KR101869795B1 - 보리 유래 신규한 바이러스 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보리로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규한 바이러스 유전자, 상기 신규한 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물, 상기 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 포함하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 보리의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물 또는 키트를 사용하면, 지금까지 알려지지 않았던 신규한 바이러스에 의한 보리의 감염여부를 진단할 수 있으므로, 바이러스 감염에 의한 보리의 질병발생 여부의 판단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

보리 유래 신규한 바이러스 유전자{Novel virus gene from barley}

본 발명은 보리 유래 신규한 바이러스 유전자에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 보리로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규한 바이러스 유전자, 상기 신규한 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물, 상기 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 포함하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 보리의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.

기후 온난화에 따른 생태계 변화, 식물과 바이러스의 진화 및 변이, 그리고 농산물 교역 확대에 따라 돌발 바이러스 및 새로운 바이러스 병의 출현 및 위험도는 점차 높아지고 있다. 지금까지 보고된 식물 바이러스는 전 세계적으로 약 1,000여 종이 알려져 있으며, 아직까지도 여러 가지 식물에서 새로운 바이러스들이 지속적으로 보고되고 있다. 현재 우리나라에서는 약 100여 종의 바이러스가 여러 가지 식물에서 보고되어 있다. 그러나 발생하는 바이러스에 대한 상세한 조사가 일부 작물에서만 이루어졌고, 대부분의 작물에서는 단편적인 조사만 이루어져 있다. 그리하여 아직까지 많은 주요 작물에서 어떤 바이러스 병이 발생하고 있는지 구체적으로 파악되지 못하고 있는 실정이다.

식물병이란 식물기주에 대한 병원균 또는 환경요인의 지속적인 영향의 결과로 나타난 기주세포와 조직의 기능이상으로서, 식물의 형태, 생리 등에 비정상적인 변화가 나타난 상태를 말하며, 그 결과 나타난 경제적 가치의 감소를 포함하기도 한다. 이러한 식물병을 일으키는 원인으로는 곰팡이(Fungi), 박테리아(Bacteria), 선충(Nematode), 마이코플라스마(Mycoplasma), 원생동물(Protozoa) 및 바이러스(Virus)가 있다. 그러나, 바이러스는 크기가 1㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없고, 전자현미경을 필요로 하기 때문에, 육안으로 식물체에 발생한 바이러스를 진단하는 것은 곤란하다.

이러한 진단의 어려움을 해결하는 방안으로서, 바이러스의 유전자를 이용하여 바이러스의 감염여부를 진단하는 방법이 개발되고 있다. 그러나, 바이러스는 유전적인 변이가 심하게 발생되기 때문에, 유전적인 변이를 감안하여 바이러스의 종류를 동정할 수 있는 데이터 베이스의 확보가 요구되고 있다. 이에 따라, 다양한 바이러스 유래 유전자의 염기서열을 확보하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국특허등록 제1613515호에는 복숭아 식물 유래 신규한 복숭아 황반 클로스테로바이러스 유전자가 개시되어 있고, 한국특허등록 제1613453호에는 고구마 식물 유래 신규한 고구마 황반 바이러스 유전자가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제1613455호에는 애기똥풀 식물 유래 신규한 애기똥풀 잎맥 황백화 바이러스 유전자가 개시되어 있고, 한국특허등록 제1613457호에는 고추 식물 유래 신규한 고추 난쟁이 엔도르나바이러스 유전자가 개시되어 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 식물에 감염될 수 있는 새로운 바이러스의 유전자를 확보하고자 예의 연구노력한 결과, 보리에 감염되는 신규한 바이러스의 유전자를 확보하고, 이를 분석한 결과, 상기 유전자가 보리에 감염된 신규한 폴레로바이러스로부터 유래된 것임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 보리로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규한 바이러스 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 포함하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 보리의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 식물에 감염될 수 있는 새로운 바이러스의 유전자를 확보하고자 식물 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 보리로부터 시료를 채취하고, 상기 시료로부터 총 RNA를 수득한 다음, 이로부터 합성된 cDNA를 이용하여 라이브러리를 제작하였다. 상기 라이브러리에 포함된 콘티그 중에서 식물 바이러스 관련 염기서열을 갖고, 적용범위가 높으며, 바이러스 관련 데이터베이스와 높은 상동성을 나타나는 염기서열을 포함하는 약 150여개의 콘티그를 선발하고, 상기 선발된 콘티그와 높은 상동성을 갖는 게놈 염기서열을 포함하는 바이러스를 도출하였다.

한편, 상기 선발된 콘티드의 서열을 증폭시키고, 이를 조합하여 보리에 감염된 신종의 바이러스로 예상되는 바이러스의 전체 게놈서열(서열번호 1)을 확보하였다.

상기 확보된 전체 게놈서열을 이용하여 상기 바이러스를 동정한 결과, 상기 바이러스는 Luteroviridae 과에 속하는 maize yellow dwarf virus/KC921392와 가장 높은 상동성을 나타내는 새로운 바이러스임을 확인하고, 상기 바이러스를 "보리 바이러스 G(barley virus G, BVG)"라 명명하였다.

상기 서열번호 1의 염기서열 및 BVG는 지금까지 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명된 것으로서, 상기 서열번호 1의 염기서열을 검출할 수 있는 제제를 이용하면 상기 BVG의 감염여부를 진단할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 보리로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규한 바이러스 유전자를 제공한다.

상기 신규한 바이러스 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성될 수 있으나, 이의 상동체 역시 본 발명에서 제공하는 유전자의 범주에 포함될 수 있다. 일 예로서, 상기 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 다른 예로서, 80% 이상, 또 다른 예로서, 90% 이상, 또 다른 예로서 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열 등이 본 발명에서 제공하는 유전자의 범주에 포함될 수 있다

상기 서열 상동성은 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 바이러스에 감염된 보리의 시료로부터 서열번호 1의 염기서열을 갖는 신규한 바이러스 유전자를 발굴하고, 상기 발굴된 유전자를 이용하여 상기 유전자가 유래된 바이러스를 분류학적으로 동정한 결과, 상기 유전자는 루테로바이러스(Luteroviridae) 과에 속하는 폴레로바이러스(polerovirus)의 일종인 maize yellow dwarf virus/KC921392와 가장 높은 상동성을 나타내었으므로, 상기 유전자가 유래된 바이러스는 폴레로바이러스에 속하는 신규한 바이러스일 것으로 분석되었다.

다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 신규한 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 바이러스 유전자는 폴레로바이러스에 속하는 신규한 바이러스로부터 유래된 것이므로, 보리로부터 상기 유전자가 존재하는지의 여부를 확인함에 의하여, 상기 보리가 신규한 폴레로바이러스의 감염에 의하여 폴레로바이러스 관련질환이 발병할 것인지의 여부를 진단할 수 있다.

본 발명의 용어 “폴레로바이러스(polerovirus)”란, 루테로바이러스(Luteroviridae) 과에 속하는 식물성 바이러스의 속(genus) 수준의 분류군을 의미하는데, 감자잎말림바이러스(Potato leafroll virus) 등이 속하는 17개의 종(species)를 포함한다고 알려져 있다.

상기 폴레로바이러스 속에 속하는 바이러스는 외피가 없고, 약 23nm의 직경을 갖는 구형의 비리온을 갖고, 상기 폴레로바이러스의 감염에 의해 발병되는 질환으로는 감자잎말림바이러스의 감염에 의해 발병되는 엽권병 등이 알려져 있다.

본 발명의 용어 "바이러스 유전자를 검출할 수 있는 제제"란, 시료에 포함된 신규한 바이러스 유전자를 검출하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RTPCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 신규한 바이러스 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 프라이머 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 보리로부터 유래된 시료의 유전자를 증폭시켜서, 상기 신규한 바이러스 유전자를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있는데, 이의 서열은 서열번호 1의 유전자의 전체 또는 일부를 증폭시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 다양한 수단으로 표지될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 보리로부터 유래된 시료의 유전자로부터 상기 신규한 바이러스 유전자를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있는데, 이의 서열은 서열번호 1의 유전자의 전체 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "단백질 수준을 측정할 수 있는 제제"란, 목적하는 단백질과 특이적으로 결합할 수 있고, 그의 수준을 용이하게 측정할 수 있는 제제를 의미하는데, 상기 제제를 사용할 경우, 목적 단백질의 수준을 용이하고 정확하게 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성된 유전자로부터 발현될 수 있는 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 일 예로서 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 목적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 상기 신규한 바이러스 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는데, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있다. 상기 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH₂로 변형시킴으로써 이루어질 수 있다.

본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 과정을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 진단은 보리에 바이러스가 감염되었는지의 여부를 확인하는 과정으로 해석될 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 바이러스의 감염이 의심되는 보리로부터 유래된 시료에서 상기 서열번호 1의 염기서열을 검출하거나 또는 상기 서열번호 1의 염기서열로부터 발현된 단백질을 검출하여, 바이러스의 감염여부를 진단하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 항체 또는 앱타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 이때, 사용될 수 있는 키트로는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트 등이 될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명의 보리의 바이러스 감염여부 진단용 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자로부터 발현되는 단백질을 검출하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 상기 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 상기 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC(Fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine B-isothiocyanate) 등이 될 수 있으며, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)), OPD(o-phenylenediamine), TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 등이 될 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 보리의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 보리의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법은 바이러스의 감염이 의심되는 보리 식물체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출하는 단계를 포함한다.

상기 방법에 의하면, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질이 검출될 겨우, 상기 보리 식물체에 바이러스가 감염된 것으로 진단할 수 있다.

이때, 상기 생물학적 시료는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 보리 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 화분 등으로부터 유래된 시료가 될 수 있다. 또한, 상기 유전자 또는 단백질을 검출하는 방법 등은 상술한 조성물 또는 키트에 포함된 동일한 제제를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물 또는 키트를 사용하면, 지금까지 알려지지 않았던 신규한 바이러스에 의한 보리의 감염여부를 진단할 수 있으므로, 바이러스 감염에 의한 보리의 질병발생 여부의 판단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 신규한 보리감염 바이러스의 게놈 구조를 예측한 결과를 나타내는 개략도이다.
도 2a는 서열번호 1의 염기서열을 이용하여 본 발명에서 제공하는 신규한 보리감염성 바이러스를 분류한 결과를 나타내는 계통수이다.
도 2b는 서열번호 1의 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 이용하여 본 발명에서 제공하는 신규한 보리감염성 바이러스를 분류한 결과를 나타내는 계통수이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 보리에 감염된 식물 바이러스 라이브러리의 제작

식물 바이러스가 감염되었을 것으로 의심되는 81개 보리 샘플을 채집하였고, 모든 샘플을 각각 액체 질소를 이용하여 마쇄하였다. 마쇄한 모든 샘플은 초저온에서 보관하였다. 마쇄한 각각의 샘플을 동량으로 혼합하고, 상기 혼합된 시료를 대상으로 트리 용액(Tri Reagent, MRC)을 이용하여 총 RNA를 수득하였다.

상기 수득한 총 RNA에서 리보솜 RNA를 제거하고, 나머지 RNA를 파쇄하여 다수의 단편을 수득한 다음, 상기 각 단편으로부터 cDNA를 합성하였으며, 상기 합성된 cDNA를 포함하는 라이브러리를 제작하였다. 이때, 상기 라이브러리에 포함된 cDNA는 350 내지 450bp의 크기를 갖도록 구성하였다.

실시예 2: 식물 바이러스 콘티그의 확보 및 위치결정

Illumina HiSeq2500을 이용하여 상기 라이브러리에 포함된 각 cDNA의 서열을 결정하고, 이를 이용하여 약 40Gbp의 로우 데이터(raw data)를 확보하였다.

상기 확보된 로우 데이터를 데노보 합성 전사체 분석(de novo transcriptome analysis, SG-de novo Assembler) 방법에 적용하여, 식물 바이러스 관련 염기서열을 갖는 약 7,000여개의 콘티그를 1차 선발하고, 바이러스 관련 데이터베이스(DataBase)를 이용하여 상기 1차 선발된 콘티그로부터 적용범위(coverage)가 낮은 데이터는 제거하여 약 700여개의 콘티그를 2차 선발하였다.

상기 2차 선발된 콘티그를 바이러스 관련 데이터베이스(DataBase)와 비교하여 약 85-90% 이상의 상동성을 보이는 콘티그를 제거함으로써, 약 150 여개의 콘티그를 3차 선발하였다.

바이러스 데이터베이스를 사용하여, 상기 3차 선발된 콘티그와 높은 상동성을 갖는 바이러스를 도출하고, 각 바이러스 별로 분류하였으며, 분류된 바이러스 내에서 각 콘티드의 대략적인 위치를 결정하였다.

실시예 3: 신규한 보리감염성 바이러스의 발굴

상기 실시예 2에서 3차 선발된 콘티그의 서열을 이용하여 프라이머를 제작하고, 상기 제작된 프라이머를 이용하여 상기 라이브러리를 증폭시킴으로써, 각각의 연관된 염기서열을 수득하고, 이의 서열정보를 조합하여 보리에 감염된 신종의 바이러스로 예상되는 바이러스의 전체 게놈서열(서열번호 1)을 확보하였다.

상기 확보된 전체 서열을 분석한 결과, 약 5.6 kb의 (+) 단일-가닥 RNA 게놈((+) single-stranded RNA genome)을 갖는 바이러스 임을 확인하고, 이를 "보리 바이러스 G (barley virus G, BVG)"라고 명명하였다.

상기 서열번호 1의 염기서열을 분석하여, 상기 BVG의 게놈 구조를 예측하였다(도 1).

도 1은 본 발명에서 제공하는 신규한 보리감염 바이러스의 게놈 구조를 예측한 결과를 나타내는 개략도이다.

실시예 4: 신규한 보리감염성 바이러스의 동정

상기 서열번호 1의 염기서열을 이용하여, 상기 실시예 3에서 발굴된 바이러스의 분류학적 위치를 규명하고(도 2a), 상기 서열번호 1의 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 이용하여, 상기 실시예 3에서 발굴된 바이러스의 분류학적 위치를 규명하였다(도 2b).

도 2a는 서열번호 1의 염기서열을 이용하여 본 발명에서 제공하는 신규한 보리감염성 바이러스를 분류한 결과를 나타내는 계통수이고, 도 2b는 서열번호 1의 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 이용하여 본 발명에서 제공하는 신규한 보리감염성 바이러스를 분류한 결과를 나타내는 계통수이다.

도 2a 및 도 2b에서 보듯이, 염기서열 및 아미노산 서열을 이용하여 분석한 결과, 두가지 분석결과 모두 동일하게, 본 발명에서 제공하는 신규한 보리감염성 바이러스가 루테로바이러스(Luteroviridae) 과에 속하는 폴레로바이러스(polerovirus)의 일종인 maize yellow dwarf virus/KC921392와 가장 높은 상동성을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, 염기서열을 중심으로 분석한 결과, 본 발명에서 제공하는 신규한 보리감염성 바이러스와 maize yellow dwarf virus/KC921392는 전체 게놈에서 71.4%의 상동성을 나타내고, 5′UTR에서 62.1%의 상동성을 나타내며, 3′UTR에서 46.9%의 상동성을 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 신규한 보리감염성 바이러스는 폴레로바이러스에 속하는 신규한 바이러스임을 알 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Novel virus gene from barley <130> KPA160277-KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5620 <212> DNA <213> Barley virus G, complete genome sequence <400> 1 acaaaaggga cccagaggga cccttgttgc aaagctctca gctttggcca tttatgcgtt 60 gtgcaatcaa cttcgacggt actctcgaat tctccgacat tccgagagac ctcagtgttc 120 ggttggccga atttgtttca gccaccatca caatcgcatt ttgtgctctc caaccggaat 180 atgatgccga agctctattc cgctctgttc ttactgtgct gcctcttatg cttcgaccct 240 ccccttatac aaggggaatc gctcgcgaag catggtcttc ctttgcgagg cacgcgctac 300 gaactggggg acgaatttct cttcccccag aattcaacga taactctgat gaacctgcgg 360 ctttgttccg cagattctta cagagagttg atgcaagagc ttatgcgcat gctctcaagg 420 gacgtgaaga aaatttcttc acaagcctgc gcagtttcca gctcaaactg gaaagctttt 480 gtagaagagc agaagatcct gacagatacc ctcaaagaag gcacatcgaa gttctgtcag 540 gaattgttcg agaggctcac aacaatggcg aaagcattta tcggcacttt cctgatgctg 600 ataatattca cttggagcta cttgatctgg ggcgttctct ggagtttgat tttcctcatc 660 aagcggtaca cccttcagat cttatctctc ggttgtttgt atatatgcac aacgctcttg 720 gtccgtttgg cctccaagat ttttggaggg tggccgatct cagcgatttc ttcgttatac 780 actctgacgt ccagtacctt caggattctt acatccagaa ggagctcgcc gacgtttgag 840 atcccaacac ccggattcaa aagcgttgaa ataccacaaa aaccaccgaa ggatagtgtc 900 ttgctggtcc aacacaacga cgcccttaac tctcctggag gttacgcatc atgcgtgcgt 960 ttgctgaatg gaagcaatgc tttgctcaca gcgaaacatg tatccaccca ggagggtgaa 1020 ttgcttattg catccacccg cacagggaac aagatcaaat tgtctctatt taacaaaatc 1080 ctgacaacgc agaactccga cgtggccctt tatcaaggtc cgccaggttg ggagtctatt 1140 cttggatgca aagccgctga catagtctct gtagatagcc tctcatgctg cgaagcttct 1200 atctacaggt tcgatggtca ctggatgcgt gcaaacgcgt ctttagtcgg cacggaaggc 1260 acatatgtct ccgtactaag caatacagaa cggggctaca gcggaacccc ctatttcaat 1320 ggcaaatcca ttttgggtgt tcatgttggg gggaatgatg ccaggacaaa caatttaatg 1380 gcccccattc ccagcatccc cggcctcaca aaacaccgtt atgtgtttga gtcgccacaa 1440 ctcaaaggcc gcctgtttac ggagaaagaa gtggaacaac ttcaatacga tattgatgca 1500 gcttatcaag aagcacatcg acttgcgaac ttcaaatcca taacaggacg aaactgggct 1560 gatgatgatg acgtctatta cgaagccccc cagtttcagg gaaacgacgc tcgcggtccc 1620 gtccgcgaaa acaaaacgga cttgcccacc cctacactct cgcccgtcgc tacttcaagc 1680 agcgatattc tcaacaaggt ggtggaagcg ttggtcaaca agatcgacgt ctcagcaatc 1740 gagagggtgg ttgttcaaca aattgcggca tcagctatga aacgacccaa gaacaaccga 1800 aggcggccat cgaagcccaa aacttcaccg cctatttcgc ttccctctac agatgggaag 1860 tacgtggcac cccctcggag atcccaggct tcgaagcctg tggatccctc cccaaatact 1920 acttcacaaa acaaaaagaa gaatcagaat gggggaggtt acttgcagcg ggaaacccgg 1980 cgctggcaga gaaagtcagt ggcttcgggt ggccccaatt cggtcccgca gccgaattga 2040 aaagcctgcg ccttcaggcg cagagatggc tctcacgcgc ggagtctgct aaaatcccat 2100 cagctgagga tagggagcgc gtgatccgga agactgtgga ggtatacaaa acttgtcaaa 2160 cacaatgccc caagacttca caaaacaacc tgcttgtttg ggaagatttt ctcgaagatt 2220 ttaagcaagc ggtgttctct ctcgagccag acgccggagt tggagtccct tttgtgggct 2280 acgatcggcg cacccacagg ggctggattg aagatccagc cttattgcca gctctcgctc 2340 gcatggcttt cgaccgacta cacaagatgt cggaagctaa gtttgatcag atgacagctg 2400 agcaattggt gcaagctggc ttgtgtgatc caatacgatt attcgtaaag ggagaacccc 2460 acaagcagtc gaagctggat gaaggccgct accgcctcat catgagtgtc tcgttgttgg 2520 atcaactggt agcccgggtt ttgtttcaaa atcaaaacaa gagggaaatt gcactgtggc 2580 gagctatacc ctcaaagccc ggttttggtc tgtcaactga cgaccaaacg cgagagtttg 2640 tgcaaaacct cgcagtacag tgtggagtta ataccgacca attactgcaa gattggcaaa 2700 accacactgt gccgactgac tgctccggat tcgactggag cgttgcggaa tggatgttac 2760 aagatgacat ggaagtccgc aaccgactta cgctcaacaa cacagatctc acgcgccgtc 2820 tacgcgcgtg ttggttgaag tgcatatcca actctgtgct gtgcttgagc gatggaaccc 2880 tactagccca acgagttgcg ggagttcaga aatctggctc ctacaacact agttcgagca 2940 actctcggat tcgcgtgatg gccgcatacc attgcggtgc aacgtgggct atggcaatgg 3000 gtgacgacgc cctcgagtca gtcgacacga acctagacgt gtataaaaat ctaggattca 3060 aagtcgaggt ctcaaaacaa ctggagtttt gctcacacgt cttcgagaag gaagacctcg 3120 cacgcccggt taatgccaat aaaatgatat acaaacttgt atatggttac aacccggcga 3180 acggctctgt ggaagtcata cagcgttatc ttgacgcttg tatgagcgta ctcaatgagt 3240 tacgccacga tcccggaacc gtagagcttc tgtaccagtg gctggtcact ccagtccagc 3300 aacaaaacgt ttaaaacagg agctctgaag ctagccagac atacgtgagt tgcaagtact 3360 ggatagctta gtctcacaca tttgcagcca tagattggaa attgctttgc ggtattctga 3420 ttgggatcct cgtagcggtc ccaataacaa tctttggctt gtacaagatc tacctatcta 3480 tctcccagaa cgtgcgatca atcgtgaatg aatacgggag gtagaaatgg acgtagaaca 3540 aggagccgcc gccgcgttcg ccctgcaagt cgcacccaac cagtggttgt ggtcgcggca 3600 ggtcagcgtc gacgccgccc cagaagacga ggacgacgaa ctggaaacac ttcaggagga 3660 tctggaatcc gaagagggtc gcgggaaaca tttgtatttt cgaaggactc tctcacgggc 3720 aatgcctccg ggaagctcac cttcggggcg tctctatcag agtgcgcagc attcagtagt 3780 ggaattctca aggcctacca tgagtataag atctcaaagg tcactttgga gttcatctcc 3840 gaggcctctt cccaatctga aggctccatc gcttatgagc ttgatccaca caacaagctc 3900 tcagccctct cttccaccat caacaaattt tcgatcgtca aaggtggtaa gagaaccttt 3960 acgtccaatc aaatcggagg tggagtttgg cgagactcaa cagaagatca attcgccatc 4020 ctctacaagg gtaatggaaa atcctcgatc gcgggttcgt tccgcgttac gatggatgtt 4080 ctaacccaaa atccgaaata ggtagacgga gcatctccgc agccagctcc agcgccaacg 4140 ccagctccaa ccccaccccc cacccctgct cccgcaaccc agcccaagtt ttacaactac 4200 tctggggtgc cggaaagccg aattcaatca cgcaagaatt ccgagttcat agacatctac 4260 tctttgagtt tcataaagat gtactattgg cacgatgaat cttggtccag tgaaacactt 4320 tcggcagggt acgtccaaaa tgactcatct agggctaccc cgtacttcct tatccccacc 4380 catgttggat cttacaaggt ctacattgag tgtgagggat tccaagctgt caaagccaag 4440 ggaggtgcga ataatgggaa gatgtcgggg tttatcacat atgatccaaa acaatcgggt 4500 tggcaagctt attcatggtc tggctgcacc ttctccaatt acaaagtcac ggatgggtgt 4560 gtcgaggcac acccagacat gaaggttaac ggctgttcct tttcaaaagg gcagtgcgtg 4620 gagaaggatg ttgttctttc gtttgatctc actgtgagtg aggaggggta ttgggctctg 4680 caagcccctc ccattgagaa atctgatgac cacaacttca tcgtatctta cggttcttac 4740 accgaaaaga tactagaatg gggtatggtt tcgatatcca tagacgagat caacaacaac 4800 gatgctcacc gcgttccgaa gaggaataag gacgctcgtg aattgagaag attgacagac 4860 tttaccaact ctgattccgt tggagtactg gtaaaagaca aagacctcaa ttctgaacca 4920 gatggacaac tggtggttca aaccccggct cagccggaaa cgggtggaga gctaactgtt 4980 caaaatcctc cacctaaacc agcattacaa gtctcgactc gagtccagca atggctcgat 5040 gattctgaac ccgagagtga tgctgatgca cctccacctc cagctccagg tcctacacaa 5100 gtgcgcctcc ccacgttgaa tgagcgcaac ctgaagccat cgcctccgcg atccccacgc 5160 cgtgacatga atgtcactta tgaggatgat gttgcatcgc ggacgtcaag aacccccacg 5220 atcacaggcg gcaatctcag accaaaactg aaatccgttt ctgatgacgt ggaaacccaa 5280 tctgtaacac cgagccgaac aggctcgttg acaggaggtt cgttgcgtcc ttccttgcaa 5340 ggagggaggt taggccagca gcaatttcgt atgacagctg aacaagctcg tcagtacgat 5400 atgatcaaaa gaagcttcgg taaaactcgc gctaacgagt attacgaaga acttaagaaa 5460 gctgctggca gttcatctta ggatgaacac cccgccgggg gtaaaacgag acagggtgac 5520 aacctggcca ctttctggca acgtttgcac gtagccagac agttctcaag tcaaagagat 5580 aggtattaga gatgagattc tctctctagt atccttggta 5620

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 바이러스 유전자.
   
2. 제1항의 바이러스 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 보리의 바이러스 감염여부 진단용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 제제는 바이러스 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것인, 조성물.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 제제는 바이러스 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머인 것인, 조성물.
   
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 보리의 바이러스 감염여부 진단용 키트.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것인, 보리의 바이러스 감염여부 진단용 키트.
   
7. 바이러스의 감염이 의심되는 보리 식물체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 보리의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 생물학적 시료는 보리 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 화분으로부터 유래된 것인, 방법.
   
   

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