CN113717997B - 一种酶组合物及化学酶法合成玻色因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种化学酶法合成玻色因的方法，包括：S1）将乙酰丙酮或乙酰乙酸酯类化合物、木糖与碱性物质在溶剂中混合加热反应，得到第一中间产物；S2）将所述第一中间产物、脱氢酶、辅酶、还原剂与异丙醇在磷酸缓冲液中混合，反应，得到玻色因。与现有技术相比，本发明使用化学‑酶法，发挥了化学合成和酶催化各自的长处，不但立体专一性地还原得到玻色因，还避免使用污染、危险的化合试剂，大大提高了玻色因生产制造过程的绿色化，同时使得产品分离提纯简单高效，克服了现有路线立体选择性低、工艺难以放大生产、危废多等缺点，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于有机合成技术领域，尤其涉及一种酶组合物及化学酶法合成玻色因的方法。
背景技术
玻色因是由欧莱雅历时多年发现的一种具有美容抗皱作用的木糖衍生物，其由木糖转换生成，具有广泛的生物活性。研究表明它可通过促进细胞间粘多糖的形成，从而重建细胞结构，增强真皮层和表皮层的连接性，提高真皮层和表皮层的结合能力，进而达到美容抗皱的效果。
2002年，欧莱雅公司的一篇国际专利号为WO02/051828Al名称为Nouveaux dérivés C-glycosides et utilization(新型碳糖酐及其应用)的专利获得授权，该专利首次批露了玻色因的原研制备方法，其合成路线如下所示：
该方法以D-木糖为原料、碳酸氢钠作为碱，水为溶剂，在90℃条件下搅拌反应6小时，乙酰丙酮与木糖缩合、环化再裂解，较高产率获得β-丙酮木糖苷；随后以甲醇为溶剂，用硼氢化钠还原β-丙酮木糖苷的酮羰基，高产率的得到四羟基化合物β-丙酮木糖苷醇，即玻色因。但该方法存在还原选择性低，使用硼氢化钠造成污染，且产物难以提纯等缺点。
现有玻色因的合成路线大部分为两步反应。第一步从D-木糖制备木糖苷2，该步转化比较顺利。难点在于第二步，即木糖苷的选择性还原。第一，用化学还原酮羰基立体选择性较差，得到一对非对映异构体，分离十分困难。第二，现有路线往往需要使用硼氢化钠、锂铝氢、催化氢化等危险试剂和工艺，引入大量污染物质。第三，同时这些试剂产生的副产物使得产品的分离纯化非常困难，比如上述路线使用硼氢化钠作为还原剂还原β-丙酮木糖苷2中的酮羰基，副产物为大量的硼酸，而硼酸极易与多羟基的玻色因铰链，需采用柱层析提纯，不易量产。
公开号为CN111876452A的中国专利公开了一种利用生物酶一锅法制备玻色因的方法，但该方法使用了异丙醇脱氢酶、玻色因合成酶、羰基还原酶等身份不明的酶，难以采信。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种酶组合物及化学酶法合成玻色因的方法，该方法不但立体专一性地还原生成了玻色因，还避免了使用污染、危险的化学试剂，同时使得产品分离提纯简单高效。
本发明提供了一种化学酶法合成玻色因的方法，包括：
S1)将乙酰丙酮或乙酰乙酸酯类化合物、木糖与碱性物质在溶剂中混合加热反应，得到第一中间产物；
S2)将所述第一中间产物、脱氢酶、辅酶、还原剂与异丙醇在磷酸缓冲液中混合，反应，得到玻色因；
所述脱氢酶包括酶A与酶B；
所述酶A为山梨醇脱氢酶或脱氢酶RDH；
所述脱氢酶RDH包括野生型RDH和/或RDH突变体；
所述野生型RDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述RDH突变体包括如下突变位点中的至少一个：
E6S、V218K、D106M、L209W、V233F、D193Q、G95L与L209F；
所述酶B为PTDH。
优选的，所述乙酰乙酸酯类化合物选自乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸丙酯、乙酰乙酸异丙酯、乙酰乙酸丁酯、乙酰乙酸异丁酯与乙酰乙酸叔丁酯中的一种或多种；
所述碱性物质选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂、氢氧化钠、氢氧化钾与氢氧化锂中的一种或多种；
所述乙酰丙酮或乙酰乙酸酯类化合物与木糖的摩尔比为(1～1.2)：1；
所述碱性物质与木糖的摩尔比为(1.2～2)：1；
所述S1)中加热反应的温度为70℃～90℃；所述加热反应的时间为10～16h；
加热反应后，将反应溶液的pH值调节至中性，除去溶剂，得到第一中间产物。
优选的，所述RDH突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2～8任一项所示；
所述山梨醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
优选的，所述辅酶选自β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐；所述还原剂选自亚磷酸钠；所述辅酶与第一中间产物的摩尔比为1：(500～1000)；所述还原剂与第一中间产物的摩尔比为1：(0.8～1.5)；所述异丙醇与第一中间产物的比例为(0.5～1.5)mL：1g；
以室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量为U，所述酶A的用量为1000～10000U；所述酶B的用量为2000～20000U。
优选的，所述S2)具体为：
将第一中间产物、辅酶、还原剂与异丙醇在磷酸缓冲液中混合，得到底液；
在底液中加入脱氢酶混合，反应，得到玻色因。
优选的，所述反应的温度为25℃～40℃；所述反应的时间为4～8h；反应后，离心，上清液纳滤除盐后，除去水分，得到玻色因。
本发明还提供了一种酶组合物，包括酶A与酶B；
所述酶A为山梨醇脱氢酶或脱氢酶RDH；
所述脱氢酶RDH包括野生型RDH和/或RDH突变体；
所述野生型RDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述RDH突变体包括如下突变位点中的至少一个：
E6S、V218K、D106M、L209W、V233F、D193Q、G95L与L209F；
所述酶B为PTDH。
本发明还提供了一种RDH突变体，其野生型RDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述RDH突变体包括如下突变位点中的至少一个：
E6S、V218K、D106M、L209W、V233F、D193Q、G95L与L209F。
本发明还提供了编码上述RDH突变体的核酸。
优选的，其序列如SEQ ID NO：11～17任一项所示。
本发明提供了一种化学酶法合成玻色因的方法，包括：S1)将乙酰丙酮或乙酰乙酸酯类化合物、木糖与碱性物质在溶剂中混合加热反应，得到第一中间产物；S2)将所述第一中间产物、脱氢酶、辅酶、还原剂与异丙醇在磷酸缓冲液中混合，反应，得到玻色因；所述脱氢酶包括酶A与酶B；所述酶A为山梨醇脱氢酶或脱氢酶RDH；所述脱氢酶RDH包括野生型RDH与突变体RDH；所述野生型RDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述突变体RDH包括如下突变位点中的至少一个：E6S、V218K、D106M、L209W、V233F、D193Q、G95L与L209F；所述酶B为PTDH。与现有技术相比，本发明使用化学-酶法，发挥了化学合成和酶催化各自的长处，不但立体专一性地还原得到玻色因，还避免使用污染、危险的化合试剂，大大提高了玻色因生产制造过程的绿色化，同时使得产品分离提纯简单高效，克服了现有路线立体选择性低、工艺难以放大生产、危废多等缺点，降低了生产成本。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种RDH突变体，其野生型RDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述RDH突变体包括如下突变位点中的至少一个：E6S、V218K、D106M、L209W、V233F、D193Q、G95L与L209F。
优选地，所述RDH突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2～8任一项所示。
本发明还提供了一种编码上述RDH突变体的核酸。
优选地，所述编码上述RDH突变体的核酸序列如SEQ ID NO：11～17任一项所示。
在本发明中所述酶合成的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中所用的酶均是合成相应基因后构建在特定的表达质粒上，再通过大肠杆菌发酵生产制得；其具体包含以下步骤：将以上酶所对应的基因进行序列优化后在下单到通用生物公司合成(安徽滁州)，再引进NdeI/XhoI酶切位点并亚克隆到pET 28a表达载体上。确认序列正确的质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。其具体包含单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD～20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm，20min)获得酶过量表达湿细胞30～65g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM，pH 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与Tris.HCl缓冲液(50mM,pH 8.0)在低温混合均匀(以～10克湿细胞：200ml缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm，45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在100～220U/ml，U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
本发明还提供了一种酶组合物，包括酶A与酶B；所述酶A为山梨醇脱氢酶或脱氢酶RDH；所述脱氢酶RDH包括野生型RDH和/或RDH突变体；所述野生型RDH的氨基酸序列如SEQID NO：1所示；所述RDH突变体包括如下突变位点中的至少一个：E6S、V218K、D106M、L209W、V233F、D193Q、G95L与L209F；所述酶B为PTDH。
其中，所述RDH突变体同上所述，在此不再赘述。
优选地，编码野生型RDH的核酸序列如SEQ ID NO：10所示。
所述山梨醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；编码山梨醇脱氢酶的核酸序列如SEQ ID NO：18所示。
所述PTDH是施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)体内一个亚磷酸脱氢酶改造而来的(Uniprot ID:O69054,EC 1.20.1.1)，其氨基酸序列可见公开号为CN113234698A的中国专利。
在本发明中，所述酶A与酶B的酶活力的比值优选为1：(1～2)，更优选为1：(1.2～1.8)，再优选为1：(1.4～1.6)，最优选为1：1.5。
本发明还提供了一种化学酶法合成玻色因的方法，包括：S1)将乙酰丙酮或乙酰乙酸酯类化合物、木糖与碱性物质在溶剂中混合加热反应，得到第一中间产物；S2)将所述第一中间产物、脱氢酶、辅酶、还原剂与异丙醇在磷酸缓冲液中混合，反应，得到玻色因；所述脱氢酶包括酶A与酶B；所述酶A为山梨醇脱氢酶或脱氢酶RDH；所述脱氢酶RDH包括野生型RDH和/或RDH突变体；所述野生型RDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述RDH突变体包括如下突变位点中的至少一个：E6S、V218K、D106M、L209W、V233F、D193Q、G95L与L209F；所述酶B为PTDH。
以原料为乙酰丙酮、碱性物质为氢氧化钠为例，本发明合成路线如下所示：
其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可；所述酶A与酶B均同上所述，在此不再赘述。
将乙酰丙酮或乙酰乙酸酯类化合物、木糖与碱性物质在溶剂中混合加热反应；所述乙酰乙酸酯类化合物优选为乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸丙酯、乙酰乙酸异丙酯、乙酰乙酸丁酯、乙酰乙酸异丁酯与乙酰乙酸叔丁酯中的一种或多种；所述木糖优选为D-木糖；所述碱性物质优选为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂、氢氧化钠、氢氧化钾与氢氧化锂中的一种或多种；所述乙酰丙酮或乙酰乙酸酯类化合物与木糖的摩尔比优选为(1～1.2)：1；所述碱性物质与木糖的摩尔比优选为(1.2～2)：1，更优选为(1.4～1.8)：1，再优选为1.5：1；所述溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为醇溶剂，更优选为甲醇；混合后反应体系中木糖的浓度优选为1～2mol/L，更优选为1.2～1.6mol/L，再优选为1.3～1.5mol/L；所述加热反应的温度优选为70℃～90℃，更优选为75℃～85℃，再优选为80℃；所述加热反应的时间优选为10～16h，更优选为12～14h。
加热反应结束后，优选将反应溶液的pH值调节至中性，除去溶剂，得到第一中间产物；在本发明中优选采用盐酸调节反应溶液的pH值；所述盐酸的浓度优选为3～5mol/L，更优选为4mol/L；除去溶剂的方法优选为旋蒸；除去溶剂无需进行纯化得到的第一中间产物即可用于下一步骤。
将所述第一中间产物、脱氢酶、辅酶、还原剂与异丙醇在磷酸缓冲液中混合；在本发明中优选先将第一中间产物、辅酶、还原剂与异丙醇在磷酸缓冲液中混合，得到底液；在底液中加入脱氢酶混合；所述辅酶选自β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐；所述辅酶与第一中间产物的摩尔比优选为1：(500～1000)，更优选为1：(500～800)，再优选为1：(600～700)，最优选为1：650；所述还原剂优选亚磷酸钠；所述还原剂与第一中间产物的摩尔比优选为1：(0.8～1.5)，更优选为1：(1～1.3)，再优选为1：(1～1.1)；所述异丙醇与第一中间产物的比例优选为(0.5～1.5)mL：1g，更优选为(0.8～1.2)mL：1g，再优选为1mL：1g；所述磷酸缓冲液的pH值优选为7～8，更优选为7.2～7.6，再优选为7.4；所述磷酸缓冲液的浓度优选为20～80mmol/L，更优选为40～60mmol/L，再优选为50mmol/L；所述磷酸缓冲液与第一中间产物的比例优选为1L：(10～100)g，更优选为1L：(30～80)g，再优选为1L：(40～60)g，最优选为1L：50g；所述脱氢酶优选在底液温度为25℃～40℃，更优选30℃～40℃的条件下加入；以室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量为U，所述酶A的用量优选为1000～10000U，更优选为2000～8000U，再优选为4000～6000U；所述酶B的用量优选为2000～20000U，更优选为4000～16000U，再优选为6000～8000U。
混合后，反应；所述反应优选在缓慢搅拌的条件下进行；所述反应的温度优选为25℃～40℃，更优选为30℃～40℃，再优选为30℃～35℃；所述反应的时间优选为4～8h，更优选为5～7h，再优选为6h。
反应后，离心，上清液纳滤除盐后，除去水分，得到玻色因。
本发明使用化学-酶法，发挥了化学合成和酶催化各自的长处，不但立体专一性地还原得到玻色因，还避免使用污染、危险的化合试剂，大大提高了玻色因生产制造过程的绿色化，同时使得产品分离提纯简单高效，克服了现有路线立体选择性低、工艺难以放大生产、危废多等缺点，降低了生产成本。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种酶组合物及化学酶法合成玻色因的方法进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
山梨醇脱氢酶(SDH)：来源于动物肝脏(EC 1.1.1.14)；
脱氢酶RDH：来自于大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum USDA 110(EC1.1.1.15)。
脱氢酶RDHE6S、RDHV218K、RDHD106M/L209W、RDHV233F等来自于对脱氢酶RDH的基因改造和发酵生产。
PTDH是施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)体内一个亚磷酸脱氢酶改造而来的(Uniprot ID:O69054,EC 1.20.1.1)。
酶的发酵生产：
本发明所需的酶都是通过公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得；其具体包含以下步骤：将以上酶所对应的基因进行序列优化后在下单到通用生物公司合成(安徽滁州)，再引进NdeI/XhoI酶切位点并亚克隆到pET 28a表达载体上。确认序列正确的质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。其具体包含单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD～20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm，20min)获得酶过量表达湿细胞30～65g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM，pH 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与Tris.HCl缓冲液(50mM,pH8.0)在低温混合均匀(以～10克湿细胞：200ml缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm，45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在100～220U/ml，U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
实施例1：β-丙酮木糖苷2的制备。
在500ml的反应瓶中依次加入甲醇150ml、碳酸钠31.8克(0.3mol)、木糖30克(0.2mol)，乙酰丙酮26克(0.24mol)，80摄氏度下反应12小时后，用4N HCl调节PH到7，旋干得到β-丙酮木糖苷2粗品。MS(ESI):m/z：191.14[M+H]+。
实施例2：SDH催化还原β-丙酮木糖苷2制备玻色因
在1L 50mM pH7.4的磷酸钠缓冲溶液中先后加入50克实施例1中得到的β-丙酮木糖苷2粗品，3.0克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM)，52克五水亚磷酸钠(240mM)以及50ml异丙醇。恒温30～40℃加入粗液(4000U SDH和6000UPTDH)，30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后，离心，上清液纳滤除盐，减压蒸除水分，得到产品45克，MS(ESI):m/z：193.01[M+H]+。
利用核磁共振对实施例2中得到的玻色因进行分析，得到结果1H NMR(400MHz,D2O)δ4.94–4.86(m,3H),4.25(d,J＝4.3Hz,1H),3.84–3.73(m,1H),3.67-3.63(m,1H),3.21-3.18(m,1H),3.13–2.87(m,3H),2.83-2.82(m,1H),1.77-1.73(m,1H),1.51-1.45(m,1H),1.01-1.00(d,J＝6.1Hz,3H)。
实施例3：野生型RDH酶催化还原β-丙酮木糖苷2制备玻色因
在1L 50mM pH7.4的磷酸钠缓冲溶液中先后加入50克实施例1中得到的β-丙酮木糖苷2粗品，3.0克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM)，52克五水亚磷酸钠(240mM)以及50ml异丙醇。恒温30～40℃加入粗液(4000U野生型RDH和6000UPTDH)，30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后，离心，上清液纳滤除盐，减压蒸除水分，纯化得35.1克玻色因，纯度98.2％，产率91.4％。
利用质谱对实施例3中得到的玻色因进行分析，得到结果MS(ESI):m/z：215.01[M+Na]+。
利用核磁共振对实施例3中得到的玻色因进行分析，得到结果1H NMR(400MHz,DMSO)δ4.92–4.83(m,3H),4.25(d,J＝4.3Hz,1H),3.85–3.71(m,1H),3.67-3.64(m,1H),3.23-3.19(m,1H),3.08–2.89(m,3H),2.86-2.80(m,1H),1.72-1.69(m,1H),1.48-1.43(m,1H),1.05-1.01(d,J＝6.1Hz,3H)。
实施例4：RDHE6S酶(SEQ ID NO：2)催化还原β-丙酮木糖苷2制备玻色因
在1L 50mM pH 7.4的磷酸钠缓冲溶液中先后加入50克上述β-丙酮木糖苷2粗品,3.0克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM)，52克五水亚磷酸钠(240mM)以及50ml异丙醇。恒温30～40℃加入粗液(4000U RDHE6S和6000U PTDH)，30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后，离心，上清液纳滤除盐，减压蒸除水分，纯化得34.7克产物，纯度98.5％，产率90.4％。MS(ESI):m/z：215.11[M+Na]+。
利用核磁共振对实施例4中得到的玻色因进行分析，得到结果1H NMR(400MHz,D2O)δ4.93–4.83(m,3H),4.25(d,J＝4.3Hz,1H),3.81–3.73(m,1H),3.67-3.63(m,1H),3.21-3.18(m,1H),3.13–2.90(m,3H),2.83-2.81(m,1H),1.77-1.73(m,1H),1.51-1.45(m,1H),1.01-1.00(d,J＝6.1Hz,3H)。
实施例5：RDHV218K酶(SEQ ID NO：3)催化还原β-丙酮木糖苷2制备玻色因
1L 50mM pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入50克上述β-丙酮木糖苷2粗品，3.0克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM)，52克五水亚磷酸钠(240mM)以及50ml异丙醇。恒温30～40℃加入粗液(4000U RDHV218K和6000U PTDH)，30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后，离心，上清液纳滤除盐，减压蒸除水分，纯化得35.5克产物，纯度98.9％，产率92.4％。MS(ESI):m/z：215.13[M+Na]+。
利用核磁共振对实施例5中得到的玻色因进行分析，得到结果1H NMR(400MHz,D2O)δ4.97–4.90(m,3H),4.30(d,J＝4.3Hz,1H),3.84–3.73(m,1H),3.67-3.63(m,1H),3.21-3.18(m,1H),3.13–2.87(m,3H),2.85-2.82(m,1H),1.75-1.70(m,1H),1.51-1.45(m,1H),1.03-1.01(d,J＝6.1Hz,3H)。
实施例6：RDHD106M/L209W酶(SEQ ID NO：4)催化还原β-丙酮木糖苷2制备玻色因
1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入50克上述β-丙酮木糖苷2粗品，3.0克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM)，52克五水亚磷酸钠(240mM)以及50ml异丙醇。恒温30～40℃加入粗酶液(4000URDHD106M/L209W和6000UPTDH)，30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后，离心，上清液纳滤除盐，减压蒸除水分，纯化得35.7克产物，纯度99.1％，产率93.0％。MS(ESI):m/z：193.07[M+H]+。
利用核磁共振对实施例6中得到的玻色因进行分析，得到结果1H NMR(400MHz,D2O)δ4.97–4.86(m,3H),4.25(d,J＝4.3Hz,1H),3.84–3.73(m,1H),3.67-3.63(m,1H),3.21-3.18(m,1H),3.13–2.87(m,3H),2.85-2.82(m,1H),1.77-1.73(m,1H),1.51-1.45(m,1H),1.01-1.00(d,J＝6.1Hz,3H)。
实施例7：RDHV233F酶(SEQ ID NO：5)催化还原β-丙酮木糖苷2制备玻色因
1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入50克上述β-丙酮木糖苷2粗品，3.0克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM)，52克五水亚磷酸钠(240mM)以及50ml异丙醇。恒温30～40℃加入粗酶液(4000U RDHV233F和6000U PTDH)，30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后，离心，上清液纳滤除盐，减压蒸除水分，纯化得35.9克产物，纯度98.9％，产率93.4％。MS(ESI):m/z：193.22[M+H]+。
利用核磁共振对实施例7中得到的玻色因进行分析，得到结果1H NMR(400MHz,D2O)δ4.97–4.83(m,3H),4.25(d,J＝4.3Hz,1H),3.84–3.73(m,1H),3.67-3.63(m,1H),3.25-3.17(m,1H),3.13–2.87(m,3H),2.85-2.82(m,1H),1.77-1.73(m,1H),1.51-1.45(m,1H),1.08-1.04(m,3H)。
实施例8：RDHA26I/D193Q酶(SEQ ID NO：6)催化还原β-丙酮木糖苷2制备玻色因
1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入50克上述β-丙酮木糖苷2粗品，3.0克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM)，52克五水亚磷酸钠(240mM)以及50ml异丙醇。恒温30～40℃加入粗酶液(4000U RDHA26I/D193Q和6000UPTDH)，30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后，离心，上清液纳滤除盐，减压蒸除水分，纯化得34.5克产物，纯度98.7％，产率89.8％。MS(ESI):m/z：193.07[M+H]+。
利用核磁共振对实施例8中得到的玻色因进行分析，得到结果1H NMR(400MHz,D2O)δ4.89–4.84(m,3H),4.25(d,J＝4.3Hz,1H),3.84–3.73(m,1H),3.67-3.63(m,1H),3.27-3.19(m,1H),3.13–2.87(m,3H),2.83-2.79(m,1H),1.77-1.73(m,1H),1.51-1.45(m,1H),1.01-1.00(d,J＝6.1Hz,3H)。
实施例9：RDHG95L/D193Q酶(SEQ ID NO：6)催化还原β-丙酮木糖苷2制备玻色因
1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入50克上述β-丙酮木糖苷2粗品，3.0克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM)，52克五水亚磷酸钠(240mM)以及50ml异丙醇。恒温30～40℃加入粗酶液(4000U RDHG95L/D193Q和6000UPTDH)，30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后，离心，上清液纳滤除盐，减压蒸除水分，纯化得36.0克产物，纯度99.1％，产率93.8％。MS(ESI):m/z：193.13[M+H]+。
利用核磁共振对实施例9中得到的玻色因进行分析，得到结果1H NMR(400MHz,D2O)δ4.97–4.86(m,3H),4.25(d,J＝4.3Hz,1H),3.84–3.73(m,1H),3.67-3.63(m,1H),3.21-3.18(m,1H),3.13–2.87(m,3H),2.85-2.82(m,1H),1.77-1.73(m,1H),1.51-1.45(m,1H),1.09-1.05(d,J＝6.1Hz,3H)。
实施例10：RDHG95L/D193Q/L209F酶(SEQ ID NO：6)催化还原β-丙酮木糖苷2制备玻色因
1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入50克上述β-丙酮木糖苷2粗品，3.0克β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM)，52克五水亚磷酸钠(240mM)以及50ml异丙醇。恒温30～40℃加入粗酶液(4000URDHG95L/D193Q/L209F和6000UPTDH)，30℃缓慢搅拌反应6小时，反应结束后，离心，上清液纳滤除盐，减压蒸除水分，纯化得37.1克产物，纯度99.3％，产率96.6％。MS(ESI):m/z：193.30[M+H]+。
利用核磁共振对实施例10中得到的玻色因进行分析，得到结果1H NMR(400MHz,D2O)δ4.91–4.86(m,3H),4.25(d,J＝4.3Hz,1H),3.84–3.73(m,1H),3.67-3.63(m,1H),3.21-3.18(m,1H),3.13–2.87(m,3H),2.85-2.82(m,1H),1.77-1.73(m,1H),1.54-1.47(m,1H),1.01-1.00(d,J＝6.1Hz,3H)。
序列表
<110> 深圳瑞德林生物技术有限公司
<120> 一种酶组合物及化学酶法合成玻色因的方法
<130> S21P002325
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum USDA 110)
<400> 1
Met Ala Arg Glu Leu Glu Gly Lys Val Ala Ala Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Ala Met Leu Ala Ala Gly Ala
20 25 30
Arg Val Val Met Val Asp Arg Asp Glu Ala Ala Leu Lys Ala Leu Cys
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Asn Lys His Gly Asp Thr Val Ile Pro Leu Val Val Asp Leu Leu Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Leu Asp Ile Leu His Ala Asn Ala Gly Thr Tyr Val Gly Gly Asp
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Val Asn Val Val Met Lys Asn Val His Asp Val Leu Pro His Met Ile
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Glu Arg Arg Thr Gly Asp Ile Ile Val Thr Ser Ser Leu Ala Ala His
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Asn Cys Phe Val Gln Thr Val Arg Arg Gln Val Phe Lys His Gly Ile
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Arg Glu Leu Ser Gly Lys Val Ala Ala Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Ala Met Leu Ala Ala Gly Ala
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Arg Val Val Met Val Asp Arg Asp Glu Ala Ala Leu Lys Ala Leu Cys
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Asn Cys Phe Val Gln Thr Val Arg Arg Gln Val Phe Lys His Gly Ile
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Asp Trp Pro Pro Glu Lys Leu Lys Glu Ala Arg Asp Ser Gly Ser Leu
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Asp Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Arg Glu Leu Glu Gly Lys Val Ala Ala Val Thr Gly Ala Ala
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Ser Gly Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Ala Met Leu Ala Ala Gly Ala
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Arg Val Val Met Val Asp Arg Asp Glu Ala Ala Leu Lys Ala Leu Cys
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Asn Cys Phe Val Gln Thr Val Arg Arg Gln Val Phe Lys His Gly Ile
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Asp Trp Pro Pro Glu Lys Leu Lys Glu Ala Arg Asp Ser Gly Ser Leu
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Asp Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Arg Glu Leu Glu Gly Lys Val Ala Ala Val Thr Gly Ala Ala
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Ser Gly Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Ala Met Leu Ala Ala Gly Ala
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Leu Glu Ala Ser Asp Val Ala Glu Val Val Met Phe Met Leu Thr Arg
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Pro Arg Gly Met Thr Ile Arg Asp Phe Leu Met Leu Pro Thr Asn Phe
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Asp Leu
<210> 6
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ala Arg Glu Leu Glu Gly Lys Val Ala Ala Val Thr Gly Ala Ala
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Ser Gly Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Ile Met Leu Ala Ala Gly Ala
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Arg Val Val Met Val Asp Arg Asp Glu Ala Ala Leu Lys Ala Leu Cys
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Leu Glu Ala Ser Asp Val Ala Glu Val Val Met Phe Met Leu Thr Arg
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Asp Leu
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Arg Glu Leu Glu Gly Lys Val Ala Ala Val Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Ala Met Leu Ala Ala Gly Ala
20 25 30
Arg Val Val Met Val Asp Arg Asp Glu Ala Ala Leu Lys Ala Leu Cys
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Leu Glu Ala Ser Asp Val Ala Glu Val Val Met Phe Met Leu Thr Arg
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Pro Arg Gly Met Thr Ile Arg Asp Val Leu Met Leu Pro Thr Asn Phe
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Asp Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Gly Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Ala Met Leu Ala Ala Gly Ala
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Arg Val Val Met Val Asp Arg Asp Glu Ala Ala Leu Lys Ala Leu Cys
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165 170 175
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180 185 190
Gln Trp Pro Pro Glu Lys Leu Lys Glu Ala Arg Asp Ser Gly Ser Leu
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Phe Glu Ala Ser Asp Val Ala Glu Val Val Met Phe Met Leu Thr Arg
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<400> 9
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20 25 30
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115 120 125
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Ala Cys Arg Arg Ala Gly Val Thr Leu Gly Asn Lys Val Leu Val Cys
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180 185 190
Gly Ala Ala Gln Val Val Val Thr Asp Leu Ser Ala Ser Arg Leu Ser
195 200 205
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<210> 10
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<213> 大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum USDA 110)
<400> 10
atggccaggg agctggaggg caaggtggcc gccgtgaccg gcgccgccag cggcatcggc 60
ctggccagcg ccgaggccat gctggccgcc ggcgccaggg tggtgatggt ggacagggac 120
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Claims (8)
1.一种化学酶法合成玻色因的方法，其特征在于，包括：
S1）将乙酰丙酮、木糖与碱性物质在溶剂中混合加热反应，得到第一中间产物；
S2）将所述第一中间产物、脱氢酶、辅酶、还原剂与异丙醇在磷酸缓冲液中混合，反应，得到玻色因；
所述脱氢酶包括酶A与酶B；
所述酶A为山梨醇脱氢酶或脱氢酶RDH；
所述脱氢酶RDH包括野生型RDH和/或RDH突变体；
所述野生型RDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述RDH突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2~8任一项所示；
所述山梨醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述酶B为PTDH；
所述辅酶选自β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐；所述还原剂选自亚磷酸钠；
以室温一分钟转化1 μmol的底物所需酶量为U，所述酶A的用量为1000~10000 U；所述酶B的用量为2000~20000 U；
所述S2）反应的温度为25℃~40℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性物质选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂、氢氧化钠、氢氧化钾与氢氧化锂中的一种或多种；
所述乙酰丙酮与木糖的摩尔比为（1~1.2）：1；
所述碱性物质与木糖的摩尔比为（1.2~2）：1；
所述S1）中加热反应的温度为70℃~90℃；所述加热反应的时间为10~16 h；
加热反应后，将反应溶液的pH值调节至中性，除去溶剂，得到第一中间产物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶与第一中间产物的摩尔比为1：（500~1000）；所述还原剂与第一中间产物的摩尔比为1：（0.8~1.5）；所述异丙醇与第一中间产物的比例为（0.5~1.5）mL：1 g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2）具体为：
将第一中间产物、辅酶、还原剂与异丙醇在磷酸缓冲液中混合，得到底液；
在底液中加入脱氢酶混合，反应，得到玻色因。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的时间为4~8 h；反应后，离心，上清液纳滤除盐后，除去水分，得到玻色因。
6.一种酶组合物，其特征在于，包括酶A与酶B；
所述酶A为RDH突变体；
所述RDH突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2~8任一项所示；
所述酶B为PTDH。
7.一种RDH突变体，
所述RDH突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2~8任一项所示。
8.编码权利要求7所述RDH突变体的核酸，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：11~17任一项所示。
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