med avseende gå nematocidal aktivitet med användning av den fritt levande hermafroditiska mikrobivora nematoden Caenorhabditis elegans II Vid följande tester användes C. elegans för att bestämma den nematocidala aktiviteten i fermentationsvätskan och den skörde- massa, som framställes vid förfarandet enligt uppfinningen.

Denna organism användes även för värdering av LL-C230240C och LL-C2302¶ß för att bestämma deras nematocidala aktiviteter.

Vid dessa tester utgör fermentationsbuljongen fermentations- vätskan och blandade fasta substanser upptages innan de fasta substanserna, dvs. skördemassan, separeras från vätskan. Skörde- massan är de fasta substanser som kvarblir efter separation.

För värdering av skördemassan dispergeras de fasta substanserna däri 1:1 i destillerat vatten. Fermentationsbuljonen användes såsom sådan och innehåller både vätska och fasta substanser.

Vid de nedan angivna värderingarna upprätthölls C. elegans i ett C. briggsae-upprätthållningsmedium. Detta medium är kommersiellt tillgängligt från Grant Island Biological Company, Grant Island, New York, och har följande sammansättning: "C. briggsae MAINTENANCE MEDIUM"(l) Komgonent mg/1 Oorganiska salter CaCl2 . 2H2O 220,50 CuCl2 . 2H2O 6.50 Fe(NH4)2 (so4)2 . 62120 58,80 KHZPQ4 l225,5O Kon (a) MnCl2 . 4H2O 22,20 Znclz 10:20 456 588 14 Andra komgonenter N-acetylglukosamin Adenosin-3'-(2')-fosforsyra.H2O Cytidin-3'-(2')-fosforsyra _ D-glukos Glutation, reducerad Guanosin-3'-(2')*P04Na2.H2O Magnesiumcitrat.5H20 (tvåbasiskt) Kaliumcitrat.H2O DL-tioktinsyra Tymin Uridin-3'-(2')-fosforsyra Aminosyror L-alanin L-arginin L-asparaginsyra L-cystein HCl.H2O L-glutamat (Na).H2O L-glutamin Glycin L-histidin L-isoleucin L-leucin L-lysin HCl L-metionin L-fenylalanin L-prolin L-serin L-treonin L-tryptofan L-tyrosin L-valin Vitaminer p-aminobensoesyra Biotin Kolindivätecitrat 15,00 365,00 323,00 1315,o0 204,00 363,00 915,00 486,00 3,75 126,00 324,00 1395,00 975,00 1s20,00 28,00 550,00 1463,00 722,00 283,00 361,00 1439,00 1283,00 389,00 803,00 653,00 788,00 717,00 184,00 272,00 J020_00 7,50 3175 88,50 w 456 588 15 Vitaminer (forts.) Cyanokobalamin (B12) 3,75 Folinat (Ca) 3:75 Myo-inositol 64,50 Niacin 7,50 ' Niacinamid 7,50 Pantetin 3,75 Pantotenat (Ca) 7,50 Pterolyglutaminsyra 7,50 Pyridoxalfosfat 3,75 Pyridoxamin 2HCl 3,75 Pyridoxin HCl 7,50 Riboflavin-5'-PO4(Na).2H2O 7,50 Tiamin HCl 7,50 Referenser: (1) Hansen, E.L., Proc. Soc. Exp. Bio. & Med. 121: 30-393 (1966).

Anm.: (a) Efter behov för inställning pâ pH 5,9 + O,l.

En testplatta uppvisande en rad små fördjupningar användes för värderingarna. 25 ml fermentationsbuljong, 1:1 vatten/ skördemassa-suspension eller en vatten/aceton-lösning av LL-C23024d. eller LL-C23024ß innehållande från 31,25 till 500 ppm av testföreningen avsattes aseptiskt i separata för- djupningar. Till varje fördjupning sattes därefter 25 ml av C. elegans upprätthâllandemedium innehållande 10-20 vuxna maskar och larver av olika ålder samt ägg. Plattorna place- rades sedan under ett skydd och undersöktes 48 timmar efter inokuleríngen för att bedöma hastigheten och graden av nema- tocidal aktivitet hos testkompositionerna. Erhâllna data anges nedan. Där aktivitet iakttogs i fermentationsbuljongen utspäddes denna vidare för att erhålla ett'l:4 förhållande mellan buljong och C. elegans. 456 588 1.6 Tabell VII Komposition Koncentration ppm Nematocidal aktivitet eller utspädning vid 48 timmar Fermentations- D = 1:1 8 (ingen motilitet) buljong D = 1:4 Skördemassa LL-230240< 500 ppm 7 250 ppm 7 125 ppm 7 62,5 ppm 6 31,25 ppm O LL-2302%ß 500 ppm 7 250 ppm 0 Den vid dessa värderingar använda aktivitetsskalan var såsom följer: Aktivitetsskala 8 = ingen motilitet (uppenbart döda) = markant reducerad motilitet 7 6 = reducerad motilitet O = normal motilitet för arten .Exempel B Värdering av LL-C23024u såsom ett nematocidalt medel gentemot infektiösa larver** av ruminanta nematoder.

Värdering av LL-C23024°§ såsom ett nematocidalt medel gent- emot de infektiösa larverna av ruminanta nematoder: Haemonhmus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongy- lus axei, T. Colubriformis; och mot vinägerålmask, Turbatrix acetí, bestämdes med användning av den ovannämnda nematod- arten i stället för C. elegans.

Erhållna data anges i tabellen nedan.

** Det tredje täckta larvstadíet 456 588 17 umšëwu wm Eonfl cmuum www uoufififluoë HmEH0: n umuflafiuoë omnwoflwwu u umuwfifiuoš wmumuzfiwn ucmxnmš u w v-\o O Q fimvßfl uumncmmmflv umuflflfluøü Cwwfifl u “MHM¥mwH@ßfl>H#M@ ó=fi=msfiøåw än mwfißwfiflu. äñdšwoumaw: ä 2 fio Näää? xåoßotoq ä 3 vmnwflfiwummofiwnnsfl fi mflfiflmumñmum .dwmævflx .ummcwcmsnunwu mm Umë uouumflmnfluHøxmøm:>m> M flhmwëøcmø ":wuum> N o o o o o .flouucouc o w w O w w m-Hm w w ß w ß www w w ß ß ß mmfl w ß næ næ ß omw o w nw no w oom Huwom .a .nøfioo .a Üxm .a .Eøuufio .o .fioucøu .m Kvwommoaqq É COHQMHHCUUCOM Åumäšflu mv ®fi>y uoë uwuwbfluxm m 0uufl> :H HHH> Hflwßmfi 4560588 18 Exempel C Värdering av nematocidal aktivitet hos antibiotikum LL-C230240< gentemot Nematospiroides dubius och Aspicularis tetraptera på fflöåâ Vid följande tester infekterades Swiss-Webster vita möss av honkön med Nematospiroides dubius och Aspicularis tetraptera och förvarades i tre veckor för att infektionerna skulle mogna.

Efter uppehållsperioden uppdelades mössen i grupper om fyra och grupperna placerades i separata burar. Medikerade fodermedel innehållande från ungefär 31,25 ppm till 4.000 ppm testförening erbjöds därefter ad libitum till mössen under en vecka. Vatten tillfördes även ad libitum under hela testperioden. Under be- handlingsperioden undersöktes mössens avföring för att bestämma huruvida maskar passerade. Alla behandlingsgrupper visade sig passera maskar vilket sålunda indikerade nematocidal aktivitet vid alla koncentrationer gentemot båda nematoderna. Vid slutet av behandlingen under en vecka med medikerat fodermedel avdödades mössen och innehållet i mag-tarm-kanalen därav undersöktes med avseende på förkomst av maskar. De erhållna data anges nedan såsom procentuell reduktion av maskar i jämförelse med infek- terade och icke medicinbehandlade kontroller.

Vid dessa tester värderades råa fermentationsbuljonger som er- hållits före skörd av massan och innehållande från 1000 ppm till 4000 ppm av den nematocidala antibiotiska substansen.

Likaledes värderades mössfodermedel behandlade med från 31,25 ppm till 500 ppm av LL-C23024p( löst i aceton/vatten (lzl).

Aktivitet Testkomposition Dietens konc. (% reduktion)*** mot ppm N. dubius A. tetraptera *Fermentations- 4.000 73 - buljong med LL-C230240ç 2'OOO 44 53 1.000 65 33 500 70 SA** 250 63 SA 125 61 SA 62,5 29 SA 31,25 32 SA 456 588 19 Å- ll mängden LL-C23024@¿ obestämd ** lätt aktivitet: ökat antal pinnmaskar tillvaratogs vid fekalundersökning ti* jämförd med infekterade icke medikerade kontroller De nya antibakteriella och antikockidiala medlen enligt upp- finningen bildas under odling under reglerade betingelser av Actinomadura yumaense sp. nov.

En representativ stam av denna mikroorganism isolerades från ett jordprov tillvarataget i Yuma County, Arizona, och hölls i kultursamlingen hos Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, såsom kultur nr.

LL-C23024. En livskraftig kultur av denna representativa stam har deponerats hos Culture Collection Laboratory, Northern Regional Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illi- nois 61604, och har upptagits i dess permanenta kollektion under tillgänglighetsnumret NRRL 12515.

Taxonomisk karaktärisering av NRRL 12515 Stammen NRRL 12515 har taxonomiskt karaktäriserats och identi- fierats såsom typstammen av en ny art av Actinomadura som är känd såsom Actinomadura yumaense sp. nov. observationer har gjorts av de kulturella, fysiologiska och morfologiska kännetecknen hos den representativa stammen NRRL 12515 med användning av de metoder som anges av E.B. Shirling och D. Gottlieb. "Methods for characterization of Streptomyces species", Internat. J. Syst. Bacteriol. l6:3l3-340 (1966), och R.E. Gordon et al., "Nocardia coeliaca, Nocardia autotro- phica, and the nocardin strain", Internat. J. Syst. Bacteriol. 24:54-63 (1974). Media som användes för detta studium utvaldes bland de som rekommenderats av T.G. Pridham et al., “A selec- tion of media for maintenance and taxonomic study of Strepto- mycetes", Antibiotics Ann., pp. 947-953 (1956/1957); G.F. Gauze et al., "Problems in the classification of antagonistic actino- mycetes", State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Moskva (l957); och R.E. Gordon et al., åupra för taxonomiskt 456 588 20 studium av actinomycetes och jordbakterier. Kemisk sammansätt- ning för cellväggarna av mikroorganismen bestämdes med använd- ning av den metod som anges av H.A. Lechevalier et al., "Chemi- cal composition as a criterion in the classification of actino- mycetes“, Adv. Appl. Microbiol. 14:47-72 (1971). Fosfolipid- mönstren bestämdes med användning av den metod som anges av M.P. Lechevalier et al., "Chemotaxonomy of aerobic actinomyce- tes; phospholipid composition", Biochem. Syst. Ecol. 5:249-260 (1977). Detaljer anges i tabellerna IV-IX och en allmän beskriv- ning av kulturen ges nedan. Understrukna beskrivande färger har tagits från K.L. Kelly och D.B. Judd, "Color. Universal Language and Dictionary of Names", U.S. Nat. Bur. Stand., Spec. Publ. 440. Washington D.C. (1976) och de åtföljande Inter- Society Color Council, Natl. Bur. Stand. Centroid Color Charts.

De data som iakttagits för denna nya art representad av stammen NRRL 12515 jämfördes med data som publicerats för de kända arterna av släktet Actinomadura [M. Goodfellow et al., “Nume- rical Taxonomy of Actinomadura and related actinomycetes", J. Gen. Microbiol. l22:95-lll (l979); L.H. Huang "Actinomadura macra sp. nov., the producer of antibiotic CP-47,433 and CP- 47,434", Internat. J. Syst. Bacteriol. 30:565~568 (l980); J. Meyer, “New species of the genus Actinomadura", Z. Allgem.

Mikrobiol. 19:37-44 (l979); H. Nomura och Y. Ohara, "Distri- bution of actinomycetes in soil. XI. Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier et al., " J. Ferment. Technol. 49:9o4-912 (l97l); och T. P. Preobrazhenskaya et al., "Key for identification of the species of the genus Actinomadura" The Biology of Actinomycetes and Related Organism 12:30-38 (l977L7. Kulturen NRRL 12515 uppvisar en viss ringa likhet med Actinomadura pelletieri, men liknar inte någon annan beskriven art och skiljer sig från A. pelletieri med avseende på ett flertal kännetecken. Sålunda har stammen NRRL 12515 designerats såsom typstammen för en ny art som skall vara känd under be- teckningen Actinomadura yumaense, sp. nov., benämnd på basis av stället för tillvaratagandet av det jordprov varifrån typstammen isolerats. 456 588 21 Mikromorfologi Sporerna är formade i korta spiralkedjor (maximilängd ungefär~ 20 sporer per kedja) på grenade, nästan verticillata luftsporo- forer. Sporerna är ovoida, 0,6-0,8 mikron gånger 1,0-1,4 mikron, med en slät yta.

Cellväggssammansättning Helcellhydrolysat av denna kultur innehåller maduros (3-0- metyl-D-galaktos) och mesoisomeren av diaminopimelinsyra (DAP). Kulturen har även ett fosfolipidmönster av typ P-1 och inga andra diagnostiska fosfolipider än något fosfatidyl- glycerol. Dessa kännetecken är samtliga mycket typiska för medlemmar av släktet Actinomadura.

Grad av tillväxt God tillväxt iakttogs på Bennetts agar, Gauze No. 2-agar, Nz-amin-stärkelseglukosagar (ATCC Medium 172), tomatpasta/havre- mjölsagar och jästextrakt/maltextrakt-agar; moderat tillväxt iakttogs på Benedicts agar, Czapeks sackarosagar, glycerol/as- paragin-agar, Hickey-Tresner-agar och havreagar; dålig tillväxt iakttogs på kalciummalatagar, Gauze No. l-agar och oorganiska salter/stärkelse-agar.

Vegetativt mycelium På medier där god tillväxt skedde iakttogs att det vegetativa myceliet var upphöjt och spiralformigt och i allmänhet gul- aktigt grå till färgen.

Luftmycelium och sporfärg Luftmycelie- och/eller spormassor var vita till 264.ljusgrå till färgen. Luftmycelieproduktionen var svag på de flesta medier.

Lösliga pigment Frånvarande på många medier; gult pigment på Benedicts och glycerol/asparagin-agar; gulgrönt pigment på kalciummalat- agar; grönaktigt brunt pigment på NZ-amin/stärkelse/glukos- agar; orangefärgat pigment på Bennetts och jästextrakt/malt- extrakt-agar. 456 588 22 Fysiologiska reaktioner Inga melaninpigment på pepton/järn-agar och tyrosin-agar (ISO-7); stark peptonisering av lackmusmjölk; stark proteolys av näringsmedelsgelatin; moderat reduktion av nitrat; ingen hydrolys av adenin eller guanin; stark hydrolys av hypoxantin, tyrosin och xantin; svag hydrolys av stärkelse; hydrolys av eskulin; variabel hydrolys av urea. Ingen tillväxt vid 4°C, 1o°c eller ss°c; moderat tillväxt vid 2s°c een 4s°c; goa till- växt vid 32°C och 37°C. Kolhydratsutnyttjandet enligt den metod som anges av T.G. Pridham och D. Gottlieb, “The utiliza- tion of carbon compounds by some actinomycetales as an aid for species determination“, J. Bacteriol. 56:10?-114 (1948): gott utnyttjande av glukos, glycerol och trehalos; moderat utnyttjande av maltos och sackaros; dåligt utnyttjande av fruktos, galaktos, inositol, mannos och melezitos; inget ut- nyttjande av adonitol, arabinos, dulcitol, laktos, mannitol, melibios, raffinos, ramnos, salicin, sorbitol och xylos.

Syraproduktion från kolhydrater enligt den metod som anges av Gordon et al., supra: god syraproduktion av glukos, glycerol, maltos, sackaros och trehalos; svag syraproduktion från galaktos, inositol och mannos. Utnyttjande av organiska syror enligt den metod som anges av Gordon et al., supra: utnyttjande av acetat, malat, propionat, pyruvat, succinat och tartrat; inget utnyttjande av bensoat, citrat, laktat, mukat och oxalat. »fi> uwwuxmfiøm .Nm .aøflfiwuæapmsfl 456 588 Ham umummoë uwum umfluxøfiøm .mm Edflflwoæñ u>«u Hmmm uwmcmuø uxnwä .Nß ummcfl |mummm> uuwfinøaøx 0Umnwuflfio>:0x wwmummum wow IN .OZ wusmw Eflflflwoæäuunfl Hmmm mßfimuww ummnw nuH> vëmmummm «uxw>H~«u uumfifl mmflmuww mflawø na .OZ musmw Hmmm Ham umfluxmwum .Om uxw>HHflu >flumummm> umuwøoš nmoumxumw ufiømxwan .mm ummcfl Edflflwohñumøfi umuwwoñ “uXm>HHfiu uumam fiflflu mflawfl mxwmwnv Hflm ummmlumamë umwuxmcmum .Om Gwumfløm Eflflfiwuæšumflfl uu«> uëwmummw ~uxm>HHflu uumfim mflflmw nëswufimx B :Små umfluxm cflunfinm umfluxmwum lflsm umfluxm .Om Hfiflu wum umfluxmasm .mm uXm>flfiflu >flu hmmm uwum uxumš .Hm wmcmuo Imummm> wmuwu:H0>G0x Nënflfimuæäuwsfl uwmøfi vom muuwncmm Wummnfifi .www Hfifiu m»fl> umflfi mflfiwø Hfiflu hmmm Hsmxwfin .mm umfluxmasm lmuæëuwøfi uuwflcofiox mmflEu0uum>Hflm .uumfim umumwoå muuwwmcmm ucmñmflm mmnm mHwwmum>mm mmfiflmmq uwuomm uwAHm\:O0 Eflflflwoæëuwøq |uxw>HH«B Eflfiflmz UOæN Musumuømëwa ummmw va nmcwuwnsxcfi mamma Ammz wmcmmäflä musømñocfluom Hmm uwmmxmcmmmmmcfifiwo HH> Hfimnmä m :nun Eflfiflwumëuudfi ummcfl umcsun umfluxmfiøw umfiuxm Hmmm » fluxmfisw.. :www .om HHH» www pmfiuxmfiam .mm .uwfla luxßnuxwuflms uxumë mß wmcmno |0H0x mflmumußa0>:0x .wømuHßXm> ~0©mumwum vom \uxmuuXwummn Hmmm Edflawuæåuwøa uufl> >m Mmmm “Hflm umfluxm |mHmwEwH>m: uwmcfi |wHm uxumå .Hm .uxm>HHwu wmuumXm> uumfim vom \mummmumEoH Ham uufl> .EflflHwo>EuwflH umumfloä “Ham Hmmm umfluxmmum .Om uwmflfl umfiuxmmum .Om .uxm>HHflu wmuumxm> .uumam umuwvoë |mHmwEwH>mm mumwsfifl .«w~ Hmmm :sun Hflflu uufl> .ëfiflflwoæëawdfi umuwflofi “uum>m xmoxøflm umfluxm :sun umflugmcsun .mm Hfifiu ucnun »Ham umfluxm \wwHwx»m»m |fi:m uxumä .wß umfluxmcwum lwnm .Hw .uxw>-flu ©muwusH0>c0x mfluwøux wow \cflEm|Nz 4 ummmlwmfiwx 2 Efl«HwU>EuwflH uufi> «nwfi:0flOx tHw@m\uwufimm mwamuwm uwmcfl mmflEu0uum>Høm _mmmflmumm .muumflm mflflwø mxmflcmmuoo wummøfifl .«@~ fififip »»fl> Hmmm H50 ~E9«HUo>EuwflH uämmummm uaøw umfluxm lumcmwuh umfluxmwum .Om uwmcfi :mmm .Om uuwficoaox wumuumxm> muumfim vmuwooë -æmxuflm ummm Esfiamoaävmflfl umnwwoä ucflmmummmm Hsmxwfin .mm nanm uufl> uuwflcofiox mmflEucuuw>Hsm .muumflm flflflu mflfimø \Houwu>Hw ucmämflm nanm mHmwmHw>wm mmflflmmq umuomm umHHm\:o0 Edflfiwuæäuwøé |uxm>HH«B Eflfiflmz 456 588 A.wflHOuV HH> flflmnmß 456 588 25 cøuxflå v.H|O.fi uwuomw mcmoë >ø uonfløxfimuflmm munox namn ...mfiw x wfififlwu wwcmuwn :flbfiåflufiuumš :moumxumm :0HxflE w.0|m.O mufiO>O :Mumma .wømcwum fiuwuømøuommumflfl mxwmmuu Hwuøuxduum muæuomm Mwfluøuwuomm Euøuuomw muowfiuømm uwHHm\nu0 Edfiflwüæšwmflfl Edfiflwz mfimmfi Aamz mmcwmëdæ mnflømšocfluufl uwm flmoflowuoäouxflz HHH> HHNQMB 456 588 26 mæflouflæs cmmcfl wøm Hmmmfl am Mmmm mhfiouøæs cmmcfi vom Hmmmw wfl |:«cmøfi Gofluxflflmu umuwvoä vom Hnmmw mm uconfifln cofluxsømu mm>m uwxuæå Uøm ummmw vfl numuuflz _m>HomuoHm flmvøu nom ummmw mm fiwwM%m% mæflowucum uuwfi mom ummmfl va lmmnfinmz .m cflummficoumwm xumvm vom uømmw mm xamwë mcfluwmflfioumwm wow fløm ummmfl va Imsäxomâ wcmimfim umfluzmfiøm wow ummmo wfi ummw ;ucwEvHm uwmzfl umnwwoä ummmw > lcfimouæa mcflcmumwcønn wuma mom ummmfl va mm%w mcflmmumucøun uumfl vom ummmu ß \n0ummw uofluwm cofiuxmwu xwflmofioflmæm @mumuxm>HHfiB |m:oflumn:x:H Eflflwmz mamma QMMZ mmZw<2D% XH Hamflmß 456 588 27 flwnmflum> mcflnflwwuwflnwm vom ummmw æw mnøfifiønmwub uoßm :oo u Nm _ Awßfi .oz øfl> una» m _ _ o vw: ousmv _ . Hflflu w0 .Uømv :OO Uoæm Uømm Hmmmtmoxbfim øfl> uxw>H~H» umnwøos No mm zoo o ofi :uo wmfiwx ~U w ©fl> uxm> a m 0 0 |umum mflfiwmfl 0 . : HH.u cm ca uwflaw mfiflww Hmvmfl m wwñ Swñmnwz mæflouwæc xumuw wow Hmmmw HN m um mæfionwæc umuwwoä vom Hmmmw vfi ncfiucmæ w>HOuU>L xumum wow ummmw HN m Hmm mæfiouøæc xumum nom ummmw vfi ncflwouæs mæflouflæs Hmuøu fløw Hmmmw fim mm u m m>~o~@>n Hmßou wow »Mmmm vfi »:fi»nmxøm>= mwflouflæs cmmfifl wow ummmw HN ummm m>fiOuUæ: cwmcfl Uom Hmmmfl va lcficmflw C Uoflumm Ofluxmmu xmflmoflowmæm @øHmuxw>aHflH |m:0flumnDxøH Eøfivoz ..wuuou. xH Hfiwnmæ 456 588 28 mæflouøæn cmmcfl nom Hmmmfl OH namn mæfiouwæs cmmcw vom ummmw m lmmfimxnmuw maHonm>:¶ vom nmmmø æw mconfløn mæflonøæz nom Hømmfl wa |:fifiøxmm wofluwm cowuxmmu xmflmøfloflmæm Umumuxm>HHflB |wc0flumn5xfiH Esfluwz ~.mßH0uv KH flfiwflmfi 456 588 29 Tabell X Kolkälleutnygtjande för Actinomadura yumaense NRRL 12515 vid ISP-9 kolhydrat-utqyttjandemedium Inkubation: 28 dggar Temperatur: 28°C Kolkälla Utnyttjande Adonitol - 1-arabinos - Dulcitol - Fruktos dålig d-Galaktos dålig d-Glukos god Glycerol god i-Inositol dålig Laktos - Maltos måttlig d-Mannitol ~ d-Mannos dålig d-Melezitos dålig d-Melibiøs - d-Raffinos - 1-Ramnos - Salicin - Sorbitol - Sackaros måttlig d-Trehalos gOd d-Xylos - Negativ kontroll 456 588 30 Tabell XI Syraproduktion ur olika kolhydrater av Actinomadura yumaense NRRL 12515 på Gordons basala oorganiska kvävemedium Inkubation: 28 dagar Temperatur: 28°C Kolkälla Syraproduktion* 7 dagar 28 dagar Adonitol - - 1-arabinos - - Dulcitol 7 - - Fruktos - - d-Galaktos - + d-Glukos +++ +++ Glycerol ++ +++ i-Inositol - + Laktos - - Maltos - +++ d-Maanitol - ' - d-Mannos - + d-Melezitos - - a-Melibios - d - d-Raffinos - - l-Ramnos - - Salicin - - Sorbitol - - Sackaros - +++ d-Trehalos - +++ d-Xylos - - Negativ kontroll - - *) +++ = starkt positiv rgspons ++ = moderat positiv respons + = något positiv respons - = negativ respons 456 583 31 Tabell XII Utnyttjande av organiska syror av Actinomadura yumaense NRRL 12515 på Gordons modifikation av Kosers basala agar (Kosers citratagar) Inkubation: 28 dagar Temperatur: 28°C Kolkälla Utnyttjande * Acetat + Bensoat - Citrat - Laktat - Malat + Mucinsyra - Oxalat - Propionat + Pyruvat + Succinat _ + Tartrat + *) + = positiv respons - = negativ respons Det bör förstås att uttrycket Actinomadura yumaense inte är begränsat till stammen Actinomadura yumaense NRRL 12515 eller till stammar som fullt motsvarar den ovan angivna tillväxt- och mikroskopiska karaktäristiken, som endast anges såsom illustration. Den Actinomadura yumaense som beskrives i före- liggande sammanhang innefattar samtliga stammar av Actinoma- dura yumaense, som kan bilda antíbiotikum LL-C23024 alfa, beta och och jota och som inte definitivt kan differentieras från Actinomadura yumaense NRRL 12515 och dess subkulturer, inklusive mutanter och varianter därav. Uttrycket "mutanter" innefattar de naturliga (spontana) mutanterna av denna orga- nism med väsentligen samma egenskaper såväl som inducerade 456 588 32 mutanter framställda av denna organism medelst olika muta- gena medel som är kända för fackmannen, såsom exponering för röntgenstrålning, ultraviolett strålning, senapsgas, aktino- fager, nitrosaminer och liknande. Det är även önskvärt och 'avsett att inkludera inter- och intraspecifika genetiska rekombinanter framställda medelst genteknik som är känd för fackmannen. exempelvis konjugation, transduktion och gene- tiska ingenjörsförfaranden.

Odling av Actinomadura yumaense kan utföras med en stor mång- fald olikartade fasta eller flytande odlingsmedier. Medier som är användbara för produktion av antibiotika LL-C234024 alfa, beta och jota innefattar en assimilerbar kvävekälla, såsom protein, proteinhydrolysat, polypeptider, aminosyror, majsstöpsvätska etc., och oorganiska anjoner och katjoner, såsom kalium, natrium, ammonium, kalcium, sulfat, karbonat, fosfat, klorid, etc. Spårelement såsom bor, molybden, koppar etc. tillföres såsom föroreningar av andra beståndsdelar i medierna. Luftning i tankar och flaskor åstadkommes genom att man bringar steril luft att flöda genom eller mot ytan av fermentationsmediet. Vidare åstadkommas omröring i behållare medelst en mekanisk omrörare. Ett skumdämpande medel, såsom isterolja eller sådana av silikontyp kan tillsättas efter behov.

Actinomadura yumaense odlas och upprätthålles på snedagar, exem- pelvis Bennetts agar, jästmaltagar eller ATCC Medium nr. 172.

ATCC Medium nr. 172 föredrages. Snedodlingen inokuleras med en kultur av Actinomadura yumaense och inkuberas vid 28-37°C, företrädesvis vid ungefär 32°C, i ungefär 7 dagar. Dessa lager- kulturer kan upprätthållas genom serieöverföringar till färska snedagarodlingar eller också kan ah plugg av agar innehållande mycelium från välväxt snedagar användas för inokulering av flytande medier.

Skakflaskeinokuleringar av Actinomadura yumaense framställes genom inokulering av 100 ml sterilt vätskemedium i 500 ml- kolvar med avskrapningar eller avtvättade sporer från en sned- 456 588 33 agarodling av kulturen. Exempel på lämpliga ympmedier är följande: Medium A Köttextrakt 0,3 % Basta tryptonl o, 5 æ Glukos 1,0 % Jästextrakt 0,5 % Vatten qs 100 % 1 . .. . .

[ En pepton, registrerat varumarke fran Difco Labora- tories, Detroit, Michigan]. pH inställes på 6,8-7,2 med utspädd bas, t.ex. natrium- hydroxid.

Medium B Glukos 1 % Stärkelse 2 % Jästextrakt 0,5 % . ® 2 N-Z-amine A 0,5 % Kalciumkarbonat 0,1 % Vatten qs 100 % ['2 Kaseinuppslutning, registrerat varumärke från Sheffield Chemical Co., Div. Nat'l. Dairy Products Corp., Norwich, N.y.].

Medium B föredrages.

Kolvarna inkuberas vid en temperatur av 25-35°C, företrädes- vis vid 32oC, och omröres kraftigt på en roterande skakapparat i 1-4 dagar. Detta ympinokulum användes därefter för inokule- ring av jäsningskulturen eller också kan denna kultur frysas och lagras för att ge inokulum för efterföljande ympkulturer. 456 588 34 Följande medier utgör exempel på dem som är lämpliga för fermentation av Actinomadura yumaense för framställning av antíbiotikum LL-C23024 alfa, beta och jota.

Medium C Glukos 1,5 % Glycerol 1,5 % sqæ@m.3 Lsæ Kalciumkarbonat 0,1 % Natriumklorid 0,3 % Vatten qs 100 % [3 Kan ersättas med bomullsfrömjöl eller lösliga köttsubstanser med lika god effektf.

Medium D Glukos 3 % Sojamjöl 1,5 % Kalciumkarbonat 0,1 % Natriumklorid 0,3 % Vatten qs lOO % Medium E Stärkelse l % Sirap 2 % Sfiæfiü. L5% Kalciumkarbonat O,l % “vatten qs 1oo % Medium F Glukos 3 % Lösliga köttsubstanser 2,5 % Natriumklorid 0,2 % Kalciumkarbonat 0,1 % Vatten qs 100 % m 456 588 35 Medium G Glukos 3 % Sojamjöl 0,5 g Ammoniumsulfat 0,3 g Natriumkloria ' o,2 s Kalciumkarbonat 0,1 % Vatten qs 100 % Medium H Glukos 3 % Ammoniumsulfat 0,3 % Tvâbasiskt kaliumfosfat 0,1 % Kalciumkarbonat 0,2 % Natriumklorid 0,1 % Vatten qs 100 % Medium D föredrages.

Fermentationen kan utföras i 100 ml medium i en 500 ml-kolv som inokuleras med 3-10 % (volym/volym) av en ympkultur som framställts såsom beskrivits ovan och inkuberas vid 25-35°C, företrädesvis vid ungefär 3200, i 24-72 timmar under luftning.

Prov av fermentationskulturen kan frysas och lagras för senare användning såsom inokulum för ympkulturer.

Alternativt kan fermentationen utföras i större fermentations- kärl försedda med organ för luftning och omröring. Varje behållare inokuleras med 3-10 % (volym/volym) inokulum som framställts såsom ovan beskrivits. Luftning utföres vid en hastighet av 0,5-2,0 liter steril luft per liter odlingsvätska per minut och mediet omröres med en omrörare som drives vid 200-400 varv/minut. Temperaturen hålles vid 25-3500, företrä- desvis vid 320C. Fermentationen fortsättes tills antibiotisk substans ansamlas i fermentationsmediet, vanligen efter 100- 150 timmar, vid vilken tidpunkt antibiotisk substans skördas. 456 588 36 Den antibiotiska substansen kan skördas och renas enligt de metoder som beskrives i den amerikanska patentskriften 4 278 663 eller enligt följande förfarande: Den råa fermentationsvätskan innehållande hela celler, fram- ställd såsom beskrivits ovan, blandas med en lika volym av ett med vatten icke blandbart organiskt lösningsmedel av icke-kolvätetyp. Metylenklorid eller etylacetat föredrages.

Den organiska fasen separeras och koncentreras i vakuum till en oljeartad sirap.

Den oljeartade sirapen löses 1 metylenklorid och sättes till en kolonn av kiselgel, aluminiumoxid, Sephadex LH-20 (Pharma- cia Fine Chemicals, dotterbolag till Pharmacia, Inc. Piscataway, N.J.) eller magnesiumaluminiumsilikat. Exempel på lämpliga lös- ningsmedel för framkallning av kolonnen är dietyleter, etyl- acetat, en 1:1 till 1:7 (volym/volym) blandning av metylen- klorid och etyleter, 10-40 % aceton i metylenklorid, 2-10 % lägre alkohol (metanol föredrages) i metylenklorid, 2-15 % acetonitril i metylenklorid, eller 2-15 % dioxan i metylenklo- rid. Metylenklorid/etylacetat (1:1, volym/volym) föredrages.

Fraktioner tillvaratages och undersökes med avseende på när- varo av antibakteriell aktivitet genom bioanalys gentemot en påverkbar organism, t.ex. Bacillus subtilis. Aktiva frak- tioner kombineras och koncentreras i vakuum till en återstod.

Denna återstod löses i ett organiskt lösningsmedel, t.ex. t-butanol (föredrages), bensen eller p-dioxan, och frystorkas.

Den frystorkade fasta substansen löses i ett lämpligt organiskt lösningsmedel, t.ex. metylenklorid, hexan, metylenklorid/etyl- acetat, dietyleter, hexan/etylacetat, hexan/kloroform eller hexan/eter. Dietylete: föredrages. Denna lösning skakas med vatten och pH inställes på 1,5-4,0, företrädesvis ungefär 2,5, med någon utspädd mineralsyra. Den organiska fasen separeras, tvättas med vatten för avlägsning av eventuellt överskott av syra, torkas över ett lämpligt torkningsmedel, filtreras och koncentreras till en återstod i vakuum. 456 588 37 Denna återstod löses i ett lämpligt lösningsmedel och lösningen får inaunete långsamt, företrädesvis vid ungefär 4°c. Exempel på lämpliga lösningsmedel är metylenklorid, hexan, metylenklo- rid/etylacetat, dietyleter, hexan/etylacetat, hexan/k1oro- form eller hexan/eter. Hexan/eter (5:2, volym/volym) före- drages. De erhållna kristallerna tillvaratages och tvättas, före- trädesvis vid ungefär 40°C med något kolväte med moderat kok- temperatur, exempelvis hexan eller heptan; och lufttorkas för erhållande av slutprodukten antibiotikum X-l4868A i form av den fria syran.

Om man önskar erhålla produkten i form av ett salt kan den fria syran omvandlas genom behandling med den motsvarande kat- jonen, företrädesvis i form av en utspädd mineralbas, enligt förfaranden som är välkända för fackmannen.

Följande exempel belyser uppfinningen. Media A, B, C, etc. är de som angetts ovan. Om inte annat anges utfördes samtliga förfaranden vid rumstemperatur (ungefär 22°C) och vid l atm. tryck.

Exempel l Tvättade sporer från en snedagar av Actinomadura yumaense NRRL 12515 användes för att inokulera en 500 ml-kolv innehållande 100 ml sterilt medium B. Kolven inkuberades i en roterande ekekepperet vid 2e°c 1 2 dager.

Ett 5 % inokulum av denna kultur överfördes därefter till 100 ml sterilt medium C i en 500 ml-kolv och inkuberades vid 28?C i 5 dagar i en roterande skakapparat.

Närvaron av antibiotisk aktivitet undersöktes dagligen genom bioanalys gentemot Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Bacillus subtilis och Streptococcus faecalis och den antelmintiska aktiviteten följdes genom bioanalys gentemot den fritt levande nematoden Caenorhabditis elegans. 456 588 38 Exemgel 2 Sju 500 ml-kolvar bereddes, vardera innehållande 100 ml av följande sterila media: Kolv 1: lOO ml medium C Kolv 2: lOO ml medium C med 1,5 % bomullsfrömjöl istället för sojamjölet Kolv 3: 100 ml medium C med 1,5 % lösliga köttsubstanser istället för sojamjölet Kolv 4: lOO ml medium D Kolv 5: lOO ml medium E Kolv 6: lOO ml medium F Kolv 7: lOO ml medium G Dessa kolvar inokulerades var och en med ett 5% inokulum av Actinomadura yumaense NRRL 12515 odlat i medium B. Kolvarna inkuberades därefter på en roterande skakapparat vid 28°C i 4-6 dagar.

Var och en av kulturerna ovan visade sig vara aktiv vid under- sökning beträffande närvaro av antibiotisk aktivitet såsom om- nämnts i exempel l och vid undersökning med avseende på anti- kockidial aktivitet gentemot Eimeria tenella i vävnadskulturer baserade på kycklingnjure.

Exemgel 3 Frysta fermentationsodlingsceller av Actinomadura yumaense NRRL 12515 användes för att inokulera en SOO ml-kolv innehållan- de lOO ml sterilt medium B. Kolven inkuberades därefter vid 32°C i 4 dagar i en roterande skakanordning.

Ett 5 % inokulum av denna kultur överfördes därefter till lOO ml sterilt medium H i en 500 ml kolv och inkuberades vid 28°C i 5 dagar i en roterande skakanordning.

Antibakteriell aktivitet bekräftades såsom i exempel l och antikockidial aktivitet såsom i exempel 2. *x 456 588 39 Närvaron av antibiotisk aktivitet analyserades även tunnskikts- kromatografiskt på kiselgelplattor som framkallades i etyl- acetat/kloroform (70:30, volym/volym).

Exemgel 4 100 ml sterilt medium A i en 500 ml-kolv inokulerades med tvättade sporer från en snedagar av Actinomadura yumaense NRRL 12515. Kolven inkuberades vid 32°C i 2 dagar i en roterande skakanordning.

Ett 5 % inokulum av denna kultur överfördes därefter till 100 ml sterilt medium H i en 500 ml-kolv och inkuberades i en roterande skakapparat vid 32OC i 2 dagar.

Ett 5 % inokulum av denna kultur överfördes därefter till en 500 ml-kolv innehållande 100 ml färskt sterilt medium H och inkuberades vid 28°C i 6 dagar i en roterande skakapparat.

Antibakteriell aktivitet bekräftades såsom i exempel 1.

Exemgel 5 Två 500 ml-kolvar som vardera innehöll 100 ml sterilt medium A inokulerades med en fryst ympkultur av Actinomadura yumaense NRRL 12515 och inkuberades vid 32°C i 2 dagar i en roterande skakapparat.

Innehållen i de två kolvarna förenades därefter och sattes till 12 liter färskt sterilt medium A i en 20 liters-flaska.

Denna kultur inkuberades därefter i två dagar vid 2800 under luftning.

Innehållet i denna flaska överfördes därefter till en 300 liters-ympbehållare innehållande 288 liter sterilt medium A och denna kultur luftades och omrördes i 25 timmar vid 32°C.

Vid slutet av 25 timmars inkubering överfördes de 300 litrarna ympkultur till en 1500 liters fermentor innehållande 1200 liter 456 588 40 sterilt medium C. Denna kultur inkuberades under luftning och omröring i 115 timmar vid 28°C.

Fermentationsvätskan analyserades med avseende på antibiotisk aktivitet genom tunnskiktskromatografi på kiselgelplattor framkallade i etylacetat/kloroform (70:30, volym/volym).

Alternativt underkastades ett flertal av de framkallade plattor- na bioanalys gentemot Bacillus subtilis som visade närvaro av antibiotisk aktivitet.

Exempel 6 Ett typiskt medium som användes för att odla det primära inokulumet framställdes enligt följande formel: Köttextrakt 0,3 % Bacto ® trypton 0,5 % Glukos 1,0 % Jästextrakt . 0,5 % Bacto ® aqar 0, 15 % Vatten qs 100 % Tvättade eller skrapade sporer och mycelier från en snedagar av Actinomadura yumaense NRRL 12515 användes för att inokulera en 500 ml-kolv innehållande 100 ml av det ovannämnda sterili- serade mediet. Kolven placerades i en roterande skakapparat och omrördes kraftigt i 48 timmar vid 32°C. Det erhållna kolv- inokulumet (100 ml) användes för att inokulera l liter av samma sterila medium i en 2-liters kolv. Detta inokulum luf- tades med steril luft under det att odlingen fortsattes i 48 timmar vid 28°C. Denna 1-liters kultur användes sedan för att inokulera en 30-liters fermentorbehållare innehållande samma sterila medium och denna tank luftades med steril luft och inkuberades vid 28°C i 42 timmar.

Bxemgel 7 Ett fermentationsmedium framställdes enligt följande formel: 456 588 41 Dextros 1,5 % Glycerol 1,5 % Sojamjöl 1,5 % Kalciumkarbonat 0,1 % Natriumklorid 0,3 % Vatten qs 100 % pH inställdes på 7,0 med 6N natriumhydroxid och mediet steri- liserades. En 30-liters andel inokulum framställt såsom be- skrivits i exempel 1 användes för att inokulera 250 liter av det ovannämnda mediet i en 300-liters fermentor. Steril luft- ning pàfördes och massan omrördes medelst en impeller som drevs vid 220 varv/minut. Fermentationen utfördes vid 32°C i 97 timmar varefter massan skördades.

Exemgel 8 Ett fermentationsmedium framställdes enligt följande formel: Dextros ' 3,0 % Sojamjöl 1,5 % Kalciumkarbonat 0,1 % Natriumklorid 0,3 % Vatten qs 100 % pH inställdes på 7,0 med 6N natriumhydroxid och mediet steri- liserades. 300 liter inokulum framställt enligt exempel l användes för att inokulera 3000 liter av det ovannämnda mediet i en fermentor. Steril luftning påfördes. Massan omrördes med en impeller som drevs vid 100 varv/minut. Fermentation utför- des vid 3200 i 115 timmar vid vilken tidpunkt massan skördades.

Exemgel 9 1. Fermentationsmassan (100 liter) instâlldes på pH 4,0 med användning av 6N HCl. Den surgjorda massan omrördes därefter i l-2 timmar med en lika volym metylenklorid. Blandningen av massa och metylenklorid filtrerades därefter med användning av diatomacêjord såsom filtrerhjälpmedel. Metylenkloridextrak- 456 588 42 tet avdrogs och koncentrerades i vakuum till ungefär 2 liter partiellt renade antibiotiska substanser. 2. Kromatografi av de partiellt renade antibiotiska substanser- na på kiselgel En glaskolonn med en diameter av 7 cm packades till en höjd av 9l cm med Woelm Silica Gel TSC. Det råa koncentratet (se l ovan) med en volym av ungefär 2 liter fick sippra in i kolonnen av kiselgel. Kolonnen framkallades därefter först med 3 liter metylenklorid âtföljt av metylenklorid/etylacetat (l:l beräknat på volymen) för erhållande av totalt 126 fraktioner som vardera hade en volym av 80 ml. Därefter framkallades ytter- ligare med användning av etylacetat/etanol (7:3) för erhål- lande av ytterligare 87 fraktioner.

Fraktionerna 58-87, som var rika med avseende på C23024X , kombinerades och koncentrerades i vakuum till en återstod som vägde 90,4 g. Denna återstod löstes i en blandning av 300 ml dietyleter och 600 ml hexan. Den erhållna suspensionen filt- rerades för erhållande av ett klart filtrat. Det klara filt- ratet koncentrerades i vakuum tills kristaller började bildas.

Denna suspension fick åldras över natten. Den kristallina substansen C23024 K tillvaratogs i en tratt, tvättades med kall eter och lufttorkades för erhållande av 33,1 g kristallint C23024K. Ytterligare 12,4 g 02302404 erhölls vid fortsatt volymminskning av det kombinerade filtratet och tvättvätskorna.

Fraktionerna 177-203 från elueringen med etylacetat/etanol och anrikat med avseende på C23024/3 kombinerades och koncen- trerades i vakuum för erhållande av 6,7 g partiellt renat C23024/6 och behandlades såsom ovan.

Fraktionerna 204-213 från elueringen med etylacetat/etanol, som var anrikade med avseende på LL-C23024 iota, kombinera- des och koncentrerades i vakuum till en pasta och extrahera- des upprepade gånger med metanol. Metanolextraktet extrahera- des med metylenklorid, som beskickades på en kolonn innehållan- 456 588 43 de Woelm kiselgel. Kolonnen tvättades med metylenklorid och eluerades därefter med metylenklorid/etylacetat (2:3). Frak- tioneringen styrdes med tunnskiktskromatografi och de aktiva fraktionerna sammanfördes, behandlades med träkol, koncentre- rades och extraherades upprepade gånger med heptan. Det slut- liga heptanextraktet kyldes vid OOC i 48 timmar och kristaller- na avlägsnades genom filtrering från moderluten.

Denna moderlut löstes i metylenklorid och fick sippra in i en glaskolonn packad med Woelm kiselgel. Kolonnen eluerades därefter i följd med 2 liter metylen, 8 liter metylenklorid/ etylacetat (l:l) och 4 liter etylacetat/metanol (9:1). Elua- tet tillvaratogs i fraktioner och undersöktes med avseende på deras antibiotiska sammansättningi De aktiva fraktionerna kombinerades och koncentrerades i vakuum för erhållande av en återstod innehållande LL-C23024 iota.

Exempel 10 3. Ytterligare rening av C23024/3 från kromatografi på kisel- gel Sephadex<â)LH2O fick svälla i en blandning av hexan/metylen- klorid/metanol (lO:5:l). En glaskolonn med en diameter av 5 cm packades till en höjd av 86 cm med gelen. Beskickningen, 3 g renad LL-C23024/3,löstes i l0 ml metylenklorid, 1 ml meta- nol och 10 ml hexan, och fick sippra in i gelkolonnen. Kolonnen 3 framkallades därefter med lösningsmedel med samma samman- sättning som det som användes för tillförande av antibiotikumet till kolonnen. Fraktioner tillvaratogs med användning av en kollektor. De första 23 fraktionerna hade vardera en volym av 17 ml. Fraktionerna 17-26 innehöll C23024¿3 enligt tunn- skiktskromatografi. Dessa fraktioner kombinerades och koncen- trerades i vakuum för erhållande av ren amorf LL-C2302$ß næd vikten 1269 mg. 456 588 44 Exempel ll Kristallisation av LL-C2302§@ såsom natriumsalt Renad LL-C23024/3 (2,4 g) framställd såsom beskrivits i sek- tionerna B och C löstes i en blandning av dietyleter (500 ml), hexan (160 ml) och metylenklorid (25 ml). Den erhållna lös- ningen överfördes till en separationstratt innehållande 300 ml destillerat vatten. Utspädd HCl (lN) sattes droppvis där- till tills pH blev 2,0-2,5 efter skakning och sedimentering.

Den sura vattenhaltiga fasen bortkastades och det syrabehand- lade organiska skiktet tvättades tre gånger successivt med 400 ml volymer av vatten. Det tvättade organiska skiktet omrör- des med en tesked Darco G-60-pulver i 15 minuter och filtrera- des genom celite. Det avfärgade organiska skiktet placerades över 500 ml destillerat vatten och SN Na0H tillsattes dropp- vis tills pH nådde 11,0-11,5 efter skakning och sedimentering.

Den alkaliska vattenfasen bortkastades och det kvarvarande organiska skiktet tvättades två gånger med portioner vatten med volymen 400 ml. Det tvättade organiska skiktet torkades över natriumsulfat och koncentrerades därefter i vakuum till en volym av 150 ml. Detta koncentrat fick stå under ett skydd i flera timmar. Den kristallina substansen LL-C23024/3 till- varatogs i en tratt, tvättades med kall hexan och lufttorkades för erhållande av 402 mg av det kristallina saltet av LL- C23024/9. Detta prov användes för mikroanalyser och utvalda spektraldata.

Analys: Beräknat för C46H77Ol7Na: C 59,70 H 8,33 O 29,46 aska 2,49 Funnet: C 61,55 H 8,79 aska 3,31 N O Smältpunkt (Fisher-Johns apparatur) = l74°C.

(FDMass Spec.) = 924;yÅï]š6 = +3,2° (i metanol). 456 588 45 Exemggl 12 Rening av LL-C23O24Ajota Ett vätskekromatograferingsinstrument (Waters Prep. SOOA) med hög effektivitet försågs med en kiselgelpatron under ett tryck av 38,5 kp/cmz. Beskickningen, som utgjordes av 5,0 g av râmaterialet från exempel 3, löstes i 50 ml heptan/ etylacetat(45:55) och injicerades på kolonnen av kiselgel.

Kolonnen framkallades därefter med samma lösningsmedelsbland- ning vid en flödeshastighet av 200 ml/minut, varvid fyrtio 200 ml-fraktioner tillvaratogs. Fraktionerna 21-32 kombinera- des, koncentrerades till en återstod, triturerades med hexan och indunstades för erhållande av ren LL-C23024 jota. Förfaran- det ovan upprepades fyra gånger för erhållande av totalt 280 mg amorf LL-C23024 jota.

En 90 mg andel amorf LL-C23024 jota löstes i 10 ml dietyl- eter, blandades med 10 ml vatten och inställdes på pH 2,5 med O,lN klorvätesyra. Eterskiktet tvättades med vatten, in- ställdes på ungefär pH ll med O,lN natriumhydroxid, separera- des och tvättades åter med vatten. Eterfasen torkades över natriumsulfat, filtrerades och koncentrerades_till en åter- stod. En lösning av denna återstod i eter/hexan fick långsamt indunsta till bildning av en amorf vit fast substans.

Denna amorfa vita fasta substans hade följande egenskaper; Elementaranalys: C 61,79 H 8,84 aska 0,32; gxíšs = +z7° (c = o,724, metano1>..

Fältdesorptionsmasspektrometri: (M+Na)+ = m/e 953, varför den beräknade molekylvikten är 930.

Claims (6)

456 588 ”IG PATENTKRAV

1. l. Biologiskt ren kultur av Actinømadura yumaense NRRL 12515 eller en mutant därav med väsentligen samma egenskaper som Actinomadura yumaense NRRL 12515, vilken kultur kan bilda anti- bictikum LL-C23024 alfa med strukturformeln: OMe Meq, NMe 0 lm š 0 on H H Me M2 antibiotikum LL-C23024 beta med strukturformeln: OMe MeO Me I, \\\ och antibiotikum LL-C23024 jota, vilken senare visat sig ha följ ande strukturformel : Ål? 456 588 i utvinningsbara mängder till användning för kontroll av koccidios hos fjäderfä vid fermentation i ett flytande näringsmedium inne- hållande assimilerbara källor för kol, kväve samt oorganiska salter.

2. Biologiskt ren kultur av mikroorganismen Actinomadura yumaense NRRL 12515 enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a d av att mikroorganismen är en spontan (naturlig) mutant, som är genetiskt förändrad men har väsentligen samma egenskaper som Actinomadura yumaense NRRL 12515 och fortfarande bibehåller förmågan att syn- tetisera antibiotikum LL-C23024, alfa, beta och jota.

3. Biologiskt ren kultur av mikroorganismen Actinomadura yumaense NRRL 12515 enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a d av att mikroorganismen muterats med för fackmannen kända mutagena medel, så att mikroorganismen är genetiskt förändrad men har väsentligen samma egenskaper och fortfarande bibehåller förmågan att syntetisera antibiotikum LL-C23024 alfa, beta och jota.

4. Förfarande för framställning av antibiotikum LL-C23024 alfa, beta och jota med formlerna: 456 588 W OMQ Meflb “pm till användning för kontroll av koccidios hos fjäderfä I k ä n n e t e c k n a t därav, att man aerobt fermenterar Actinomadura yumaense NRRL 12515 eller en mutant därav med väsentligen samma egenskaper i ett vätskemedium innehållande 456 588 45 assimilerbara källor för kol, kväve samt oorganiska salter till dess att väsentlig antibiotisk aktivitet förlänats fermentationsvätskan, och att man därefter utvinner den antibiotiska substansen därur.

5. Förfarande enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k - n a t därav, att temperaturen i fermentationskulturen hålles vid 25-3S°C under en tidsperiod av 24-150 timmar.

6. Förfarande enligt patentkravet 5 för framställning av antíbiotikum LL-C23024 alfa, k ä n n e t e c k n a t därav, att man aerobt odlar Actinomadura yumaense NRRL 12515 eller en mutant därav med väsentligen samma egenskaper i ett vätskemedium innehållande assimilerbara källor för kol, kväve samt oorganiska salter till dess att väsentlig anti- biotisk aktivitet förlänats fermentationsvätskan, och att man därefter utvinner den antibiotiska substansen därur.