CN113373191A - 一种烟酰胺单核苷酸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种烟酰胺单核苷酸及其制备方法,其制备方法包括:向缓冲液中加入核糖‑1‑磷酸、烟酰胺和腺苷三磷酸,在Mg2+存在的条件下,调节缓冲液的pH和温度,加入催化酶,进行酶促反应,即得;所述核糖‑1‑磷酸、烟酰胺和腺苷三磷酸的摩尔比为(0.5‑3):(1‑4):(1‑6),所述催化酶为PNP II酶和NRK酶。本发明采用价廉易得的核糖‑1‑磷酸、烟酰胺和腺苷三磷酸为原料,在PNP II酶和NRK酶的催化下,实现了一步全酶法合成烟酰胺单核苷酸,提高其整体收率,同时提高了NMN的单次产量,并降低其成本,实际应用前景好。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物技术领域,更具体地,涉及一种烟酰胺单核苷酸及其制备方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,简称NMN)是一种重要的物质,其分子量为334.2192,是人体固有的物质之一,也富在一些水果和蔬菜中;NMN在人体细胞能量生成中扮演重要角色,是细胞内NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,细胞能量转化的重要辅酶)的合成中间体,在细胞的能量代谢中起到关键的作用,在医药领域具有巨大的应用价值。
研究表明,NMN作用于小鼠可显示抗衰老作用,且NMN对于糖尿病、阿尔茨海默症和心力衰竭等疾病的预防以及症状的改善有明显效果,因此,我们期待能规模化生产NMN。
申请号为201880054836.6的中国发明专利申请公开了烟酰胺单核苷酸的制造方法及该方法所使用的转化体,其使用烟酰胺、D-核糖以及腺苷三磷酸来合成NMN,但是整体得率偏低,导致成本高昂;申请号为201611245619.4的中国发明专利申请公开了一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法,其以化学合成的烟酰胺核苷为底物,利用烟酰胺核苷激酶催化合成NMN,但是化学合成所引入的有机杂质可能会影响人体健康;“New function forEscherichia coli xanthosine phophorylase(xapA):genetic and biochemicalevidences on its participation in NAD+salvage from nicotinamide”也公开了一种烟酰胺核苷磷酸化酶。
鉴于此,如何在现有技术的基础上,进一步优化烟酰胺单核苷酸的制备方法,提高其整体收率,并降低其成本,是本领域技术人员亟待解决的关键技术问题。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题,本发明提供了一种烟酰胺单核苷酸及其制备方法。
本发明采用如下技术方案:
一种烟酰胺单核苷酸的制备方法,包括:
向缓冲液中加入核糖-1-磷酸、烟酰胺和腺苷三磷酸,在Mg2+存在的条件下,调节缓冲液的pH和温度,加入催化酶,进行酶促反应,即得。
其具体工艺路线如下所示:
在上述技术方案中,所述核糖-1-磷酸、烟酰胺和腺苷三磷酸的摩尔比为(0.5-3):(1-4):(1-6)。
具体地,在本发明的具体实施方式中,所述核糖-1-磷酸可以是市售产品,也以为化学法合成得到的,也可以为生物催化法(如胞苷+磷酸盐、肌苷+磷酸盐等)合成得到的。
在上述技术方案中,所述缓冲液的pH调节为3-9。
在本发明的一个优选实施方式中,所述缓冲液的pH调节为5.5-8。
在上述技术方案中,所述缓冲液的温度调节为4-60℃。
在本发明的一个优选实施方式中,所述缓冲液的温度调节为25-40℃。
进一步地,在上述技术方案中,所述催化酶为PNP II酶和NRK酶。
具体地,在本发明的具体实施方式中,所述PNP II酶和NRK酶的加入量之比为2-3:1。
又进一步地,在上述技术方案中,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液和Tric-HCl缓冲液中的一种或多种。
又进一步地,在上述技术方案中,所述缓冲液中Mg2+的浓度为5-40mM,优选为15-30mM。
在本发明的具体实施方式中,所述制备方法还包括,将酶促反应后的反应产物进行后处理。
具体地,在本发明的具体实施方式中,所述后处理具体为通过HZ-818型大孔树脂吸附。
本发明另一方面还提供了上述制备方法制备得到的烟酰胺单核苷酸。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明采用价廉易得的核糖-1-磷酸、烟酰胺和腺苷三磷酸为原料,在PNP II酶和NRK酶的催化下,实现了一步全酶法合成烟酰胺单核苷酸(NMN),提高其整体收率,同时提高了NMN的单次产量,并降低其成本,实际应用前景好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明,以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例,仅用于说明本发明,但不止用来限制本发明的范围。
基于本发明中的具体实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下,所获得的其他所有实施例,都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中,若无特殊说明,所有组件均为本领域技术人员熟知的市售产品。
在本发明实施例中,若未具体指明,所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本发明实施例提供了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。
1、原料
2、工艺方法
将核糖-1-磷酸环己铵盐、烟酰胺、腺苷三磷酸和六水氯化镁加入到三乙醇胺缓冲液中,混匀后调节缓冲液的pH和温度分别为8和55℃,加入PNPII酶和NRK酶,保温搅拌进行酶促反应,直至核糖-1-磷酸环己铵盐消耗完毕后,通过HZ-818型大孔树脂吸附,重结晶后得到780g NMN,其核糖-1-磷酸环己铵盐的转化率达到90%以上。
实施例2
本发明实施例提供了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。
1、原料
2、工艺方法
将上述除酶以外的各原料加入到磷酸盐缓冲液中,混匀后调节缓冲液的pH和温度分别为3和8℃,加入胞苷磷酸化酶、PNPII酶和NRK酶,保温搅拌进行酶促反应,直至胞苷消耗完毕后,通过HZ-818型大孔树脂吸附,重结晶后得到1373.2g NMN,其胞苷的转化率达到90%以上。
实施例3
本发明实施例提供了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。
1、原料
2、工艺方法
将上述除酶以外的各原料加入到磷酸盐缓冲液中,混匀后调节缓冲液的pH和温度分别为5.5和37.8℃,加入腺苷磷酸化酶、PNPII酶和NRK酶,保温搅拌进行酶促反应,直至胞苷消耗完毕后,通过HZ-818型大孔树脂吸附,重结晶后得到1250g NMN,其胞苷的转化率达到90%以上。
实施例4
本发明实施例提供了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。
1、原料
2、工艺方法
将上述除酶以外的各原料加入到Tric-HCl缓冲液中,混匀后调节缓冲液的pH和温度分别为6和20℃,加入鸟苷磷酸化酶、PNPII酶和NRK酶,保温搅拌进行酶促反应,直至胞苷消耗完毕后,通过HZ-818型大孔树脂吸附,重结晶后得到1179.4g NMN,其胞苷的转化率达到90%以上。
实施例5
本发明实施例提供了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。
1、原料
2、工艺方法
将上述除酶以外的各原料加入到磷酸盐缓冲液中,混匀后调节缓冲液的pH和温度分别为4.8和30℃,加入尿苷磷酸化酶、PNPII酶和NRK酶,保温搅拌进行酶促反应,直至胞苷消耗完毕后,通过HZ-818型大孔树脂吸附,重结晶后得到13367.8g NMN,其胞苷的转化率达到90%以上。
实施例6
本发明实施例提供了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。
1、原料
2、工艺方法
将上述除酶以外的各原料加入到磷酸盐缓冲液中,混匀后调节缓冲液的pH和温度分别为7.5和37℃,加入肌苷磷酸化酶、PNPII酶和NRK酶,保温搅拌进行酶促反应,直至胞苷消耗完毕后,通过HZ-818型大孔树脂吸附,重结晶后得到1245.3g NMN,其胞苷的转化率达到95%以上。
实施例7
本发明实施例提供了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。
1、原料
2、工艺方法
将上述除酶以外的各原料加入到磷酸盐缓冲液中,混匀后调节缓冲液的pH和温度分别为6和37℃,加入黄苷磷酸化酶、PNPII酶和NRK酶,保温搅拌进行酶促反应,直至胞苷消耗完毕后,通过HZ-818型大孔树脂吸附,重结晶后得到1175.2g NMN,其胞苷的转化率达到97.5%以上。
实施例8
本发明实施例提供了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。
1、原料
2、工艺方法
将上述除酶以外的各原料加入到磷酸盐缓冲液中,混匀后调节缓冲液的pH和温度分别为7和37℃,加入胸苷磷酸化酶、PNPII酶和NRK酶,保温搅拌进行酶促反应,直至胞苷消耗完毕后,通过HZ-818型大孔树脂吸附,重结晶后得到1378.8g NMN,其胞苷的转化率达到97%以上。
在此有必要指出的是,以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明,并不是对本发明的技术方案的进一步的限制,本发明的方法仅为较佳的实施方案,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种烟酰胺单核苷酸的制备方法,其特征在于,
包括:向缓冲液中加入核糖-1-磷酸、烟酰胺和腺苷三磷酸,在Mg2+存在的条件下,调节缓冲液的pH和温度,加入催化酶,进行酶促反应,即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
所述核糖-1-磷酸、烟酰胺和腺苷三磷酸的摩尔比为(0.5-3):(1-4):(1-6)。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
所述缓冲液的pH调节为3-9,优选为5.5-8。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
所述缓冲液的温度调节为4-60℃,优选为25-40℃。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法,其特征在于,
所述催化酶为PNP II酶和NRK酶。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,
所述PNP II酶和NRK酶的加入量之比为2-3:1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法,其特征在于,
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液和Tric-HCl缓冲液中的一种或多种。
8.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法,其特征在于,
所述缓冲液中Mg2+的浓度为5-40mM,优选为15-30mM。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法,其特征在于,
还包括,将酶促反应后的反应产物进行后处理;
所述后处理具体为通过HZ-818型大孔树脂吸附。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的烟酰胺单核苷酸。
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