DK141582B - Fremgangsmåde til fremstilling af lasalocidantibiotika eller farmaceutisk tolerable salte deraf. - Google Patents

Description

(jlf/ (11) FREMLÆG6ELSESSKRIFT 141582 DAMMARS (51) int. Cl.3 C 07 D 407/04 UAINIVIAKK c 12 P 17/16 // c 12 r 1Λ65 (21) Aneegning nr. 1576/75 (22) Indlever« den 1* aPr * 1975 \W® (23) Ljøbedag 1· apr. 1975 \£y (44) Antegningen fremlagt og p inQn fremlaeggeteesskriftet offentliggjort den · aPr · s

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) Modt« begær« fra den

2. apr. 1974, 457296, US

(71) P. HOFPMANN-LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLSCHAFT, Grenzacherstrasee 124-184, Postfach, CH-4002 Basel, CH

(72) Opfinder: John Westley, 111 Pollard Road, Mountain Lakes, New Jersey, US.

(74) Fuldmægtig und« sagene behandling:

Plougmann & Vingtoft Patentbureau. _____________ (64) Fremgangsmåde til fremstilling af lasalocidantibiotika eller farms?* ceutisk tolerable salte deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte lasalocidantibiotika eller farmaceutisk tolerable salte deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der ud fra et råprodukt vundet ved submers og aerob dyrkning af en mikroorganisme af arten Streptomyces X-537 i en assimilerbar carbonhy-drat- og nitrogenkildeholdig naeringsopløsning isoleres lasalocid B, C, D og E med formlen COOH f |3 C/5 R* ,C2H5^

H0 V-/ x""C2H5 I

t fj I I V^O^H r1 H

2 141582 12 3 4 hvor én af substituenterne R , R , R og R er ethyl, og de øvrige er methyl, og et vundet produkt, om ønsket, omdannes til et farmaceutisk tolerabelt salt deraf.

Det har vist sig, at antibiotika med formlen I og de farmaceutisk tolerable salte deraf har coccidiostatisk og antibakteriel virkning.

De kan således anvendes som coccidiostatiske og antibakterielle midler.

Den antibiotikumdannende mikroorganisme hører til slægten Streptomyces og er isoleret fra en i Hyde Park, Massachusetts, fundet jordprøve. Frysetørrede prøver af den med laboratoriebetegnelsen X-537 mærkede kultur er deponeret i mikroorganismesamlingen i United States Department for Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA under nr. NRRL 3382. Denne kultur er almindelig tilgængelig gennem NRRL.

Nedenfor er anført en almen beskrivelse af en typisk stamme af Streptomyces X-537.

Når kulturen afprøves efter de i Shirling, E.B. og D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. J. Systematic Bacteriol. 16, 313 - 340, 1966" (herefter betegnet som "Shirling & Gottlieb, 1966") givne forskrifter, viser den et godt udviklet og forgrenet mycelium. Sporekæderne opviser fra hinanden trukne vindinger (retinaculum-apertum ifølge den af Ralf Hutter: Systematic der Streptomyceten, side 10, Publ. S. Karger, 1967 givne terminologi). Hver sporekæde bærer i gennemsnit ca. 25 sporer; sporeoverfladen er ru.

Koloniernes morphologi på forskellige agarmedier er som følger:

Agarmedium 1) Kolonioverfladens Koloniens bagsides Opløseligt farve 2) farve 3) pigment 4) Gær-malt 2dc (lys brun- 0c5r (gul- Gul-brunt (ISP nr. 2) lig-grå) -brun) 3 141582

Havremel e (lys metal- Co5a (hvidlig Svagt gul-brunt (ISP nr. 3) lisk grå) gul)

Uorganiske e Coo4s (rød- Gullig-brunt salte og stivel- lig gul-brun) se (ISP nr. 4)

Glucose-aspara- 2dc Coo2m (gylden Lyst gulliggin (ISP nr. 5) gul-brun) -brunt 1) Medier ifølge Shirling & Gottlieb, 1966 2) Tresner-Backus-farveskala 3) Prauser's (1964) farveskala 4) Ingen forandring i 0,05N HC1 eller NaOH.

Når kulturen afprøves ifølge Shirling & Gottlieb, 1966, udnytter den carbonhydrater på følgende måde:

Arabinose 3+, cellulose +, fructose 3+, glucose 3+, inositol 4+, mannitol 4+, raffinose +, rhamnose 2+, saccharose + og xylose 3+.

Når kulturen afprøves ifølge R.E. Gordon "The Taxonomy of Soil Bacteria" i Ecology of Soil Bacteria, forlægger T.R.G. Gray £ D. Parkinson, Liverpool University Press, Liverpool, 1967, iagttages nedenstående fysiologiske reaktioner:

Hydrolyse af: adenin +, casein + , hypoxanthin +, tyrosin +, kartoffelstivelse + .

Dannelse af: urease -, nitratreduktase -.

Udnyttelse af: citrat +, lactat -, malat +, mucat -, oxalat -, suc-cinat +.

Syre af: adonitol -, arabinose -, dulcitol -, erythritol -, galactose + glucose +, inositol +, lactose +, maltose +, mannitol +, mannose +, melibiose +, α-methyl-D-glucosid +, raffinose -, rhamnose +, sorbitol -, trehalose +, xylose +.

141582 4

Vækst ved: 10°C +, 42°C + , 53°C

Vækst i:'lysozymdyrkningsvæske -, salicylatdyrkningsvæske -, glyceroldyrkning s væske + .

Ved anvendelse af de ifølge International Streptomyces Project (ISP) (Shirling & Gottlieb, 1966) anførte metoder og den af Nonomura (J. Nonomura: Key for Classification and Identification of 458 Species of Streptomycetes Included in ISP; J. Ferment. Technol. 52: 78-92, 1974) angivne nøgle fremgår det, at kulturen ikke svarer til nogle af de i disse studier undersøgte streptomyceter. Kulturen indeholder L-isomeren af diaminopimelinsyre.

Det tidligere som antibiotikum X-537A (lasalocid A) betegnede, kendte antibiotikum er 6-[7(R)-[5(S)-ethyl-5-(5(R)-ethyltetrahydro--5-hydroxy-6(S)-methyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-methyl--2(S)-furyl]-4(S)-hydroxy-3(R) ,5(S)-dimethyl-6-oxononyl]-2,3-kre-sotinsyre, dvs. en forbindelse med formlen COOH CH3 Cp3 C2H5 PH3 h°Jxy* I I I h/\o/ A A oh J OH 0 %

Up/ ^ “3^ CH3

Antibiotiket X-537A (lasalocid A) er beskrevet i J. Am. Chem. Soc. bind 73, 1951, side 5295 - 98, og denne forbindelse kan ifølge den kendte teknik fremstilles ad fermentativ vej ved dyrkning af Streptomyces X-537. Den fermentative fremstilling af de omhandlede homologe af antibiotiket lasalocid A adskiller sig ikke væsentligt fra de kendte fremgangsmåder. Ifølge opfindelsen er der dog ved anvendelse af andre isoleringsmetoder fundet, at dyrkningsvæsken indeholder hidtil ukendte homologe med formlen I, der udmærker sig i forhold til lasalocid A ved at have overraskende fordele såsom lavere toxicitet eller mere intensiv antibiotisk virkning.

5 1A1582

De omhandlede lasalocldhomologe er forbindelser med nedenstående formler og nomenklatur:

Lasalocid B

CO OH CHo §R3 pH3 I I f X /2Hr-A *C2H5 \# / V 2 5 T i I ηΛ/α-Λοη η c OH 0 H5C2 CH3 6- [7 (R) - [5 (S) -ethyl-5- (5 (R) -ethyltetrahydro-5-hydroxy-6 (S)-methyl-2H--pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-methyl-2(S)-furyl]-4(S)-hydroxy-3(R),5-(S)-dimethyl-6-oxononyl]-2-hydroxy-3-ethylbenzoesyre.

Lasalocid C: COOH C2H5 CH, *2H5 _ H0

II T T Λ0/Λ /oH

ix J OH 0 \ H3c ch3 6—[7(R)—[5(S)-ethyl-5-(5(R)-ethyltetrahydro-5-hydroxy-6(S)-methyl-2H--pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-methyl-2(S)-furyl]-3(R)-ethyl-4(S)--hydroxy-5(S)-methyl-6-oxononyl]-2,3-kresotinsyre.

Lasalocid D: COOH CH, C_H5 C2H fH3 F ^ I Ϊ i /—\^2H5 /-WC2H5 /Vy oh o % H3C ch3 6- [7(R) — [5(S)-ethyl-5-(5(R)-ethyltetrahydro-5-hydroxy-6(S)-methyl--2H-pyran- 2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-methyl-2(S)-furyl]-5(S)-ethyl--4(S)-hydroxy-3(R)-methyl-6-oxononyl]-2,3-kresotinsyre.

141582 6

Lasalocid E:

COOH CH3 5H3 S2H5f* CH

H0 \ JvV2 VVCA

TT 1 ' AMT

J OH O “ % H-.C ^ ^ 3 CH3 6- [7 (R) - [5 (S) -ethy 1-5-(5 (R) -ethyltetrahydro-5-hydroxy-6 (S)-methyl--2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-ethy1-2(S)-furylj“4(S)-hydroxy--3 (R) , 5 (S)-dimethyl-6-oxononylJ-2,3-kresotinsyre.

De omhandlede lasalocidhomologe fremstilles som nævnt ved fermentation af Streptomyces X-537 under aerobe submerse betingelser, idet pH-vær-dien i gæringsopløsningen indstilles på omtrentlig neutral værdi, dvs. ca. 6,5 - 7,5. Den anvendte næringsvæske indeholder en nitrogenkilde, f.eks. gær, et gærprodukt, majsmel eller bønnemel, hvorhos sojabønnemel foretrækkes; salte såsom kaliumphosphat og calciumcarbonat og sporgrundstoffer; en carbonhydratkilde såsom sukker eller melasse, fortrinsvis brunt sukker; og vegetabilsk eller animalsk fedt eller olie, f.eks. sojabønneolie eller lardolie, som carbonkilde og agens til skumbekæmpelse samt til forbedring af udbyttet af det ønskede slutprodukt. Fermentationen udføres ved let forhøjet temperatur, dvs. mellem ca. 25 og 35°C, især ved ca. 28°C. Efter en inkubationstid på ca. 4 - 6 dage filtreres gæringsopløsningen, og råproduktet indeholdende lasalociderne isoleres ved ekstraktion.

Efter isolering af råproduktet kan der anvendes adskillige metoder til isolering og rensning af de omhandlede lasalocidhomologe. Eksempler herpå er opløsningsmiddel-ekstraktionsfremgangsmåder, f.eks. intermitterende ekstraktion eller væske-væske-ekstraktion i modstrømsfordelingsfremgangsmåder eller gelpermeationschromatografi i et ikke-vandigt system.

På grund af de særlige fordele med hensyn til isoleringen af lasa-locidhomologene foretrækkes det, at råproduktet isoleres ved filtrering af den vandige næringsopløsning, ekstraktion af filtratet med et vanduopløseligt opløsningsmiddel og fraskillelse af slutprodukter 141582 7 ne fra opløsningsmiddelekstrakten, især at filtratet ekstraheres med n-butylacetat, og ekstrakten behandles med petroleumsether til opnåelse af en med de ønskede slutprodukter beriget moderlud.

En særlig foretrukken metode til isolering af lasalociderne fra råproduktet, som foretrækkes ifølge opfindelsen, går ud på, at råproduktet underkastes modstrømsfordeling, og at denne modstrømsfordeling udføres på den måde, at der først anvendes et opløsningsmiddelsystem bestående af heptan-ethylacetat-methanol-vand, hvorefter den fraktion, som indeholder de ønskede produkter, underkastes en yderligere modstrømsfordeling med heptan-ethylacetat-ethanol-vand--iseddike som opløsningsmiddelsystem. På grund af de særlig gode udbytter, der fås derved, går en ifølge opfindelsen foretrukken variant ud på, at opløsningsmiddelsystemet til den første modstrømsfordeling består af heptan-ethylacetat-methanol-vand i et volumenforhold på ca. 27:18:18:2, og at opløsningsmidlet til den anden modstrømsfordeling består af heptan-ethylacetat-ethanol-vand--iseddike i et volumenforhold på ca. 10:5:9:3:1.

De farmaceutisk tolerable salte af de omhandlede lasalocidhomologe kan fremstilles på sædvanlig måde. Disse salte fremstilles ud fra den frie syreform af antibiotiket eller et derivat deraf efter i og for sig kendte metoder, f.eks. ved vask af den frie syre i opløsning med en egnet base eller et egnet salt. Eksempler på sådanne farmaceutisk tolerable basiske, til saltdannelse egnede stoffer er alkalimetalbaser, f.eks. natriumhydroxid, kaliumhydroxid eller lithiumhydroxid; jordalkalimetalbaser såsom calciumhydroxid og kaliumhydroxid; og ammoniak. Alkalimetal- eller jordalkaliraetal-salte, som kan anvendes til fremstilling af de omhandlede farmaceutisk tolerable salte, er f.eks. carbonater, hydrogencarbonater og sulfater.

Den relative antibiotiske virkning af de lasalocidhomologe B, C, D og E i forsøg in vitro mod mikroorganismen Bacillus TA konstateres ved sammenligning af et rent natriumsalt af lasalocid A med de fire homologe under anvendelse af agardiffusionsmetoden på hulplader. De beregnede talværdier for de fem komponenter er baseret på en vilkårligt sat aktivitet på 100 for lasalocid A-basen og fremgår af nedenstående tabel: 1 Al 582

Forbindelse Beregnet aktivitet in vitro mod ______ Bacillus TA_

Lasalocid A 100

Lasaloeid B 90

Lasalocid C 180

Lasalocid D 160

Lasalocid E 170

Med hensyn til toxicitet er de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede lasalocider B, C, D og E lasalocid A overlegne, hvilket fremgår af de nedenfor anførte data for den akutte toxicitet (forsøg udført på mus, værdier efter 24 timers forløb):

Produkt LD50 mg/kg peroralt til mus

Lasalocid B + C

(i forholdet 1:1) 210 - 30

Lasalocid D + E

(i forholdet 1:1) 195 - 32

Lasalocid A 146

Det fremgår af de i tabellerne anførte værdier, at de hidtil ukendte stoffer har overraskende fordele fremfor lasalocid A.

Der kan fremstilles coccidiostatiske præparater, der som virksom bestanddel indeholder homologe af antibiotiket Lasalocid A eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf, ved blanding af den aktive bestanddel med et inert bærestof. Det inerte bærestof kan være et foderstof eller erstatningsmateriale. Med udtrykket "inert bærestof" forstås et materiale, der ikke virker som antiparasitært middel, f.eks. som coccidiostatikum, og som er uskadeligt for de dyr, som skal behandles.

Den aktive bestanddel undertrykker coccidiose hos nyttefjerkræ, især kalkuner og kyllinger, enten ved profylakse eller, ved allerede tilstedeværende sygdom, helbredelse deraf efter oral administration som en bestanddel af foderstoffet. Endvidere beholder de behandlede dyr deres vægt, eller de forøger endog deres vægt i sammenligning med kontroldyr. De omhandlede midler bekæmper således ikke kun coccidiose, men virker desuden som vækstfremmende middel.

141582 9

Koncentrationen af det aktive stof i foderstoffer kan varieres alt efter det individuelle behov. F.eks. kan en foderforblanding eller et fuldstændigt foderstof beriges med en tilstrækkelig mængde aktivstof, således at det udgør ca. 0,006 - ca. 0,03 vægtprocent af den daglige foderstofmængde. Der anvendes fortrinsvis ca. 0,015 -0,03 vægtprocent. I almindelighed er det tilstrækkeligt med ca. 0,015 vægtprocent af det aktive stof til effektivt at undertrykke eller bekæmpe coccidiose. Større mængder end 0,015% er ganske vist virksomme, men viser dog i almindelighed ingen fordele i forhold til 0,015% og kan i nogle tilfælde øve negativ indflydelse på væksten, foderomdannelsen og mortaliteten.

Selv om mængder på over 0,03 vægtprocent er virksomme til bekæmpelse af coccidiose, er disse mængder af økonomiske grunde den foretrukne overgrænse, dvs. omkostningerne pr. virkningsenhed er lavest inden for dette område. Under 0,006 vægtprocent er aktivstofferne ikke virksomme til bekæmpelse af coccidiose. Der foretrækkes en nedre grænse på 0,015%, da denne koncentration sikrer optimal virkning.

Den særligt foretrukne koncentration, dvs. 0,015 vægtprocent af den daglige foderstofindtagelse, er derfor særlig foretrukken, da den fremkalder maksimal virkning ved minimal dosering.

Til behandling eller profylakse af coccidiose kan aktivstofferne først bringes i form af et koncentrat, en fodertilsætningsstoffor-blanding eller et fodertilsætningsmiddel. Ud fra disse kan helfoder eller fodertilsætningsstof fremstilles ved fortynding. Eksempler på bærestoffer er: kommercielt fjerkræfoder, formalede cerealier, biprodukter fra mølleriindustrien, planteproteinkoncentrater (f.eks. soja og jordnødder), biprodukter fra fermentationer, salt, kalksten og uorganiske forbindelser eller blandinger heraf. Flydende dispersioner kan fremstilles under anvendelse af vand eller vegetabilske olier, fortrinsvis under inkorporering af et overfladeaktivt middel eller en emulgator, f.eks. ethylendiamintetraeddikesyre, og opløsningsformidler. Som inerte bærestoffer kan der også anvendes andre bærestoffer eller erstatningsmaterialer, såfremt de forholder sig inerte i forhold til aktivstoffet og ikke er toxiske for de dyr, til hvilke de skal administreres.

Typiske fjerkræfoderstoffer, som kan blandes med aktivstoffet, indeholder f.eks. kornprodukter såsom majs, hvede, havre, byg, milokorn, 10 141582 havremel og eftermel (f.eks. hvedeeftermel); stabiliserede fedtstoffer; planteproteiner såsom sojamel, majsglutenmel og jordnødderne1; vegetabilske proteiner såsom fiskemel, vandopløselige dele af fisk ("fish solubles") og kødaffald; kilder til UGF ("unidentified growth factor") og andre B-vitaminbærestoffer såsom tørmælkprodukter, tørret bryggerigær, tørrede opløslige remanenser fra destillationsindustrien, tørrede remanenser fra fermentationer og lucernegrønmel; samt forskellige specialtilsætningsstoffer såsom riboflavin, vitamin B^/ calciumpantothenat, niacin, cholin, vitamin K, vitamin E, stabiliseret vitamin A, vitamin (aktiverede animalske steroler), calcium-og phosphorsupplementstoffer såsom dicalciumphosphat, dampbehandlet benmel, defluoriseret phosphat og kalksten, ioderet salt, mangansulfat, zinkcarbonat, methionin eller hydroxyanaloge deraf, antioxidan-ter samt andre antibiotisk aktive foderstoftilsætningsstoffer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempel:

Eksempel.

Fremstilling af de lasalocidhomologe B , C , D og E.

Streptomyces x-537 dyrkes i beluftet submers næringsopløsning i rysteflasker. pH-værdien i gasringsopløsningen indstilles på 6,5 - 7,5 ved tilsætning af vandig kaliumhydroxidopløsning; derefter steriliseres næringsopløsningen. Der udføres en tankgæring, idet der anvendes et S - 10%'s inokulum bestående af en 3 dage gammel submers kultur fra de beluftede kolber. Næringsmediet indeholder 2% søjabønnemel, 2% brunt sukker, 0,1% dikaliumphosphat og 0,5% majsstøbevand. Fermentationen udføres ved 28°C under positivt lufttryk, idet der indblæses luftmængder på 150 - 300 liter/minut pr. 150 -300 liter opløsning. Gæringen afbrydes efter 4-6 dages forløb, gæringsopløsningen filtreres, og antibiotiket isoleres ved ekstraktion. Ekstraktionen udføres på følgende måde: 204 liter gæringsopløsning filtreres. Den våde filterkage opslaanmes i 100 liter n-butylacetat, og blandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Derefter filtreres blandingen, og vandfasen fraskil- ' : ’ : ·*·’ 141582 11 les og kasseres, n-Butylacetatopløsningen, som indeholder en anti-biotikumkoncentration svarende til 30 millioner Bacillus E-enheder, inddampes til 3 liter under reduceret tryk, vaskes med 10%'s vandig natriumcarbonatopløsning og tørres over vandfrit natriumsulfat.

Efter yderligere inddampning til 300 ml og fortynding med 350 ral petroleumsether (kogeinterval 50 - 60°C) fraskilles 41 g faststof, som svarer til 25 millioner Bacillus E-enheder. Dette faststof ekstraheres derefter i Soxhlet^apparatur med 4 liter petroleumsether (kogeinterval 50 - 60°C) i 40 timer. Ekstrakten inddampes til tørhed under reduceret tryk, og den krystallinske remanens dis-pergeres i petroleumsether og filtrenes. Efter gentagne krystallisationer fås en med de lasalocidhomologe B, C, D og E beriget moderlud. -

Isolering af de lasalocidhomologe B, C, D pg E.

En portion (svarende til 22 g faststof) af den vundne moderlud chromatograferes i et med 200 små rør (hver med et rumfang på 80 ml) udstyret modstrømsfordelingsapparatur. Prøven opløses i 160 ml af de blandede faser (heptan-ethylacetat-methanol--vand i forholdet 27:18:18:2), og opløsningen hældes på de to første små rør. Efter 380 fordelinger fås følgende fraktioner, idet de vundne faste stoffer efter inddampning identificeres på følgende måde: A. Blanding af de lasalocidhomologe B, C, D og E, B. Lasalocid A, C. Isolasalocid A. Dette produkt er en isomer af Lasalocid A med en fra lasalociderne A - E afvigende struktur.

Fraktion A opløses i 20 ml af de blandede faser af opløsningsmiddelsystemet heptan-ethylacetat-ethanol-vand-iseddike (10:5:9:3;!) og chromatograferes i et med 500 små rør forsynet modstrømsfordelingsapparatur. Efter 2800 fordelinger separeres ca. 200 mg af hver af Lasalocid B, C, D og E med nedenstående smeltepunkter:

Claims (2)

12 141582 Lasalocid B - 85 - 87°C Lasalocid C - 97 - 100°C Lasalocid D - 102 - 104°C Lasalocid E - 90°C. Natriumsaltet af Lasalocid E. Ca. 100 mg Lasalocid E opløses i methylenchlorid og behandles med mættet vandig natriumcarbonatopløsning. Methylenchloridfasen inddampes med hexan. Der fås 104 mg krystallinsk natriumsalt af Lasalocid E (smeltepunkt 182.- 182,5°C). Patentkrav..

1. Fremgangsmåde til fremstilling af lasalocidantibiotika eller farmaceutisk tolerable salte deraf, kendetegnet ved, at der ud fra et råprodukt vundet ved submers og aerob dyrkning af en mikroorganisme af arten Strepto-myces X-537 i en assimilerbar carbonhydrat- og nitrogenkildehol-dig næringsopløsning isoleres lasalocid B, C, D og E med formlen R1 B.2 =2R5 R3 p°°H Ξ Ξ I I \ o' _/Oli ·. J OH O σ É 0-k ir ^ CH3 12 3 4 hvor en af substituenterne R , R , R og R er ethyl, og de øvrige er methyl, og et vundet produkt, om ønsket, omdannes til et farma ceutisk tolerabelt salt heraf. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 kendetegnet ved, at råproduktet underkastes modstrøms 3 fordeling.