CN107271583B - 用于检测8-OHdG的适配体功能化磁纳米材料及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学检测领域，具体而言，涉及一种用于检测8‑OHdG的适配体功能化磁纳米材料及其应用。所述适配体功能化磁纳米材料，其由生物素化8‑OHdG适配体修饰到磁纳米颗粒表面得到。该适配体功能化磁纳米材料可与液相色谱‑串联质谱技术联用，针对8‑OHdG进行检测，该方法具有灵敏度高、选择性好，操作简单、快速等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测领域，具体而言，涉及一种用于检测8-OHdG的适配体功能化磁纳米材料及其应用。
背景技术
8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG)是一种DNA氧化损伤产生的加合物，也是灵敏和有效示踪DNA氧化损伤的有效生物标记物。其是指在受到化学物质、电离辐射、吸烟以及空气污染等因素的影响下，体内产生的大量活性氧自由基，致使氧化损伤产生的氧化加合物，若该损伤未被及时修复或被错误修复时，即会引起基因突变，而此突变若发生在功能基团的表达序列，将会导致肿瘤等疾病的发生。因此，DNA氧化加合物的形成代表着化学致癌过程中的一个早期的、可检测的关键阶段。在已发现的二十几种DNA氧化损伤产物中，8-OHdG性能稳定，不受饮食等因素影响，可从体液如血浆和尿样中检出，可实现无创伤性检测。为此，8-OHdG已被公认为氧化损伤的一种主要生物标记物。但是由于尿样中8-OHdG含量非常低、基质干扰很大，分析中常用固相萃取进行样品富集，萃取材料主要有C18和HLB等通用型非选择性材料，在处理尿样时，费时费力，缺乏选择性，严重干扰了含量很低8-OHdG分离分析。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测8-OHdG的适配体功能化磁纳米材料，其特异性好，灵敏度高，可克服固相萃取及材料的不足。
本发明的第二目的在于提供一种基于适配体功能化磁纳米材料富集分离8-OHdG的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明为了弥补现有富集技术不足，提供了一种用于检测8-OHdG的适配体功能化磁纳米材料，其由生物素化8-OHdG适配体修饰到磁纳米颗粒表面得到；
所述8-OHdG适配体的序列如SEQ ID NO:1所示。
核酸适配体(Aptamer)是一种单链的寡核苷酸，多为单链DNA，长度在10～100bp之间，通常是利用特异的靶标从随机序列的寡核苷酸文库中通过体外筛选获得，作为一种新型生物识别分子，可以与靶标物质高亲和力特异性结合。
本发明涉及的核酸适配体是已知并成功从体外合成的随机寡核甘酸文库中通过指数富集配体的系统进化技术筛选得到的与靶物质特异性结合的一簇DNA片段(序列如SEQID NO:1所示)。该适配体的亲和力(平衡解离常数Kd)为0.1mmol/L。利用8-OHdG核酸适配体特异性和磁纳米材料易分离性可以快速和选择性从尿液中提取出8-OHdG，克服了固相萃取及材料的不足。
本发明提供的用于检测8-OHdG的适配体功能化磁纳米材料可特异性地与8-OHdG结合，还具有灵敏度高、线性范围广等优点，并且磁纳米颗粒在进行纯化的时候操作简单，利用推广使用。
优选的，如上所述的适配体功能化磁纳米材料，所述磁纳米颗粒是通过戊二醛交联作用在氨基化三氧化二铁表面修饰醛基，再将亲和素修饰到磁纳米表面得到。
优选的，如上所述的适配体功能化磁纳米材料，所述生物素化8-OHdG适配体修饰到磁纳米颗粒表面的过程具体包括：
将所述磁纳米颗粒于PBS中超声分散，加入生物素化8-OHdG适配体单链并孵育，磁分离后，清洗除去未与所述磁纳米颗粒连接的单链。
一种基于如上所述的适配体功能化磁纳米材料的检测8-OHdG的方法，包括：
将所述适配体功能化磁纳米材料加入到待检样品的溶液中，室温孵育使其充分结合后用磁铁分离并洗脱得到洗脱液；通过液相色谱-串联质谱技术对洗脱液进行检测。
优选的，如上所述的方法，洗脱时所用的溶剂为甲醇。
优选的，如上所述的方法，洗脱温度为58℃～62℃，洗脱时间为50min～70min；
更优选的，洗脱温度为59℃～61℃，洗脱时间为59min～61min。
优选的，如上所述的方法，在通过液相色谱-串联质谱技术对洗脱液进行检测之前还包括：将所述洗脱液吹至近干并用水重悬。
优选的，如上所述的方法，液相色谱的流动相为0.08％～0.12％v/v甲酸甲醇溶液；更优选的，液相色谱的流动相为0.1％v/v甲酸甲醇溶液。
优选的，如上所述的方法，液相色谱的洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.2～0.4mL/min；
更优选的，流速为0.3mL/min。
优选的，如上所述的方法，质谱条件为正离子模式下多反应检测，检测离子对分别为m/z 284.1>140和m/z 284.1>168。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的检测探针灵敏度高、选择性好。
(2)目标物能够在很快的时间之内进行富集、分离。
(3)本发明方法简单、快速、易操作。
具体实施方式
本发明提供了一种适配体功能化磁纳米材料磁分离8-羟基脱氧鸟苷的方法，其特征在于：适配体功能化的磁纳米材料合成、纳米材料吸附8-羟基脱氧鸟苷，并洗脱后通过高效液相-串联质谱仪检测；
适配体功能化的磁纳米材料合成步骤为：
在乙二醇中，按1,6-己二胺、无水乙酸钠和六水合三氯化铁按一定比例混合转移到水热反应釜加热反应，制备出氨基化磁纳米粒子。通过戊二醛偶联链亲和素，使磁纳米粒子表面修饰上亲和素。通过亲和素-生物素系统，5末端修饰上生物素的8-羟基脱氧鸟苷适配体固定亲和素修饰的磁纳米材料表面。
在使用适配体吸附样品中的目标物的时候，将所述适配体功能化磁纳米材料加入到待检样品的溶液中，室温孵育使其充分结合后用磁铁分离并洗脱得到洗脱液；通过液相色谱-串联质谱技术对洗脱液进行检测。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种基于适配体功能化磁纳米材料富集分离8-OHdG，从而实现尿液中8-OHdG含量测定。
S11、适配体功能化的磁纳米材料合成
在70mL乙二醇中，加入12.0g 1,6-己二胺、4.5g无水醋酸钠和2.5g六水合三氯化铁。然后在50℃加热条件下搅拌，形成较均匀的胶体溶液。将所得溶液转移到100mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在200℃件下反应6h。取出反应釜后，在室温下自然冷却，弃釜内上层液体，下层黑色固体用二次水冲洗至烧杯中，然后利用磁分离收集。超声条件下，再用二次水和乙醇洗涤3-4次，所得黑色固体冷冻干燥。
称取上述黑色固体4.0mg溶解在2.0mL10.0mmol/LPBS中超声分散，加入1.0mL15％戊二醛溶液。将混合溶液在室温下缓慢摇晃2h，反应结束后，磁分离,得到的固体粉末用5.0mL10.0mmol/LPBS洗三次。将粉末再用2.0mL10.0mmol/LPBS溶解，超声分散开，加入0.5mL1.0mg/mL亲和素。此溶液在室温下缓慢摇晃12h，反应结束后清洗多次，弃上清。所得沉淀物在37℃条件下干燥12h。
利用通过亲和素与生物素之间的特异性结合将表面修饰有亲和素的磁性纳米球与生物素修饰的8-OHdG适配体单链连接。具体方法为取2mg上述沉淀物溶孵于1.0mL10.0mmol/LPBS中超声分散，随后加入50nM生物素修饰适配体单链，37℃孵育过夜，磁分离后，弃上清，并且用PBS缓冲液清洗多次以保证去除未与纳米材料连接的单链，最后将沉淀重悬于1mLPBS缓冲液中，4℃保存。
S12、适配体吸附尿液中目标物
200L溶于PBS缓冲液的磁纳米探针置于2.0mL离心管中，加入1.0mL含1.0ng/mL-10.0ng/mL8-羟基脱氧鸟苷样品溶液中，室温下孵育2小时，磁铁分离；
S13、目标物的解吸
将上述经过磁分离后的适配体功能化磁纳米粒子于2.0mL甲醇溶剂中在60℃下洗脱1小时，收集洗脱液，洗脱液吹至近干，用水定容1.0mL；
S14、目标物检测
将(3)中定容液通过高效液相-串联质谱仪检测：液相色谱条件为：流动相为0.1％甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脱；流速为0.3mL/min；质谱条件为正离子模式下多反应检测，检测离子对分别为m/z 284.1>140和m/z284.1>168。8-OHdG在0.2ng/mL-20.0ng/mL峰面积与浓度呈线性关系，相关系数达到0.999。
实施例2
本实施例提供了一种基于适配体功能化磁纳米材料富集分离8-OHdG，从而实现尿液中8-OHdG含量测定。
S21、S22操作同S11、S12。
S23、目标物的解吸
将上述经过磁分离后的适配体功能化磁纳米粒子于2.0mL甲醇溶剂中在58℃下洗脱50min，收集洗脱液，洗脱液吹至近干，用水定容1.0mL；
S24、目标物检测
将(3)中定容液通过高效液相-串联质谱仪检测：液相色谱条件为：流动相为0.08％甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脱；流速为0.4mL/min；质谱条件为正离子模式下多反应检测，检测离子对分别为m/z 284.1>140和m/z 284.1>168。8-OHdG在0.2ng/mL-20.0ng/mL峰面积与浓度呈线性关系，相关系数达到0.999。
实施例3
本实施例提供了一种基于适配体功能化磁纳米材料富集分离8-OHdG，从而实现尿液中8-OHdG含量测定。
S31、S32操作同S11、S12。
S33、目标物的解吸
将上述经过磁分离后的适配体功能化磁纳米粒子于2.0mL甲醇溶剂中在62℃下洗脱70min，收集洗脱液，洗脱液吹至近干，用水定容1.0mL；
S34、目标物检测
将(3)中定容液通过高效液相-串联质谱仪检测：液相色谱条件为：流动相为0.08％甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脱；流速为0.2mL/min；质谱条件为正离子模式下多反应检测，检测离子对分别为m/z 284.1>140和m/z 284.1>168。8-OHdG在0.2ng/mL-20.0ng/mL峰面积与浓度呈线性关系，相关系数达到0.999。
实验例1尿样实际样品中8-OHdG含量检测及以HLB为固相萃取柱的结果对比
取不同志愿者的尿样，利用实施例1中的方法和固相萃取分别测定其中8-OHdG的含量，结果见表1。将得到的数据进行相关性比较，结果表明两者无显著差异。说明该发明方法快速可靠，灵敏度高，稳定性好，适合用于尿样实际样品中8-OHdG的检测。
表1尿样实际样品检测本方法和固相萃取方法
实验例2尿样实际样品中8-OHdG含量检测及添加回收率试验
从实验例1得到8-OHdG含量数据中选择一组作为本底值，接着选取添加2.0ng/mL、4.0ng/mL和8.0ng/mL分别添加到待测物中，同样利用本发明方法再次检测其中的含量，得到检测值。回收率在80％～100％之间，相对标准偏差少于10％，说明本发明稳定，灵敏，准确，适合用于尿样实际样品中8-OHdG含量的检测(结果见表2)。
表2制备的适配体功能化磁纳米粒子用于尿样中8-OHdG添加回收率和重复性
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> PA1404126BJ_用于检测8-OHdG的适配体功能化磁纳米材料及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgggcgatc ggcggggggt gcgtgcgctc tgtgccaggg ggtgggacag atcatatggg 60
ggtgct 66
Claims (3)
1.一种基于适配体功能化磁纳米材料的检测8-OHdG的方法，其特征在于，包括：
将所述适配体功能化磁纳米材料加入到待检尿液样品的溶液中，室温孵育使其充分结合后用磁铁分离并洗脱得到洗脱液；通过液相色谱-串联质谱技术对洗脱液进行检测；
所述适配体功能化磁纳米材料由生物素化8-OHdG适配体修饰到磁纳米颗粒表面得到；
所述8-OHdG适配体的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述磁纳米颗粒是通过戊二醛交联作用在氨基化三氧化二铁表面修饰醛基，再将亲和素修饰到磁纳米表面得到；
洗脱时所用的溶剂为甲醇；洗脱温度为58℃～62℃，洗脱时间为50min～70min；
液相色谱的流动相为0.08％～0.12％v/v甲酸甲醇溶液；液相色谱的洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.2～0.4mL/min；
质谱条件为正离子模式下多反应检测，检测离子对分别为m/z 284.1>140和m/z 284.1>168。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化8-OHdG适配体修饰到磁纳米颗粒表面的过程具体包括：
将所述磁纳米颗粒于PBS中超声分散，加入生物素化8-OHdG适配体单链并孵育，磁分离后，清洗除去未与所述磁纳米颗粒连接的单链。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在通过液相色谱-串联质谱技术对洗脱液进行检测之前还包括：将所述洗脱液吹至近干并用水重悬。
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| Urinary 8-OHdG: a marker of oxidative stress to DNA and a risk factor for cancer, atherosclerosis and diabetics;Lily L. Wu等;《Clinica Chimica Acta》;20041231;第339卷;全文 * |
| 人尿8一羟基脱氧鸟嘌呤的HPLC电化学测定方法;王天成等;《中国卫生检验杂》;20060430;第16卷(第4期);全文 * |
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