KR101856476B1 - 벼 유래 신규한 바이러스 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규한 바이러스 유전자, 상기 신규한 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물, 상기 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 포함하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 벼의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물 또는 키트를 사용하면, 지금까지 알려지지 않았던 신규한 바이러스에 의한 벼의 감염여부를 진단할 수 있으므로, 바이러스 감염에 의한 벼의 질병발생 여부의 판단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

벼 유래 신규한 바이러스 유전자{Novel virus gene from rice}

본 발명은 벼 유래 신규한 바이러스 유전자에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 벼로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규한 바이러스 유전자, 상기 신규한 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물, 상기 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 포함하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 벼의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.

기후 온난화에 따른 생태계 변화, 식물과 바이러스의 진화 및 변이, 그리고 농산물 교역 확대에 따라 돌발 바이러스 및 새로운 바이러스 병의 출현 및 위험도는 점차 높아지고 있다. 지금까지 보고된 식물 바이러스는 전 세계적으로 약 1,000여 종이 알려져 있으며, 아직까지도 여러 가지 식물에서 새로운 바이러스들이 지속적으로 보고되고 있다. 현재 우리나라에서는 약 100여 종의 바이러스가 여러 가지 식물에서 보고되어 있다. 그러나 발생하는 바이러스에 대한 상세한 조사가 일부 작물에서만 이루어졌고, 대부분의 작물에서는 단편적인 조사만 이루어져 있다. 그리하여 아직까지 많은 주요 작물에서 어떤 바이러스 병이 발생하고 있는지 구체적으로 파악되지 못하고 있는 실정이다.

식물병이란 식물기주에 대한 병원균 또는 환경요인의 지속적인 영향의 결과로 나타난 기주세포와 조직의 기능이상으로서, 식물의 형태, 생리 등에 비정상적인 변화가 나타난 상태를 말하며, 그 결과 나타난 경제적 가치의 감소를 포함하기도 한다. 이러한 식물병을 일으키는 원인으로는 곰팡이(Fungi), 박테리아(Bacteria), 선충(Nematode), 마이코플라스마(Mycoplasma), 원생동물(Protozoa) 및 바이러스(Virus)가 있다. 그러나, 바이러스는 크기가 1㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없고, 전자현미경을 필요로 하기 때문에, 육안으로 식물체에 발생한 바이러스를 진단하는 것은 곤란하다.

이러한 진단의 어려움을 해결하는 방안으로서, 바이러스의 유전자를 이용하여 바이러스의 감염여부를 진단하는 방법이 개발되고 있다. 그러나, 바이러스는 유전적인 변이가 심하게 발생되기 때문에, 유전적인 변이를 감안하여 바이러스의 종류를 동정할 수 있는 데이터 베이스의 확보가 요구되고 있다. 이에 따라, 다양한 바이러스 유래 유전자의 염기서열을 확보하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국특허등록 제1613515호에는 복숭아 식물 유래 신규한 복숭아 황반 클로스테로바이러스 유전자가 개시되어 있고, 한국특허등록 제1613453호에는 고구마 식물 유래 신규한 고구마 황반 바이러스 유전자가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제1613455호에는 애기똥풀 식물 유래 신규한 애기똥풀 잎맥 황백화 바이러스 유전자가 개시되어 있고, 한국특허등록 제1613457호에는 고추 식물 유래 신규한 고추 난쟁이 엔도르나바이러스 유전자가 개시되어 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 식물에 감염될 수 있는 새로운 바이러스의 유전자를 확보하고자 예의 연구노력한 결과, 벼에 감염되는 신규한 바이러스의 유전자를 확보하고, 이를 분석한 결과, 상기 유전자가 벼에 감염된 신규한 톰부스비리데(Tombusviridae)과 바이러스로부터 유래된 것임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 벼로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규한 바이러스 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 포함하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 벼의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 식물에 감염될 수 있는 새로운 바이러스의 유전자를 확보하고자 식물 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 벼로부터 시료를 채취하고, 상기 시료로부터 총 RNA를 수득한 다음, 이로부터 합성된 cDNA를 이용하여 라이브러리를 제작하였다. 상기 라이브러리에 포함된 콘티그 중에서 식물 바이러스 관련 염기서열을 갖고, 적용범위가 높으며, 바이러스 관련 데이터베이스와 높은 상동성을 나타나는 염기서열을 포함하는 약 150여개의 콘티그를 선발하고, 상기 선발된 콘티그와 높은 상동성을 갖는 게놈 염기서열을 포함하는 바이러스를 도출하였다.

한편, 상기 선발된 콘티드의 서열을 증폭시키고, 이를 조합하여 벼에 감염된 신종의 바이러스로 예상되는 바이러스의 전체 게놈서열(서열번호 1)을 확보하였다.

상기 확보된 전체 게놈서열을 이용하여 상기 바이러스를 동정한 결과, 상기 바이러스는 톰부스비리데(Tombusviridae) 과에 속하는 aureusviruses, tombusviruses 및 zeaviruses와 높은 상동성을 나타내는 새로운 바이러스임을 확인하고, 상기 바이러스를 "벼 바이러스 A (rice virus A, RVA)"라 명명하였다.

상기 서열번호 1의 염기서열 및 RVA는 지금까지 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명된 것으로서, 상기 서열번호 1의 염기서열을 검출할 수 있는 제제를 이용하면 상기 RVA의 감염여부를 진단할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 벼로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규한 바이러스 유전자를 제공한다.

상기 신규한 바이러스 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성될 수 있으나, 이의 상동체 역시 본 발명에서 제공하는 유전자의 범주에 포함될 수 있다. 일 예로서, 상기 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 다른 예로서, 80% 이상, 또 다른 예로서, 90% 이상, 또 다른 예로서 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열 등이 본 발명에서 제공하는 유전자의 범주에 포함될 수 있다

상기 서열 상동성은 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 바이러스에 감염된 벼의 시료로부터 서열번호 1의 염기서열을 갖는 신규한 바이러스 유전자를 발굴하고, 상기 발굴된 유전자를 이용하여 상기 유전자가 유래된 바이러스를 분류학적으로 동정한 결과, 상기 유전자는 톰부스비리데(Tombusviridae) 과에 속하는 aureusviruses, tombusviruses 및 zeaviruses와 높은 상동성을 나타내었으므로, 상기 유전자가 유래된 바이러스는 톰부스비리데과에 속하는 신규한 바이러스인 것으로 분석되었다.

다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 신규한 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 바이러스 유전자는 톰부스비리데과에 속하는 신규한 바이러스로부터 유래된 것이므로, 벼로부터 상기 유전자가 존재하는지의 여부를 확인함에 의하여, 상기 벼가 신규한 톰부스비리데과에 속하는 바이러스의 감염에 의하여 관련질환이 발병할 것인지의 여부를 진단할 수 있다.

본 발명의 용어 "톰부스비리데(Tombusviridae)"란, (+) 단일-가닥 RNA 게놈 바이러스(single-stranded positive sense RNA plant viruses)의 분류항목에 속하는 하나의 과(family)를 의미하는데, 13개의 속과 71개의 종을 포함한다. 대체로 분절되지 않은 직선형 게놈을 포함하는데, 그의 게놈은 약 4.6 내지 4.8kDa의 길이를 갖고, 5' cap과 poly(A) tail이 결손되어 있으며, 4 내지 6개의 ORF를 포함한다.

본 발명의 용어 "바이러스 유전자를 검출할 수 있는 제제"란, 시료에 포함된 신규한 바이러스 유전자를 검출하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RTPCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 신규한 바이러스 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 프라이머 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 벼로부터 유래된 시료의 유전자를 증폭시켜서, 상기 신규한 바이러스 유전자를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있는데, 이의 서열은 서열번호 1의 유전자의 전체 또는 일부를 증폭시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 다양한 수단으로 표지될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 벼로부터 유래된 시료의 유전자로부터 상기 신규한 바이러스 유전자를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있는데, 이의 서열은 서열번호 1의 유전자의 전체 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "단백질 수준을 측정할 수 있는 제제"란, 목적하는 단백질과 특이적으로 결합할 수 있고, 그의 수준을 용이하게 측정할 수 있는 제제를 의미하는데, 상기 제제를 사용할 경우, 목적 단백질의 수준을 용이하고 정확하게 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성된 유전자로부터 발현될 수 있는 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 일 예로서 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 목적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 상기 신규한 바이러스 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는데, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있다. 상기 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH2로 변형시킴으로써 이루어질 수 있다.

본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 과정을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 진단은 벼에 바이러스가 감염되었는지의 여부를 확인하는 과정으로 해석될 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 바이러스의 감염이 의심되는 벼로부터 유래된 시료에서 상기 서열번호 1의 염기서열을 검출하거나 또는 상기 서열번호 1의 염기서열로부터 발현된 단백질을 검출하여, 바이러스의 감염여부를 진단하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 항체 또는 앱타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 이때, 사용될 수 있는 키트로는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트 등이 될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명의 벼의 바이러스 감염여부 진단용 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자로부터 발현되는 단백질을 검출하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 상기 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 상기 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC(Fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine B-isothiocyanate) 등이 될 수 있으며, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)), OPD(o-phenylenediamine), TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 등이 될 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 벼의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 벼의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법은 바이러스의 감염이 의심되는 벼 식물체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출하는 단계를 포함한다.

상기 방법에 의하면, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질이 검출될 겨우, 상기 벼 식물체에 바이러스가 감염된 것으로 진단할 수 있다.

이때, 상기 생물학적 시료는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 벼 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 화분 등으로부터 유래된 시료가 될 수 있다. 또한, 상기 유전자 또는 단백질을 검출하는 방법 등은 상술한 조성물 또는 키트에 포함된 동일한 제제를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물 또는 키트를 사용하면, 지금까지 알려지지 않았던 신규한 바이러스에 의한 벼의 감염여부를 진단할 수 있으므로, 바이러스 감염에 의한 벼의 질병발생 여부의 판단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 신규한 벼감염 바이러스의 예측된 게놈 구조를 공지된 바이러스의 게놈 구조와 비교한 결과를 나타내는 개략도이다.
도 2는 서열번호 1의 염기서열로부터 추론된 RdRp 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 본 발명에서 제공하는 신규한 벼감염성 바이러스를 분류한 결과를 나타내는 계통수이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 벼에 감염된 식물 바이러스 라이브러리의 제작

식물 바이러스가 감염되었을 것으로 의심되는 200개 벼 샘플을 채집하였고, 모든 샘플을 각각 액체 질소를 이용하여 마쇄하였다. 마쇄한 모든 샘플은 초저온에서 보관하였다. 마쇄한 각각의 샘플을 동량으로 혼합하고, 상기 혼합된 시료를 대상으로 트리 용액(Tri Reagent, MRC)을 이용하여 총 RNA를 수득하였다.

상기 수득한 총 RNA에서 리보솜 RNA를 제거하고, 나머지 RNA를 파쇄하여 다수의 단편을 수득한 다음, 상기 각 단편으로부터 cDNA를 합성하였으며, 상기 합성된 cDNA를 포함하는 라이브러리를 제작하였다. 이때, 상기 라이브러리에 포함된 cDNA는 350 내지 450bp의 크기를 갖도록 구성하였다.

실시예 2: 식물 바이러스 콘티그의 확보 및 위치결정

Illumina HiSeq2500을 이용하여 상기 라이브러리에 포함된 각 cDNA의 서열을 결정하고, 이를 이용하여 약 40Gbp의 로우 데이터(raw data)를 확보하였다.

상기 확보된 로우 데이터를 데노보 합성 전사체 분석(de novo transcriptome analysis, SG-de novo Assembler) 방법에 적용하여, 식물 바이러스 관련 염기서열을 갖는 약 7,000여개의 콘티그를 1차 선발하고, 바이러스 관련 데이터베이스(DataBase)를 이용하여 상기 1차 선발된 콘티그로부터 적용범위(coverage)가 낮은 데이터는 제거하여 약 700여개의 콘티그를 2차 선발하였다.

상기 2차 선발된 콘티그를 바이러스 관련 데이터베이스(DataBase)와 비교하여 약 85-90% 이상의 상동성을 보이는 콘티그를 제거함으로써, 약 150 여개의 콘티그를 3차 선발하였다.

바이러스 데이터베이스를 사용하여, 상기 3차 선발된 콘티그와 높은 상동성을 갖는 바이러스를 도출하고, 각 바이러스 별로 분류하였으며, 분류된 바이러스 내에서 각 콘티드의 대략적인 위치를 결정하였다.

실시예 3: 신규한 벼감염성 바이러스의 발굴

상기 실시예 2에서 3차 선발된 콘티그의 서열을 이용하여 프라이머를 제작하고, 상기 제작된 프라이머를 이용하여 상기 라이브러리를 증폭시킴으로써, 각각의 연관된 염기서열을 수득하고, 이의 서열정보를 조합하여 벼에 감염된 신종의 바이러스로 예상되는 바이러스의 전체 게놈서열(서열번호 1)을 확보하였다.

상기 확보된 전체 서열을 분석한 결과, 약 4,832 nt의 (+) 단일-가닥 RNA 게놈((+) single-stranded RNA genome)을 갖는 바이러스 임을 확인하고, 이를 "벼 바이러스 A (rice virus A, RVA)"라고 명명하였다.

상기 확보된 서열번호 1의 게놈서열을 분석한 결과, RVA의 게놈은 5개의 ORF로 구성되고 Tombusviridae과의 aureusviruses, tombusviruses and zeaviruses와 유사한 것으로 추정하였다. 전체게놈 시퀀스는 일반적인 Tombusviridae과의 3.7~4.8 kb 보다 약간 길게 나타났다. 5' 와 3'의 untranslated regions(UTRs)은 각각 45nt 와 105nt로 확인되었다. ORF1은 32kDa(p32) 단백질을 코드하고 이것의 readthrough에 의해 90kDa (ORF2, p90)의 RdRp 단백질을 코드한다. ORF3는 206nt의 긴 intergenic region과 49 kDa CP protein(p49)를 코드한다. ORF4는 24 kDa movement protein(MP, p24)을 코딩하고, ORF5는 19kDa의 단백질(p19)을 코드하는데, 이는 gene silencingdml suppressor 역할을 하는 것으로 분석되었다.

상기 비구조단백질(p32, p90, p24, p19)는 길이와 서열 모두에서 aureusvirus와 가장 밀접하게 관련되어 있는 것으로 확인되었다. 특히, p32 및 p90은 Johnsongrass chlorotic stripe mosaic virus(JCSMV)의 상응하는 단백질과 각각 44.1%와 59.6%의 아미노산 상동성을 나타내고, p24와 p19는 maize white line mosaic virus(MWLMV)의 MP 및 silencing suppressor 단백질과 아미노산 서열에서 각각 58.5%와 56.1%의 상동성을 나타냄을 확인하였다.

상기 확인된 서열번호 1의 전체 게놈서열을 사용한 BLASTp 검색을 수행하였다(표 1).

상기 표 1에서 보듯이, RVA CP는 carascovirus SF1 (GenBank KF510027)의 gp3 단백질과 39% (E-value : 5e-68, query cover : 75 %)의 아미노산 상동성을 나타내었다. 한편, RVA CP는 Tombusviridae 과의 바이러스와는 아미노산 서열 상동성이 없음을 확인하였다.

상기 서열번호 1의 염기서열의 분석결과로부터 상기 RVA의 게놈 구조를 예측하고, 상기 예측된 게놈 구조를 Aureusvirus 속의 PoLV(pothos latent virus), Tombusvirus 속의 TBSV(tomato bushy stunt virus) 및 Zeavirus 속의 MNeSV(and maize necrotic streak virus)의 게놈 구조와 비교하였다(도 1).

도 1은 본 발명에서 제공하는 신규한 벼감염 바이러스의 예측된 게놈 구조를 공지된 바이러스의 게놈 구조와 비교한 결과를 나타내는 개략도이다.

실시예 4: 신규한 벼감염성 바이러스의 동정

상기 서열번호 1의 염기서열로부터 RdRp 단백질의 아미노산 서열을 추론하고, 추론된 아미노산 서열을 이용하여, 상기 실시예 3에서 발굴된 바이러스의 분류학적 위치를 규명하였다(도 2).

도 2는 서열번호 1의 염기서열로부터 추론된 RdRp 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 본 발명에서 제공하는 신규한 벼감염성 바이러스를 분류한 결과를 나타내는 계통수로서, 약자로 표시된 구체적인 바이러스의 명칭은 다음과 같다: AMCV (artichoke mottled crinkle virus); AnFBV (Angelonia flower break virus); BBSV (beet black scorch virus); CaMoV (carrot mottle virus); CarMV (carnation mottle virus), CBV (cucumber Bulgaria virus); CIRV (carnation Italian ringspot virus); CLSV (cucumber leaf spot virus); CMoMV (carrot mottle mimic virus); CNV (cucumber necrosis virus); CRSV (carnation ringspot virus); CymRSV (cymbidium ringspot virus); EMCV (eggplant mottled crinkle virus); FNSV (furcraea necrotic streak virus); GALV (grapevine Algerian latent virus); GaMV (galinsoga mosaic virus); JCSMV (Johnsongrass chlorotic stripe mosaic virus); MCMV (maize chlorotic mottle virus); MNeSV (maize necrotic streak virus); MNSV (melon necrotic spot virus); MPV (Moroccan pepper virus); MWLMV (maize white line mosaic virus); OCSV (oat chlorotic stunt virus); OLV (olive latent virus 1); PLCV (pelargonium leaf curl virus); PLPV (pelargonium line pattern virus); PMV (panicum mosaic virus); PNSV (pelargonium necrotic spot virus); PoLV (pothos latent virus); RCNMV (red clover necrotic mosaic virus); RrLDV (rosa rugosa leaf distortion virus); TBSV (tomato bushy stunt virus); TCV (turnip crinkle virus); TNV-A (tobacco necrosis virus A); TNV-D (tobacco necrosis virus D); YSV (yam spherical virus)

도 2에서 보듯이, RVA의 RdRp 아미노산 서열과 Tombusviridae과 바이러스의 계통수를 분석한 결과, 상기 RVA와 아우레우스바이러스가 같은 군집에 있음을 확인하였다.

다만, RVA CP 유전자가 Aureusvirus, Tombusvirus 및 Zeavirus의 것 보다 월등하게 크기 때문에, Tombusviridae과의 새로운 속에 속하는 바이러스일 것으로 분석되었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Novel virus gene from rice <130> KPA161561-KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4832 <212> DNA <213> Rice virus A, complete genome sequence <400> 1 agaaatctga ctggggattg accatcctct gagagttgcc tagccatggg tatcggattt 60 ctctcacagc ggctgaccac cgtaacgcgg gtggaggtgg aggtgccctt tggatctgtc 120 gagtatgagg atcctagggt ggtctctgca ctgtcgactg ggggtttgaa ggagccggct 180 accgaaaggg gtcaaattgt aactgggctc aaaatggcat ggtggttgtt gctagcacca 240 ttctggctac ctgcgtgggt atgccggaaa attctggtgg cgatctgttc actcgtgatg 300 gtgttctata ggtggtgtgc gcgtgtggac cagcgtattc gcgctgttgt taggtccgtg 360 gtggaggttt gccaggatgt agcgatcata tgcagggcgt catttaacta tcgaatgcgt 420 gcattgatcg ttctgctcgc ggttgtgttc gtgtctctct ttggattgct cgggttactc 480 gtgtggtccg gttccgtcgc cggttgggtg tgctgttatc ttccgactga cttcaagtat 540 tatttgaagt tcttgaggaa gttggaggac gcctggacta aatcactcga gtgtcccgaa 600 cttgaggacc agaagtcggt cccactggtc aagaaggaga ggaacacatt cgcctgtcgc 660 ctggcaactc gcgctatctc gcgggttggc ctactgaaac caaccaaggc taatgccctg 720 gtttaccaga aggtcatcct tgatgagatg cgtgagctta acgtacgcta cgcggatcgt 780 cttcgggtcc tgcctgttgc tatagctgcc tgtctcgagc gacctgagga ggtgcagagt 840 gttgagaggt gcattgagca cctctgctct gcgtcggcga acctctaggg gtgcctcgtg 900 aggcgtgagg gggtggacac acacgttgat agacgttcat ttgacctatc tcgtgttgac 960 ggtgttagtc catccgaggt cctcacggta actcgcgggg taacagggaa agggagtcgt 1020 acttggtatt cgttcaactc cccagcccat acatatgaat accttgtcca caacagttct 1080 ttgatcaacg tggtccgtgg tctcgttgaa cgcgtctttt gtgttgtggg caaaaacgga 1140 caacttgtca gaccccctcg gcctgacaag ggtgtcttca ccacgaagat gggagcagtt 1200 ggtaaacttc tgagcgctag tgtaggttac tgccaccgga tgacagttga cgagtttgtc 1260 aattcttatc acggttcgcg aagggactca tacgctcgtg ctgcagagac actgtccgat 1320 cgaggcttga ctgttaggga ctcctacctt agtacctttg tcaaggccga gaagatcaac 1380 tgcaccctta aacccgaccc cgccccgcgt gtcatacaac cgcggggtca acgctataat 1440 atagaggtcg gaaggtactt gaagcccctg gagccgctat taatgaaagc cattgacaag 1500 atgtgggggt cccccaccgc tatcaagggc tatacagtgg agaaggtggc ttctattctt 1560 gatgcaaagc ggaggagatt tcgtgaaccc gtatacgtcg gactagacgc gagcaggttt 1620 gatcagcact gttcagttga ggctctccaa tgggaacatt ctgtctataa tgctatttat 1680 aaatcagagt atttggcaga acttctcagc tggcaattac gtaatcgtgg gactgccttt 1740 gtccctgatg gtaaggttaa gtattcagtg gacggttgtc gcatgtctgg ggacatgaac 1800 acgtccatgg gtaactactt aattatgtcc tcattgtgct acgtgtattg ccaggaggtc 1860 ggcctcaaag ctgaactcat gaattgcggc gatgactgtg tccttataat ggagaagaaa 1920 gatttaggac ttatgtcatc gttacctgcg tggttcttac gtatgggtta tactatgaag 1980 gttgaaacgc cggtgtatga catggaaaag gtagaatttt gccaaatgca ccccgtttac 2040 tgcagtagag gttgggtaat ggtcaggagg cccgatacag ttatgacaaa ggactgttgt 2100 gtggttcgag gtaatatgac cctcaaacgc ctttctgcct ggttgcatgc acagagtgtt 2160 ggtggtgcct ccctgtgtgg agacatccct gtcctaggtg cattttatcg ttgcttccaa 2220 ggtgaagagg ggggcgagga ctctgaatat gctgcacctc ataaatttcg ggccggacag 2280 cagtgtggca gcatctcgag cgcatcgcgc tactcgtttt ggctggcgtt tgggcttaca 2340 cccgacgacc aattggctct ggaggaggag ctagccaaat ttacattctc caccacttat 2400 ggggagtatg ttaagagtgg ggcgtcgttg ctcgactact gctgtagata accgaccatt 2460 atcacccacg caaactggat ccagtcacat taattgcttt aggtggatat acacttgctg 2520 catcagcgta cgaactgtat gagaacagtc gttcttcgac aaaacagggt aatagcacca 2580 acaagactgc ggccactcag cctgcgaaac aaccagcctc acttccccaa acaccctcga 2640 cgtccacgcc caatggcatg aaatatatag tggagtttcc ggattcgagc gaccaaattg 2700 ttgtacacaa ttctggtgga cagttgtcta gtgcaggtac attccgcgga gctgctggtg 2760 gaggtattgg tggagcgatt aaggaaggat tgcgcgacgt cattatgaca ggaggtaaga 2820 aacttgctgc taaggccgct gataatgcgg tggactacgt ggtggctaag ttgcctaaga 2880 agaaacaacc caagaaagtt tcaggcaagc ttgggcggag ggctggcacc cagcaggaac 2940 gtgctattgt tattgccccg cgggcatcga agccatatgt tacgactaca gcaccggtaa 3000 gctatggagc tactttagct ggagctcgga ctatcgctcg gaagactcgc caagggcata 3060 ttgtacaagg ccgtgaattc ctgggagccg cctatgacac caaactcgtg accacttggt 3120 ctatgtgttt tggtgcgccg ctcacccctg tgagctttgt ggattctatt cttaggcaat 3180 atggtgcgat gtacaattac ttccgttgga ggaagctaac tgtgcattat gttaccacgt 3240 caccgacgtc cacagctgga tcagtcatgc tgtactacaa caaggatcgt gcctccacct 3300 tcatcaatca gactagtcca aacctaatgc cttttgtgtt gtcagatcct cataccacga 3360 ttgcacccca gtggcagaac ttctctgttg tcctggaaac cgacagtgag tggaagcgtc 3420 tggactatgg tctaactgat gattccactc attacactgc cggggaggtt ttccttttat 3480 ccaagaccgc agctagtact gattcacctg gtatcctgct tatggagtat gagatcgagt 3540 ttaaggacga gaatttaacg cctaggttgt tgttgtggcc gcaacctacc attaactttg 3600 ttccctacac gttcaccatc cctacagcca cagctggcaa tcctgttaac atgttgctag 3660 gggggactcc tattatgggt tcaaacacga acctggtaca gccagggggt atctataagg 3720 taattatgga tgtctccaat tctgacttta ccgggaccac gcctgctttg accgcaacca 3780 atatatggaa gtaccctgct ggtactggca catacaacgc cagcctggtt gatggatcaa 3840 cgttatacgc cgtgaatggg ccgtcaaatg ttcaattctt cacaacgttg gctgatgctt 3900 atgttaacaa ttcacctgtt cagtggcaga caaccataac tgcctccact ggacggcttt 3960 tcatgtggtt ttcattgata gggtatgttg gtagctccag cattaaccct aatatgtagt 4020 ttgcgtggga gcggggtaaa gaagccgacc acttcatgtc gatcatttct cttgacgggg 4080 agcttgattt taccccttac aatcgtacct cttctgttgt gcatttatct cataaaagta 4140 aacgcggcga aatacactta ggccctaaga ccttttctga caaatggaag atcccgagca 4200 gtgggtttta cacccccaca gatgtgaggc ttgtaatcac tccacatatc tccgagaaag 4260 ctggcgtaat ggcagtggta aagttaatcg acgcatccga catgagccct gcccgagtgt 4320 tgtaccagtc caaggaattc aaccttggtc atggcctgac tctcgagggg acccaactgc 4380 cgttctgcct gccaatcggg gaatatccta tactgttcga ggtcacggtg tcacgatcac 4440 agtttgtgga agctcggacg atgtttacaa catcgctcga gtggcgtatg atgtggtcca 4500 acaccccgtt gtccagggta aagtctgttt tcgccgtggc tcatcaacct gtgattgaag 4560 tgtctcctac attcaagaat attgtaccgt tgttggacag tgggcctagg gccggaagca 4620 agaacaggaa gagcagaacc tcagcatcca ctagtggtgg tacggtccag ggtttggtca 4680 ccttggaatg cgtagggcca gtgaatgctg tcagtaactc taactgattt tgtggatggt 4740 gtccgggtgg gggttcccac acccgttggg tggggctata agggaactct tggaattacc 4800 tcatttcatc acctgggaaa ccagggtagc cc 4832

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 바이러스 유전자.
   
2. 제1항의 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 벼의 바이러스 감염여부 진단용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 제제는 바이러스 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것인, 조성물.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 제제는 바이러스 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머인 것인, 조성물.
   
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 벼의 바이러스 감염여부 진단용 키트.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것인, 벼의 바이러스 감염여부 진단용 키트.
   
7. 바이러스의 감염이 의심되는 벼 식물체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 벼의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 생물학적 시료는 벼 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 화분으로부터 유래된 것인, 방법.
   

Images