CN115927274A - 氨甲酰水解酶突变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氨甲酰水解酶突变体SEQ ID NO:3，其能够高效催化N‑氨甲酰‑D‑对羟基苯甘氨酸水解为D‑对羟基苯甘氨酸，且具有较高的热稳定性，可用于工业化双酶法催化生成D‑对羟基苯甘氨酸。

Description

氨甲酰水解酶突变体

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种氨甲酰水解酶突变体及其在D-对羟基苯甘氨酸合成中的应用。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸(又称左旋对羟基苯甘氨酸，英文名称D-p-hydroxyphenylglycine,D-HPG)是合成β-内酰胺类半合成广谱抗生素例如阿莫西林、头孢羟氨苄、头孢哌酮、羟氨苄唑头孢、头孢罗齐、头孢曲嗪等的重要侧链原料化合物，也是合成抗菌和抗病毒药物、人工甜味剂的重要中间体，具有广泛的商业应用价值。

D-HPG合成方法大致分两类，一类是化学合成法，另一类是生物酶法。化学法合成D-HPG又有三种，一是通过对甲氧基苯甲醛和氰化钠在水溶液或者醇溶液里面，经过环合，加压碱水解和脱甲基，得到混旋的DL-HPG；二是乙醛酸与苯酚反应生成对羟基α-羟基苯乙酸，再在酸性或碱性情况下于50～70℃反应，接缩合成DL-对羟基苯海因，再水解生成DL-HPG；三是以乙醛酸水溶液、苯酚和铵盐为原料，采用一步法合成DL-HPG。但所有的化学方法合成的产物均为混旋的DL-HPG，后面都要通过化学拆分剂如溴代樟脑磺酸、邻甲基苯磺酸、磺基水扬酸、苯基乙磺酸等进行手性拆分才能得到D-HPG。化学合成法存在消旋体手性拆分剂价格较高，反应总收率不高，而且能耗高的问题，不符合当下绿色制造的理念。

生物酶法是当前国内外研究比较多的拆分方法，生物酶法具有光学活性单一、能源消耗少、“三废”污染小等优点。例如以DL-对羟基苯海因为原料，在D-海因酶和氨甲酰水解酶双酶作用下催化生成D-HPG。首先，D-海因酶能选择性地将外消旋DL-对羟基苯海因中D型水解为N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)，残留L-对羟基苯海因在中性或碱性条件下，会迅速自发地消旋为DL-对羟基苯海因，消旋的DL-对羟基苯海因最终接近于完全转化为D-HPG，这样省去了先合成外消旋混合物再拆分的繁琐步骤，可直接得到期望产物。近年来，双酶法制备D-氨基酸由于经济、环境友好及底物范围广等优点具有潜在的应用价值而备受关注。

专利CN201510457039.0公开了采用从海洋链霉菌(Streptomyces sp.7-145(CGMCCNO.7914))来源的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶(DCase)及其突变体可用于将NC-D-HPG水解为D-HPG。

发明内容

我们在对现有技术报道的氨甲酰水解酶/DCase进行实验测试时发现，这些酶在催化底物NC-D-HPG水解反应时，要么存在底物或产物抑制性，要么热稳定性较差，一般在40℃以上反应温度下容易失活，难以长时间保持酶活力。例如，CN201510457039.0公开的DCase及其突变体在底物NC-D-HPG初始浓度达到5％后酶活力就趋于明显下降，反应体系中添加再多量的酶也难以使反应速度相应地提高，提示存在底物或产物D-HPG抑制性。

氨甲酰水解酶催化底物NC-D-HPG水解的反应速度一般都不太快，基本都需要较长时间。然而该反应过程中很容易遭到氧化破坏，导致副产物产生，严重影响产品收率和质量，因此理想的反应过程是反应速度尽可能高，例如采用较高反应温度，同时避免高温导致酶的变性失活，又要避免氧气存在。

该反应特点要求使用的氨甲酰水解酶没有底物/产物抑制性、或者抑制性很低，具有较高的热稳定性，对氧气不敏感，尽可能高的酶活力，较高的立体选择性。为寻找符合这些要求的酶，发明人对于众多文献中报道的氨甲酰水解酶/Dcase或它们的同工酶进行了比较和筛选，最终发现Hirokazu NANBA等在文献(Hirokazu NANBA,Yasuhiro IKENAKA,etal.,Isolation of Agrobacterium sp.Strain KNK712 That Produces N-Carbamyl-D-Amino Acid Amido hydrolase,Cloning of the Gene for this Enzyme,and Propertiesof the Enzyme.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,Volume 62,Issue 5,1January 1998.DOI:10.1271/bbb.62.875.)中报道的农杆菌(Agrobacterium sp.StrainKNK712)来源的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(akDCase，SEQ ID NO:1)在用于催化NC-D-HPG水解方面表现出优秀的底物和产物耐受力，耐氧化环境，并且具有高度的立体选择性，因此发明人将其作为氨甲酰水解酶来进行重点研究。

为了提高初始氨甲酰水解酶akDCase的热稳定性和酶活力，我们通过突变方式进行结构改造，经过大量的筛选，得到了几个综合性能优良的突变体，不仅热稳定性好，而且几乎没有底物/产物抑制性，有潜力应用于D-对羟基苯甘氨酸的酶法生产。具体而言，本发明包含如下技术方案：

一种氨甲酰水解酶突变体，其为选自下述的多肽：

(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；

(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有85％以上、优选90％以上、优选95％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且在45℃以上反应环境中的酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。

MTRQMILAVGQQGPIARAETREQVVVRLLDMLTKAASRGANFIVFPELALTTFFPRWYFTDEAELDSFYETEMPGPVVRPLFEKAAELGIGFNLGYAELVVEGGVKRRFNTSILVDKSGKIVGKYRKIHLPGHKETEAYRDFQHLEKRVFEPGDLGFPVYDVDAAKMGMFICNDRRWPEAWRVMGLRGAEIICGGYNTPTHNPEVPQHDHLTSFHHLLSMQAGSYQNGAWSAAAGKAGMEENCMLLGHSCIVAPTGEIVALTTTLEDEVITAAVDLDRCRELREHIFNFKQHRQPQHYGLIAEL(SEQ ID NO:3)。

本文中，氨基酸序列为SEQ ID NO:3的氨甲酰水解酶突变体编号为2-C4，其为初始型氨甲酰水解酶SEQ ID NO:1中第136位的酪氨酸(Y)替换为苏氨酸(T)、第141位的脯氨酸(P)替换为天冬氨酸(D)、第149位的酪氨酸(Y)替换为缬氨酸(V)的突变体。

上述酶活力是指催化N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)水解为D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)时的酶活力。

本发明的另一方面还提供了编码上述氨甲酰水解酶突变体的基因。

例如，编码氨甲酰水解酶突变体SEQ ID NO:3的基因可以是核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:4有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。

本发明还提供了包含上述编码基因的质粒。例如，上述质粒可以是pET载体例如pET22b、pET24a、pET28a，也可以是pSH质粒等其他常用载体。

本发明的另一方面提供了一种用于表达上述氨甲酰水解酶突变体比如SEQ IDNO:3的微生物，其基因组中整合了上述的编码基因比如SEQ ID NO:4，或者是转化了上述质粒的微生物。

上述质粒的转化可以通过常规的化学转化法或者电转化方法转入细胞感受态中。上述基因编辑技术例如选自下组：同源双交换，TALEN系统，CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cpf1系统，CRISPR-Cas12系统，CRISPR-BEST系统，MuGENT(multiplex genome editing bynatural transformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)等。

优选地，上述微生物是增殖速度快、适合于表达外源重组蛋白的微生物，例如选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、大肠杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母。优选微生物是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌BL21(DE3)。

上述氨甲酰水解酶突变体或者上述微生物可以用于生产D-对羟基苯甘氨酸。例如，以N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)为反应底物，采用上述氨甲酰水解酶突变体或者上述微生物催化水解反应，得到D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。

可选地，上述催化反应在含有β-巯基乙醇的缓冲溶液反应体系中进行。

在一种实施方式中，反应体系中充入惰性气体比如氮气或氩气保护，以免氧气存在影响反应。

优选地，上述缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液。

上述水解反应温度可以为35-60℃、优选38-55℃、优选39-52℃、优选40-50℃，优选45℃左右。反应pH值可以为6.5-8.5、优选pH 6.8-8.0、更优选pH 7.0-7.5。

可选地，上述氨甲酰水解酶突变体或者其表达微生物与D-海因酶组成双酶体系，联合催化底物DL-对羟基苯海因反应生成D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。

本发明通过突变筛选的氨甲酰水解酶突变体在催化底物NC-D-HPG水解生成D-HPG时，底物浓度能够达到至少10wt％以上，几乎没有底物/产物抑制性，而且具有较高的热稳定性，能够在45℃以上的反应体系中长时间催化而不失活，得到高光学纯度的产物D-HPG，提高了D-HPG的生成效率，展示出良好的工业化开发和应用前景。

附图说明

图1是构建的用于表达初始型氨甲酰水解酶akDCase的质粒pET28a-akDCase的图谱。

具体实施方式

本发明中述及的氨甲酰水解酶及其突变体都是具有立体选择性的酶，即将D-型底物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解为仍是D-型的D-对羟基苯甘氨酸，因此氨甲酰水解酶(突变体)也可称为D-氨甲酰水解酶(突变体)。

氨基酸序列为SEQ ID NO:1的农杆菌Agrobacterium sp.Strain KNK712来源的初始型D-氨甲酰水解酶akDCase是本发明的改进起点，发明人通过对其进行突变，筛选出了一些酶活力显著提高的突变体。

MTRQMILAVGQQGPIARAETREQVVVRLLDMLTKAASRGANFIVFPELALTTFFPRWYFTDEAELDSFYETEMPGPVVRPLFEKAAELGIGFNLGYAELVVEGGVKRRFNTSILVDKSGKIVGKYRKIHLPGHKEYEAYRPFQHLEKRYFEPGDLGFPVYDVDAAKMGMFICNDRRWPEAWRVMGLRGAEIICGGYNTPTHNPEVPQHDHLTSFHHLLSMQAGSYQNGAWSAAAGKAGMEENCMLLGHSCIVAPTGEIVALTTTLEDEVITAAVDLDRCRELREHIFNFKQHRQPQHYGLIAEL(SEQ ID NO:1)。

在本文中，术语“初始(型)”、“初始酶”、“初始型酶”表示相同的意义，都是指初始型的氨甲酰水解酶akDCase。有时为了表述方便起见，在本文中可以将初始酶与其突变体比如SEQ ID NO:3等统称为“氨甲酰水解酶”或“D-氨甲酰水解酶”。

本文中，上述所用术语“(酶活力)提高”或“增加”表示相较于参考水平提高至少100％，例如相较于参考水平的至少约1倍、至少约2倍、或至少约3倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约20倍的提高。

所述的“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。示例性的保守取代例如可以根据下表来进行，其中在第二列中属于同一个分区的氨基酸可以相互取代，在优选的情况下第三列中同一行的氨基酸可互相取代：

“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。

“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％，同时保留酶活性和/或保留工程化醛缩酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。

“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化醛缩酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的醛缩酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的醛缩酶多肽中。插入可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。

为了进行定点突变，可以基于生物信息学技术对氨甲酰水解酶进行立体模型构建(建模)，推断其酶催化活性中心、底物/产物进出通道、刚性/柔性结构区域等，选定可能的结构影响位点并尝试饱和突变。

对于初始氨甲酰水解酶akDCase，我们选定SEQ ID NO:1蛋白结构中表面转角区域的6个关键氨基酸位点F59、Y136、P141、Y149、H201、H285进行单点饱和突变并构建单点突变体库。从单点突变体库中筛选出酶活力提高、热稳定性提高(例如在45℃的0.1M磷酸盐缓冲液pH7.5中12小时内酶活力基本不降低)的突变体，发现其中F59L、Y136T、P141D、Y149V、H201T五个突变的活力较高。以此为基础进行多位点的组合突变并构建组合突变体库，筛选出酶活力进一步提高、热稳定性提高(例如在45℃的0.1M磷酸盐缓冲液pH7.5中12小时内酶活力基本不降低)的突变体，其中发现突变酶SEQ ID NO:3具有多方面的优点，还保持了初始酶akDCase的无底物/产物抑制特性和较高立体选择性，适合于本发明的较高温度的水解反应体系。

研究发现，该D-氨甲酰水解酶的活性中心存在L-半胱氨酸，加入还原剂例如β-巯基乙醇有助于提高酶活性中心结构的热稳定性，起到保护酶的作用。

另一方面，本领域技术人员可以预期的是，突变酶SEQ ID NO:3还可以与现有的D-海因酶组成双酶体系，联合催化底物DL-对羟基苯海因反应生成D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)，实现以DL-对羟基苯海因为原料的双酶法制备D-HPG。

本发明的氨甲酰水解酶突变体SEQ ID NO:3的氨基酸数量有304个，结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达氨甲酰水解酶突变体，可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

例如，为了在大肠杆菌中表达氨甲酰水解酶突变体，经密码子优化的初始氨甲酰水解酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ ID NO:2；氨甲酰水解酶突变体SEQ IDNO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。

上述转化体宿主可以是任何适合表达氨甲酰水解酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

当作为生物催化剂用于生产D-对羟基苯甘氨酸时，本发明的氨甲酰水解酶突变体可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体、死亡菌体、固定化菌体等。

当微生物比如枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

底物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸和产物D-对羟基苯甘氨酸的HPLC检测条件：Agilent1260，waters Symmetry-C18(250×4.6mm，5um)，流动相：0.05M醋酸钠-醋酸(PH4.2)：甲醇(90:10)，1.0ml/min，254nm，20ul，柱温30℃。

需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。

实施例1：初始氨甲酰水解酶表达重组大肠杆菌的构建

根据文献(Hirokazu NANBA,Yasuhiro IKENAKA,et al..Biotechnology,andBiochemistry,Volume 62,Issue 5,1January 1998.DOI:10.1271/bbb.62.875.)公布的Agrobacterium sp.KNK 712来源的D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列即SEQ ID NO:1，进行大肠杆菌偏好性的密码子优化，全基因合成其编码基因序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET28a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET28a-akDCase，其结构如1所示。

电转法将重组质粒pET28a-akDCase转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到表达初始D-氨甲酰水解酶的重组大肠杆菌akDCase。

实施例2：单点饱和突变库建立及筛选

根据氨甲酰水解酶SEQ ID NO:1的蛋白质结构模型，选定蛋白结构中表面转角区域的6个氨基酸位点F59、Y136、P141、Y149、H201、H285进行单点饱和突变。

2.1饱和突变点库建立

以初始酶的编码基因SEQ ID NO:2为模板，分别以简并密码子引物对F59-F/F59-R、Y136-F/Y136-R、P141-F/P141-R、Y149-F/Y149-R、H201-F/H201-R、H285-F/H285-R进行扩增的方式获得F59、Y136、P141、Y149、H201、H285共计6个位点的单点饱和突变体库，引物序列见表1。

表1、饱和突变库引物列表

引物名称	序列(5’→3’)
		F59-F	CTTCTTCCCGCGTTGGTACNNKACCGACGAAGCTGAAC
F59-R	GTTCAGCTTCGTCGGTMNNGTACCAACGCGGGAAGAAG
		Y136-F	CTGCCGGGTCACAAAGAANNKGAAGCTTACCGTCCGTTC
Y136-R	GAACGGACGGTAAGCTTCMNNTTCTTTGTGACCCGGCAG
		P141-F	GAATACGAAGCTTACCGTNNKTTCCAGCACCTGGAAAAAC
P141-R	GTTTTTCCAGGTGCTGGAAMNNACGGTAAGCTTCGTATTC
		Y149-F	CAGCACCTGGAAAAACGTNNKTTCGAACCGGGTGACCTG
Y149-R	CAGGTCACCCGGTTCGAAMNNACGTTTTTCCAGGTGCTG
		H201-F	GTTACAACACCCCGACCNNKAACCCGGAGGTTCCGCAG
H201-R	CTGCGGAACCTCCGGGTTMNNGGTCGGGGTGTTGTAAC
		H285-F	GCCGTGAACTGCGTGAANNKATCTTCAACTTCAAACAG
H285-R	CTGTTTGAAGTTGAAGATMNNTTCACGCAGTTCACGGC

其中M＝A/C，K＝G/T，N＝A/G/C/T。

50μL PCR反应体系包括：10ng质粒模板，10pmol的引物对，1xKOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

PCR反应条件为：95℃3min；98℃10s，57℃30s，68℃2min/kbp；30个循环；68℃10min。

扩增的PCR产物中加入1μL DpnI消化1小时，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态，得到超过10³个克隆的随机突变库。

2.2突变体库的高通量筛选

每个单点饱和突变库各随机挑选160个转化子接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，培养过夜，然后取80μl过夜培养物，转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。过夜培养液体4000rpm离心15min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL含1mg/ml溶菌酶、10mg/ml DNase和0.1％(v/v)β-巯基乙醇的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，重悬菌体，37℃孵育1h，4℃，5000rpm离心20min，取20μl上清进行未热处理样品的酶活力测定，另外取20μl在65℃下孵育30min后用于酶活力测定。

分别进行上述两种处理方式获得的样品的筛选反应，反应体系如下：上述20μL不同处理液加入180μL底物反应液(20mM的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1％(v/v)β-巯基乙醇，0.01％酚红，pH5.8-6.0)，在45℃的条件下反应1-3小时，检测558nm下的吸光度变化。

酶活力定义：在45℃下每分钟催化底物水解生成1微摩尔(μmol)氨所需要的酶量定义为1个单位(U)。

对6个单点饱和突变库分别进行突变体克隆筛选，选取未热处理样品和热处理样品酶活均有明显的增强的菌株，提取质粒，并委托苏州金唯智公司进行核酸测序，将基因组中氨甲酰水解酶相关片段与SEQ ID NO:1进行比对，确定氨甲酰水解酶的氨基酸序列改变情况。筛选发现akDCase-F59L、akDCase-Y136T、akDCase-P141D、akDCase-Y149V、akDCase-H201T突变菌株相对出发菌akDCase未热处理样品和热处理样品酶活均有明显的增强，具体结果见表2。

表2、突变菌相对比活结果

实施例3：组合突变库建立及筛选

3.1组合突变库建立

以包含初始酶编码基因SEQ ID NO:2的质粒pET28a-akDCase为模板，分别以两个引物对F59-F0/Y136-P141-R0、Y149-F0/H201-R0进行扩增，扩增出两个片段A和B,然后再以A和B片段为模板，以F59-F0/H201-R0为引物对进行扩增，获得大片段AB，最终以AB作为引物，pET28a-akDCase为模板进行mega-primer PCR扩增，获得5个位点的组合突变库。其中F59-F0、Y136-P141-R0、Y149-F0、H201-R0四条引物均是由两条不同引物等比例混合获得，引物混合制备表格为如下表3。

表3、组合突变库引物列表

其中S＝G/C，K＝G/T。

50μl PCR反应体系包括：10ng质粒模板，40pmol的引物对，1xKOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

PCR反应条件为：95℃1min；98℃10s，57℃30s，68℃1min/kbp；30个循环；68℃10min。胶回收两个片段A和B，片段A大小288bp，片段B大小198bp。

以片段A、B为模板，以F59-F0和H201-R0为引物进行第二轮PCR，获得片段AB，大小466bp，切胶回收；

PCR反应条件为：95℃3min；98℃10s，60℃30s，68℃1min/kbp；25个循环；68℃10min。

以片段AB作为大引物，以pET28a-akDCase为模板，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，98℃30s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。

扩增的PCR产物中加入1μL DpnI消化1小时，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态，得到超过10³个克隆的随机突变库。

3.2突变体库的高通量筛选

方法同实施例2中步骤2.2，通过对160个突变体克隆筛选，筛选出一株菌株2-C4，相较出发菌株akDCase，其在未热处理和热处理条件下的酶活均有明显增强，即酶活力及热稳定性均有明显提升。通过基因测序、比对，确定该菌株的氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第136位氨基酸由酪氨酸突变成苏氨酸、第141位氨基酸由脯氨酸突变成天冬氨酸、第149位氨基酸由酪氨酸突变成缬氨酸。

实施例4：菌株催化生产D-对羟基苯甘氨酸的对比

4.1菌体发酵

分别从akDCase和2-C4的LB培养平板上挑取单菌落，分别接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2mL过夜培养物接种至200mL TB培养基中，于37℃，250rpm培养2-3h，至OD₆₀₀ 0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG，于28℃，200rpm培养过夜。然后于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体，然后用0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.5)重悬至菌浓10％，进行超声破碎后(超声破碎条件：55％能量，工作2s，间歇5s，工作20min)。

4.2酶活力测定

配制含3.5％底物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸、0.1％v/vβ-巯基乙醇的0.1M磷酸盐缓冲液pH7.5，加入终浓度1.5v/v％的菌体超声破碎混液，与40℃，170rpm摇床中反应30min，然后取出0.5ml反应混液，加入0.5ml 10％盐酸终止反应，过滤后HPLC检测底物及产物含量。

4.3热稳定性测定

10wt％菌浓的超声菌体破碎混液在65℃下保温30min，然后取处理后的破碎菌悬液进行活力测定，测定过程同步骤4.2。

相比初始菌种akDCase(初始酶SEQ ID NO:1)，本发明筛选的突变菌株的D-氨甲酰水解酶突变体2-C4(SEQ ID NO:3)的酶活力提高了3.56倍，65℃热处理后的酶活力提高了8.12倍。

实施例5：突变体生产D-对羟基苯甘氨酸的应用

配制含10％底物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸、0.1％v/vβ-巯基乙醇的0.1M磷酸盐缓冲液pH7.5，加入终浓度3.5v/v％的菌体超声破碎混液，全程通入氮气保护，用3M磷酸和2M氢氧化钠溶液控制pH7.0-7.5，45℃反应20-24h。通过HPLC检测反应样品，结果显示，在反应20个小时后，反应体系中D-对羟基苯甘氨酸的生成率超过97％。

实验结果表明，相比初始D-氨甲酰水解酶akDCase，本发明构建的D-氨甲酰水解酶突变体SEQ ID NO:3催化N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸反应生成D-对羟基苯甘氨酸的酶活力和热稳定性都有了显著提高，能够在45℃以上的反应体系中长时间催化而不失活，反应中没有底物/产物抑制性，底物浓度能够达到至少10wt％以上，具有工业化开发和应用潜力。

Claims (10)

1.一种氨甲酰水解酶突变体，其为选自下述的多肽：

(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；

(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上同源性、且在45℃以上反应环境中的酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。

2.如权利要求1所述的氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述酶活力是指催化N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解为D-对羟基苯甘氨酸的酶活力。

3.编码如权利要求1或2所述氨甲酰水解酶突变体的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码氨甲酰水解酶突变体SEQ IDNO:3的基因是核苷酸序列为SEQ ID NO:4的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:4有90％以上同源性的多核苷酸。

5.包含如权利要求4所述基因的质粒。

6.一种用于表达如权利要求1或2所述氨甲酰水解酶突变体的微生物，其特征在于，基因组中整合了如权利要求4所述的基因，或者转化了如权利要求5所述质粒的微生物。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。

8.如权利要求1所述氨甲酰水解酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产D-对羟基苯甘氨酸中的用途。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，在含有β-巯基乙醇的反应体系中，以N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸为反应底物，采用如权利要求1所述的氨甲酰水解酶突变体或者如权利要求6所述的微生物催化水解反应，得到D-对羟基苯甘氨酸。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，如权利要求1所述氨甲酰水解酶突变体或者如权利要求6所述微生物与D-海因酶组成双酶体系，联合催化底物DL-对羟基苯海因生成D-对羟基苯甘氨酸。

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