DE3137049A1 - Verfahren zur bildung von uricase durch mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur bildung von uricase durch mikroorganismen

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Description

ο ι ο ./ υ
1A-55 126
E.N.I.
.Beschreibung
Verfahren zur Bildung von Uricase durch. Mikroorganismen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung des Enzyms üricase (EC 1.7.3.3.) mit hoher Aktivität, die angewandt werden kann bei der klinischen Diagnose zur Bestimmung von Harnsäure in Serum oder Urin.
üricase ist ein Enzym, das die Oxidation von Harnsäure zu Allantoin katalysiert und das im Gewebe von höheren Säugetieren wie Menschen nicht vorhanden ist: Es ist dagegen vorhanden in Geweben und speziell in inneren Organen von niederen Säugetieren und in größeren oder kleineren Mengen in einigen Mikroorganismen.
Es hat sich nun gezeigt, daß üricase gebildet werden kann durch Micrococcus roseus, einem Mikroorganismus, von dem bisher nicht bekannt war, daß er dieses Enzym bilden kann und der darüber hinaus verglichen mit anderen bekannten Mikroorganismen den Vorteil besitzt, daß er große Mengen an Uricase in Kulturmedien bildet, die geringe Konzentrationen an Harnsäure enthalten. Es hat sich darüber hinaus überraschenderweise gezeigt, daß das Optimum der Aktivität der von Micrococcus roseus NRKL B 12196 gebildeten Uricase im Gegensatz zu der Uricase r die von anderen Bakterien gebildet worden ist, nahe den pH-Werten von physiologischen Flüssigkeiten liegt,und das ist ir/sofern "
3137040
1A-55 126
ein Vorteil, als es nicht erforderlich ist, den pH-Wert der biologisch3ή Probe, in der die Harnsäure bestimmt werden soll, zu verändern, so daß mögliche Schäden durch chemische Modifikationen der zu untersuchenden Probe vermieden werden. Dieser Mik -oorganismus wurde isoliert von Ackerland in der Nähe von Monterotondo (Rom) und besitzt die folgenden morphologischen und biologischen Eigenschaften:
Mikroskopische Morphologie
Kugeln mit einem Durchmesser von 1 bis 2,5 μΐιι unbeweglich und Gram-positiv, bildet durch Aufspalten in mehr als einer Ebene kubische Packungen oder irreguläre Gruppierungen und erscheint manchmal paarweise oder isoliert
Makroskopische Morphologie
Kolonien auf Nähr-Agar: aufrecht, glatter Rand, rosa Farbe, glatte Oberfläche, 1 bis 2 mm Durchmesser,
Nähr-Agar-Schräge: blaß-rosa Patina, glatt und glänzend.
Biochemische Eigenschaften:
25
Wachstum in Glucose Nährbrühe:
leichte Trübung mit Schlexmabscheidung, hell-rosa, pH 6,5.
Wächst bei 100C, aber nicht bei 4 50C, Optimum zwischen 25 und 350C.
Wächst in Glucose-Brühe enthaltend NaCl, 5 and 10 %, aber nicht 15 %.
Wächst nicht auf Simmons Citrat-Agar,.
O ! -O / U
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Aerobe Bildung von Säure aus Zuckern in Purple Broth Base (DIFCO): Xylose, Glycerin, Mannit, Lactose, Maltose, Sorbose, Ribose, Arabinose, Raffinose, Cellobiose negativ; Glucose, Sucrose, Fructose leicht verzögerte Säurebildung (7 bis 10 Tage).
Argmin-Hydrolyse: negativ
Stärke-Hydrolyse: positiv
Gelatine-Hydrolyse: negativ
Urease: positiv
H2S: negativ
Catalase: positiv
Nitratase: positiv
Indol: negativ
Acetoin: negativ
Methylrot: negativ
Lecithinase: negativ
Lipase (Butter und Olivenöl): negativ
Beim Vergleich dieser Daten mit den Beschreibungen in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, VIII, Aufl. gehört der erfindungsgemäße Mikroorganismus zu der Familie Micrococcaceae, Gattung Micrococcus, .Spezies roseus. Er wurde bei dem Northern Regional Research Center, Peoria, 111... USA hinterlegt, .wo er d._e Nummer NRRL B-123 96 erhielt. -
Die Züchtung von Micrococcus roseus NRRL B-]2196 kann aerob nach irgendeinem üblichen Verfahren durchgeführt werden, wie in Form von OberfLächenkulturen oder besser in Submers- Kulturen mit Hilf 3 von Rührfermentoren, Das Kulturmedium, das fest oder fLüssig sein kann, enthält eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Stickstof fquelle, eine PhosphorqueLle sowie Mineralsalz und Vi- tamine.
1A-55 126
Die Kulturen können bei Temperaturen zwischen 1O und 400C gehalten werde i, wobei der bevorzugte Bereich bei 25 bis 35°C liegt und 10 bis 48 h, vorzugsweise 20 bis 30 h bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8 aahalten werden.
Als KohlenstoffquelIe können z.B. Glucose, Lactat, Acetat, Saccharose, Punarat, Harnsäure, Maiswasser und Glycerin angewandt werden.
10
Als Stickstoffquel]e können ζ.B. Fleischhydrolysate, Casein-oder Sojabol nen-Hydrolysate, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrate und Harnsäure verwendet werden.
Die Extraktionen ui d möglicherweise Reinigung der Uricase aus der Bakterienp; ste wird nach üblichen Verfahren durch geführt. Die von d<-m Micrococcus roseus WRRL B-12196 extrahierte Uricase hann vorteilhafterweise in polymeren Matrices unter Ausbildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder ionischer Bindung oder durch reine physikalische * Immobilisierung immobilisiert werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
25
Beispiel 1
Es wurde eine Kultarbrühe der folgenden Zusammensetzung hergestellt.
30
Hefeextrakt 15 g/l
Harnsäure 2 g/l
Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,2 eingestellt und das Medium in Mengen \on jeweils 200 ml im 500 ml-Kolben verteilt. Nach 30-mii utenlangem Sterilisieren bei 116°C wurden die Kolben mii einer Kultur des Stammes NRRL B-12196
ö ! ό I
1Λ-55 126
von einer Schräge enthaltend das gleiche Medium zusammen mit 2 % Agar beimpft und 24 h bei 300C unter Orbitalschütteln mit 22 0 UpM inkubiert. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert. Von 200 ml Brühe erhielt man 3 g Paste (Feuchtgewicht)» Die so erhaltene Zellpaste wurde in 60 ml Phosphatpuffer (0,1 m; pH 8,5) aufgeschlämmt und durch eine French-Pressure-Cell-Presse geleitet bis ein vollständiges Aufbrechen der Zellen eingetreten war. Die Enzymaktivität wurde in dem so erhaltenen Extrakt bestimmt. 1 g feuchte Zellen enthielt 100 Uricase-Einheiten.
Bestimmung der Uricase.
Die Uricaseaktivität wurde spektrofotometrxsch durch Verfolgung der Harnsäure-Absorption bei 283 nm bestimmt nach dem Verfahren von Mahler et al ( .T.Biol. ehem., (1955), 216, 625) , modifiziert wie später erläutert. 7 ml einer Lösung enthaltend 20 mg Harnsäure in 100 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH 8,5) wurden in einen kleinen Kolben von 50 ml gegeben und unter Rühren auf dem Wasserbad bei 30°C inkubiert. Die Reaktion begann mit der Zugabe einer kleinen Menge Enzymextrakt, Unmittel— bar nach der Zugabe des Extraktes sowie 10 min danach wurden 0,5 ml Proben des Reaktionsgemisches entnommen und zu 4 ml 0,1 m HCl gegeben.
Die Absorption der so erhaltenen Lösung wurde bei 283 nm abgelesen.
30
Eine Uricase-Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die 1 μΜοΙ Harnsäure pro Minute unter den angegebenen Versuchsbedingungen abbauen kann. ;
/6
1A-55 126 - ff- Τ'*
Beispiel 2
Ein Extrakt von Micrococcus roseus NRRL B-12196-Zellen wurde wie in Beispial 1 hergestellt, 5
Der rohe Extrakt wurde zentrifugiert und in der überstehenden Flüssigkeit die Uricaseaktivität, wie oben beschrieben, bestimmt, wobei als Reaktionsgemisch Harnsäure in Lösungen von 0,1 m Phosphat bei verschiedenen pH-Werten angewandt wurde. Dabei wurden gleichzeitig die Aktivitäten eines Enzymextrakts untersucht, der von Kulturen von Bacillus fastidiosus unter den gleichen Bedingungen erhalten worden war wie für Micrococcus roseus angegeben. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle angegeben. Dabei wurden die Aktivitäten der Extrakte der beiden Mikroorganismen bei pH 9 als 100 angenommen.
Tabelle
uricaseaktivität als Funktion des pH-Wertes in Extrakten von B. fastidiosus und M. roseus.
pH-Wert Extrakt von
. M.roseus B.fastidiosus
6,5 ·· 71 13,5
7,0 94 35
7,5 103 57
8,0 106 85
8,5 103 95
9,0 100 100
6255

Claims (5)

1. Verfahren zur Bildung von Uricase durch Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet , daß man den Mikroo -ganismus Micrococcus roseus NRRL B-12196 unter aeroben Bedingungen in einem P'ulturme-
5 dium enthaltend ei ie Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Sticks ;offquelle, eine Phosphorcmelle und Mineralsalze züchtet.
2. Verfahren nac1 Anspruch 1, dadurch g e k e η η 10 zeichnet, daß man den Mikroorganismus bei einer Temperatur zwischei 10 und 400C züchtet.
3. Verfahren nac h Anspruch 2, dadurch g e k e η η zeichnetm daß man bei einer Temperatur zwischen
15 25 und 35°C arbeitet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch g e -■ kennzeichnet , daß der pH-Wert des Kulturmediums zwischen ' und 9 liegt.
5. Verfahren na<h Anspruch 4, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der pH-Wert zwischen 7 und 8 liegt.
25
6255
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