CN117778341A

CN117778341A - 基于蛋白质标签自组装的固定化羰基还原酶及连续催化制备阿瑞吡坦中间体的应用

Info

Publication number: CN117778341A
Application number: CN202311806808.4A
Authority: CN
Inventors: 王普; 王耀武; 刘汉宇
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2023-12-26
Filing date: 2023-12-26
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明公开了一种基于蛋白质标签自组装的固定化羰基还原酶及连续催化制备阿瑞吡坦中间体的应用，所述固定化羰基还原酶是将融合羰基还原酶的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎，破碎液经离心后所得沉淀用含0.5‑2％Triton X‑100的PB缓冲液洗涤，随后用PB缓冲液洗涤并重悬于PB缓冲液中，即为固定化羰基还原酶酶液。本发明通过将连续流催化与产物萃取偶联，实现了(R)‑3,5‑双三氟甲基苯乙醇的高效制备，在2mol/L的高底物浓度下进行不对称还原反应7h后，(R)‑BTPE产率达97％，ee值>99.9％，同时，本发明的辅因子总周转率可达4816。

Description

基于蛋白质标签自组装的固定化羰基还原酶及连续催化制备阿瑞吡坦中间体的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种基于蛋白质标签自组装的固定化羰基还原酶及其在连续催化3,5-双三氟甲基苯乙酮不对称还原制备阿瑞吡坦中间体(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇中的应用。

(二)背景技术

阿瑞吡坦为神经激肽1受体拮抗剂，可用做肿瘤病人化疗过程中的镇吐和止吐药物。(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇是合成阿瑞吡坦药物的关键手性中间体，目前不对称合成(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的方法主要有化学法和生物法，其中，生物催化制备法因具有选择性高，反应条件温和，环境友好等优势，在不对称合成(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇方面具有重要的应用价值。酶作为一类重要的生物催化剂，是实现高效生物催化的关键。然而，利用游离酶催化时，酶的催化活性和酶稳定性易受到反应条件的影响，且酶的重复使用性能通常也不理想，这不仅降低了酶催化反应的效率，同时也由于反应体系中残存的酶使得后续的产物分离纯化过程变得复杂。利用固定化酶进行生物催化，特别是近年来出现的新型酶固定化策略可很好地改善酶的性能，克服上述缺陷，明显提高酶催化的反应效率，并实现酶的重复使用。

传统的酶固定化技术多通过物理或化学方法，将游离酶结合于载体上或束缚于一定的空间范围内用于生物催化反应，例如包埋法，吸附法，交联法和共价结合法等。上述方法的酶固定化制备过程较为复杂，且固定化过程中酶容易失活，酶稳定性和重复使用性能也存在一定的局限性。

近年来，通过蛋白质自组装标签形成的纳米颗粒已成功应用于蛋白纯化，药物递送和酶固定化等多个领域。蛋白质标签是指一类特殊的多肽序列，通过在目标蛋白上引入该类序列的重组蛋白质在表达后能够自发聚集形成纳米颗粒，从而实现酶的固定化。不同于传统的酶固定化方法，基于自组装标签的酶固定化技术具有以下优点：(1)酶蛋白仅通过细胞破碎离心后即可获得，无须繁杂的酶纯化过程，操作步骤简单；(2)无需通过载体实现酶的固定化，成本低廉，且提升了固定化酶载量；(3)仅在基因层面对酶蛋白进行改造，可充分保留酶的活性。

通过连续流方式进行生物催化近年来受到人们的关注，然而目前的研究还仅限于酯酶等不涉及辅因子的酶催化反应过程。对于反应过程中需要NAD(P)H、磷酸吡哆醛(PLP)、FAD等辅因子的复杂酶催化反应，由于在连续流酶催化反应时NAD(P)H、PLP、FAD等昂贵辅因子因其流动性而往往不易回收，这也阻碍了反应过程中涉及辅因子的复杂酶在连续流催化模式中的应用。因此，利用NAD(P)H依赖性羰基还原酶实现连续流催化时辅因子再生对产率的影响至关重要。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种基于蛋白质标签自组装的无载体固定化羰基还原酶及其在不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇中的应用。本发明首先通过筛选不同的刚性或柔性连接肽，得到合适的连接肽，随之将自组装标签与实验室自行筛选的雷弗松氏菌来源羰基还原酶连接，构建得到无载体固定化羰基还原酶，不仅省去了酶固定化载体的使用，且有效提高了羰基还原酶的稳定性、酶催化活性和底物耐受性，延长了酶的半衰期，增加了酶的重复使用批次；此外，本发明将所述制备得到的固定化羰基还原酶冻干酶粉填入层析柱中进行连续流酶催化制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇，可实现2M的3,5-双三氟甲基苯乙酮的高底物浓度转化以及对辅因子NAD(P)H的高效利用，辅因子的总转化数(TTN值)达4816，有效解决了连续流反应过程中辅因子的流失问题，可大大降低应用连续流酶催化时因辅因子过度流失导致的催化成本提高，并显著提高了酶催化效率。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种基于蛋白质标签自组装的无载体固定化羰基还原酶，所述基于蛋白质标签自组装的无载体固定化羰基还原酶是将融合羰基还原酶的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体通过超声破碎，将破碎液经离心后所得沉淀用含0.5-2％(v/v)Triton X-100的PB缓冲液(pH 6.0)洗涤(优选洗涤三次)，随后再用纯PB缓冲液洗涤(优选洗涤一次)后重悬于PB缓冲液中，即得固定化羰基还原酶酶液；所述融合羰基还原酶是将源自雷弗松氏菌的SEQ ID NO.2所示羰基还原酶LXCAR-S154Y基因编码蛋白的N端通过连接肽与SEQ IDNO.3所示CipA基因编码蛋白的C端连接构成。

进一步，所述连接肽氨基酸序列为：GGGGSGGGGS。

进一步，所述融合羰基还原酶的基因工程菌按如下步骤构建：采用重叠延伸PCR方法，分别扩增雷弗松氏菌来源的羰基还原酶LXCAR-S154Y基因(编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)与CipA基因(编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，使得CipA序列的C端与LXCAR-S154Y的N端分别带有连接肽；随后，以上述两段基因作为模板，运用无缝克隆技术扩增出完整的融合蛋白基因CipA-Linker-LXCAR-S154Y，将其插入到pET28a载体的Nco I与HindⅢ之间，构建重组质粒pET28a(+)-CipA-Linker-LXCAR-S154Y；采用热激法将重组质粒pET28a(+)-CipA-Linker-LXCAR-S154Y转入E.coli DH5α中，随后涂布至含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h；随机挑取生长良好的单克隆菌株接种至LB液体培养基中，37℃，180rpm培养12h，以SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取培养菌液中的重组质粒，热激法转化E.coli BL21(DE3)，构建重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-CipA-Linker-LXCAR-S154Y。

进一步，所述固定化羰基还原酶酶液按如下步骤制备：将融合羰基还原酶的基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃、180rpm培养12h后获得种子培养液，以体积浓度1％比例吸取种子培养液加至新鲜的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8；随后，在液体培养基中加入0.1-0.8mM(优选0.5mM)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，30℃、200rpm培养1-20h(优选10h)以诱导蛋白表达；培养后的菌液经9000rpm，4℃，离心10min后，所得湿菌体用PB缓冲液重悬(优选100mM、pH 6.0的PB缓冲液，湿菌体加入量为0.05g/mL)，随后于冰浴条件下通过超声破碎裂解细胞(360W、超声2s间歇5s，共超声40min)；破碎液经9000g，4℃离心10min后，所得沉淀用含体积浓度0.5-2％(优选1％)Triton X-100的PB缓冲液(pH 6.0)洗涤三次，继而用纯PB缓冲液洗涤一次，随后重悬于与超声破碎时所用体积相同PB缓冲液中，即得固定化羰基还原酶酶液。

本发明还提供一种所述固定化羰基还原酶在催化潜手性酮不对称还原制备阿瑞吡坦中间体中的应用，所述的应用为：以所述固定化羰基还原酶为催化剂，以潜手性酮为底物，以NADH为辅酶，以异丙醇为辅助底物和助溶剂，以pH 6.0-8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-55℃、150-300rpm条件下进行酶催化反应，反应结束后，反应液经分离纯化获得阿瑞吡坦手性中间体；所述潜手性酮为3,5-双三氟甲基苯乙酮(BTAP)，阿瑞吡坦手性中间体为(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇((R)-BTPE)。

进一步，所述催化剂采用固定化羰基还原酶酶液，或是在-80℃冷冻干燥12h后制备的冻干酶粉。

进一步，所述反应体系中，催化剂用量以蛋白含量计为0.05～1mg/mL(优选0.15mg/mL)；底物BTAP初始加入浓度为10～2000mM(优选200mM)；所述NADH加入终浓度为0.5～3mM(优选2mM)；所述异丙醇体积加入量为20-70％(优选40％)。所述缓冲液为0.1M PB缓冲液(pH 6.0)。

进一步，所述反应条件为37℃、200rpm。

进一步，所述酶催化反应采用层析柱为反应器进行连续流酶催化反应，将所述固定化羰基还原酶装入层析柱中作为催化剂，再将底物溶液经循环泵以一定流速连续泵入层析柱中直至底物被催化完全(产率＞97％)，反应结束后，反应液经分离纯化获得阿瑞吡坦手性中间体；所述底物溶液组成为：0.5-3mM NADH、20-70％(v/v)异丙醇、10～2000mMBTAP，溶剂为0.1M PB缓冲液(pH 6.0)。所述底物溶液通入的流速为2-6mL/min，优选5mL/min。优选地，底物溶液组成：2mM NADH、2M BTAP，40％(v/v)异丙醇，溶剂为0.1M PB缓冲液(pH 6.0)。所述固定化羰基还原酶装填量以层析柱容积计为0.5-1.5g/L，优选1.25g/L，所述层析柱内径为1cm，高5cm。

本发明还提供一种用于固定化羰基还原酶制备阿瑞吡坦中间体的连续流催化与萃取偶联反应装置，所述连续流催化与萃取偶联反应装置包括层析柱1、萃取器6、蠕动泵11、循环泵12、萃取剂容器9、收集器10、底物溶液储罐13；所述萃取器6为侧壁带有出气口7的分液漏斗，所述分液漏斗顶部配有活塞5，底部设有用于控制出液口的旋塞8；所述活塞5顶端设有第一进液管3和第二进液管4，第一进液管3与第二进液管4在活塞内部交汇成一个通道并向下延伸，交汇处高度至少低于两处进液管高度1cm，延伸长度短于分液漏斗高度；所述底物溶液储罐13为三口烧瓶，设置取样口14；所述层析柱1的顶端通过硅胶管与三通阀2相连，同时三通阀2通过硅胶管与循环泵12连接，所述循环泵12与底物溶液储罐13连接，所述底物溶液储罐13与层析柱1的底端连接形成反应通路；所述萃取器6的出液口与收集器10连通，所述萃取器6顶端的第一进液管3通过硅胶管与蠕动泵11连接，所述蠕动泵11通过硅胶管与萃取剂容器9连接，萃取剂通过蠕动泵泵入分液漏斗；所述第二进液管4通过硅胶管与三通阀2相连形成萃取通路。

所述连续流催化与萃取偶联反应装置具体的操作方法为：将底物溶液加入底物溶液储罐13，萃取剂加入萃取剂容器9，反应开始时，将三通阀门2与循环泵12连通，关闭三通阀门2与萃取器6第二进液口4的连接，底物溶液从底物溶液储罐13通过循环泵12经三通阀2从顶部进入层析柱1中，反应液回到底物溶液储罐13再进入循环泵12形成循环的反应通路；从底物溶液储罐13的取样口14取样检测反应结束后，将三通阀门2与萃取器6的第二进液口4连通而关闭三通阀门2与层析柱1的连接，反应液经循环泵12通过第二进液管4进入萃取器6，同时萃取剂通过蠕动泵11经第一进液管3进入萃取器6中，以2-6mL/min的流速泵入空气5-15min(优选5mL/min的流速泵入空气10min)，利用空气压力使反应液与萃取剂混合均匀，并从分液漏斗上出气口7排出，在萃取器中进行萃取反应，反应结束后，打开旋塞8，收集产物到收集罐10中，提取得到产物；当反应液全部进入分液漏斗中后，关闭三通阀门2与萃取器6的第二进液口4的连接，将三通阀门2与层析柱1连通，使得酶催化反应与萃取分离同步进行。所述固定化羰基还原酶装填量以层析柱1容积计为0.5-1.5g/L，优选1.25g/L，所述层析柱1的内径为1cm，高5cm；所述底物溶液组成为：0.5-3mM NADH、20-70％(v/v)异丙醇、10～2000mM BTAP，溶剂为0.1M PB缓冲液(pH 6.0)；优选地，底物溶液组成：2mM NADH、2MBTAP，40％(v/v)异丙醇，溶剂为0.1M PB缓冲液(pH 6.0)。所述底物溶液通入的流速为2-6mL/min，优选5mL/min。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明通过筛选合适的刚性或柔性连接肽，将雷弗松氏菌来源的羰基还原酶与自组装标签蛋白融合，提高了羰基还原酶融合蛋白的酶活性，扩大了固定化羰基还原酶的适用性，相较于传统的酶固定化方法，基于蛋白质标签自组装的无载体酶固定化方法操作便捷，成本低廉，酶蛋白活性保留率高，从而使得阿瑞吡坦手性中间体的合成效率更高。

(2)本发明通过底物偶联方式实现辅因子的再生。所述反应体系中加入的异丙醇既可作为辅助底物实现辅酶NADH的循环再生，又可作为助溶剂增加水难溶性底物BTAP的溶解性，促进不对称还原反应过程的传质，相较于共固定化羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶(或甲酸脱氢酶等)的双酶共表达催化体系更加简便和高效。

(3)本发明通过优化反应条件，可使固定化羰基还原酶保持较高的催化活性，前一批次反应结束后经离心分离获得的固定化酶可直接投入下一批次的酶催化反应中，相对于第一批次反应98.9％的产率，固定化酶在重复使用18批次后仍能保持61.35％的产率。

(4)本发明通过将连续流酶催化与原位萃取相偶联，实现了(R)-BTPE的高效制备。底物溶液经循环泵连续泵入装有固定化羰基还原酶的层析柱中，底物BTAP经生物转化生成产物(R)-BTPE，在2M的高底物浓度下反应7h后，(R)-BTPE产率达到97％，ee值>99.9％。

(5)本发明有效提高了固定化羰基还原酶在连续流催化模式中对辅因子的利用率，将2mM辅因子NADH一次性投入层析柱后，可在反应5个批次(即连续反应35h)后仍能保持稳定的催化效率，辅因子的总转化数提升至4816。这为辅因子高效利用与连续流酶催化反应的高效稳定运行提供了新的启发。

(四)附图说明

图1、融合蛋白CipA-GGGGSGGGGS-LXCAR-S154Y的蛋白预测模型，1：CipA结构域；2：Linker 1结构域；3：LXCAR-S154Y结构域；4：Linker 2结构域。

图2、固定化羰基还原酶与游离酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M代表Marker、L1代表LXCAR-S154Y超声破碎离心后的沉淀、L2代表LXCAR-S154Y纯酶液、L3代表CL₁L超声破碎离心后的蛋白质聚集体沉淀；L4代表CL₁L经超声破碎离心后获得的上清液；L5代表CL₂L超声破碎离心后获得的上清液；L6代表CL₂L经超声破碎离心后的蛋白质聚集体沉淀。

图3、不同连接肽固定化羰基还原酶与游离酶在不同温度下反应的相对活性。

图4、连接不同连接肽的固定化羰基还原酶和游离酶在不同pH条件下反应的相对活性。

图5、固定化羰基还原酶冻干酶粉的SEM图。

图6、固定化羰基还原酶与游离酶在不同底物浓度下反应的产物浓度和产率。

图7、固定化羰基还原酶重复使用情况。

图8、连续流反应时酶加量的优化。

图9、连续流反应时辅因子加量的优化。

图10、连续流反应时流速的优化。

图11、辅因子的重复使用效率。

图12、连续流催化与萃取偶联反应装置示意图，1、层析柱；2、三通阀；3、第一进液管；4、第二进液管；5、延伸通道；6、萃取器；7、出气口；8、旋塞；9、萃取剂容器；10、收集器；11、蠕动泵；12、循环泵；13、底物溶液储罐；14、取样口。

图13、连续流催化与萃取偶联反应装置实物图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中大肠杆菌DH5α与E.coli BL21(DE3)分别作为宿主细胞用于质粒导入与蛋白表达，购自北京擎科生物科技有限公司。实验中涉及的引物合成与测序验证由北京擎科生物科技有限公司完成。实验中所用底物与产物购自鸿鹄生物医药科技科技有限公司(中国上海)。

LB液体培养基组成：酵母提取物5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。

LB固体培养基：在LB液体培养基中加入10.0g/L琼脂粉制得。

抗生素：卡那霉素，无菌水溶解，配制浓度为50-100mg/mL，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。接种抗生素用量依据所接种培养基体积终浓度为50μg/mL。

诱导剂：异丙基β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside，IPTG)，无菌水溶解，配制浓度为0.2M，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。诱导剂用量依据所接种培养基体积终浓度为0.5mM。

所述雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2010241，保藏日期：2010年9月21日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；已在专利申请ZL201010523043.X中公开。

实施例1：同源建模分析CipA对LXCAR-S154Y结构的影响

1、重组质粒pET28a-LXCAR-S154Y

来源于雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904的羰基还原酶LXCAR-S154Y(PDB：6XNB)的基因片段，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并连接于质粒pET28a(+)的酶切位点NdeI和HindIII之间，构建重组质粒pET28a-LXCAR-S154Y。羰基还原酶LXCAR-S154Y氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、重组质粒CipA

来自于发光杆菌(Photorhabdus luminescens)的自组装标签蛋白CipA(GenBank:

M97630.1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并连接于质粒pET28a(+)的酶切位点NdeI和HindIII之间构建重组质粒pET28a-CipA。自组装标签蛋白CipA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3、重组质粒CipA-GGGGSGGGGS-LXCAR-S154Y

利用重叠延伸PCR方法，采用表1反应体系，以重组质粒pET28a-LXCAR-S154Y为模版，表4中引物3、4扩增LXCAR-S154Y基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；以重组质粒pET28a-CipA为模版，利用引物1、2扩增CipA基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，使得CipA序列的C端与LXCAR-S154Y的N端均带有连接肽GGGGSGGGGS(Linker 1)基因。

随后，以上述两段基因作为模板，利用表4中的引物1、4，运用无缝克隆技术扩增出完整的融合蛋白基因CipA-Linker1-LXCAR-S154Y。

通过引物7、8扩增线性化载体pET28a，利用表2所示Dpn I消化反应体系进行消化，随后将完整的融合蛋白基因CipA-Linker1-LXCAR-S154Y通过无缝克隆技术插入到pET28a载体的Nco I与HindⅢ之间，构建重组质粒pET28a-CipA-Linker1-LXCAR-S154Y，无缝克隆体系如表3所示。

同样条件下，利用引物1、5扩增CipA基因，利用引物6、4扩增LXCAR-S154Y基因，使得CipA序列的C端与LXCAR-S154Y的N端均带有连接肽AEAAAKEAAAKA(Linker 2)基因，构建重组质粒pET28a-CipA-Linker2-LXCAR-S154Y。

表1PCR反应体系

PCR扩增条件：(1)98℃预变性2min；(2)98℃变性10s；(3)57℃退火5s；(4)72℃延伸1min。重复步骤(2)～(4)进行35个循环，最后72℃终延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。

表2Dpn I消化反应体系

Dpn I消化条件：37℃孵育2h，80℃灭活2min，4℃保存Dpn I消化产物。

表3无缝克隆反应体系

无缝克隆条件：50℃孵育30min，随后冰上放置5min。

表4目的基因扩增所用引物

4、蛋白结构分析

利用同源建模技术，采用Alpha-fold 2服务器，构建CL₁L和CL₂L的融合羰基还原酶三维结构，蛋白质结构模型如图1所示。从蛋白模拟结果可知Linker的引入并不会影响羰基还原酶的蛋白质结构。

SEQ ID NO 1：

1MAQYDVAGRSAIVTGGGSGIGRAIALTLAASGAAVLVTDLNEENANAVVA

51EISAAGGTARALAGDVTDPAFAEASVAAANELAPLRIAVNNAGIGGAAAP

101VGDYPLDSWRKVIEVNLNAVFYGMQAQLDAIGANGGGAIVNMASILGSV

151GFANYSAYVTAKHALLGLTQNAALEYAGKNVRVVAVGPGFIRTPLVASN

201MDADTLAFLEGKHALGRLGEPEEVASLVAFLASDAASFITGSYHLVDGG YTAQ。

SEQ ID NO 3：

1ATGATCAACGACATGCACCCGAGCCTGATTAAAGATAAAGACATTGTTG

51ATGACGTGATGCTGCGTAGCTGTAAAATTATTGCAATGAAAGTGATGCC

101GGACAAAGTTATGCAGGTTATGGTTACCGTTCTGATGCACGACGGTGTT

151TGTGAAGAAATGCTGCTGAAATGGAATCTGCTGGATAATCGTGGAA

TGG

201CAATTTACAAAGTTCTGATGGAAGCACTGTGTGCAAAAAAAGATGT

TAA

251AATTAGCACCGTTGGTAAAGTTGGTCCGCTGGGTTGTGATTATATTAAT

301TGTGTTGAAATTAGCATG

实施例2：羰基还原酶重组基因工程菌的构建

将实施例1的重组质粒pET28a(+)-CipA-Linker1-LXCAR-S154Y和pET28a(+)-CipA-Linker2-LXCAR-S154Y，分别采用热激法转化E.coli DH5α，涂布至含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养12h。随机挑取生长良好的单克隆菌株，利用引物T7(TAATACGACTCACTATAGGG)和T7 ter(TGCTAGTTAT TGCTCAGCGG)进行菌落PCR检测，确认阳性克隆菌株。

挑取阳性克隆株接种于5mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养12h，以SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取菌液中的重组质粒，热激法转化E.coli BL21(DE3)，构建重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-CipA-Linker1-LXCAR-S154Y，记为菌株CL₁L；E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-CipA-Linker2-LXCAR-S154Y，记为菌株CL₂L。

同样方法将组质粒pET28a-LXCAR-S154Y转入E.coli BL21(DE3)，构建重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-LXCAR-S154Y，作为对照菌株，记为菌株LXCAR-S154Y。

菌落PCR体系：PCR Master Mix(With Dye)10μL；T7 0.5μL；T7 ter 0.5μL；菌液1μL；无菌水8μL，总体系20μL。

菌落PCR条件：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火15s；(4)72℃延伸1min；重复步骤(2)～(4)进行25个循环，最后72℃终延伸10min，4℃保存菌落PCR产物。

实施例3：目的蛋白表达、纯化与蛋白浓度测定

1、固定化羰基还原酶制备：将实施例2构建的菌株CL₁L、CL₂L接种于5mL的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养12h后，以体积浓度1％比例取菌液加至100mL的LB液体培养基中，继续在37℃、200rpm培养2.3h至OD₆₀₀为0.6-0.8。随后，在培养基中加入0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并于30℃、200rpm培养10h以诱导蛋白表达。培养后的菌液经9000rpm，4℃离心10min，所得湿菌体按照0.05g/mL比例重悬于30mL0.1 M的PB缓冲液(pH6.0)中，随后在冰浴条件下通过超声破碎裂解细胞(360W、超声2s间歇5s，共超声40min)。破碎液经9000g，4℃离心10min后，蛋白聚集体(PCIs)沉淀至底部，而杂蛋白与细胞碎片留在上清液中。分别取沉淀和上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示。沉淀用含有1％(v/v)Triton X-100的PB缓冲液(pH 6.0)洗涤三次，随后用纯PB缓冲液洗涤一次，最后，将沉淀重悬于PB缓冲液中，并调整蛋白浓度为20mg/mL，即得固定化羰基还原酶CL₁L酶液和固定化羰基还原酶CL₂L酶液。

2、游离酶纯酶液制备：将步骤1中菌株CL₁L、CL₂L替换为E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-LXCAR-S154Y，在相同条件下进行诱导表达并超声破碎、离心，收集上清液，并经0.22μm滤膜过滤后，所得滤液即为游离酶粗酶液。

采用蛋白纯化系统(AKTA)，上样缓冲液为含0.5M NaCl的0.1M PB缓冲液(pH6.0)，使用上样缓冲液冲洗系统，流速为1.0mL/min，待基线走稳后将制得的游离酶粗酶液进行上样，上样量为20mL，上样流速为1mL/min。依次通过含50mM咪唑和250mM咪唑的上样缓冲液进行洗脱，以去除杂蛋白并获取高纯度目的蛋白，洗脱流速为1.0mL/min，收集含250mM咪唑的上样缓冲液的流出液至吸光度归零。使用超滤管(10kDa)进行超滤浓缩，以PB作为置换液，获得LXCAR-S154Y纯酶液，用PB缓冲液调整蛋白浓度为20mg/mL，SDS-PAGE凝胶电泳检测图如图2所示。

图2表明，在27kDa与42kDa附近有目的蛋白条带(LXCAR-S154Y蛋白分子量为26.9kDa，CL₁L、CL₂L的蛋白分子量为41.2kDa)，表明目的蛋白表达成功。

3、蛋白浓度测定：按照Bradford蛋白质定量试剂盒的操作步骤，检测不同浓度的Bradford蛋白在595nm波长下的吸光值，绘制得到蛋白浓度-吸光值标准曲线，曲线方程为y＝0.0525x+0.5457(R²＝0.9936)。同样方法检测制备得到的固定化酶与游离酶纯酶液的吸光值，根据检测样品的吸光度值，通过标准曲线计算得到样品的蛋白浓度。

实施例4：融合蛋白在不同温度与pH条件下的酶活比较

以实施例3方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L酶液、固定化羰基还原酶CL₂L酶液与游离酶LXCAR-S154Y纯酶液作为酶源，进行如下实验：

1、最适温度

在2mL EP管中分别加入以蛋白含量计终浓度均为0.15mg/mL的酶液(CL₁L酶液、CL₂L酶液与LXCAR-S154Y纯酶液)、0.5mM NADH、40％(v/v)异丙醇、50mM 3,5-双三氟甲基苯乙酮(BTAP)和0.1M PB缓冲液(pH 6.0)，反应总体积为200μL。分别在25，30，37，45，50，55℃，200rpm条件下反应20min后，将反应液用两倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离得到萃取溶剂相，采用气相色谱法进行检测，并计算固定化酶与游离酶催化生成(R)-BTPE的产率。产率最高的实验组对应的温度即为该酶的最适温度，将其定义为100％，计算其他温度下酶的相对催化活性。结果如图3所示，固定化羰基还原酶CL₁L、CL₂L与游离酶LXCAR-S154Y的最适反应温度均为37℃(相对活性100％)，CL₁L在50℃时相对活性为92.1％，55℃时相对活性为87.1％；CL₂L在50℃时相对活性为87.7％，55℃时相对活性为75.5％；LXCAR-S154Y在50℃时相对活性为77.3％，55℃时相对活性为63.5％。

2、最适pH

在2mL EP管中分别加入以蛋白含量计终浓度均为0.15mg/mL的酶液(CL₁L酶液、CL₂L酶液与LXCAR-S154Y纯酶液)、0.5mM NADH、40％(v/v)异丙醇、50mM BTAP和0.1M不同pH缓冲液(pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，反应总体积为200μL。37℃，200rpm条件下反应20min后，将反应液用两倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离得到萃取溶剂相，采用气相色谱法进行检测，并计算固定化酶与游离酶催化合成(R)-BTPE的产率。产率最高的实验组所对应的缓冲液pH即为该酶的最适pH，将其定义为100％，计算其他pH下的相对催化活性。其中pH 3.0-6.0为Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液，pH 6.0-8.0为KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，pH8.0-10.0为Gly-NaOH缓冲液。

结果见图4所示，固定化羰基还原酶CL₁L酶液在不同pH的催化活性均高于固定化羰基还原酶CL₂L和游离酶LXCAR-S154Y，且最适反应pH为6.0。固定化羰基还原酶CL₂L和游离酶LXCAR-S154Y的酶活在pH大于7.0后都出现了明显下降。

综合不同温度与pH条件下的酶活性比较结果与实施例2蛋白质结构的预测结果，选择固定化酶CL₁L作为后续催化反应条件优化的催化剂。

3、气相色谱检测方法：

气相色谱检测条件如下：安捷伦气相色谱仪；CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比为15:1；进样口和检测器温度分别为250℃和250℃；色谱柱温度80～125℃；80℃维持2min；升温速度：9℃/min至125℃，维持3min；检测器为FID。

用上述条件对底物3,5-双三氟甲基苯乙酮(BTAP)、产物(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇((S)-BTPE)和(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇((R)-BTPE)标准品进行检测，内标物十二烷的保留时间为3.6min，底物BTAP的保留时间为4.2min，产物(R)-BTPE和(S)-BTPE的保留时间分别为8.9min和9.4min。

实施例5：固定化羰基还原酶的扫描电子显微镜图像

使用冻干机将实施例3制得的固定化羰基还原酶CL₁L酶液在-80℃下真空冷冻干燥12h，制得固定化酶冻干酶粉。用牙签挑取少量冻干酶粉涂布在蔡司Sigma 300型扫描电镜样品台上的导电胶上，吹去未牢固结合的样品并对样品进行喷金处理，随后在15KV的条件下进行电镜分析。如图5所示，固定化羰基还原酶呈现为致密的网状结构，个体外观呈圆柱状，直径约为500nm。

实施例6：游离酶LXCAR-S154Y及固定化酶CL₁L温度稳定性与pH稳定性考察

以实施例3方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L酶液与游离酶LXCAR-S154Y纯酶液作为酶源，进行如下实验：

1、温度稳定性

将游离酶LXCAR-S154Y纯酶液与固定化羰基还原酶CL₁L酶液分别置于30、37、45、50、55℃的恒温水浴锅中孵育不同时间，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h、4h时取出酶液，按照实施例4测定最适温度的方法，在37℃反应20min后检测酶活。将各温度孵育下0h的酶活设为100％，计算其余时间的相对酶活。结果表明，固定化羰基还原酶CL₁L在37℃时的热稳定性最佳，孵育4h后仍可保持86.3％的相对活性。

2、pH稳定性

将游离酶LXCAR-S154Y纯酶液与固定化羰基还原酶CL₁L酶液分别置于装有0.1M不同pH(同实施例4步骤2)缓冲液的2mL EP管中，于4℃冰箱内孵育24h后，采用实施例4步骤2方法在pH 6.0条件下进行反应并检测酶活。将不同pH缓冲液孵育的初始酶活设为100％，计算24h后的残余酶活，结果表明，固定化羰基还原酶CL₁L在pH 6.0时的稳定性最佳。

实施例7：游离酶LXCAR-S154Y及固定化酶CL₁L的半衰期比较

以实施例3方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L酶液与游离酶LXCAR-S154Y纯酶液作为酶源，于4℃中放置5-8d，每天取样测定相对酶活性变化。每隔1d在2mL EP管中分别加入以蛋白含量计终浓度均为0.15mg/mL的固定化酶CL₁L酶液或游离酶LXCAR-S154Y纯酶液、0.5mM NADH、40％(v/v)异丙醇、50mM BTAP和0.1M PB缓冲液(pH 6.0)，反应总体积为200μL。37℃，200rpm条件下反应20min后，将反应液用两倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离得到萃取溶剂相，采用实施例4气相色谱法进行检测，并计算固定化酶与游离酶催化生成(R)-BTPE的产率。将未在4℃放置的酶的催化产率设定为100％，计算在4℃孵育不同时间后固定化酶与游离酶的相对催化活性。固定化羰基还原酶CL₁L的半衰期为8d^-1，游离酶半衰期为3d^-1，固定化羰基还原酶CL₁L半衰期约为游离酶的2.67倍。

实施例8：反应动力学参数测定

以实施例3方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L或游离酶LXCAR-S154Y纯酶液作为酶源，在2mL EP管中分别加入以蛋白含量计终浓度均为0.02mg/mL的酶源、一定浓度NADH、40％(v/v)异丙醇、一定浓度BTAP和0.1M PB缓冲液(pH 6.0)，反应总体积为200μL。37℃，200rpm条件下反应1min后，将反应液用两倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离得到萃取溶剂相，采用实施例4气相色谱法进行检测，并计算固定化酶与游离酶相对于NADH和BTAP的反应动力学参数。对BTAP进行反应动力学参数测定时，底物BTAP浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM和1.5mM，NADH浓度为10mM；对NADH进行反应动力学参数测定时，底物BTAP浓度为5mM，NADH浓度分别为0.001mM、0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.05mM、0.08mM和0.1mM。将不同底物浓度下测得的酶促反应速率代入米氏方程，采用GraphPadPrism 9软件中的Michaelis-Menten进行作图，得到V_max和K_m，再根据转换数k_cat的计算公式计算得到k_cat，进而得到催化效率k_cat/K_m，结果如表5所示。

转换数k_cat的计算公式如下：

k_cat＝V_max/[E]

V_max为最大酶促反应速度，[E]为酶的摩尔浓度

表5反应动力学参数测定

实施例9：游离酶LXCAR-S154Y与固定化酶CL₁L的底物耐受性比较

以实施例3方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L酶液或游离酶LXCAR-S154Y纯酶液作为酶源，在2mL EP管中分别加入以蛋白含量计终浓度均为0.15mg/mL的酶源、0.5mMNADH、40％(v/v)异丙醇、0.1M PB缓冲液(pH 6.0)，BTAP浓度为10、20、30、50、80、100、150、200和250mM，反应总体积为200μL。在37℃、pH 6.0，200rpm条件下反应1h后，将反应液用两倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离得到萃取溶剂相，采用实施例4气相色谱法进行检测，并计算固定化酶与游离酶催化合成(R)-BTPE的产率。

如图6所示，当BTAP浓度小于50mM时，游离酶LXCAR-S154Y催化体系中(R)-BTPE的产率可达98％以上，当底物浓度提升至150mM时，产率下降至30％。在相同的反应条件下，采用等量CL₁L作为催化剂时，可催化250mM的BTAP合成191mM的(R)-BTPE，产率达76％，其催化的底物浓度是游离酶催化(150mM)的1.67倍。

实施例10：固定化酶CL₁L的重复使用情况

以实施例3方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L酶液作为酶源，在2mL EP管中分别加入以蛋白含量计终浓度均为0.15mg/mL的固定化酶、0.5mM NADH、40％(v/v)异丙醇、0.1MPB缓冲液(pH 6.0)，BTAP浓度为50mM，反应总体积为200μL。在37℃、pH 6.0，200rpm条件下反应1h，反应液经9000rpm，4℃离心10min，将所得上清液用两倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离得到萃取溶剂相，采用实施例4气相色谱法进行检测，并计算固定化酶催化合成(R)-BTPE的产率。将反应结束后收集的固定化酶加入到新的反应体系中，在相同的条件下进行下一批次催化，考察固定化酶的重复使用情况。如图7所示，固定化酶CL₁L经过18个批次的重复使用后，产率仍可达到61.35％。

实施例11：固定化酶CL₁L冻干前后的活性比较

取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g以实施例3方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L酶液，于-80℃真空冻干12h，测定冻干后固定化酶的重量，并绘制以干重为纵坐标，以湿重为横坐标的干湿重曲线，曲线方程公式为y＝0.123x-0.0007(R²＝0.9928)。按照干湿重曲线，分别取0.025g(蛋白含量0.25mg)冻干前的固定化酶与0.00565g(蛋白含量0.25mg)冻干后的固定化酶作为酶源，在2mL EP管中分别加入5mM的NADH、1M BTAP、40％(v/v)异丙醇和0.1M PB缓冲液(pH 6.0)，反应总体积为1mL。37℃，200rpm条件下反应1h后，用两倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离得到萃取溶剂相，采用实施例4气相色谱法进行检测，并计算冻干前后固定化酶催化生成(R)-BTPE的产率。反应1h后，经冻干后的固定化酶CL₁L催化合成(R)-BTPE的产率为32.6％，而未冻干的固定化酶CL₁L催化合成(R)-BTPE的产率为22.5％，产率提升0.45倍。

实施例12：利用层析柱进行连续流反应时酶加量的优化

以实施例10方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L冻干酶粉作为酶源，分别将0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g(蛋白含量分别为2、3、4、5、6mg)固定化羰基还原酶CL₁L冻干酶粉装入内径为1cm，高5cm的层析柱中，酶源的蛋白加量以层析柱容积计分别为0.5g/L、0.75g/L、1g/L、1.25g/L、1.5g/L；将含有2mM的NADH、200mM底物BTAP，40％(v/v)异丙醇与0.1M PB缓冲液(pH 6.0)的20mL底物溶液，以4mL/min的流速按照从上到下的方向通过循环泵连续加入层析柱，在37℃条件下反应，每隔0.5h收集样品，用两倍体积的乙酸乙酯萃取并按照实施例4进行气相色谱检测。结果如图8所示，当酶加量提高至0.5g(蛋白含量5mg)时，反应3h后产物的产率最高为94.8％。

实施例13：采用层析柱进行连续流反应时辅因子的加量优化

以实施例10方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L冻干酶粉作为酶源，将0.5g(蛋白含量5mg)酶源装入内径为1cm，高5cm的层析柱中，将含有不同浓度(0.5、1、1.5、2、3mM)NADH、200mM底物BTAP，40％(v/v)异丙醇与0.1M PB缓冲液(pH 6.0)的20mL底物溶液，以4mL/min的流速按照从上到下的方向通过循环泵连续加入层析柱。在37℃条件下反应，每隔0.5h收集样品，用两倍体积的乙酸乙酯萃取并按照实施例4进行气相色谱检测。结果如图9所示，当辅因子NADH浓度提升至2mM，反应3h后产物的产率为92.5％。

实施例14：采用层析柱进行连续流反应时的流速优化

以实施例10方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L冻干酶粉作为酶源，将0.5g(蛋白含量5mg)酶源装入内径为1cm，高5cm的层析柱中，将含有2mM的NADH、200mM底物BTAP，40％(v/v)异丙醇与0.1M PB缓冲液(pH 6.0)的20mL底物溶液，以2、3、4、5、6mL/min的流速按照从上到下的方向通过循环泵连续加入层析柱，在37℃条件下反应，每隔0.5h收集样品，用两倍体积的乙酸乙酯萃取并按照实施例4进行气相色谱检测。结果如图10所示：当反应液流速提高至5mL/min时，反应3h后产物的产率最高为97.7％。

实施例15：高底物浓度下采用层析柱进行连续流催化反应合成阿瑞吡坦手性中间体

实验组：以实施例10方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L冻干酶粉作为酶源，将0.5g(蛋白含量5mg)固定化羰基还原酶CL₁L冻干酶粉装入内径为1cm，高5cm的层析柱中，将含有2mM的NADH、2M底物BTAP，40％(v/v)异丙醇与0.1M PB缓冲液(pH 6.0)的10mL底物溶液，以5mL/min的流速按照从上到下的方向通过循环泵连续加入层析柱，在37℃条件下反应，每隔1h收集样品，用两倍体积的乙酸乙酯萃取并按照实施例4进行气相色谱检测。实验组在完成第一批次反应后，继续进行下一批次反应，反应液中除不需额外添加NADH外，其他组分的浓度保持不变，该反应总共重复5个批次。

对照组：底物溶液中除不添加NADH外其他组分的浓度与实验组保持一致，仅进行一个批次反应。如图11所示，实验组在反应7h后，2M的BTAP已接近完全转化为(R)-BTPE，产率达97％，ee值＞99.9％，时空产率达到1703g·L^-1·d^-1，而对照组在反应7h后(R)-BTPE的产率仅为7％。并且，仅在第一批次添加辅因子条件下，后4个批次在反应7h后产率仍能与第一批次的时空产率保持相当，使得辅因子NADH的总转化数(TTN值)达4816。

TTN值＝总产物物质的量(mM)/辅酶因子物质的量(mM)

TTN值＝(0.970+0.974+0.977+0.943+0.952)×2000/2＝4816

实施例16：连续流催化与萃取偶联反应装置

为了更加高效便捷地制备手性醇产物，减少产物后处理过程，本发明采用连续流催化与萃取偶联反应装置(示意图见图12、实物图见图13)合成阿瑞吡坦手性中间体，具体操作如下：

所述连续流催化与萃取偶联反应装置包括层析柱1、萃取器6、蠕动泵11、循环泵12、萃取剂容器9、收集器10、底物溶液储罐13；所述萃取器6为侧壁带有出气口7的分液漏斗，所述分液漏斗顶部配有活塞5，底部设有用于控制出液口的旋塞8；所述活塞5顶端设有第一进液管3和第二进液管4，第一进液管3与第二进液管4在活塞内部交汇成一个通道并向下延伸，交汇处高度低于两处进液管高度1cm，延伸长度短于分液漏斗高度；所述底物溶液储罐13为三口烧瓶，设置取样口14；所述层析柱1的顶端通过硅胶管与三通阀2相连，同时三通阀2通过硅胶管与循环泵12连接，所述循环泵12与底物溶液储罐13连接，所述底物溶液储罐13与层析柱1的底端连接形成反应通路；所述萃取器6的出液口与收集器10连通，所述萃取器6顶端的第一进液管3通过硅胶管与蠕动泵11连接，所述蠕动泵11通过硅胶管与萃取剂容器9连接，萃取剂通过蠕动泵泵入分液漏斗；所述第二进液管4通过硅胶管与三通阀2相连形成萃取通路；

具体制备方法为：将实施例10方法制得的固定化羰基还原酶CL₁L冻干酶粉作为酶源，将0.5g(蛋白含量5mg)冻干酶粉装入内径为1cm，高5cm的层析柱1中，将含有2mM NADH、2M底物BTAP，40％(v/v)异丙醇与0.1M PB缓冲液(pH 6.0)的10mL底物溶液加入底物溶液储罐13中。反应开始时，将三通阀门2与循环泵12连通，关闭三通阀门2与萃取器6第二进液口4的连接，形成反应通路，底物溶液从底物溶液储罐13通过循环泵12以5mL/min的流速经三通阀2从顶部进入层析柱1中，反应液回到底物溶液储罐13再进入循环泵12形成循环的反应通路；每隔1h从底物溶液储罐13的取样口14取样，采用实施例4方法检测；当产率达到97％后，将三通阀门2与萃取器6的第二进液口4连通而关闭三通阀门2与层析柱1的连接，形成萃取通路，反应液经循环泵12通过第二进液管4进入萃取器6，同时萃取剂通过蠕动泵11经第一进液管3进入萃取器6中，以4mL/min的流速泵入空气10min，利用空气压力使反应液与萃取剂混合均匀，并从分液漏斗上出气口7排出，在萃取器中进行萃取反应，反应结束后，等待溶液分层，并依次获得上下层溶液，通过该方法可使萃取回收率达到90％以上。打开旋塞8，收集产物到收集罐10中，提取得到产物；当反应液全部进入分液漏斗中后，关闭三通阀门2与萃取器6的第二进液口4的连接，将三通阀门2与层析柱1连通，使得反应与萃取同步进行。

利用该反应装置可以很好地实现酶催化反应与萃取过程的结合偶联，有效减少了产物后处理的步骤，进一步提高了反应效率。

Claims

1.一种基于蛋白质标签自组装的固定化羰基还原酶，其特征在于，所述固定化羰基还原酶是将融合羰基还原酶的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎，破碎液经离心后所得沉淀用含体积浓度0.5-2％Triton X-100的PB缓冲液洗涤，随后用PB缓冲液洗涤并重悬于PB缓冲液中，即为固定化羰基还原酶酶液；所述融合羰基还原酶是将源自雷弗松氏菌的SEQ ID NO.2所示LXCAR-S154Y基因编码蛋白的N端通过连接肽与SEQ ID NO.3所示CipA基因编码蛋白的C端连接构成。

2.如权利要求1所述的固定化羰基还原酶，其特征在于，所述连接肽氨基酸序列为：GGGGSGGGGS。

3.如权利要求1所述的固定化羰基还原酶，其特征在于，所述固定化羰基还原酶酶液按如下步骤制备：将融合羰基还原酶的基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃、180rpm培养12h后，以体积浓度1％比例取菌液加入LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8；随后，加入0.1-0.8mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并于30℃、200rpm培养1-20h以诱导蛋白表达；培养后的菌液经离心分离，湿菌体用PB缓冲液重悬，随后在冰浴条件下通过超声破碎裂解细胞；破碎液经离心，沉淀用含有体积浓度0.5-2％Triton X-100的PB缓冲液洗涤三次，随后用纯PB缓冲液洗涤一次，最后重悬于PB缓冲液中，即为固定化羰基还原酶酶液。

4.如权利要求3所述的固定化羰基还原酶，其特征在于，超声破碎条件为：功率360W、超声2s间歇5s，共超声40min。

5.一种权利要求1所述固定化羰基还原酶在制备阿瑞吡坦中间体中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以所述固定化羰基还原酶为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，以NADH为辅酶，以异丙醇为辅助底物和助溶剂，以pH 6.0-8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-55℃、150-300rpm条件下进行催化反应，反应液经分离纯化后获得(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇产物。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂用量以蛋白含量计为0.05～1mg/mL；底物初始加入浓度为10～2000mM；所述NADH加入终浓度为0.5～3mM；所述异丙醇体积加入量为20-70％。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的催化应用采用层析柱为反应器进行连续流酶催化反应，将所述固定化羰基还原酶加入层析柱中，再将底物溶液经循环泵连续泵入层析柱中直至底物被完全催化，反应结束后，反应液经分离纯化，获得(R)-3，5-双三氟甲基苯乙醇产物；所述底物溶液组成：0.5-3mM NADH、体积浓度20-70％异丙醇、10～2000mM3,5-双三氟甲基苯乙酮，溶剂为PB缓冲液；所述底物溶液通入的速度为2-6mL/min；所述固定化羰基还原酶装填量以层析柱容积计为0.5-1.5g/L。

9.一种用于固定化羰基还原酶制备阿瑞吡坦中间体的连续流催化与萃取偶联反应装置，其特征在于，所述连续流催化与萃取偶联反应装置包括层析柱1、萃取器6、蠕动泵11、循环泵12、萃取剂容器9、收集器10、底物溶液储罐13；所述萃取器6为侧壁带有出气口7的分液漏斗，所述分液漏斗顶部配有活塞5，底部设有用于控制出液口的旋塞8；所述活塞5顶端设有第一进液管3和第二进液管4，第一进液管3与第二进液管4在活塞内部交汇成一个通道并向下延伸，交汇处高度至少低于两处进液管高度1cm，延伸长度短于分液漏斗高度；所述底物溶液储罐13为三口烧瓶，设置取样口14；所述层析柱1的顶端通过硅胶管与三通阀2相连，同时三通阀2通过硅胶管与循环泵12连接，所述循环泵12与底物溶液储罐13连接，所述底物溶液储罐13与层析柱1的底端连接形成反应通路；所述萃取器6的出液口与收集器10连通，所述萃取器6顶端的第一进液管3通过硅胶管与蠕动泵11连接，所述蠕动泵11通过硅胶管与萃取剂容器9连接，萃取剂通过蠕动泵泵入分液漏斗；所述第二进液管4通过硅胶管与三通阀2相连形成萃取通路。

10.如权利要求9所述的装置，其特征在于，所述连续流催化与萃取偶联反应装置具操作方法为：将底物溶液加入底物溶液储罐13，萃取剂加入萃取剂容器9，反应开始时，将三通阀门2与循环泵12连通，关闭三通阀门2与萃取器6第二进液口4的连接，底物溶液从底物溶液储罐13通过循环泵12经三通阀2从顶部进入层析柱1中，反应液回到底物溶液储罐13再进入循环泵12形成循环的反应通路；从底物溶液储罐13的取样口14取样检测反应结束后，将三通阀门2与萃取器6的第二进液口4连通而关闭三通阀门2与层析柱1的连接，反应液经循环泵12通过第二进液管4进入萃取器6，同时萃取剂通过蠕动泵11经第一进液管3进入萃取器6中，以2-6mL/min的流速泵入空气5-15min，利用空气压力使反应液与萃取剂混合均匀，并从分液漏斗上出气口7排出，在萃取器中进行萃取反应，反应结束后，打开旋塞8，收集产物到收集罐10中，提取得到产物；当反应液全部进入分液漏斗中后，关闭三通阀门2与萃取器6的第二进液口4的连接，将三通阀门2与层析柱1连通，使得催化反应与萃取同步进行。