NO143669B - Fremgangsmaate ved fremstilling av lasalocidantibiotika - Google Patents

Description

Nærværende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte ved fremstilling av nye antibiotika av den generelle formel

hvor R^, R2, og R4 er metyl eller etyl, idet bare en av substituentene R-^ —- R^ er etyl,

i isolert form såvel som farmasoytisk aksepterbare salter av disse forbindelser.

Det ble funnet at antibiotikaene av formel I og deres farmasoytisk aksepterbare salter utover kokkidiostatisk og anti-bakteriell virkning. De er således anvendbare som kokkidiostatiske og antibakterielle midler.

De nye antibiotika av formel I og deres farmasoytisk aksepterbare salter fremstilles ifolge oppfinnelsen ved en fremgangsmåte, som er karakterisert ved at man submerst og aerobt dyrker en under arten Streptomyces lasaliensis (Streptomyces X-537) fallende mikroorganisme, fortrinnsvis stammen NRRL 3382, i et næringsmedium som inneholder assimilerbare karbohydrat-og nitrogenkilder, hvoretter man isolerer de erholdte forbindelser av formel I fra det vandige dyrkningsmedium og, hvis ønsket, overfører en erholdt forbindelse til et farmasøytisk aksepterbart salt av denne.

Mikroorganismen som fremstiller antibiotikaene hører til slek-ten Streptomyces og ble isolert fra en i Hyde Park, Massa-chusetts funnet jordprøve. Frysetørkede prøver av den med laboratoriebetegnelsen X-537 betegnede kultur ble deponert i mikroorganismesamlingen i United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA under nr. NRRL 3382. Denne kultur er blitt gjort tilgjengelig for almenheten under NRRL.

Nedenfor folger en generell beskrivelse av en typisk stamme av Streptomyces X-537.

Når kulturen proves etter forskriftene i Shirling, E.B. og

D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. J. Systematic Bacteriol. 16, 313-340, 1966

(i det folgende kort betegnet "Shirling & Gottlieb, 1966" oppviser den et godt utviklet og forgrenet mycelium. Sporekjedene oppviser fra hverandre trukne vindinger (Retinaculum-Apertum ifolge terminolien etter Ralf Huttér: Systematic der Strepto-myceten, side 10, PubL.S. Karger, 1967). Hver sporekjede bærer gjennomsnittlig ca. 25 sporer 5 sporeoverflaten er ru.

Morfologien for koloniene på forskjellige agar-media er som folger :

Når kulturen ifolge Shirling & Gottlieb, 1966 proves utnytter denne karbohydrater som folger: Arabinose 3+, cellulose i, fruktose 3+, glukose -3+, inositol 4+, mannitol 4+, raffinose rhamnose 2+, sukrose +, xylose 3+.

Når kulturen ifolge R.E. Gordon "The Taxonomy of Soil Bacteria" i Ecology of Soil Bacteria, forlegger T.R.G. Gray & D. Parkinson, Liverpool University Press, Liverpool, 1967 proves, ble de folgende fysiologiske reaksjoner iakttatt: Hydrolyse av: Adenin +, kasein hypoxantin +, tyrosin +,

potetstivelse -.

Produksjon av: Urease -, nitratreduktase -.

Utnyttelse av: Citrat +, laktat -, malat +, mukat -,

oksalat -, succinat +.

Syre fra: Adonitol -, arabinose -, dulcitol -, ery-tritol -, galaktose +, glukose + , inositol +, laktose +, maltose +, mannitol +, mannose +, melibiose +, a-metyl-D-glukosid +, raffinose -, rhamnose +, sorbitol -, trehalose +, xylose +.

Vekst ved: 10°C +, 4 2°C +, 53°C -.

Vektst i: Lysozymsuppe -, salicylatsuppe -, glycerol-suppe +.

Ved anvendelse av metodene ifolge det International Streptomyces Project (ISP) (Shirling & Gottlieb, 1966) og noklen av Nonomura (J. Nonomura: Key for Classification and Identifica-tion of 458 Species of Streptomycetes included in ISP; J. Fer-ment. Technol. 52: 78-92, 1974) fremgår det at kulturen ikke tilsvarer noen Streptomyceter som er undersokt ved disse stu-dier. Kulturen inneholder L-isomeren av diaminopimelinsyre.

Det hittil som antibiotikum X-537A (Lasalocid A) karakteriserte antibiotikum ble ved laboratorieanalysen karakterisert som 6-\ 1<C>R)-[5(S)-etyl-5-(5(R)-etyltetrahydro-5-hydroksy-6(S)-metyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-metyl-2(S)-furyl]-4(S)-hy-droksy-3(R),5(S)-dimetyl-6-oksononyl} - 2,3-kresotinsyre, d.v.s.

en forbindelse av formelen

Ved foreliggende oppfinnelse fås homologer av antibiotikummet lasalocid A og deres farmasoytisk aksepterbare salter. Lasalocidhomologene er forbindelse av de folgende formler og nomenklatur:

Lasalocid B:

6-(7(R)- I 5(S)-etyl-5-(5(R)-etyltetrahydro-5-hydroksy-6(S)-metyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-metyl-2(S)-furylJ-4(S)-hydroksy-3(R),5(S)-dimetyl-6-oksononyl}-2-hydroksy-3-etylbenzo-syre.

Lasalocid C:

6- {7 (R) - 1.5 (S ) -etyl-5- ( 5 (R) -etyltetrahydro-5-hydroksy-6 (S) - metyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-metyl-2 (S)-furylJ-3(R)-etyl-4(S)-hydroksy-5(S)-metyl-6-oksononyl} - 2,3-kresotinsyre.

Lasalocid D:

6- (7 (R)- I 5(S)-etyl-5-(5(R)-etyltetrahydro-5-hydroksy-6(S)-metyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-metyl-2(S)-furylJ-5(S)-etyl-4(S)-hydroksy-3(R)-metyl-6-oksononyl} - 2,3-kresotinsyre .

Lasalocid E:

6-{7(R)-[5<S)-etyl-5-(5(R)-etyltetrahydro-5-hydroksy-6(S)-metyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-etyl-2(S)-furyl]-4(S)-hydroksy-3(R),5(S)-dimetyl-6-oksononyl} - 2,3-kresotinsyre.

Lasalocidhomologene fremstilles ifølge oppfinnelsen ved fermentering av Streptomyces lasaliensis (Streptomyces X-537) under aerobe, submerse betingelser, idet pH-verdien for gjæroppløs-ningen innstilles omtrent nøytralt, d.v.s. ca. 6,5 til 7,5.

Den anvendte næringsbunn inneholder en nitrogenkilde, som f.eks. gjær, et gjærprodukt, maismel eller bønnemel og soyabønnemel er foretrukket: salter som f.eks. kaliumfosfat, kalsiumkarbonat og sporelementer; en karbohydratkilde, som sukker eller mel-asse fortrinnsvis brunt sukker, og et vegetabilsk eller ani-malsk fett eller olje, som f.eks. soyabønneolje eller smult-olje, som karbonkilde og middel for skumbekjempelse og for forbedring av utbyttet av det ønskede sluttprodukt. Fermenter-ingen gjennomføres ved svakt forhøyet temperatur, d.v.s. mellom ca. 25° og 35°C, særlig ved ca. 28°C. Etter en inkubasjonstid på ca. 4 til 6 dager filtreres gjæroppløsningen og antibiotikaene utvinnes ved ekstraksjon.

Etter fullfort fermentering kan mange metoder anvendes for isolering og rensning av lasalocidhomologene ifolge oppfinnelsen. Eksempler på disse er opplosningsmiddel-ekstraksjonsfremgangs-måten, som f.eks. intermitterende ekstraksjon eller flytende-flytende ekstraksjon i motstromsfordelingsfremgangsmåte eller også gelpermeasjonskromatografi i et ikke-vandig system.

De farmasoytisk aksepterbare salter for Lasalocidhomologene frem-stilt ifølge oppfinnelsen, kan fremstilles etter tradisjonelle metoder. Disse salter fremstilles fra den frie syreform for antibiotikummet eller dets derivater etter i og for seg kjente metoder, f.eks. ved vaskning av den frie syre i opplosning med en egnet base henh. et egnet salt. Eksempler på slike farmasoytisk aksepterbare basiske, for saltdannelse egnede substanser er alkalimetallbaser, som f.eks. natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, og litiumhydroksyd; jordalkalimetallbaser som f.eks. kalsium-hydroksyd og kaliumhydroksyd og ammoniumhydroksyd. Alkali-metall- eller jordalkalimetallsalter, som kan anvendes for fremstillingen av de farmasøytisk aksepterbare salter ifølge oppfinnelsen, er f.eks. karbonater, bikarbonater og sulfater.

Den relative antibiotiske virkning for lasalocidhomologene

B, C, D og E i in vitro proven overfor mikroorganismen 3acil-lus TA ble vist ved sammenligning av et rent natriumsalt av lasalocid A med de fire homologer under anvendelse av agar-diffusjonsmetoden på hulplater. Den beregnede tallverdi for de fem komponenter baserer seg på en vilkårlig satt aktivitet på 100 for lasalocid A-basen og fremgår av den nedenstående tabell:

Med hensyn til toksisiteten er lasalocidene B, C, D og E som erholdes gjennom foreliggende oppfinnelse bedre enn det kjente lasalocid A som det fremgår av de etterfølgende data for akutt toksisitet hos mus (24^timersverdi):

Lasalocidene B, C, D og E som erholdes gjennom foreliggende oppfinnelse viser følgelig fordeler med hensyn til virkning og/ eller toksisitet overfor tidligere kjente produkter hvilket ikke kunne utledes fra teknikkens stand. De utgjør følgelig en overraskende og verdifull tilvekst i utvalget av legemidler.

De kokkidiostatiske preparater inneholder som virksom bestanddel homologer av antibiotikummet lasalocid A eller et farma-søytisk aksepterbart salt av dette og fremstilles ved blanding av den virksomme bestanddel med en inert bærer. Den inerte

bærer kan bestå av for eller tilsetningsmaterialer. Med uttrykket "inert bærer" menes et materiale som ikke virker

som antiparasitært middel, f.eks. som kokkidiostatikum, og. som er uskadelig for dyrene som skal behandles.

Den virksomme bestanddel undertrykker koccidiose ved nyttefjærfe, særlig kalkuner og kyllinger, enten ved å hindre eller, ved allerede tilstedeværende sykdom, helbredelse av denne etter oral administrering som en komponent.av fåret. Dessuten be-holder dyrene som skal behandles deres vekt eller de oker til og med deres vekt sammenlignet med kontrolldyrene. Midlene ifolge oppfinnelsen kontrollerer således ikke bar kokkidiose, men de virker dessuten som vekstfremmende middel.

Konsentrasjonen av det virksomme stoff i fdrmidler kan varie-res svarende til de individuelle behov. F.eks. kan et fér-"pramix eller et fullstendig fdr anrikes med tilstrekkelig virksomt stoff til å inneholde ca. 0,006 til ca. 0,03 vekts% av det daglige f6rkonsum. Fortrinnsvis anvender man ca. 0,015 til 0,03 vekts%. Generelt er ca. 0,015 vekts% virksomt stoff tilstrekkelig for å undertrykke henh. bekjempe med held kokki-diosene. Storre mengder enn 0,015 % er rigtignok virksomt, men de oppviser generelt ingen fordeler overfor 0,015 % og kan i noen tilfeller innvirke uheldig på veksten, fdromdannel-sen og mortaliteten.

Skjbnt mengder over 0.03 vekts% er virksomme for bekjempelse av kokkidiose. er denne mengde av okonomiske grunner den foretrukne ovre grense, d.v.s. omkostningene pr. virknings-enhet er lavest innenfor dette område. Under 0,006 vekts% er de virksomme stoffer for bekjempelse av kokkidiose ikke virksomme. Foretrukket er en lavere grense på 0,015 %, fordi denne konsentrasjon yter optimal virksomhet. Den særlig foretrukne konsentrasjon d.v.s. ca. 0,015 vekts% av det daglige férkonsum, er derfor særlig foretrukket, da den ved minimal dosering gir den maksimale virkning.

For behandlingen eller forhindring av kokkidiose kan det virksomme stoff forst bringes til en form av et konsentrat, et fårtilsetnings-"pramix" eller en f6rtilsetning. Ut fra dette kan fullverdig f6r eller tilsetningsf6r fremstilles ved fortynning. Eksempler på bærere er: kommersielt fjærfefdr, opp-malte cerealier, biprodukter fra molleindustrien, plantepro-teinkonsentrater (soya, jordnott, etc), biprodukter fra fermenteringer, salt, kalksten, uorganiske forbindelser osv. eller blandinger av disse. Flytende dispersjoner kan fremstilles av vann eller vegetabilske oljer, fortrinnsvis under medanvendel-se av et overflateaktivt middel eller en emulgator, o.s.v.., som etylendiamintetraeddiksyre etc, og opplosningsf ormidler . Også andre bærere eller tilsetningsmaterialer kan anvendes som inerte bærere, hvis de forholder seg inert overfor det virksomme stoff og er ikke-giftige overfor dyrene til hvilke de skal administre-res .

Typiske fjærfefér som kan blandes med det virksomme stoff inneholder f.eks. kornprodukter, som mais, hvete, havre, bygg, "milo", havremel, "Nachmel" (f.eks. "tfeizennachmehl") o.r.v.; stabliserte fettarter; plateproteiner, som soyamel, maisg'' 'ten-mel, jordnbttmel, o.s.v.; dyreproteiner som fiskemel, vannopp-loselige andeler av fisk ("fish solubles"), kjottavfall, o.s.v.; kilder for UGF ("unidentified growth factor") og andre B-vita-minbærere som torrmelkprodukter, torket bryggerihavre, tbrkede, opploselige rester fra destillasjonsindustrien, opploselige rester fra fermenteringer etc, gronluzernemel og forskjellige spesialtilsetingsmidler som "Riboflavin", vitamin B-^? kal-siumpantotenat, niacin, kolin, vitamin K, vitamin E, stabili-sert vitamin A, vitamin D^ (aktiverte animalske steroler), kal-sium og fosforsupplementer som f.eks. dikalsiumfosfat, damp-behandlet knoklemel, avfluorisert fosfat, kalksten etc, jodi-sert salt, mangansulfat, sinkkarbonat, metionin eller dets hydroksyanaloger, antioksydanter såvel som også ytterligere antibiotisk virksomme f6rtilsetninger.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av lasalocidhomologene B, C, D og E.

Streptomyces-organismen NRRL 3 3 82 dyrkes i luftet submers nærings-oppløsning i rystef lasker. pH-verdien for gjæringsoppløsningen innstilles på 6,5 til 7,5 ved tilsetning av vandig kaliumhydroksyd-opplosning, og derpå steriliseres næringsopplosningen. Det gjennomfores en beholdergjæring, idet et 5-10%'s inokulum som består av en 3 dager gammel submers kultur fra de luftede flasker anvendes. Næringsmediet inneholder 2 % soyabonnemel, 2 % brunt sukker, 0,1 % dikaliumfosfat og 0,5 % maiskildevann. Fermente-ringen gjennomfores ved 28°C under positivt lufttrykk, idet luftmengder på 150-300 liter pr. minutt pr. 150-300 liter opplosning blåses inn. Gjæringen avbrytes etter 4 til 6 dager, gjæropplosningen filtreres og antibiotikummet utvinnes ved ekstraksjon. Ekstraksjonen gjennomfores som folger: 204 liter gjæringsopplosning filtreres. Den våte filterkake slemmes opp i 100 liter n-butylacetat og blandingen rores over natten ved romtemperatur. Blandingen filtreres deretter og det vandige skikt skilles fra og kastes, n-butylacetatopplos-ningen, som inneholder en antibiotikumkonsentrasjon svarende til 30 millioner Bacillus E-enheter konsentreres under redusert trykk til 3 liter, vaskes med 10% vandig natriumkarbonatopplosning og torkes over vannfritt natriumsulfat.

Etter ytterligere konsentrering til 300 ml og fortynning med 350 ml petroleter (kokepunkt 50-60°C) får man utskilt 41 g fastsubstans, som ved prbven svarer til 25 millioner Bacillus E-enheter. Denne fastsubstans ekstraheres deretter i 40 timer i et Soxhlet-apparat med 4 liter petroleter (kokepunkt 50-60°C). Ekstraktet dampes inn under redusert trykk til tbrrhet og den krystallinske rest dispergeres i petroleter og filtreres.

Etter gjentatte krystallisasjoner får man en på Lasalocidhomologene B, C, D og E anriket moderlut.

Isolering av lasalocidhomologene B, C, D og E

En porsjon (tilsvarende 22 g faststoff) av den ifolge eksempel 1 utvunne moderlut kromatograferes i et med 200 små ror (hvert med en opptagelsesevne på 80 ml) utstyrt motstromsfordelingsapparat. Proven opploses i 160 ml av de blandede faser (heptan-etylacetat-metanol-vann, 27:18:18:2) og opplosningen anbringes foran i de forste to små ror. Etter 380 fordelinger får man folgende fraksjoner, idet de utvunne fastsubstanser etter inn-dampning identifiseres som folger:

A. Blanding av lasalocidhomologene B, C, D og E

B. Lasalocid A

C. Isolasalocid A. Dette produkt er en isomer av lasalocid A med en fra lasalocidene A-E avvikende struktur.

Fraksjon A opploses i 20 ml av de blandede faser av opplos-ningsmiddelsystemet heptan-etylacetat-etanol-vann-iseddik (10:5:9:3:1) og kromatograferes på et med 500 små ror utstyrt motstromsfordelingsapparat. Etter 2800 fordelinger separeres hver ca. 200 mg lasalocid B, C, D og E med folgende smelte-punkter :

Lasalocid B - 85-87°C

Lasalocid C - 97-100°C

Lasalocid D - 102-104°C

Lasalocid E - 90°C .

EKSEMPEL 2

Natriumsalt av lasalocid E

Ca. 100 mg lasalocid E opploses i metylenklorid og behandles med mettet vandig natriumkarbonatopplosning. Metylenkloridfasen konsentreres med heksan. Man får 104 mg krystallinsk natriumsalt av lasalocid E (smeltepunkt 182-182,5°C).

Tilsetning i dyrefår

Denne tilsetningen anskueliggjør anvendelsen av det virksomme stoff i et dyref6r. Et som begynnelsesf6r for broilere bestemt, medikert fjærfefor fremstilles på den måte at man tilblander 0,015 vekts% og 0,006 vekts% av en blanding av lasalocid B og C (50/50) og lasalocid D og E (50/50) i et fjærfefér.

Følgende forsøk illustrerer virkningen av det virksomme stoff: Laboratorie- kyllinger infisert med Eimeria tenella Forsoksmetodikk: Det anvendes 10 kyllinger pr. dose. 10 kyllinger anvendes som vektskontroll og 10 kyllinger som infiserte kontroller. Antibiotikummet tilsettes 48 timer for infeksjonen. 1 g av antibiotikummet blandes i en mekanisk blandeanordning med den nbd-vendige mengde kyllingfér, for å nå den bnskede dosering. Infeksjonen består av ca. 200,000 Oocysten, administrert peroralt ved hjelp av en pipette. Forsbket varer 11 dager, hvoretter de overlevende dyr underkastes autopsi og undersbkes med hensyn til grove caecale skader. Tallet på overlevende dyr og tallet på caecale skader fastslås. Resultatene uttrykkes som "gjennomsnittlig infeksjonsgrad". Ved en gjennomsnittlig infeksjonsgrad på mindre enn 1,5 anses den tilhbrende dose som bety-delig virksom.

Som det fremgår av det nedenstående er antibiotika-blandingen virksom ved behandlingen av kokkidiose.

Tilsetning i dyrefor.

Denne tilsetningen anskueliggjør anvendelsen av et enkelt virksomt stoff som kokkidiostatikum i et dyref6r. Et som be-gynnelsesfor for broilere bestemt medikert fjærfefor fremstilles. Ca. 0,01 vekts% lasalocid D tilblandes fjærfefiret.

Den ovenfor beskrevne prøvemetodikk anvendes for undersøkelsen

av virkningen overfor Eimeria tenella. Som det fremgår av nedenstående virker antibiotikummet overfor kokkidiose.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotika med den generelle formel hvor R^, R2, R3 og R^ er metyl eller etyl, idet bare en av substituentene R^-R^ er etyl, i isolert form, og farmasoytisk aksepterbare salter av disse forbindelser, karakterisert ved at man submerst og aerobt dyrker en under arten Streptomyces lasaliensis (Streptomyces X-537) fallende mikroorganisme, fortrinnsvis stammen NRRL 3382, i et næringsmedium som inneholder assimilerbare karbohydrat- og nitrogenkilder, hvoretter man isolerer de erholdte forbindelser av formel I fra det vandige dyrkningsmedium og, hvis ønsket, overfører en erholdt forbindelse til et farmasøytisk aksepterbart salt av denne.

2. Fremgangsmåte etter krav 1, karakterisert ved at man utvinner sluttproduktene på den måte at man filtrerer den vandige næringsbunn, ekstraherer filtratet med et vannuoppløselig oppløsningsmiddel og separerer sluttproduktene fra oppløsningsmiddelekstraktet.

3. Fremgangsmåte etter krav 2, karakterisert ved at man ekstraherer filtratet med n-butylacetat og be-handler ekstraktet med petroleter for å oppnå en på de ønskede sluttprodukter anriket moderlut.

4. Fremgangsmåte etter krav 2 eller 3, karakterisert ved at man gjennomforer fraskillelsen av sluttproduktene fra opplosningsrniddelekstraktet på den måte at man underkaster sistnevnte en motstrbmsfordeling.

5. Fremgangsmåte etter krav 4, karakterisert ved at man utforer'motstrbmsfordelingen på den måte at man forst anvender et opplbsningsmiddelsystem som består av heptan-etylacetat-metanol-vann og deretter underkaster fraksjo-nen som inneholder de bnskede produkter en andre motstrbmsfordeling med heptan-etylacetat-etanol-vann-iseddik som opplbsningsmiddelsystem.

6. Fremgangsmåte etter krav 5, karakterisert ved at opplbsningsmiddelsystemet for den fbrste motstrbmsfordeling består av heptan-etylacetat-metanol-vann i et volumforhold på ca. 27:18:18:2 og at opplbsningsmidlet for den andre motstrbmsfordeling består av heptan-etylacetat-etanol-vann-iseddik i et volumforhold på ca. 10:5:9:3:1.