JP2017023138A - 糖ヌクレオチド合成触媒組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】糖ヌクレオチドの合成において、使用する酵素の種類を減らすことができる糖ヌクレオチド合成触媒組成物を提供することにある。更に詳しくは、ＡＴＰの再生活性と、糖ヌクレオチドの合成に対する活性を有する糖ヌクレオチド合成触媒組成物を提供することにある。【解決手段】下記反応（ａ）及び反応（ｂ）を含む糖ヌクレオチド合成方法に用いる糖ヌクレオチド合成触媒組成物であって、所定のアミノ酸配列を含むタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターが導入された宿主の形質転換体、又は所定の塩基配列を遺伝子に有する細胞のいずれか少なくとも１つを含有する糖ヌクレオチド合成触媒組成物。（ａ）糖リン酸とＵＴＰから、糖残基が単糖由来であるＵＤＰ−糖を合成する反応（ｂ）ＡＭＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応、又はＡＤＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応【選択図】なし
Description
本発明は、糖ヌクレオチド合成触媒組成物に関する。より詳しくはＡＴＰの再生活性及び糖転移活性を有する糖ヌクレオチド合成触媒組成物に関する。
糖ヌクレオチド合成触媒組成物として、１）化学触媒（非特許文献１）、２）酵素（特許文献１）、３）酵母等の微生物乾燥菌体（特許文献２）等が知られている。
１）の場合、原料としてヌクレオシド一リン酸（以下、ＮＭＰと略記）の誘導体や糖リン酸等が必要であり、２）の場合、原料としてヌクレオシド三リン酸（以下、ＮＴＰと略記）、ホスホエノールピルビン酸、糖リン酸等やピルビン酸キナーゼ等の多数の酵素が必要であり、３）の場合、菌体の乾燥工程等が必要である。上記いずれの場合においても、原料として高価なヌクレオチドや糖リン酸等が必要であるという課題又は大量生産が困難な工程が必要であるため、糖ヌクレオチドを効率的に合成できていないという課題がある。
１）の場合、原料としてヌクレオシド一リン酸（以下、ＮＭＰと略記）の誘導体や糖リン酸等が必要であり、２）の場合、原料としてヌクレオシド三リン酸（以下、ＮＴＰと略記）、ホスホエノールピルビン酸、糖リン酸等やピルビン酸キナーゼ等の多数の酵素が必要であり、３）の場合、菌体の乾燥工程等が必要である。上記いずれの場合においても、原料として高価なヌクレオチドや糖リン酸等が必要であるという課題又は大量生産が困難な工程が必要であるため、糖ヌクレオチドを効率的に合成できていないという課題がある。
２）の場合、ＡＴＰの再生反応と組み合わせることで、安価な単糖から糖リン酸を合成し（非特許文献２）、合成した糖リン酸から糖ヌクレオチドを合成することで高価な原料であるＡＴＰを再生して糖ヌクレオチドを合成する方法が知られている。しかし、ＡＴＰの再生反応、糖リン酸の合成及び糖ヌクレオチドの合成のそれぞれにおいて、アデニル酸キナーゼやポリリン酸キナーゼ等の複数の酵素が必要であり、使用する酵素の種類を減らすことが出来る方法が望まれていた。
ＢＵＬＬＥＴＩＮ ＯＦ ＴＨＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＳＯＣＩＥＴＹ ＯＦ ＪＡＰＡＮ，１９７３，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．１０，ｐ．３２７５−３２７７
ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２０００，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．５，ｐ２０４５−２０５１
特表平７−５０８４１３号公報
特公昭４５−２０７３号公報
本発明の目的は、糖ヌクレオチドの合成において、使用する酵素の種類を減らすことができる糖ヌクレオチド合成触媒組成物を提供することにある。更に詳しくは、ＡＴＰの再生活性と、糖ヌクレオチドの合成に対する活性を有する糖ヌクレオチド合成触媒組成物を提供することにある。
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。即ち、本発明は、下記反応（ａ）及び反応（ｂ）を含む糖ヌクレオチド合成方法に用いる糖ヌクレオチド合成触媒組成物であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）を満たす糖ヌクレオチド合成触媒組成物である。
（ａ）糖リン酸とウリジン三リン酸（以下、ＵＴＰと略記）から、糖残基が単糖由来であるウリジン二リン酸（以下、ＵＤＰと略記）−糖を合成する反応
（ｂ）アデノシン一リン酸（以下、ＡＭＰと略記）とＵＴＰからアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略記）を合成する反応、又はアデノシン二リン酸（以下、ＡＤＰと略記）とＵＴＰからＡＴＰを合成する反応
（ｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ１）及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上１００％未満であるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ２）を含有する。
（ｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、前記タンパク質（ｃ１）又は前記タンパク質（ｃ２）をコードする核酸（ｄ）を含む組換えベクター（ｅ）が導入された、動物細胞、植物細胞又は微生物の形質転換体（ｆ）を含有する。
（ｉｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、前記核酸（ｄ）の塩基配列を遺伝子に有する細胞（ｇ）を含有する。
（ａ）糖リン酸とウリジン三リン酸（以下、ＵＴＰと略記）から、糖残基が単糖由来であるウリジン二リン酸（以下、ＵＤＰと略記）−糖を合成する反応
（ｂ）アデノシン一リン酸（以下、ＡＭＰと略記）とＵＴＰからアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略記）を合成する反応、又はアデノシン二リン酸（以下、ＡＤＰと略記）とＵＴＰからＡＴＰを合成する反応
（ｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ１）及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上１００％未満であるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ２）を含有する。
（ｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、前記タンパク質（ｃ１）又は前記タンパク質（ｃ２）をコードする核酸（ｄ）を含む組換えベクター（ｅ）が導入された、動物細胞、植物細胞又は微生物の形質転換体（ｆ）を含有する。
（ｉｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、前記核酸（ｄ）の塩基配列を遺伝子に有する細胞（ｇ）を含有する。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、ＡＴＰの再生活性を有し、かつ糖ヌクレオチドの合成において糖転移活性を有することで効率的に糖ヌクレオチドを合成できるという効果を奏する。
なお、本発明において、「効率的に糖ヌクレオチドを合成できる」とは、ひとつの酵素でＡＴＰの再生及び糖ヌクレオチドの合成を同時に行うことを意味する。
なお、本発明において、「効率的に糖ヌクレオチドを合成できる」とは、ひとつの酵素でＡＴＰの再生及び糖ヌクレオチドの合成を同時に行うことを意味する。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、下記反応（ａ）及び反応（ｂ）を含む糖ヌクレオチド合成方法に用いる糖ヌクレオチド合成触媒組成物である。
（ａ）糖リン酸とウリジン三リン酸（以下、ＵＴＰと略記）から、糖残基が単糖由来であるウリジン二リン酸（以下、ＵＤＰと略記）−糖を合成する反応
（ｂ）アデノシン一リン酸（以下、ＡＭＰと略記）とＵＴＰからアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略記）を合成する反応、又はアデノシン二リン酸（以下、ＡＤＰと略記）とＵＴＰからＡＴＰを合成する反応
（ａ）糖リン酸とウリジン三リン酸（以下、ＵＴＰと略記）から、糖残基が単糖由来であるウリジン二リン酸（以下、ＵＤＰと略記）−糖を合成する反応
（ｂ）アデノシン一リン酸（以下、ＡＭＰと略記）とＵＴＰからアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略記）を合成する反応、又はアデノシン二リン酸（以下、ＡＤＰと略記）とＵＴＰからＡＴＰを合成する反応
反応（ａ）において糖残基の由来となる単糖としては、合成効率の観点から好ましいのは、Ｎ−アセチルヘキソサミン等が挙げられる。
Ｎ−アセチルヘキソサミンとしては、ヘキソースが有するヒドロキシル基のうち１つがアミノ基に置換されたヘキソサミンのアミノ基がアセチル化されたものが含まれ、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルマンノサミン等が挙げられる。
Ｎ−アセチルヘキソサミンとしては、ヘキソースが有するヒドロキシル基のうち１つがアミノ基に置換されたヘキソサミンのアミノ基がアセチル化されたものが含まれ、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルマンノサミン等が挙げられる。
反応（ａ）において用いる糖リン酸としては、合成効率の観点から好ましいのは、Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸等が挙げられる。
Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸としては、ヘキソースが有するヒドロキシル基のうち１つがアミノ基に置換されたヘキソサミンのアミノ基がアセチル化されたものが含まれ、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン−１−リン酸及びＮ−アセチルマンノサミン−１−リン酸等が挙げられる。
Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸としては、ヘキソースが有するヒドロキシル基のうち１つがアミノ基に置換されたヘキソサミンのアミノ基がアセチル化されたものが含まれ、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン−１−リン酸及びＮ−アセチルマンノサミン−１−リン酸等が挙げられる。
反応（ａ）において用いる糖リン酸は、下記の反応（ｂ）において合成されたＡＴＰ及び単糖から合成された糖リン酸であることが好ましい。すなわち、反応（ａ）は、反応（ｂ）において合成されたＡＴＰ及び単糖から合成された糖リン酸と、ＵＴＰから、ＵＤＰ−糖を合成する反応であることが好ましい。
反応（ｂ）は、前述の通り、ＡＭＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応、又はＡＤＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応である。
ＡＭＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応においては、まず、ＡＭＰとＵＴＰからＡＤＰが合成され、合成されたＡＤＰは、更にＵＴＰと反応してＡＴＰとなる。
反応（ｂ）において合成されたＡＴＰは、更に糖と反応することで糖リン酸となり、生成した糖リン酸は前記反応（ａ）に用いることができる。
ＡＭＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応においては、まず、ＡＭＰとＵＴＰからＡＤＰが合成され、合成されたＡＤＰは、更にＵＴＰと反応してＡＴＰとなる。
反応（ｂ）において合成されたＡＴＰは、更に糖と反応することで糖リン酸となり、生成した糖リン酸は前記反応（ａ）に用いることができる。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、下記（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）満たす糖ヌクレオチド合成触媒組成物であり、反応（ａ）において糖ヌクレオチドの合成触媒及び反応（ｂ）においてＡＴＰを合成する反応触媒として作用する。
（ｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ１）及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上１００％未満であるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ２）を含有する。
（ｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）をコードする核酸（ｄ）を含む組換えベクター（ｅ）が導入された、動物細胞、植物細胞又は微生物の形質転換体（ｆ）を含有する。
（ｉｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、核酸（ｄ）の塩基配列を遺伝子に有する細胞（ｇ）を含有する。
（ｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ１）及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上１００％未満であるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ２）を含有する。
（ｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）をコードする核酸（ｄ）を含む組換えベクター（ｅ）が導入された、動物細胞、植物細胞又は微生物の形質転換体（ｆ）を含有する。
（ｉｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、核酸（ｄ）の塩基配列を遺伝子に有する細胞（ｇ）を含有する。
本発明のタンパク質（ｃ１）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
また、本発明のタンパク質（ｃ２）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上１００％未満であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
また、本発明のタンパク質（ｃ２）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上１００％未満であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
配列番号１は４５６個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列であり、ＡＴＰを再生する機能（以下、ＡＴＰ再生活性という）と、糖ヌクレオチド（好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルヘキソサミン）の合成において、リン酸（好ましくはＵＴＰ）に糖（好ましくはＮ−アセチルヘキソサミン）を転移する反応を触媒する機能（以下、糖転移活性という）とを有するアミノ酸配列である。
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ１）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでいればよいが、触媒活性の観点から、１〜５個が好ましい。
タンパク質（ｃ１）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むことにより、ＡＴＰ再生活性と、糖ヌクレオチドの合成における糖転移活性を有する。
タンパク質（ｃ１）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むことにより、ＡＴＰ再生活性と、糖ヌクレオチドの合成における糖転移活性を有する。
また、タンパク質（ｃ１）は、更に１〜１００個（反応性の観点から、好ましくは１〜５０個）のアミノ酸で構成された他のアミノ酸配列を有していてもよい。
タンパク質（ｃ２）は、配列番号１のアミノ酸配列との相同性が７０％以上１００％未満であるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、タンパク質（ｃ２）が有するアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同等であるので、タンパク質（ｃ１）と同様にＡＴＰ再生活性と、糖ヌクレオチドの合成における糖転移活性を有する。
本発明における相同性とは、アミノ酸配列同士の類似性である。
本発明における相同性は以下のデータベースにより算出できる。
ＤＮＡデータバンクジャパンの提供する配列比較プログラム「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）
本発明における相同性とは、アミノ酸配列同士の類似性である。
本発明における相同性は以下のデータベースにより算出できる。
ＤＮＡデータバンクジャパンの提供する配列比較プログラム「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）
また、タンパク質（ｃ２）は、更に１〜１００個（反応性の観点から、好ましくは１〜５０個）のアミノ酸で構成された他のアミノ酸配列を有していてもよい。
タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）であるかは、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によってアミノ酸配列を決定することにより確認することができる。
また、天然物から抽出したタンパク質が、タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）に該当するかどうかは、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって、抽出したタンパク質のアミノ酸配列を決定し、ＤＮＡデータバンクジャパンの提供する配列比較プログラム「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いてタンパク質（ｃ１）又は（ｃ２）の配列と相同部分を検索することにより決定できる。
また、天然物から抽出したタンパク質が、タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）に該当するかどうかは、ペプチドマッピング法等の一般的な方法によって、抽出したタンパク質のアミノ酸配列を決定し、ＤＮＡデータバンクジャパンの提供する配列比較プログラム「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いてタンパク質（ｃ１）又は（ｃ２）の配列と相同部分を検索することにより決定できる。
上記タンパク質（ｃ１）及びタンパク質（ｃ２）は、タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）をコードする核酸（ｄ）を含む組換えベクター（ｅ）を用いて、以下に詳述する方法で、形質転換体（ｆ）を作成し、この形質転換体（ｆ）を培養液中で培養し、培養液中からタンパク質（ｃ１）及びタンパク質（ｃ２）を採取及び精製することによって生産することができる。なお、タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）をコードする核酸（ｄ）は、自然界等から得ることも可能ではあるが、更に部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）等に記載の手法］を利用して調製することもできる。
形質転換体（ｆ）を得るために用いる組換えベクター（ｅ）は、核酸（ｄ）の核酸を含む組換えベクターである。
組換えベクターは、適当なベクターに上記核酸（ｄ）を挿入することによって得ることができる。
ベクターは種々のものが公知であり、市販品も多く存在する。当業者であれば、宿主の種類に応じて適切なベクターを容易に選択することができる。ベクターの具体例としては、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣシリーズなどが挙げられる。
組換えベクターの調製方法自体は周知の常法である。
組換えベクターは、適当なベクターに上記核酸（ｄ）を挿入することによって得ることができる。
ベクターは種々のものが公知であり、市販品も多く存在する。当業者であれば、宿主の種類に応じて適切なベクターを容易に選択することができる。ベクターの具体例としては、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣシリーズなどが挙げられる。
組換えベクターの調製方法自体は周知の常法である。
形質転換体（ｆ）は、核酸（ｄ）を含む組換えベクター（ｅ）が導入された宿主の形質転換体である。形質転換体（ｆ）は、組換えベクター（ｅ）を含有する。
形質転換体（ｆ）を得るために用いる宿主としては、動物細胞、植物細胞及び微生物等が挙げられる。
動物細胞としては、特に限定されないが、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等が挙げられる。
植物細胞としては、特に限定されないが、ＢＹ−２細胞等が挙げられる。
微生物としては、特に限定されないが、細菌及び酵母等が挙げられる。
動物細胞としては、特に限定されないが、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等が挙げられる。
植物細胞としては、特に限定されないが、ＢＹ−２細胞等が挙げられる。
微生物としては、特に限定されないが、細菌及び酵母等が挙げられる。
細菌としては、真正細菌及び古細菌等が挙げられる。
また、真正細菌としては、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が挙げられる。
グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。
グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属 (Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属)、ラクトコッカス属 (Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属)、エンテロコッカス属 (Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属)、ペディオコッカス属(Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属)、リューコノストック属 (Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属)、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）等が挙げられる。
また、真正細菌としては、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が挙げられる。
グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。
グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属 (Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属)、ラクトコッカス属 (Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属)、エンテロコッカス属 (Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属)、ペディオコッカス属(Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属)、リューコノストック属 (Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属)、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）等が挙げられる。
タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）を得るために用いる宿主としては、クローニングの容易さの観点から、微生物が好ましく、更に好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）及びブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）であり、特に好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）である。
宿主を形質転換して形質転換体（ｆ）を得る具体的な方法としては、エレクトロポレーション法及びカルシウム法等が挙げられる。
形質転換体（ｆ）の培養は、微生物等の宿主の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に、形質転換体（ｆ）を接種し、常法に従って行えばよい。
本発明において、形質転換体（ｆ）を培養した培養液からタンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）を採取及び精製する方法としては、常法に準じて行うことができる。例えば、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが、さらに公知の方法［Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ（１９９０）等に記載の方法］により結晶化や造粒化することができる。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物において、核酸（ｄ）は、反応性の観点から、大腸菌（エシェリチア属菌等）由来であることが好ましく、タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）は、大腸菌由来の核酸（ｄ）を用いて得られるタンパク質であることが好ましい。
前記（ｉｉ）において、糖ヌクレオチド合成触媒組成物が含む形質転換体（ｆ）は、タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）の製造方法において説明した形質転換体（ｆ）と同じである。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、形質転換体（ｆ）を含有する場合、反応用液中で形質転換体（ｆ）が、ＡＴＰ再生活性と、糖ヌクレオチドの合成における糖転移活性を有するタンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）を生成するため、糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、本発明の効果を奏することができる。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、形質転換体（ｆ）を含有する場合、反応用液中で形質転換体（ｆ）が、ＡＴＰ再生活性と、糖ヌクレオチドの合成における糖転移活性を有するタンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）を生成するため、糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、本発明の効果を奏することができる。
前記（ｉｉｉ）において、細胞（ｇ）は、遺伝子の塩基配列に、核酸（ｄ）の塩基配列を有する細胞である。
細胞としては、タンパク質（ｃ１）及びタンパク質（ｃ２）の説明で例示した微生物及び植物細胞等が挙げられる。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、細胞（ｇ）を含有する場合、反応用液中で細胞（ｇ）が、ＡＴＰ再生活性と、糖ヌクレオチドの合成における糖転移活性を有するタンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）を生成するため、糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、本発明の効果を奏することができる。
細胞としては、タンパク質（ｃ１）及びタンパク質（ｃ２）の説明で例示した微生物及び植物細胞等が挙げられる。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、細胞（ｇ）を含有する場合、反応用液中で細胞（ｇ）が、ＡＴＰ再生活性と、糖ヌクレオチドの合成における糖転移活性を有するタンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）を生成するため、糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、本発明の効果を奏することができる。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物としては、合成の効率の観点から、少なくともタンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）の内いずれかを含むことが好ましい。
タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）は、前記組換えベクター（ｅ）を用いて宿主を形質転換した組換えベクター（ｅ）を含む形質転換体（ｆ）を培養した培養液から公知の方法で採取することができ、採取したタンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）に核酸（ｄ）、ベクター（ｅ）及び形質転換体（ｆ）のうちいずれかの成分が含まれていても良い。
タンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）は、前記組換えベクター（ｅ）を用いて宿主を形質転換した組換えベクター（ｅ）を含む形質転換体（ｆ）を培養した培養液から公知の方法で採取することができ、採取したタンパク質（ｃ１）又はタンパク質（ｃ２）に核酸（ｄ）、ベクター（ｅ）及び形質転換体（ｆ）のうちいずれかの成分が含まれていても良い。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ１）及び／若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上１００％未満であるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ２）、（ｉｉ）前記組換えベクター（ｅ）で形質転換された形質転換体（ｆ）、又は（ｉｉｉ）核酸（ｄ）の塩基配列を遺伝子に有する細胞（ｇ）の少なくともいずれか１つを有するので、ＡＴＰの再生活性と、糖ヌクレオチドの合成における糖転移活性を有する。
このため、ＡＭＰ又はＡＤＰと、ＵＴＰと、単糖とを、使用する単糖に対応するキナーゼ（例えば、単糖がＮ−アセチルヘキソサミンの場合は、Ｎ−アセチルヘキソサミンキナーゼ）及び本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物存在下で反応させるという１回の工程で、反応（ａ）及び反応（ｂ）を経て単糖から糖ヌクレオチドを合成することができる。
上記の工程において、本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物以外に、使用する触媒（酵素）は、前記の単糖に対応するキナーゼのみである。
このため、ＡＭＰ又はＡＤＰと、ＵＴＰと、単糖とを、使用する単糖に対応するキナーゼ（例えば、単糖がＮ−アセチルヘキソサミンの場合は、Ｎ−アセチルヘキソサミンキナーゼ）及び本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物存在下で反応させるという１回の工程で、反応（ａ）及び反応（ｂ）を経て単糖から糖ヌクレオチドを合成することができる。
上記の工程において、本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物以外に、使用する触媒（酵素）は、前記の単糖に対応するキナーゼのみである。
例えば、単糖がＮ−アセチルヘキソサミンである場合に、本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物と、酵素としてＮ−アセチルヘキソサミンキナーゼ１種とを用いて反応（ａ）及び反応（ｂ）を経て、単糖から糖ヌクレオチドを合成することができる。
すなわち、本発明の合成触媒組成物の作用によりＡＭＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応又はＡＤＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応［反応（ｂ）］が進行し、更にＮ−アセチルヘキソサミンキナーゼの作用によりＮ−アセチルヘキソサミンと前記反応（ｂ）で合成されたＡＴＰとから糖リン酸（Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸）が得られ、更に、本発明の合成触媒組成物の作用により糖リン酸（Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸）とＵＴＰとから糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルヘキソサミン）を合成する反応［反応（ａ）］が進行する。
すなわち、本発明の合成触媒組成物の作用によりＡＭＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応又はＡＤＰとＵＴＰからＡＴＰを合成する反応［反応（ｂ）］が進行し、更にＮ−アセチルヘキソサミンキナーゼの作用によりＮ−アセチルヘキソサミンと前記反応（ｂ）で合成されたＡＴＰとから糖リン酸（Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸）が得られ、更に、本発明の合成触媒組成物の作用により糖リン酸（Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸）とＵＴＰとから糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルヘキソサミン）を合成する反応［反応（ａ）］が進行する。
Ｎ−アセチルヘキソサミンキナーゼの作用により、Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸を合成する反応において、ＡＤＰが副生する。副生したＡＤＰは、反応（ｂ）においてのＵＴＰと反応することでＡＴＰとして再生され、Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸を合成する反応で消費されたＡＴＰを補う。そのため、高価なＡＴＰの使用量を抑えることができるという効果も有する。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物が触媒として作用する反応（ａ）は、例えば、糖リン酸であるＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、ＵＴＰ、糖ヌクレオチド合成触媒組成物、２価の金属塩（塩化マグネシウム及び塩化カルシウム等）を含むリン酸緩衝液を反応液として調製し、この反応液を所定の温度で培養することで行うことができる。なかでも以下のような条件で反応を行うことが合成効率の観点から好ましい。
反応液中での、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸及びＵＴＰの濃度は、それぞれ０．００１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
反応中での、２価の金属塩の濃度は、０．１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
用いるリン酸緩衝液は、１０〜２００ｍＭリン酸緩衝液であることが更に好ましい。
反応液のｐＨは、７〜８であることが好ましい。
反応液温度は、２５〜４０℃であることが好ましく、３０〜３８℃であることが更に好ましい。
反応液中での、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸及びＵＴＰの濃度は、それぞれ０．００１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
反応中での、２価の金属塩の濃度は、０．１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
用いるリン酸緩衝液は、１０〜２００ｍＭリン酸緩衝液であることが更に好ましい。
反応液のｐＨは、７〜８であることが好ましい。
反応液温度は、２５〜４０℃であることが好ましく、３０〜３８℃であることが更に好ましい。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物が触媒として作用する反応（ｂ）は、例えば、ＡＭＰ又はＡＤＰ、ＵＴＰ、糖ヌクレオチド合成触媒組成物、２価の金属塩（塩化マグネシウム及び塩化カルシウム等）を含むリン酸緩衝液を反応液として調製し、この反応液を所定の温度で培養することで行うことができる。なかでも以下のような条件で反応を行うことが合成効率の観点から好ましい。
反応液中での、ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＵＴＰの濃度は、それぞれ０．００１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
反応中での、２価の金属塩の濃度は、０．１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
用いるリン酸緩衝液は、１０〜２００ｍＭリン酸緩衝液であることが好ましい。
反応液のｐＨは、７〜８であることが好ましい。
反応液温度は、２５〜４０℃であることが好ましく、３０〜３８℃であることが更に好ましい。
反応液中での、ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＵＴＰの濃度は、それぞれ０．００１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
反応中での、２価の金属塩の濃度は、０．１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
用いるリン酸緩衝液は、１０〜２００ｍＭリン酸緩衝液であることが好ましい。
反応液のｐＨは、７〜８であることが好ましい。
反応液温度は、２５〜４０℃であることが好ましく、３０〜３８℃であることが更に好ましい。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物が触媒として作用させて、単糖から反応（ａ）及び反応（ｂ）を経て、糖ヌクレオチドを合成する反応としては、例えば、ＡＭＰ又はＡＤＰ、ＵＴＰ、糖であるＮ−アセチルグルコサミン、糖ヌクレオチド合成触媒組成物、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ、２価の金属塩（塩化マグネシウム及び塩化カルシウム等）を含むリン酸緩衝液を反応液として調製し、この反応液を所定の温度で培養することで行うことができる。なかでも以下のような条件で反応を行うことが合成効率の観点から好ましい。
反応液中での、ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＵＴＰの濃度は、それぞれ０．００１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
反応中での、２価の金属塩の濃度は、０．１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
用いるリン酸緩衝液は、１０〜２００ｍＭリン酸緩衝液であることが更に好ましい。
反応液のｐＨは、７〜８であることが好ましい。
反応液温度は、２５〜４０℃であることが好ましく、３０〜３８℃であることが更に好ましい。
反応液中での、ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＵＴＰの濃度は、それぞれ０．００１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
反応中での、２価の金属塩の濃度は、０．１〜１０００ｍＭであることが好ましい。
用いるリン酸緩衝液は、１０〜２００ｍＭリン酸緩衝液であることが更に好ましい。
反応液のｐＨは、７〜８であることが好ましい。
反応液温度は、２５〜４０℃であることが好ましく、３０〜３８℃であることが更に好ましい。
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜製造例１：糖ヌクレオチド合成触媒組成物（ｃ１）の製造＞
大腸菌由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号２）（５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩ認識配列、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を付加し、ライフテクノロジーズジャパン株式会社に合成を依頼したもの）にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んで、配列番号１のタンパク質（ｃ１）を発現するプラスミド（Ｐ−１）を作成した。作成したプラスミド（Ｐ−１）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、配列番号１のタンパク質（ｃ１）を発現する大腸菌（α）を作成した。
作成した大腸菌（α）を、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含有するＬＢ培養液２ｍｌに植菌し、一晩培養を行った。この培養液２ｍｌを１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含有するＬＢ培養液２０ｍｌに植菌し、３０℃で３時間振とう培養を行った後、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン及び０．１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）１００ｍｌに植菌して３０℃で培養を開始した。培養開始後、４０時間目に培養を停止し、培養液を回収した。続いて遠心分離機（６，０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収し、回収した大腸菌を、緩衝液Ａ｛１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム｝に再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラム［シグマアルドリッチジャパン（株）製］で精製を行い、（ｃ１）を含む糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）を得た。
大腸菌由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号２）（５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩ認識配列、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を付加し、ライフテクノロジーズジャパン株式会社に合成を依頼したもの）にＦＬＡＧタグを融合した遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んで、配列番号１のタンパク質（ｃ１）を発現するプラスミド（Ｐ−１）を作成した。作成したプラスミド（Ｐ−１）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、配列番号１のタンパク質（ｃ１）を発現する大腸菌（α）を作成した。
作成した大腸菌（α）を、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含有するＬＢ培養液２ｍｌに植菌し、一晩培養を行った。この培養液２ｍｌを１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含有するＬＢ培養液２０ｍｌに植菌し、３０℃で３時間振とう培養を行った後、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン及び０．１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）１００ｍｌに植菌して３０℃で培養を開始した。培養開始後、４０時間目に培養を停止し、培養液を回収した。続いて遠心分離機（６，０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収し、回収した大腸菌を、緩衝液Ａ｛１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム｝に再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラム［シグマアルドリッチジャパン（株）製］で精製を行い、（ｃ１）を含む糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）を得た。
＜糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）の濃度（糖ヌクレオチド合成活性）測定＞
水溶液ａ１｛１ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、１０ｍＭの塩化マグネシウム及び１ｍＭのＵＴＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝０．２ｍＬに、製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ１〜ｒ４）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ１〜ｒ４）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬを下記条件で高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
＜ＨＰＬＣの測定条件＞
以下において、ＨＰＬＣの測定条件は全て同じである。
装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステム［（株）島津製作所製］
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＩＥＣ ＤＥＡＥ−８２５［昭和電工（株）製］
移動相：０．０１〜０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０体積％アセトニトリル（ナカライテスク社製）水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ ＵＶ検出器
温度：３５℃
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ社製）を１００ｍＭリン酸緩衝液に１５ｍＭ、５ｍＭ、１．５ｍＭ及び０．５ｍＭの濃度となるようにそれぞれ溶解したＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン標準溶液（１）〜（４）を作製し、ＨＰＬＣにより分析したＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を縦軸（ｙ軸）とし、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン標準溶液（１）〜（４）のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度（ｍＭ）を横軸（ｘ軸）としてプロットし、線形近似して、以降のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度の計算の際に用いる検量線を作成した。
反応溶液（ｒ１〜ｒ４）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度はそれぞれ０．５４ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）の濃度を計算した。その結果、３，６００Ｕ／Ｌであった。
水溶液ａ１｛１ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、１０ｍＭの塩化マグネシウム及び１ｍＭのＵＴＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝０．２ｍＬに、製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ１〜ｒ４）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ１〜ｒ４）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬを下記条件で高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
＜ＨＰＬＣの測定条件＞
以下において、ＨＰＬＣの測定条件は全て同じである。
装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステム［（株）島津製作所製］
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＩＥＣ ＤＥＡＥ−８２５［昭和電工（株）製］
移動相：０．０１〜０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０体積％アセトニトリル（ナカライテスク社製）水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ ＵＶ検出器
温度：３５℃
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ社製）を１００ｍＭリン酸緩衝液に１５ｍＭ、５ｍＭ、１．５ｍＭ及び０．５ｍＭの濃度となるようにそれぞれ溶解したＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン標準溶液（１）〜（４）を作製し、ＨＰＬＣにより分析したＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を縦軸（ｙ軸）とし、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン標準溶液（１）〜（４）のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度（ｍＭ）を横軸（ｘ軸）としてプロットし、線形近似して、以降のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度の計算の際に用いる検量線を作成した。
反応溶液（ｒ１〜ｒ４）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度はそれぞれ０．５４ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）の濃度を計算した。その結果、３，６００Ｕ／Ｌであった。
＜製造例２；糖ヌクレオチド合成触媒組成物（ｃ２−１）の製造＞
配列番号３及び４の遺伝子配列であるプライマー遺伝子（ライフテクノロジーズジャパン株式会社に合成を依頼したもの）を使用して、製造例１で作成した配列番号１のタンパク質（ｃ１）を発現するプラスミド（Ｐ−１）を鋳型としてＰＣＲを行い、配列番号１のアミノ酸配列と７０％の相同性を有する遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んで、配列番号５のタンパク質（ｃ２−１）を発現するプラスミド（Ｐ−２）を作成した。作成したプラスミド（Ｐ−２）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、配列番号５のタンパク質（ｃ２−１）を発現する大腸菌（β）を作成した。
作成した大腸菌（β）を、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含有するＬＢ培養液２ｍｌに植菌し、一晩培養を行った。この培養液２ｍｌを１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含有するＬＢ培養液２０ｍｌに植菌し、３０℃で３時間振とう培養を行った後、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン及び０．１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）１００ｍｌに植菌して３０℃で培養を開始した。培養開始後、４０時間目に培養を停止し、培養液を回収した。続いて遠心分離機（６，０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収し、回収した大腸菌を、緩衝液Ａに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、（ｃ２−１）を含む糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）を得た。
配列番号３及び４の遺伝子配列であるプライマー遺伝子（ライフテクノロジーズジャパン株式会社に合成を依頼したもの）を使用して、製造例１で作成した配列番号１のタンパク質（ｃ１）を発現するプラスミド（Ｐ−１）を鋳型としてＰＣＲを行い、配列番号１のアミノ酸配列と７０％の相同性を有する遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んで、配列番号５のタンパク質（ｃ２−１）を発現するプラスミド（Ｐ−２）を作成した。作成したプラスミド（Ｐ−２）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、配列番号５のタンパク質（ｃ２−１）を発現する大腸菌（β）を作成した。
作成した大腸菌（β）を、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含有するＬＢ培養液２ｍｌに植菌し、一晩培養を行った。この培養液２ｍｌを１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含有するＬＢ培養液２０ｍｌに植菌し、３０℃で３時間振とう培養を行った後、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン及び０．１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）１００ｍｌに植菌して３０℃で培養を開始した。培養開始後、４０時間目に培養を停止し、培養液を回収した。続いて遠心分離機（６，０００×ｇ、１５分間）を用いて大腸菌を回収し、回収した大腸菌を、緩衝液Ａに再懸濁して、超音波破砕（１３０Ｗ、１０分）を行った。その後、抗ＦＬＡＧ抗体カラムで精製を行い、（ｃ２−１）を含む糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）を得た。
＜糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）の濃度（糖ヌクレオチド合成活性）測定＞
水溶液ａ１を０．２ｍＬに、製造例２の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ５〜ｒ８）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ５〜ｒ８）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ５〜ｒ８）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度はそれぞれ０．８２ｍＭ、０．８３ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．０３ｍＭであった。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、（ｃ２−１）水溶液（Ｓ−２−１）の濃度を計算した。その結果、１０，２００Ｕ／Ｌであった。
水溶液ａ１を０．２ｍＬに、製造例２の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ５〜ｒ８）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ５〜ｒ８）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ５〜ｒ８）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度はそれぞれ０．８２ｍＭ、０．８３ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．０３ｍＭであった。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、（ｃ２−１）水溶液（Ｓ−２−１）の濃度を計算した。その結果、１０，２００Ｕ／Ｌであった。
＜製造例３；糖ヌクレオチド合成触媒組成物（ｃ２−２）の製造＞
製造例２において、「配列番号４の遺伝子配列であるプライマー遺伝子」に代えて「配列番号６の遺伝子配列であるプライマー遺伝子」を使用すること以外は製造例２と同様にして、配列番号１のアミノ酸配列と８０％の相同性を有する遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んで、配列番号７のタンパク質（ｃ２−２）を発現するプラスミド（Ｐ−３）を作成した。作成したプラスミド（Ｐ−３）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、配列番号７のタンパク質（ｃ２−２）を発現する大腸菌（γ）を作成した。
作成した大腸菌（γ）から、製造例２と同様の操作を行うことで（ｃ２−２）を含む糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）を得た。
製造例２において、「配列番号４の遺伝子配列であるプライマー遺伝子」に代えて「配列番号６の遺伝子配列であるプライマー遺伝子」を使用すること以外は製造例２と同様にして、配列番号１のアミノ酸配列と８０％の相同性を有する遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んで、配列番号７のタンパク質（ｃ２−２）を発現するプラスミド（Ｐ−３）を作成した。作成したプラスミド（Ｐ−３）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、配列番号７のタンパク質（ｃ２−２）を発現する大腸菌（γ）を作成した。
作成した大腸菌（γ）から、製造例２と同様の操作を行うことで（ｃ２−２）を含む糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）を得た。
＜糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）の濃度（糖ヌクレオチド合成活性）測定＞
水溶液ａ１を０．２ｍＬに、製造例３の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ９〜ｒ１２）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ９〜ｒ１２）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ９〜ｒ１２）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度はそれぞれ０．５２ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、（ｃ２−２）水溶液（Ｓ−２−２）の濃度を計算した。その結果、３，４００Ｕ／Ｌであった。
水溶液ａ１を０．２ｍＬに、製造例３の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ９〜ｒ１２）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ９〜ｒ１２）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ９〜ｒ１２）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度はそれぞれ０．５２ｍＭ、０．３１ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、（ｃ２−２）水溶液（Ｓ−２−２）の濃度を計算した。その結果、３，４００Ｕ／Ｌであった。
＜製造例４；比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物（ｃ３）の製造＞
製造例２において、「配列番号４の遺伝子配列であるプライマー遺伝子」に代えて「配列番号８の遺伝子配列であるプライマー遺伝子」を使用すること以外は製造例２と同様にして、配列番号１のアミノ酸配列と６０％の相同性を有する遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んで、配列番号９のタンパク質（ｃ３）を発現するプラスミド（Ｐ−４）を作成した。作成したプラスミド（Ｐ−４）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、配列番号９のタンパク質（ｃ３）を発現する大腸菌（δ）を作成した。
作成した大腸菌（δ）から、製造例２と同様の操作を行うことで（ｃ３）を含む比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）
製造例２において、「配列番号４の遺伝子配列であるプライマー遺伝子」に代えて「配列番号８の遺伝子配列であるプライマー遺伝子」を使用すること以外は製造例２と同様にして、配列番号１のアミノ酸配列と６０％の相同性を有する遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んで、配列番号９のタンパク質（ｃ３）を発現するプラスミド（Ｐ−４）を作成した。作成したプラスミド（Ｐ−４）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、配列番号９のタンパク質（ｃ３）を発現する大腸菌（δ）を作成した。
作成した大腸菌（δ）から、製造例２と同様の操作を行うことで（ｃ３）を含む比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）
＜比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）の濃度（糖ヌクレオチド合成活性）測定＞
水溶液ａ１を０．２ｍＬに、製造例４の比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ１３〜ｒ１６）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ１３〜ｒ１６）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ１３〜ｒ１６）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度はそれぞれ０．００５ｍＭ、０．００３ｍＭ、０．００１ｍＭ、０ｍＭであった。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、（ｃ３）水溶液（Ｓ−３）の濃度を計算した。その結果、３０Ｕ／Ｌであった。
水溶液ａ１を０．２ｍＬに、製造例４の比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ１３〜ｒ１６）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ１３〜ｒ１６）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ１３〜ｒ１６）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度はそれぞれ０．００５ｍＭ、０．００３ｍＭ、０．００１ｍＭ、０ｍＭであった。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、（ｃ３）水溶液（Ｓ−３）の濃度を計算した。その結果、３０Ｕ／Ｌであった。
＜製造例５：Ｎ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼの製造＞
製造例１において、「大腸菌由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号２）」に代えて、「ビフィドバクテリウム由来の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１１）」を用いる以外は同様にして、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼ水溶液を得た。
製造例１において、「大腸菌由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号２）」に代えて、「ビフィドバクテリウム由来の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１１）」を用いる以外は同様にして、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼ水溶液を得た。
＜Ｎ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼの濃度（糖リン酸合成活性）測定＞
水溶液ａ２｛１ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＵＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ及び製造例１で作成した糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）１μＬを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝０．２ｍＬに、製造例５のＮ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼ水溶液を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ１７〜ｒ２０）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ１７〜ｒ２０）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ１７〜ｒ２０）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの濃度はそれぞれ０．９ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２ｍＭ、０ｍＭであった。
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼの作用で生成したＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸は、過剰に加えた糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）により、全てＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンに変換されたものと仮定して、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼの濃度を計算した。その結果、５，４００Ｕ／Ｌであった。
水溶液ａ２｛１ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＵＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ及び製造例１で作成した糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）１μＬを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝０．２ｍＬに、製造例５のＮ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼ水溶液を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ１７〜ｒ２０）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ１７〜ｒ２０）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ１７〜ｒ２０）における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの濃度はそれぞれ０．９ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２ｍＭ、０ｍＭであった。
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼの作用で生成したＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸は、過剰に加えた糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）により、全てＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンに変換されたものと仮定して、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成量から、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼの濃度を計算した。その結果、５，４００Ｕ／Ｌであった。
本発明において、ＡＴＰの再生活性及び糖転移活性は下記のように測定した。
＜糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）のＡＴＰ再生活性測定＞
水溶液ａ３｛１ｍＭのＡＤＰ、１０ｍＭの塩化マグネシウム及び１ｍＭのＵＴＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝０．２ｍＬに、製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ２１〜ｒ２４）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ２１〜ｒ２４）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＡＴＰのピーク面積を記録した。
ＡＴＰ（Ｗａｋｏ社製）を１００ｍＭリン酸緩衝液に１５ｍＭ、５ｍＭ、１．５ｍＭ及び０．５ｍＭの濃度となるようにそれぞれ溶解したＡＴＰ標準溶液（１）〜（４）を作製し、ＨＰＬＣにより分析したＡＴＰのピーク面積を縦軸（ｙ軸）とし、ＡＴＰ標準溶液（１）〜（４）のＡＴＰ濃度（ｍＭ）を横軸（ｘ軸）としてプロットし、線形近似して検量線を作成した。
反応溶液（ｒ２１〜ｒ２４）における３０分後のＡＴＰ濃度はそれぞれ０．６３ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＡＴＰの合成量から、糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）のＡＴＰ再生活性を計算した。その結果、４，２００Ｕ／Ｌであった。
＜糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）のＡＴＰ再生活性測定＞
水溶液ａ３｛１ｍＭのＡＤＰ、１０ｍＭの塩化マグネシウム及び１ｍＭのＵＴＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝０．２ｍＬに、製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ２１〜ｒ２４）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ２１〜ｒ２４）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＡＴＰのピーク面積を記録した。
ＡＴＰ（Ｗａｋｏ社製）を１００ｍＭリン酸緩衝液に１５ｍＭ、５ｍＭ、１．５ｍＭ及び０．５ｍＭの濃度となるようにそれぞれ溶解したＡＴＰ標準溶液（１）〜（４）を作製し、ＨＰＬＣにより分析したＡＴＰのピーク面積を縦軸（ｙ軸）とし、ＡＴＰ標準溶液（１）〜（４）のＡＴＰ濃度（ｍＭ）を横軸（ｘ軸）としてプロットし、線形近似して検量線を作成した。
反応溶液（ｒ２１〜ｒ２４）における３０分後のＡＴＰ濃度はそれぞれ０．６３ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＡＴＰの合成量から、糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）のＡＴＰ再生活性を計算した。その結果、４，２００Ｕ／Ｌであった。
＜糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）のＡＴＰ再生活性測定＞
水溶液ａ３を０．２ｍＬに、製造例２の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ２５〜ｒ２８）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ２５〜ｒ２８）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＡＴＰのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ２５〜ｒ２８）における３０分後のＡＴＰ濃度はそれぞれ０．４５ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．１０ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＡＴＰの合成量から、（ｃ２−１）水溶液（Ｓ−２−１）のＡＴＰ再生活性を計算した。その結果、３，０００Ｕ／Ｌであった。
水溶液ａ３を０．２ｍＬに、製造例２の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ２５〜ｒ２８）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ２５〜ｒ２８）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＡＴＰのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ２５〜ｒ２８）における３０分後のＡＴＰ濃度はそれぞれ０．４５ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．１０ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＡＴＰの合成量から、（ｃ２−１）水溶液（Ｓ−２−１）のＡＴＰ再生活性を計算した。その結果、３，０００Ｕ／Ｌであった。
＜糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）のＡＴＰ再生活性測定＞
水溶液ａ３を０．２ｍＬに、製造例３の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ２９〜ｒ３２）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ２９〜ｒ３２）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＡＴＰのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ２９〜ｒ３２）における３０分後のＡＴＰ濃度はそれぞれ０．５３ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．１０ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＡＴＰの合成量から、（ｃ２−２）水溶液（Ｓ−２−２）のＡＴＰ再生活性を計算した。その結果、３，５００Ｕ／Ｌであった。
水溶液ａ３を０．２ｍＬに、製造例３の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ２９〜ｒ３２）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ２９〜ｒ３２）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＡＴＰのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ２９〜ｒ３２）における３０分後のＡＴＰ濃度はそれぞれ０．５３ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．１０ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＡＴＰの合成量から、（ｃ２−２）水溶液（Ｓ−２−２）のＡＴＰ再生活性を計算した。その結果、３，５００Ｕ／Ｌであった。
＜比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）のＡＴＰ再生活性測定＞
水溶液ａ３を０．２ｍＬに、製造例４の比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ３３〜ｒ３６）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ３３〜ｒ３６）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＡＴＰのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ３３〜ｒ３６）における３０分後のＡＴＰ濃度はそれぞれ０．３０ｍＭ、０．１９ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＡＴＰの合成量から、（ｃ３）水溶液（Ｓ−３）のＡＴＰ再生活性を計算した。その結果、２，０００Ｕ／Ｌであった。
＜実施例１＞
水溶液ａ４｛１ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＵＴＰ、１ｍＭのＡＭＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝０．２ｍＬに、製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）を１μＬ及び製造例５のＮ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼ水溶液を１μＬ加えて、反応溶液とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度をピーク面積から算出したところ、０．２０ｍＭであった。
水溶液ａ３を０．２ｍＬに、製造例４の比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）を１μＬ、０．６μＬ、０．２μＬ、０．０２μＬ加えて、反応溶液（ｒ３３〜ｒ３６）とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液（ｒ３３〜ｒ３６）を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬを下記条件でＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＡＴＰのピーク面積を記録した。
反応溶液（ｒ３３〜ｒ３６）における３０分後のＡＴＰ濃度はそれぞれ０．３０ｍＭ、０．１９ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０１ｍＭであった。ＡＴＰの合成量から、（ｃ３）水溶液（Ｓ−３）のＡＴＰ再生活性を計算した。その結果、２，０００Ｕ／Ｌであった。
＜実施例１＞
水溶液ａ４｛１ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのＵＴＰ、１ｍＭのＡＭＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）｝０．２ｍＬに、製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）を１μＬ及び製造例５のＮ−アセチルグルコサミン−１−キナーゼ水溶液を１μＬ加えて、反応溶液とし、３７℃で３０分間反応を行った。３０分後、反応溶液を１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。酵素反応を停止した溶液について、遠心分離器（４℃、１３，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させた。上清５０μＬをＨＰＬＣにより分析し、酵素反応開始から３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのピーク面積を記録した。
反応溶液における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度をピーク面積から算出したところ、０．２０ｍＭであった。
＜実施例２＞
実施例１において、「製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）」に代えて「製造例２の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）」を用いる以外は同様にして、反応溶液における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度をピーク面積から算出したところ、０．３１ｍＭであった。
実施例１において、「製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）」に代えて「製造例２の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−１）」を用いる以外は同様にして、反応溶液における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度をピーク面積から算出したところ、０．３１ｍＭであった。
＜実施例３＞
実施例１において、「製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）」に代えて「製造例３の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）」を用いる以外は同様にして、反応溶液における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度をピーク面積から算出したところ、０．１５ｍＭであった。
実施例１において、「製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）」に代えて「製造例３の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−２−２）」を用いる以外は同様にして、反応溶液における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度をピーク面積から算出したところ、０．１５ｍＭであった。
＜比較例１＞
実施例１において、「製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）」に代えて「製造例４の比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）」を用いる以外は同様にして、反応溶液における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度をピーク面積から算出したところ、０ｍＭであった。
実施例１において、「製造例１の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−１）」に代えて「製造例４の比較用の糖ヌクレオチド合成触媒組成物水溶液（Ｓ−３）」を用いる以外は同様にして、反応溶液における３０分後のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン濃度をピーク面積から算出したところ、０ｍＭであった。
実施例１〜３及び比較例１の結果から配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ１）又は配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性のあるアミノ酸配列である糖ヌクレオチド合成活性を有するタンパク質（ｃ２）を使用した場合、単糖、ＡＭＰ、ＵＴＰ及びＮ−アセチルヘキソサミンキナーゼの存在下で糖ヌクレオチドを合成できることがわかる。
本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、ＡＴＰ再生活性を有し、かつ糖ヌクレオチドの合成において糖転移活性を有することで効率的に糖ヌクレオチドを合成できる。本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物を用いて得られる糖ヌクレオチドは多様な生物機能を持つ糖鎖の合成に必要である。したがって、本発明の糖ヌクレオチド合成触媒組成物は、糖鎖関連分野、研究用試薬などの化学品として有用である。
Claims (3)
- 下記反応（ａ）及び反応（ｂ）を含む糖ヌクレオチド合成方法に用いる糖ヌクレオチド合成触媒組成物であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）を満たす糖ヌクレオチド合成触媒組成物。
（ａ）糖リン酸とウリジン三リン酸（以下、ＵＴＰと略記）から、糖残基が単糖由来であるウリジン二リン酸（以下、ＵＤＰと略記）−糖を合成する反応
（ｂ）アデノシン一リン酸（以下、ＡＭＰと略記）とＵＴＰからアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略記）を合成する反応、又はアデノシン二リン酸（以下、ＡＤＰと略記）とＵＴＰからＡＴＰを合成する反応
（ｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ１）及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上１００％未満であるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｃ２）を含有する。
（ｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、前記タンパク質（ｃ１）又は前記タンパク質（ｃ２）をコードする核酸（ｄ）を含む組換えベクター（ｅ）が導入された、動物細胞、植物細胞又は微生物の形質転換体（ｆ）を含有する。
（ｉｉｉ）糖ヌクレオチド合成触媒組成物が、前記核酸（ｄ）の塩基配列を遺伝子に有する細胞（ｇ）を含有する。 - 前記反応（ａ）が、反応（ｂ）において合成されたＡＴＰ及び単糖から合成された糖リン酸と、ＵＴＰから、ＵＤＰ−糖を合成する反応である請求項１に記載の糖ヌクレオチド合成触媒組成物。
- 前記単糖が、Ｎ−アセチルヘキソサミンであり、前記糖リン酸が、Ｎ−アセチルヘキソサミン−１−リン酸である請求項２に記載の糖ヌクレオチド合成触媒組成物。
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| CN113462744B (zh) * | 2021-05-24 | 2023-06-23 | 中国药科大学 | N-乙酰葡萄糖胺作为标志物在制备诊断缺血性脑中风试剂中的应用 |
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