FI56979B - Foerfarande foer framstaellning av nya lasalosidantibiotika - Google Patents

Description

I-------- Fr1 kuulutusjulkaisu CCQ7q

Wj W (11)uTLÄGGN!NGSSKRIFT 5697 9 1¾¾ C ^4j| Patentti «yonnetty 12 05 1933

Patent raeddelat ^ T ^ (51) Kv.lk.*/int.ci.* c 12 D 9/14 A 25 K 1/1? C O? D 407/0* SUOM I—FI N LAN D (21) Patanttihakamu*— PatantansSknlnf 750930 (22) HakamlipUvt — Anseknlngadag 02.0U.75 (23) AlkupUvt —GHtlghotadag 02.0U.75 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offantllg 03.10.75

Patentti- ja rekisterihallitus .... .. . . . ,,,., _ ,, (44) NlhtivWcalpanon ja kuuLJulkataun pvm. —

Patent- och reglsterstyrelsen ' Anaöktn utlagd och utl.akrlftan publkarad 31.01.30

(32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus— Bagird prlorltet 02.0U. 7U

USA(US) U57296 (71) F. Hofftaann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel, Sveitsi-Schveiz(CH) ' (72) John Westley, Mountain Lakes, N.J., USA(US) (7^+) Oy Kolster Ab (5U) Menetelmä uusien lasalosidiantibioottien valmistamiseksi - Förfarande för framställning av nya lasalosidantibiotika Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uusien lasalosidiantibioottien valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava

RU

CO H R R CpH l__ c H __k c H

„0„ X χ 2 5 if TT °^o Λ» _ R1 OH 0 /"CH3 jossa R1, R2, R^ ja R^ tarkoittavat metyyliä tai etyyliä, jolloin vain yksi substi-tuenteista R^-R^ tarkoittaa etyyliä, eristetyssä muodossa, sekä näiden yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

f 2 56979

Ennestään tunnetaan antibiootti X-537A (lasalosidi A) (j. Am. Chem. Soc. voi. 73, 1951, sivut 5295-98), jota voidaan valmistaa fermentoimalla. Keksinnön mukaisesti valmistettavien lasalosidi A:n homologien fermentatiivinen valmistus ei olennaisesti eroa tunnetusta valmistuksesta. Keksinnön mukaisesti saadaan kuitenkin käyttämällä toisenlaista eristämismenetelmää uusia kaavan I mukaisia homologeja, joilla tunnettuun lasalosidi A:han verrattuna on edullisia ominaisuuksia, kuten alempi myrkyllisyys ja vahvempi antibioottinen teho.

On huomattu, että kaavan I mukaisilla antibiooteilla ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävillä suoloilla on kokkidiostaattista ja antibakteerista tehoa.

Ne ovat sen vuoksi käyttökelpoisia kokkidiostaattisina ja antibakteerisina aineina.

Kaavan I mukaisia uusia antibiootteja ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja valmistetaan keksinnön mukaan menetelmällä, jolle on tunnusomaista, että Streptomyces lasaliensis-lajiin kuuluvaa mikro-organismia (Streptomyces lasaliensis X-537), edullisesti kantaa NRRL 3382, viljellään yhteyttäviä hiilihydraatin ja typen lähteitä sisältävässä elatusaineessa submersisti ja aerobisesti siksi, kunnes väliaineen antibioottinen aktiviteetti saadaan huomattavaksi, jonka jäikin nm n valmistetut kaavan I mukaiset yhdisteet eristetään vesipitoisesta elatusaineesta ja haluttaessa muutetaan saatu tuote sen farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Keksinnön mukaisia antibiootteja tuottava mikro-organismi kuuluu Streptomyces-sukuun ja se eristettiin Hyde Park'issa (Massachusetts) löydetystä maanäytteestä. Laboratoriomerkinnällä X-537 merkitystä viljelmästä otetut kylmäkuivatut näytteet talletettiin merkinnällä n:o NRRL 3382 Yhdysvaltojen maatalousministeriön, Northern Utilization Research and Development Division-nimisen laitoksen (Peoria, Illinois, USA) mikro-organismikokoelmaan. Viljelmä on merkinnällä NRRL 3382 yleisön saatavissa.

Seuraavassa selostetaan yleisesti erästä tyypillistä Streptomyces lasaliensis (X-537)-kantaa.

Tutkittaessa viljelmää ohjeiden mukaan, jotka on esitetty E.B.Shirling'in ja D.Gottlieb’in julkaisussa "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. J. Systematic Bacteriol. 16, 313-3^0, 1966, (josta jäljempänä käytetään lyhennystä "Shirling & Gottlieb, 1966"), osoittautuu sillä olevan hyvin kehittynyt ja haarautunut rihmasto. Itiöketjuissa on toisistaan eroavia kierteitä (Retinaculm-Apertum terminologian mukaan, jonka Ralf Hiitter on esittänyt julkaisussa: Systematic der Streptomyceten, sivu 10, julkaisija S. Karger, 1967) - Jokaisessa itiöketjussa on keskimäärin noin 25 itiötä, itiöiden pinta on karkea.

Pesäkkeiden morfologia erilaisia agar-väliaineita käytettäessä on seuraavanlainen :

5 5697S

Agar-väliaine1' Pesäkkeiden Pesäkkeen selkä- Liukoinen pinnan väri 2) puolen väri pigmentti k)

Hiiva-mallas 2dc 0c5r Kellanruskea (ISP n:o 2) (kirkkaan rus- (kellanruskea) kehtavanharmaa)

Kaurajauho e (ISP n:o 3) (kirkkaan metalli- Co5a Heikosti senharmaa) (vaikeahkon kellanruskea keltainen)

Epäorgaaniset e Goo4s Kellertävän suolat ja tärk- (punertavan ruskea kelys kellanruskea) (ISP n:o U)

Glukoosi- 2dc Coo2m . Kirkkaan kel- asparagiini (i§^e^Pke 1" 1 θ r * ävän (ISP n:o 5) ruskea) ruskea ^ Väliaineet julkaisun Shirling & Gottlieb, 1966, mukaiset 2) " ' Tresner-Backus-väriasteikko ^ Prauser’in (1964) väriasteikko ' Ei muutosta 0,09 n Helissä tai NaOHtssa - Kun viljelmää tutkitaan julkaisun "Shirling & Gottlieb, 1966", mukaan, käyttää se hyväkseen hiilihydraatteja seuraavalla tavailet arabinoosia 3+* selluloosaa + , fruktoosia 3+, glukoosia 3+» inositoliä 4+» raffinoosia +, ramnoosia 2+, sakkaroosia +, ksyloosia 3+·

Tutkittaessa viljelmää H.E· Gordon*in julkaisun "The Taxonomy of Soil Bacteria" in Ecology of Soil Bacteria, T.B.G* Gray & D.Parkinson,

Liverpool University Press, Liverpool, 1967f mukaan, havaitaan seuraavat fysiologiset reaktiot!

Seuraavien aineiden hydrolyysi: adeniini +, kaseiini +, hypoksantiini +, tyrosilni + , perunatärkkelys +.

4 66979

Seuraavien aineiden syntyminen: ureaasi -, nitiaattireduktaasi

Seuraayien aineiden hyväksikäyttö: sitraatti +, laktaatti -, malaatti +, raukeatti -, oksalaatti -, sukkinaattl +.

Happoja seuraavista aineista: adonltoli -, arabinoosi -, dulsitoli -, erytritpll -, galaktoosi +, glukoosi +, inositoli +, laktoosi +, maltoosi +, mannitoli +, mannoosi +, melibioosi +, a-metyyli-D-glykosidi +, raffinoosi -, ramnoosi +, sorbitoli -, trehaloosi +, ksyloosi +.

Kasvu seuraavissa lämpötiloissa : 10°C +, 42°C +, 53°C -.

Kasvu seuraavissa aineissa: lysotsyymillemi -, salisyjaattiliemi -, gly-seroliliemi +.

Käytettäessä menetelmiä, jotka ovat International Streptomyces Project*in (iSP) (Shirling & Gottlieb, 1966) ja Nonomura'n mukaiset (j. Nono mura: Key for Classification and Identification of 436 Species of Strepto-mycetes included in ISP| J. Ferment. Teohnol. 52: 76-92, 1974)» käy ilmi, että viljelmä ei vastaa mitään näissä tutkimuksissa tukittua Streptomycetes-lajia. Viljelmä sisältää diaminoplmellinlhapon L-isomeeriä.

Tähän asti antibiootti X 537A:na (Lasalesidi A) merkittyä antibioottia on pidetty laboratorioanalyysin mukaan yhdisteenä 6-£7(H)—(S)— etyyli-5-(5(R)-etyylitetrahydro-5-hydroksi-6(S)-metyyli -2H-pyran-2(R)-yyli)-t e trahydro.-3 (S) -metyyli-2 ( S) -furyyli ] -4 (s) -hydroksi-3 (R) -dimetyyli-6-okso-nonyyli^ -2,3-kreeotiinihappo, so. yhdisteenä, jolla on kaava 9°2H CH3 CH3 C2H5 p H (A xv JL X / \ Co He r—\

Ai « T" 3 ch3

Esillä olevan keksinnön mukaisesti saadaan lasalosidi A:n homologeja ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja. Näillä lasalosldihomologoilla on seuraavat kaavat ja kemialliset nimet:

Lasalosidi B: 5 56979 f*" f1 f", c*?4 VV^vSr^X>2V^*e>"·

AJ) J. J

ch3 6- ^ 7(R)-[5(s)-etyyli-5-(5(R)-etyylitetrahydro-5-hydrokei-6(S)-metyyli-2H-pyran-2(R) -yyli )-tetrahydro-3 ( s) -me tyyli-2(S) -furyyli ] -4 (S) -hydrokei-3 (R),5(s)-diaetyyli-6-okeononyyli ^2-hydrokei-3-etyylihenteoehappo.

Lasaloeidi C: 9°2h c2h5 rH c H 9¾

BiCAJ f» I

* ch3 6-^7 (R) -[ 5( S) -etyyli-5-( 5 (R) -etyylltetrahydro-3-hydrokei-6 (S) -metyyli-2H-pyran-2(R)-yyli)-tetrahydro-3(s)-metyyli-2(S)-furyyli]-3(R)-etyyli-4(S)-hydrokei-3(S)-aetyyli-6-okeononyyliJ -2,3-kreeotiinihappo.

Lasaloeidi D: ?°2h t3 Tl hcl λ JL X * / \ c2He /—\ r

JL (J * UH O^^OH

oh o ο-^ς h3C CHj 6- £ 7(R}-5' S)-etyyll-5-(5(R)-it3Trllt«tr»hjdro-5-hydrol(«l-6(s)-mtyyli-2H-pyran-2(R)-yyli)-tetrahydro-3(s)-metyyli-2(s)-furyyli]-5(s)-etyyli-4(s) -hydrokei-3(R)-metyyli-6-oksonoayyliJ -2,3-kreeotlinihappo.

Lasaloeidi Ei 56979 COgH CHj CHj C2H5 ys V"°2h5

T jj H H<^0 OH

H3C oh ° 'ch3 6- £t(R)-/5(S)-etyyli-5“(5(R)-etyylitetrahydro-5~hydroksi-6(S)-metyyli-2H-pyran-2(R)-yyli)-tetrahydro-3(S)-etyyli-2(S)-furyyli7~^(S)-hydroksi-3(R), 5 (S) -dimetyyli-ö-oksononyyli^ -2,3~kr sotiinihappo.

Keksinnön mukaisesti lasalosidihomologeja valmistetaan Streptomyces lasaliensis ~ X-537-lajin käymisen avulla aerobisissa olosuhteissa upoksissa, jolloin käymisliuok-sen pH säädetään suunnilleen neutraaliksi, so. suunnilleen välille 6,5-7,5. Käytetty kasvualusta sisältää typen lähdettä, kuten esim. hiivaa, hiivatuotetta, maissi- ' jauhoa tai papujauhoa, jolloin soijapapujauho on edullinen, suoloja, kuten esim. kaliumfosfaattia, kalsiumkarbonaattia ja hivenaineita, hiilihydraatin lähdettä, kuten sokeria tai melassia, edullisesti ruskeata sokeria, lisäksi hiililähteenä kasvi- tai eläinrasvaa tai -öljyä, kuten esim. soijapapuöljyä tai paistinöljyä, ja aineita vaahtoamisen estämiseksi ja toivotun lopputuotteen saannon parantamiseksi. Käyminen suoritetaan lievästi kohotetussa lämpötilassa, so. välillä noin 25~35°C, erityisesti suunnilleen 28°C:ssa. Noin k-6 päivää kestäneen haudonta-ajan jälkeen käymisliuos suodatetaan ja antibiootit otetaan talteen uuttamalla.

Suoritetun käymisen jälkeen voidaan käyttää monia menetelmiä keksinnön mukaisten lasalosidihomologien eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Esimerkkejä näistä ovat liuotinuuttomenetelmät, kuten esim. jaksottainen uutto tai neste-neste-uutto vastavirtajakamismenetelmässä tai myös geelinläpäisykromatografia vedettömässä järjestelmässä.

Keksinnön mukaisesti valmistettujen lasalosidihomologien farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan valmistaa totunnaisten menetelmien mukaan. Näitä suoloja valmistetaan antibiootin vapaasta happomuodosta tai sen johdannaisista sinänsä tunnettujen menetelmien mukaan, esimerkiksi pesemällä vapaat hapot liuoksessa sopivalla emäksellä tai sopivalla suolalla. Esimerkkejä tällaisista farmaseuttisesti hyväksyttävistä emäksisistä, suolan muodostukseen kykenevistä aineista ovat alkalimetalliemäkset, kuten esim. natriumhydroksidi, kaliumhydroksidi tai litiumhydroksidi, maa-alkalimetalliemäkset, kuten esim. kalsiumhydroksidi sekä ammoniumhydroksidi. Alkalimetalli - tai maa-alkalimetallisuoloja, joita voidaan käyttää farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistukseen, ovat esimerkiksi karbonaatit, bikarbonaatit ja sulfaatit.

7 56973

Lasalosidihomologien B, C, D ja E suhteellinen antibioottinen teho in vitro mikro-organismina käytetyn BacillusTA:n suhteen selvitettiin vertailemalla puhtaan lasalosidi A:n natriumsuolan tehoa neljän homologin kanssa käyttämällä agar-diffuu- siomenetelmää reikälevyllä. Lasketut lukuarvot viidelle komponentille perustuvat lasalosidi A-emäkselle mielivaltaisesti valittuun aktiviteettilukuun 100 ja ne käyvät ilmi seuraavasta taulukosta:

Yhdiste Lasketut arvot aktiviteetille in vitro

Bacillus TA:ta vastaan

Lasalosidi A 100

Lasalosidi B 90 ^ Lasalosidi C 1Ö0

Lasalosidi D 160

Lasalosidi E 170.

„ Lasalosidihomologien B, C, D ja E myrkyllisyys on vähäisempi kuin tunnetun lasalosidi A:n, kuten seuraavasta taulukosta nähdään. Kokeet suoritettiin hiirillä, ja LD^-arvo ilmoittaa akuutin myrkyllisyyden (2k tunnin arvo).

Yhdiste LD^q mg/kg p.o. hiirellä

Lasalosidi B + C 210-30 (suhde 1:1)

Lasalosidi D + E 195“32 (suhde 1:1)

Lasalosidi A 1L6.

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla lasalosidihomologeilla B, C, D ja E on siten tunnettuun lasalosidi A:han verrattuna edullisempi vaikutus ja vähäisempi myrkyllisyys.

Esimerkki 1 «, Lasalosidihomologien B, C, Il ja E valmistus

Streptomyces X-537 (Streptomyces lasaliensis) kantaa NRRL 3382 haudotaan ravistelupulloissa upotettuna ilmastoituun ravintoliuokseen. Käymisliuoksen pH säädetään välille 6,5~7»5 lisäämällä kaiiumhydroksidin vesiliuosta, tämän jälkeen ravintoliuos steriloidaan. Suoritetaan käyminen säiliössä, jolloin käytetään 5-10 % ymppiä, joka käsittää ilmastetuista pulloista otettua 3 päivän vanhaa uppo-viljelmää. Ravintoväliaine sisältää 2 % soijapapujauhoa, 2 % ruskeata sokeria, 0,1 % dikaliumfosfaattia ja 0,5 % maissinliotusvettä. Käyminen suoritetaan 28°C:ssa positiivisen ilmanpaineen alaisena, jolloin liuokseen puhalletaan 150-300 litraa ilmaa minuutissa 150-300 litraa kohti liuosta. Käyminen keskeytetään k-6 päivän kuluttua, käymisliuos suodatetaan ja antibiootti otetaan talteen uuttamalla. Uutto suoritetaan seuraavasti:

e 5G97S

204 litraa käymisliuosta suodatetaan. Märkä suodatuskakku lietetään 100 litraan n-butyyliasetaattia, ja seosta sekoitetaan yön yli huoneen lämpötilassa.

Sen jälkeen seos suodatetaan, vesikerros erotetaan ja hyljätään, n-butyyliasetaat-tiliuos, jonka sisältää antibioottikonsentraatio vastaa 30 miljoonaa Bacillus E-yksikköä (antibioottisen aktiviteetin tutkimisessa agardiffuusiokokeella vastaa sellainen antibioottipitoisuus yhtä Bacillus E-yksikköä/ml, jolla Bacillus E:n inhi-bitiovyöhyke on läpimitaltaan 20-22 mm),konsentroidaan alipaineessa 3 litraksi, pestään 10-#:isella natriumkarbonaatin vesiliuoksella ja kuivataan vedettömän nat-riumsulfaatin avulla.

Liuos väkevöidään 300 ml:ksi, ja siihen lisätään 350 ml petrolieetteriä ... o (kiehumisväli 50-60 C), jolloin saadaan 41 g kiinteätä ainetta, joka kokeessa vastaa 25 miljoonaa Bacillus E-yksikköä ja joka erotetaan. Tämä kiinteä aine uutetaan sen jälkeen Soxhlet-laitteessa 4 litralla petrolieetteriä (kiehumaväli 50-60°C) 40 tuntia. Uute haihdutetaan kuiviin alipaineessa, ja kiteinen jäännös dispergoidaan petrolieetteriin ja suodatetaan. Uusintakiteytysten jälkeen saadaan lasalosidihomologien B, C, D ja E osalta rikastettu emäliuos.

Esimerkki 2

Lasalosidihomologien B, C, D ja E eristäminen

Osa (mikä vastaa 22 g kuiva-ainetta) esimerkin 1 mukaan saatua emäliuosta kromatografoidaan 200 pienellä putkella (jokaisen vetoisuus 80 ml) varustetussa vastavirtajakolaitteessa. Näyte liuotetaan 160 ml:aan faasiseosta (heptaani/etyyli-asetaatti/metanoli/vesi, 27:18:18:2) ja liuos pannaan molempiin ensimmäisiin pieniin putkiin. 380 jakautuman jälkeen saadaan seuraavat fraktiot, jolloin saadut kiinteät aineet identifioidaan haihdutuksen jälkeen seuraavasti: I. lasalosidihomologien B, C, D ja E seos

II. lasalosidi A

III. isolasalosidi A. Tämä tuote on lasalosidi A:n isomeeri, jolla on lasalosidi A - E:sta poikkeava rakenne.

Fraktio I liuotetaan 20 mlraan liuotinjärjestelmän heptaani/etyyliasetaatti/ etanoli/vesi/jääetikka-faasiseosta (10:5:9:3:1) ja kromatografoidaan 500 pienellä putkella varustetussa vastavirtajakolaitteessa. 2 800 jakautuman jälkeen erotetaan kussakin tapauksessa noin 200 mg lasalosidi B, Cf D ja E, joilla on seuraavat sulamispisteet:

Lasalosidi B - 85_87°C

Lasalosidi C - 97~100°C

Lasalosidi D - 102-104°C

Lasalosidi E - 90°C

Esimerkki 3

Lasalosidi E:n natriumsuola.

Noin 100 mg lasalosidi E liuotetaan metyleenikloridiin ja käsitellään kyllästetyllä natriumkarbonaatin vesiliuoksella. Metyleenikloridifaasi konsentroidaan 9 56979 heksaanin kanssa. Tällöin saadaan 104 mg lasalosidi E:n kiteistä natriumsuolaa (sulamispiste 182-182,5°C).

Lasalosidien käyttö rehun lisäaineena

Ensirehuksi broileri-kananpojille tarkoitettua lääkeaineella varustettua siipikarjan rehua valmistetaan siten, että sekoitetaan 0,015 paino-# ja 0,006 paino-# lasalosidi B:n ja C:n seosta (50/50) ja lasalosidi D:n ja E:n seosta (50/50) siipikarjan rehuun, joka koostuu seuraavista aineksista:

Aineosat Painoyksiköltä jauhettua maissijauhoa 510 kg/tonni stabilisoitua rasvaa tai kasviöljyä 27 kg/tonni "" soijapapujauhoa (alhainen kuitupitoisuus; 50 % proteiinia) 200 kg/tonni maissigluteenijauhoa 23 kg/tonni kalajauhoa, käsitelty antioksidantilla, 60 % proteiinia 1U kg/tonni ^ kalojen liukoisia osia ("fish solubles"), kuivapainon perusteella 5 kg/tonni liha- ja luujätteitä, 50 % proteiinia 64 kg/tonni maissin polttimosta saatuja kuivattuja, liukoisia jäännöksiä 23 kg/tonni luserniviherrehujauhoa, 17 % proteiinia, 200,000 A/kg 14 kg/tonni mangaanisulfaattia, rehulaatua 0,35 kg/tonni sinkkikarbonaattia tai -oksidia 0,11 kg/tonni riboflaviinia 3 g vitamiini B12 6 mg kalsiumpantotenaattia 5 g niasiinia 30 g stabilisoitua vitamiini A, USA-farmakopea-yksiköitä 6,000,000 2) vitamiini D_, kansainväl. kananpoikayksiköitä 650,000 . . . 3 . . .....3) vitamiini E-asetaattia, kansamval. yksiköitä 5,000 vitamiini K, (menadioni-natriumbisulfiitti) 2 g DL-met ioniini a tai sen hydroksianalogia 0,1+5 kg/tonni antioksidanttia (etoksikinia tai butyloitua hydroksitolueenia) 0,11 kg/tonni 1 A-vitamiiniyksikkö = 0,0006 mg /fl-karotiinia (sp. 184°C) 2) 1 D^-vitamiiniyksikkö = 0,000025 mg 7-dehydrokolesterolia (dimetyylidihydro- kalsiferolia) 3) .....

1 E-vitamiimyksikko = 1,0 mg d,l-et-tokoferoliasetaattia 10 56979 10 laboratoriossa kasvatettua kananpoikaa tartutettiin kussakin kokeessa Eimeria tenella mikro-organismilla. 10 kananpoikaa käytettiin painovertailuna ja 10 kananpoikaa tartutettuina vertailueläiminä. Antibioottia annettiin U8 tuntia ennen infektiota. 1 g antibioottia sekoitettiin mekaanisessa sekoituslaitteessa tarvittavan määrän kanssa kananpoikien rehua toivotun annostuksen aikaansaamiseksi.

Infektio käsitti noin 200,000 Eimeria tenellan ookystaa annettuna pipetin avulla peroraalisesti. Koe kesti 11 päivää, jonka jälkeen eloon jääneille eläimille suoritettiin ruumiinavaus ja tutkittiin silmämääräisesti umpisuolivammat. Eloonjääneiden eläinten luku ja umpisuolivammojen lukumäärä merkittiin muistiin. Tulos on ilmaistu "keskimääräisenä infektioasteena". Lukua 1,5 pienempi keskimääräinen infek-tioaste katsotaan kyseiselle annokselle huomattavan tehokkaaksi.

Kuten seuraavasta ilmenee, on antibioottiseos tehokas kokkidioosin käsittelyyn.

Annostus rehussa, Keskimääräinen Kuolleisuus paino-# infektioaste #

Ei-infektoitu, käsittelemätön vertailu 0,0 0

Infektioitu, käsittelemätön vertailu ei lainkaan 2,6-2,8 10-20

Lasalosidi B / , , 0,015 1,0 0

Lasalosidi C.) 0,006 1,2 0

Lasalosidi D (. . , 0,015 0,0 0

Lasalosidi E_J 0,006 1,2 0

Seuraavassa kokeessa sekoitettiin edellä kuvattuun perusrehuun 0,01 paino-# lasalosidi-D:tä. Antibiootin vaikutusta tutkittiin Eimeria tenella-mikro-organismia vastaan samalla tavalla kuin edellä. Seuraavista tuloksista ilmenee, että antibiootilla on vaikutusta kokkidioosia vastaan.

Annostus rehussa, Keskimääräinen Kuolleisuus paino-# infektioaste #

Ei-infektoitu, käsittelemätön - vertailu ei yhtään 0,0 0

Infektoitu, käsittelemätön vertailu ei yhtään 3,0 20

Lasalosidi D 0,01 0,5 0

Claims (6)

1. Menetelmä uusien lasalosidiantibioottien valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava CO.H E R C H. ?1> h° <y 5 T TT OH 0 'CH3 ^ I jossa R1, R^, R^ ja R^ tarkoittavat metyyliä tai etyyliä, jolloin vain yksi substi-tuenteista R^-R^ tarkoittaa etyyliä, eristetyssä muodossa, sekä näiden yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että Streptomyces lasaliensis-lajiin (Streptomyces lasaliensis X-537) kuuluvaa mikro-organismia, edullisesti kantaa NRRL 3382? viljellään yhteyt-täviä hiilihydraatin ja typen lähteitä sisältävässä elatusaineessa submersisti ja aerobisesti siksi, kunnes väliaineen antibioottinen aktiviteetti saadaan huomattavaksi, jonka jälkeen näin valmistetut kaavan I mukaiset yhdisteet eristetään vesipitoisesta elatusaineesta ja haluttaessa muutetaan saatu tuote sen farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Streptomyces X-537:n viljely suoritetaan pH-välillä noin 6,5 - noin 7»5 ja lämpö-tilavälillä noin 25 - noin 35°C.

3- Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, _ että viljely suoritetaan kasvi- tai eläinrasvan tai -öljyn läsnäollessa. U. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lopputuote otetaan talteen siten, että vesipitoinen elatusaine suodatetaan , suodos uutetaan veteenliukenemattomalla liuottimena ja lopputuote erotetaan liuotinuutteesta. 5* Patenttivaatimuksen U mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suodos uutetaan n-butyyliasetaati11a ja uutetta käsitellään petrolieetterillä toivottujen lopputuotteiden osalta rikastetun emäliuoksen saamiseksi.

6. Patenttivaatimuksen U tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lopputuotteiden erotus suoritetaan liuotinuutteesta siten, että viimemainitulle suoritetaan vastavirtajakaminen. 12 56979

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vastavirtajakaminen toteutetaan siten, että ensiksi käytetään heptaani/etyyliasetaatti /metanoli/vesiseosta käsittävää liuotinjärjestelmää ja sen jälkeen toivottuja tuotteita sisältävälle fraktiolle suoritetaan toinen vastavirtajakaminen käyttäen heptaani/etyyliasetaatti/etanoli/vesi/jääetikkaseosta liuotinjärjestelmänä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuotinjärjestelmä ensimmäistä vastavirtajakamista varten käsittää heptaani/etyyli-asetaatti/metanoli/vesiseoksen tilavuussuhteissa noin 27:18:18:2 ja että liuotin toista vastavirtajakamista varten käsittää heptaani/etyyliasetaatti/etanoli/ vesi/jääetikkaseoksen tilavuussuhteissa noin 10:5:9:3:1. 5697S