CN110286216B - 一种快速可视化的溶血性大肠杆菌o157：h7检测方法 - Google Patents

一种快速可视化的溶血性大肠杆菌o157：h7检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速可视化的溶血性大肠杆菌O157：H7检测方法，以微流控芯片作为反应的载体，将I链经共价连接在微流控芯片底板上反应孔的表面，核酸适配体与I链通过碱基互补配对结合，溶血性大肠杆菌O157：H7与所述的核酸适配体特异性结合后，核酸适配体从I链脱离，H1链、H2链与I链通过碱基互补配对结合并发生HCR反应，H1链和H2链3’末端耦连的铂纳米粒子催化H2O2反应产生O2，O2推动微流控芯片上的指示剂形成人眼可视的指示条带，根据指示条带的长度定量大肠杆菌O157：H7的浓度。此检测方法以裸眼可视的方式来获取溶血性大肠杆菌的浓度，灵敏度高，操作简单，成本低廉。

Description

一种快速可视化的溶血性大肠杆菌O157：H7检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种基于核酸适配体及微流控芯片快速检测溶血性大肠杆菌的方法，通过这种方法可以实现溶血性大肠杆菌的体外快速检测，并且以裸眼可视的方式来获取溶血性大肠杆菌的浓度。
背景技术
溶血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli)是大肠杆菌(E.coli)的一个亚型，主要分为O157：H7、O26：H11、O111和O104等4种血清型，其中E.Coli O157：H7为典型的主要致病菌。该致病菌可以引起人体腹泻、出血性肠炎、血栓性血小板减少性紫癫和溶血性尿毒症，E.coli O157：H7的感染具有爆发流行、致病性强、致死率高等特点。因此，针对E.coli O157：H7致病菌的快速、特异的检测对于相关疾病的有效控制至关重要。
目前关于E.coli O157：H7的检测方法主要包括：1)常规检测方法：培养和克隆计数是最常使用的细菌检测方法和最标准的检测方法，培养基里通常加入一些生长抑制因子来抑制非目标细菌的生长或者使用一些仅目标细菌能够分解吸收营养的特殊培养基，或者赋予要检测的细菌一种特殊的颜色，使得肉眼就可以区分目标细菌和非目标细菌，这种方法操作简单，成本低，但周期长，检测速度慢；2)免疫学检测方法：这种方法主要利用E.coliO157：H7抗原与相应抗体的特异反应来检测，目前应用较多的有酶联免疫吸附法、金标法和免疫磁珠富集等，这类方法操作简单、检测快速，但是成本及特异性还有待改善；3)分子生物学方法：这种方法主要通过PCR技术对E.coli O157：H7菌株中特异性目的基因扩增然后进行下游检测，与常规检测方法相比缩短了检测时间，但不能区分致病菌的死活，而且扩增产物容易被污染造成假阳性的结果；4)生物传感器：通过致病菌独特的理化性质来检测，主要有光学生物传感器、压电生物传感器、电化学生物传感器、纳米生物传感器等等，这些生物传感器检测高效、灵敏度高，但是设备昂贵，不利于广泛使用。综上所述，目前已有检测E.coli O157：H7的方法或耗时长，或灵敏度不高，或成本太高，因此发展更加快速、稳定、灵敏、高效且低成本的E.coli O157：H7检测方法将具有非常重要的意义。
近年来，微流控技术由于其独特的优点被广泛应用于致病菌的分析检测。微流控芯片的优点在于可以大量生产，成本较低；消耗样品少；样品混合速率快，分析时间短；更安全，对环境更友好。V-Chip(volumetric bar-chart chip)是近几年被发展的一类用于生化分析和检测的微流控芯片(Nature Communications,2012,3:1283；ACS Nano,2015,10:1640；Biosensors and Bioelectronics,2016,85:777)，它由盖片和底片组成，二者之间可以相互滑动，因此不需要任何阀或其它外加装置就可以实现液体间的隔离或接触；当液体接触时，会启动芯片上的反应产生气体，气体量的大小与被检物质的多少直接相关，气体可以推动芯片上的指示剂流动一段距离形成能被人眼识别的颜色条带，从而实现生化分子的可视化检测。
核酸适配体，是指通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands byExponential enrichment)技术在体外筛选的，对靶目标具有高亲和力、高特异性的单链DNA或RNA，具有靶标物质范围广泛，筛选周期短，亲和力高，特异性好，易保存运输等诸多优点。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种基于微流控芯片及核酸适配体的E.coli O157：H7检测方法，此检测方法灵敏度高、操作简单，成本低廉，且可以通过裸眼实现E.coliO157：H7的快速检测。
技术原理：先将微流控芯片底板上反应孔的表面进行改性，其后将I链经共价连接在微流控芯片的表面，然后将可以特异识别E.coli O157：H7的核酸适配体(简称A链)与I链通过碱基互补配对结合，E.coli O157：H7与核酸适配体结合后会从I链上脱离下来，E.coli越多，暴露的I链就越多；然后将足量的、带有铂纳米粒子(PtNP)的H1链、H2链加入体系中，由于I链、H1、H2的碱基序列是根据HCR(hybridization chain reaction)反应来设计的，在有I链存在时，H1链与H2链会相继结合，形成类似楼梯一样的结构；由于H1与H2链是足量的，所以I链越多在基底上就有形成越多的楼梯，也就会引入越多的PtNP；PtNP可以催化H2O2反应产生O2，从而推动芯片上的指示剂形成裸眼可见的条带，条带长度越长，说明反应体系中产生的O2越多，也就说明PtNP越多，进一步说明E.coli越多。该反应中，H1、H2链结合I链形成的楼梯结构的长度(及对信号的放大倍数)随时间延长而增加，半小时可以放大100倍以上。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速可视化的溶血性大肠杆菌O157：H7检测方法：以微流控芯片作为反应的载体，将I链经共价连接在微流控芯片底板上反应孔的表面，核酸适配体与I链通过碱基互补配对结合，溶血性大肠杆菌O157：H7与所述的核酸适配体特异性结合后，核酸适配体从I链脱离，H1链、H2链与I链通过碱基互补配对结合并发生HCR反应，H1链和H2链3’末端耦连的铂纳米粒子催化H2O2反应产生O2，从而推动微流控芯片上的指示剂形成人眼可视的指示条带，根据指示条带的长度定量大肠杆菌O157：H7的浓度。
进一步地，核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，I链的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，H1链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，上述的溶血性大肠杆菌O157：H7检测方法，具体包括如下步骤：
(1)微流控芯片底板改性：将芯片的底板反应孔表面活化后，再将反应孔进行环氧化处理；
(2)加入I链：在改性后的反应孔中加入5’末端氨基化的I链，I链通过氨基与反应孔表面的环氧基共价连接；
(3)加入核酸适配体：用缓冲液清洗反应孔后，再向反应孔中加入核酸适配体，核酸适配体与I链通过碱基配对结合；
(4)将已知浓度的溶血性大肠杆菌O157：H7标准样品和待测样本分别加入反应孔中孵育，缓冲液冲洗反应孔后，再加入H1链和H2链进行孵育，用缓冲液冲洗反应孔；
(5)将微流控芯片的底板和盖板组合，在芯片中加入缓冲液、H2O2及指示剂，滑动芯片后十分钟进行读数，根据标准品的浓度及其产生的指示条带的长度制作标准曲线，再根据标准曲线计算待测样本的浓度值。
所述的微流控芯片包括但不限于实施例中所述的芯片类型，还可选用其它可产生气体推动指示剂形成人眼可识别的指示剂条带的芯片，比如文献《Multiplexedvolumetric bar-chart chip for point-of-care diagnostics》(Song Y,Zhang Y,Bernard P E,et al.Nature Communications,2012,3:1283)和《Fast,Sensitive andQuantitative Point-of-Care Platform for the Assessment of Drugs of Abuse inUrine,Serum and Whole Blood》(Li Y,Uddayasankar U,et al.Analytical Chemistry,2017:89,8273)中已公开的芯片(简称V-chip)。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1.利用特异性的核酸适配体直接识别E.coli O157：H7，然后利用HCR反应让体系的检测探针(PtNP)数量增大最少两个数量级，从而有效提高检测的灵敏度；
2.将反应体系中的检测信号转化为可视的指示剂的长度，从而在不需要任何仪器设备的情况下完成对E.coli O157：H7的定量检测；
3.本发明对E.coli O157：H7可实现250CFU/mL的最低检测限。
附图说明
图1为核酸适配体(A链)与E.coli O157：H7的特异性结合效果。泳道1：2.5μL A链，泳道2：40μL E.coli O157:H7，泳道3:2.5μL A链+2.5μL E.coli O157:H7，泳道4:2.5μL A链+5μL E.coli O157:H7，泳道5:2.5μL A链+10μL E.coli O157:H7，泳道6:2.5μL A链+20μL E.coli O157:H7，泳道7:2.5μL A链+40μL E.coli O157:H7。
图2为E.coli O157：H7的检测原理验证。泳道1:2.5μL I链，
泳道2:5μL A链，泳道3:2.5μL I链+5μL A链，泳道4:2.5μL I链+5μL A链(95℃加热变性10min)，泳道5:5μL H1链+5μL H2链，泳道6:5μL H1链+5μL H2链(95℃加热变性10min)，泳道7:2.5μL I链+5μL H1链+5μL H2链，泳道8:2.5μL I链+5μL A链+5μL H1链+5μLH2链，泳道9:2.5μL I链+2.5μL A链+5μL H1链+5μL H2链，泳道10:2.5μL I链+5μL A链+20μL E.coli O157:H7+5μL H1链+5μL H2链，泳道11:2.5μL I链+2.5μL A链+20μL E.coliO157:H7+5μL H1链+5μL H2链，泳道12:2.5μL I链+2.5μL A链+20μL E.coli O157:H7+5μLH1链+5μL H2链，泳道12与泳道11区别在于12是菌液离心后取的上清，在上清中加H1链和H2链。
图3为微流控芯片图。(a)底板，箭头所指为反应孔；(b)盖板；(c)盖板与底板组合后的芯片效果图；(d)为盖板与底板滑移后的芯片效果图。芯片组合后，e、f、和g所示的结构处分别用于缓冲液、H2O2和指示剂的装载；h和i分别为读数通道和读数标尺。
图4为芯片上E.coli O157：H7检测原理图。其中，(1)为微流控芯片底板，(2)为I链，(3)为A链，(4)为E.coli O157：H7，(5)为H1链，(6)为H2链，(7)为PtNP。
图5为微流控芯片的检测结果图，从左至右被检样品分别对应缓冲液、稀释10000倍、1000倍和100倍的E.coli O157：H7，其对应的指示剂的长度分别为0，2，4.6，8.9mm。
图6为E.coli O157：H7菌浓度与指示剂长度的标准曲线。
具体实施方式
实验材料说明：
核酸适配体(简称A链)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，I链的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，H1链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，H2链的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，经过HPLC-CE方式纯化。H1链及H2链的3’末端耦连巯基及铂纳米粒子(PtNP)，PtNP可通过商业购买获得，粒径可根据需要选择，一般优选为1-100纳米，我们选用了5nm的PtNP；将3’末端耦连巯基的H1链、H2链分别与过量的PtNP混合，室温孵育2小时，H1链、H2链通过巯基与PtNP形成共价连接，其后用牛血清蛋白(BSA)封闭对铂金属粒子表面的空白位点进行封闭，所制得得H1-PtNP、H2-PtNP存于4度冰箱待用。
实施例1：
本实施例为核酸适配体对NB培养基中E.coli O157：H7的琼脂糖凝胶电泳检测结果。检测步骤如下：
将E.coli O157：H7在NB培养基培养至OD600＝1.0左右，然后取1ml菌于4000rpm离心5min，弃上清，重复两次；加入1ml 10mM Tris pH7.5buffer重悬菌液，按图1中7条泳道分别配制体系，室温孵育50min，孵育完成后4000rpm离心5min取上清进行琼脂糖凝胶电泳。
结果如图1所示，随着反应中E.coli O157:H7菌浓度的增大，A链对应的条带明显减弱，说明E.coli O157:H7对A链的结合也随之增大，证实该核酸适配体能很好地识别E.coli O157:H7。
实施例2：
本实施例为通过琼脂糖凝胶电泳验证E.coli O157：H7检测的原理。步骤如下：
将E.coli O157：H7在NB培养基培养至OD600＝1.0左右，然后取1ml菌于4000rpm离心5min，弃上清，重复两次；加入1ml 10mM Tris pH7.5buffer重悬菌液，按图1中12条泳道分别配制体系，室温孵育50min，孵育完成后4000rpm离心5min取上清进行琼脂糖凝胶电泳。
结果如图2所示，I链、H1链、H2链在没有A链和E.coli O157:H7存在时可以形成很好的楼梯(如条带7)；在有足够的A链和没有E.coli O157:H7存在时，由于I链被A链封闭，H1、H2无法与I链结合，所以无法形成楼梯(如条带8)；在无E.coli O157:H7，但A链略偏少时，由于有部分的I链是暴露的，H1、H2可以与I链结合，从而形成楼梯(如条带9)；在有足够的A链对I链封闭时，E.coli O157:H7会和游离的A链结合，但不会让I链暴露，从而H1、H2无法与I链结合，不能无法形成楼梯(如条带10)；对比条件9，条件11，12由于E.coli O157:H7的存在会结合部分A链，让溶液中的I链相对于条件9更多，从而使条件11，12中H1，H2形成的楼梯高度减小。
实施例3：
本实施例为测定微流控芯片上E.coli O157:H7检测的标准曲线和最低检测限。实验所用的缓冲液为pH＝7.5的Tris-HCl buffer(10mM Tris,5mM Mg2+)。下面结合附图3、4、5对检测过程进行说明：
芯片预处理及试剂装载：
1)微流控芯片改性。如图3所示，微流控芯片由尺寸为75mm×50mm的底板和盖板组成，底板和盖板可以分开和组合；分开时，底板上可以进行检测反应；组合后，相应通道被连接起来形成4组并行的结构，可以通过进样孔进行相应试剂的装载(e，缓冲液；f，H2O2；g，指示剂)，试剂装载完成后，盖板可以相对底板滑动，从而让反应孔内的PtNP与H2O2接触，启动气体反应，产生的气体可以推动指示剂在读数通道流动一段距离，反应一定时间后根据读数标尺进行读数。
按照体积比3:1配制浓硫酸：双氧水的混合液，然后加入至芯片底板反应孔中进行表面活化；30分钟后，用超纯水洗净芯片，再在反应孔内加入10％的(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷(甲苯配制)，于120℃将芯片烘30分钟，芯片表面引入大量环氧基；
2)在改性后的反应孔内加入10μL的I链(2μM)，I链通过氨基与芯片表面的环氧基发生共价反应，反应进行1个小时；
3)用缓冲液对反应孔清洗后，再往反应孔内加入10μL的A链(5μM)，A链与I链通过碱基配对结合在一起，多余的A链用缓冲液进行冲洗；
芯片上E.coli O157：H7检测标准曲线绘制：
1)将培养至OD600＝1.0的E.coli O157：H7分别稀释10、102、103、104、105和106倍，然后取上述稀释了103、104、105倍的菌液和缓冲液各10μL从右至左加到芯片的反应孔中，孵育30分钟，之后用缓冲液清洗反应孔表面；稀释了105倍的菌液取100μL均匀涂板于固体琼脂平板上培养16h后再计数。
2)将耦联有PtNP的H1链、H2链(10μM)加入到反应孔中孵育30分钟，其后用缓冲液冲洗反应孔；
3)将芯片组合，在芯片对应的位置通入相应的试剂(如图3，e、f、g所示的结构处分别通入缓冲液、H2O2及指示剂)，滑动芯片盖片使反应孔中的PtNP与H2O2接触，十分钟后进行读数。由图5可知，根据芯片上设计的尺度，缓冲液和稀释105倍、104倍和103倍的E.coliO157：H7菌液，其对应的指示剂的平均长度(三次测试)分别为0，20，46，89mm。后又对第一步中稀释了106、102和10倍的菌液分别在芯片上进行了测试，其对应的平均长度分别为1，112和134mm。
4)浓度计算。稀释了105倍的大肠杆菌菌液100μL培养后形成的菌落数约为5×102个，因此原始OD600＝1.0的大肠杆菌培养液中E.coli的数目约为10×5×102×105＝5.0×108CFU/mL；据此，稀释10、102、103、104、105和106倍的E.coli O157：H7菌液其浓度均可获得。
5)标准曲线绘制。通过上述结果，绘制E.coli O157：H7菌浓度与指示剂长度的标准曲线如图6所示。根据最低检测限计算公式(样本信号强度大于背景信号的3倍标准偏差)，我们获得本方法的最低检测线约为250CFU/mL。
实施例4：
本实施例为验证本发明方法检测E.coli O157：H7的准确性。将培养至OD600＝1.0的E.coli O157：H7取10μL菌液加入到10mL培养基中，37°摇床上培养12h后，将菌液分别稀释103、104和105倍；被稀释105的菌液取100μL均匀涂板于固体琼脂平板上培养16h后进行E.coli的计数，而被稀释103、104和105倍的菌液于芯片上进行E.coli浓度的检测。其结果如表1所示，通过平板计数得到被稀释105倍的菌液100μL的菌落数为360个(即3600CFU/mL)，因此原始菌液浓度为3.6×108CFU/mL；而通过芯片上的三次测试，获得的三个菌液(被稀释105、104和103倍)的浓度平均值分别为3400、3.5×104、3.7×105CFU/mL，因此芯片上各样本的测试结果与标准计数方法所获得的结果(3600、3.6×104、3.6×105CFU/mL)非常接近，证明本发明的方法结果准确、稳定。
表1
Figure GDA0002174039740000081
序列表
<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所
<120> 一种快速可视化的溶血性大肠杆菌O157：H7检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccgtcaca cctgctctgt ctgcgagcgg ggcgcgggcc cggcggggga tgcgtggtgt 60
tggctcccgt at 72
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atacgggagc caacaccacg catc 24
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagccaacac cacgcatcca aagtgatgcg tggtgttggc tcccgtat 48
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actttggatg cgtggtgttg gctcatacgg gagccaacac cacgcatc 48

Claims (2)

1.一种快速可视化的溶血性大肠杆菌O157：H7检测方法，其特征在于，以微流控芯片作为反应的载体，将I链经共价连接在微流控芯片底板上反应孔的表面，核酸适配体与I链通过碱基互补配对结合，溶血性大肠杆菌O157：H7与所述的核酸适配体特异性结合后核酸适配体从I链脱离，H1链、H2链与I链通过碱基互补配对结合并发生HCR反应，H1链和H2链3’末端耦连的铂纳米粒子催化H2O2反应产生O2，O2推动微流控芯片上的指示剂形成人眼可视的指示条带，根据指示条带的长度定量大肠杆菌O157：H7的浓度；核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，I链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，H1链的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的溶血性大肠杆菌O157：H7检测方法，其特征在于，具体包括 如下步骤：
（1）微流控芯片底板改性：所述的微流控芯片由盖板和底板组成，盖板和底板可以相对滑动，芯片内经过反应可以产生气体并推动指示剂形成读数条带，将芯片的底板反应孔表面活化后，再将反应孔进行环氧化处理；
（2）加入I链：在改性后的反应孔中加入5’末端氨基化的I链，I链通过氨基与反应孔表面的环氧基共价连接；
（3）加入核酸适配体：用缓冲液清洗反应孔后，再向反应孔中加入核酸适配体，核酸适配体与I链通过碱基配对结合；
（4）将已知浓度的溶血性大肠杆菌O157：H7标准样品和待测样本分别加入反应孔中孵育，缓冲液冲洗反应孔后，再加入H1链和H2链进行孵育，用缓冲液冲洗反应孔；
（5）将微流控芯片的底板和盖板组合，在芯片上装载相应的缓冲液、H2O2及指示剂，滑动 芯片后十分钟进行读数，根据标准品的浓度及其产生的指示条带的长度制作标准曲线，再 根据标准曲线计算待测样本的浓度值。
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