CN113295796B - 膜保护磁固相萃取-高效液相色谱检测牛奶中的雌激素 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了膜保护磁固相萃取‑高效液相色谱检测牛奶中的雌激素，属于检测分析领域。本发明利用在磁性Fe3O4纳米球表面原位生长亚胺类共价有机骨架COF‑LZU1，制备得到磁性复合材料Fe3O4@COF‑LZU1。本发明将其用作为吸附剂用于膜保护磁固相萃取三种雌激素，通过在特定单体浓度、萃和洗脱条件下对样品进行处理，与HPLC‑FLD联用检测，建立了E1、E2、E3的分析方法。本发明检测方法的样品处理无需有机溶剂，操作简单，吸附剂用量少，可应用于食品样品中E1、E2、E3的富集检测，检测的线性范围宽(0.1～800μg/L)、检出限低(0.01～0.15μg/L)、重复性和重现性好，具有非常好的应用前景。

Description

膜保护磁固相萃取-高效液相色谱检测牛奶中的雌激素
技术领域
本发明具体涉及膜保护磁固相萃取-高效液相色谱检测牛奶中的雌激素，属于检测分析领域。
背景技术
雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)是三种典型的内源性雌激素，可由人体及动物自身分泌。这些物质具有促进和维持女性正常生理特征以及促进动物生长、提高日增重量、提高饲料效率等作用。然而，过量的摄入会导致生殖功能障碍、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和性早熟等许多其他疾病。有研究表明，畜牧业等非法滥用雌激素会在动物体内积累，从而进入到食物链，危害人类健康。因此，有必要开发食品样品中雌激素的快速、准确检测方法，以便雌激素残留实施有效监控。
E1、E2、E3在食品中的含量通常较低，尤其是牛奶样品，因其基质较为复杂，因此在分析之前，通常使用各种预处理技术对样品中的分析物进行富集。传统的样品预富集方法选择性差，回收率低，难以准确分离和检测牛奶样品中的雌激素。因此，开发吸附性能好、稳定性高的准确分离和检测多种雌激素的方法具有重要意义。
发明内容
本发明通过原位生长策略制备磁性Fe3O4@COF-LZU1，用其作为吸附剂，建立了膜保护MSPE法用于萃取牛奶中的痕量雌激素(E1、E2、E3)，并与HPLC-FLD联用检测。所制备的复合材料不但具有COF-LZU1的优异特性，还具有与溶液分离操作简单、快速的特点。此外，利用膜保护技术减少了牛奶样品预处理步骤，无需有机溶剂便能进行萃取，这为复杂基质食品样品中痕量物质的分析提供了一种简单且绿色环保的方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于吸附雌激素的磁性吸附材料，所述材料的制备方法包括如下步骤：
(1)制备氨基修饰的Fe3O4粒子：将铁盐分散在乙二醇中，然后加入乙酸钠，溶解混匀后，再加入乙二胺进行反应，反应结束后获得透明溶液；将该透明溶液置于反应容器中，在180-220℃下进行溶剂热反应，反应结束后，冷却，并通过外加磁场进行固液分离，收集固体，即得氨基修饰的Fe3O4粒子，记作Fe3O4-NH2；
(2)将所得氨基修饰的Fe3O4粒子分散在二氧六环中，配制得到分散液A；将1,3,5-三甲醛基苯(TFB)分散在在二氧六环中，配制得到分散液B；将分散液B加入到分散液A中，获得混合液C，然后滴加乙酸溶液，滴加结束后，置于100-120℃下进行反应；反应结束后，获得初步反应液；
(3)将对苯二胺、1,3,5-三甲醛基苯分散二氧六环中，配制得到分散液D；然后将分散液D加入到初步反应液中，再滴加乙酸溶液，混匀，在100-120℃下进行反应；反应结束后，通过外加磁场进行固液分离，收集固体，即得磁性吸附材料，记作Fe3O4@COF-LZU1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中铁盐包括氯化铁或其水合物；具体可选FeCl3·6H2O。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中铁盐相对乙二醇的浓度为40-80mg/mL；具体可为50mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中乙酸钠与铁盐的质量比为2-5：1；具体可为3：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中乙二胺与铁盐的质量比为8-12：1；具体可为9：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中反应的时间为6-12h。具体可选8h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中分散液A中Fe3O4-NH2纳米粒子的浓度为15-25mg/mL；具体可选20mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中混合液C中TFB的浓度为50-60mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中混合液C中Fe3O4-NH2纳米粒子与TFB的质量比为2：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中乙酸溶液的浓度为5-8mol/L，具体可选6mol/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中乙酸与Fe3O4-NH2纳米粒子的质量比为1-2：1；具体可选1.8:1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中反应的时间为3-6h。具体可选4h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中分散液D中的对苯二胺、1,3,5-三甲醛基苯的质量比为(0.8～1.5)：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中分散液D中的对苯二胺的浓度为10～15mg/mL；具体可选12.5mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中乙酸溶液的浓度为5-8mol/L，具体可为6mol/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中乙酸与对苯二胺的质量比为6-8：1；具体可为7.2:1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中反应的时间为20～48h；具体可选24h。
在本发明的一种实施方式中，所述制备方法具体包括：
(1)制备氨基修饰的Fe3O4粒子：于20mL乙二醇中加入1.0g FeCl3·6H2O，超声混匀，之后在磁力搅拌下缓慢加入3.0g乙酸钠，继续磁力搅拌使其完全溶解，然后缓慢加入10mL乙二胺(9.0g)，并强烈搅拌，直到溶液形成透明液体；将混合溶液移入聚四氟乙烯反应釜中，并在200℃高温下反应8h；反应结束后，取出并冷却至室温，用外加磁铁分离产物，并用超纯水及乙醇洗涤数次，60℃真空干燥8h，即得氨基修饰的Fe3O4粒子，记作Fe3O4-NH2；
(2)取100mg所得Fe3O4-NH2纳米粒子分散在5mL1,4-二氧六环溶液中，超声处理使其分散均匀，加入2mL溶解有50mg TFB的1,4-二氧六环溶液，再逐滴加入0.5mL乙酸溶液，将所得溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，并在120℃下反应4h；
(3)之后，再向其中加入4mL溶解有50mg对苯二胺和50mg 1,3,5-三甲醛基苯的二氧六环溶液，并逐滴加入1mL乙酸溶液，放入120℃烘箱中反应24h；反应结束后，外部磁铁分离产物，用无水乙醇、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺依次清洗数次，最后60℃真空干燥8h，制备得到Fe3O4@COF-LZU1。
本发明的第二个目的是提供一种检测牛奶中雌激素的方法，所述方法包括如下过程：
A、样品处理：将上述磁性吸附材料置于透析膜内，并向膜内装满去离子水，获得装有磁性吸附材料分散液的透析膜；然后将装有磁性吸附材料分散液的透析膜置于一系列浓度梯度的已知E1、E2、E3含量的混合标准样品液中，对混合标准样品进行吸附萃取，结束后，收集透析膜内的分散液，并通过外加磁场进行分离，获得固体，洗脱，得到相应样品处理液；
B、检测雌激素：利用HPLC检测所得样品处理液，获得相应的高效液相色谱图；将高效液相色谱图中E1、E2、E3对应的色谱峰面积分别和相应的浓度构建线性关系，得到E1、E2、E3的检测模型。
在本发明的一种实施方式中，所述混合标准样品液的一系列浓度梯度范围为1～1000μg/L。
在本发明的一种实施方式中，所述吸附萃取的条件为：将每含有3mg磁吸附材料的透析膜置于装有20mL样品液中，在50℃下进行萃取10min。
在本发明的一种实施方式中，所述洗脱的条件为：对于每3mg磁吸附材料参与的萃取过程，配合使用2mL乙腈分两次(2×1mL)进行洗脱，合并洗脱液。
在本发明的一种实施方式中，洗脱后，使用0.22μm的尼龙滤膜过滤用于HPLC-FLD进行后续分析定量。
在本发明的一种实施方式中，所述HPLC检测的色谱条件为：选择
Figure BDA0003082851290000041
C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱对3种雌激素进行分离，并用荧光检测器(FLD)进行检测。
在本发明的一种实施方式中，所述HPLC检测的流动相为乙腈:水(80:20，v:v)。
在本发明的一种实施方式中，所述HPLC检测的进样体积为10μL，
在本发明的一种实施方式中，所述HPLC检测的流速为1mL/min。
在本发明的一种实施方式中，所述HPLC检测的分离检测条件还包括：柱温为25℃，激发波长和发射波长分别为280nm和310nm，单个样品检测时长为6min。
本发明有益效果：
本发明通过溶剂热法，在磁性Fe3O4纳米球表面原位生长亚胺类共价有机骨架COF-LZU1，制备磁性复合材料Fe3O4@COF-LZU1。通过FT-IR、XRD、EDX、HAADF-STEM、VSM和氮吸附仪等对其进行表征，结果表明合成的Fe3O4@COF-LZU1具有稳定性好、孔径分布均匀且比表面积大等特点。用其作为吸附剂用于膜保护磁固相萃取三种雌激素，与HPLC-FLD联用检测，对萃取条件进行优化，在单体浓度为50mmol/L、吸附剂用量为3mg、萃取时间为10min、萃取温度为50℃、洗脱溶剂为乙腈(2×1mL)的条件下，建立了E1、E2、E3的分析方法。该方法的线性范围宽(0.1～800μg/L)、检出限低(0.01～0.15μg/L)、重复性和重现性好。此外，预处理无需有机溶剂，操作简单，吸附剂用量少，并成功应用于食品样品中E1、E2、E3的富集检测。
附图说明
图1为Fe3O4@COF-LZU1的合成过程示意图。
图2A为Fe3O4@COF-LZU1的TEM图；图2B为Fe3O4@COF-LZU1的HAADF-STEM图及EDX元素面扫描图。
图3为Fe3O4、COF-LZU1和Fe3O4@COF-LZU1的XRD图。
图4为Fe3O4、COF-LZU1和Fe3O4@COF-LZU1的FT-IR图。
图5为Fe3O4和Fe3O4@COF-LZU1的磁滞曲线图。
图6为Fe3O4@COF-LZU1在酸、碱(A)和有机溶剂(B)中浸泡三天的FT-IR谱图。
图7A为膜保护磁固相萃取程序；图7B为HPLC-FLD检测三种雌激素。
图8为线性模型，其中(A)为E1、(B)E2和(C)E3的浓度与色谱峰面积的线性关系。
图9A为不同浓度TFB合成的Fe3O4@COF-LZU1的FT-IR谱图，图9B为对萃取效率的影响变化结果图。
图10为不同萃取条件的效果变化图；其中，(A)萃取时间、(B)萃取温度、(C)吸附剂用量对Fe3O4@COF-LZU1萃取效率的影响。
图11为不同洗脱条件的效果变化图；其中，(A)洗脱溶剂、(B)溶剂体积、(C)洗脱次数对Fe3O4@COF-LZU1萃取效率的影响。
图12为Fe3O4@COF-LZU1的吸附-解吸循环使用次数。
图13为实施例6中不同洗脱模式以及流动相比例所对应的色谱图。
具体实施方式
本发明涉及的试剂：1,3,5-三甲醛苯(TFB)、对苯二胺(PDA)、E1和E3(阿拉丁生化科技有限公司，上海)；E2(百灵威科技有限公司，上海)；实验用水为纯净水(娃哈哈集团有限公司，杭州)；N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、无水乙醇、冰乙酸、无水乙酸钠、乙二醇、FeCl3·6H2O、1,4-二氧六环(国药集团化学试剂有限公司，上海)；甲醇、乙腈和正己烷均为色谱级(赛默飞世尔科技有限公司，上海)；透析膜(亿博生物有限公司，北京)。
本发明涉及的仪器：X射线衍射仪(XRD)(德国布鲁克AXS有限公司)；Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)(Nicolet，美国)；AR522CN电子天平(奥豪斯仪器常州有限公司)；DF-101S集热式数显恒温磁力搅拌器(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；KQ-100DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Autosorb-iQ氮吸附仪(Quantachrome，美国)，MPMS3振动样品磁强计(VSM)(Quantum Design，美国)；能量色散X射线光谱(EDX)和高角度环形暗场扫描透射电子显微镜(HAADF-STEM)(Tecnai G2 F30，FEI，美国)，RamanTracer-200-HS便携式拉曼光谱仪(欧普图斯科技有限公司，美国)。配备2475荧光检测器的Waters e2695高效液相色谱仪，色谱柱为XBridge C18 5μm(4.6×250mm)(Waters，美国)。
实施例1Fe3O4@COF-LZU1的制备
制备过程如图1所示，具体如下：
(1)制备氨基修饰的Fe3O4粒子：于20mL乙二醇中加入1.0g FeCl3·6H2O，超声混匀，之后在磁力搅拌下缓慢加入3.0g乙酸钠，继续磁力搅拌使其完全溶解，然后缓慢加入10mL乙二胺，并强烈搅拌，直到溶液形成透明液体。将混合溶液移入聚四氟乙烯反应釜中，并在200℃高温下反应8h。反应结束后，取出并冷却至室温，用外加磁铁分离产物，并用超纯水及乙醇洗涤数次，60℃真空干燥8h，即得氨基修饰的Fe3O4粒子，记作Fe3O4-NH2；
(2)取100mg所得Fe3O4-NH2纳米粒子分散在5mL1,4-二氧六环溶液中，超声处理使其分散均匀，加入2mL溶解有50mg TFB的1,4-二氧六环溶液，再逐滴加入0.5mL乙酸溶液(6mol/L)，将所得溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，并在120℃下反应4h；
(3)之后，再向其中加入4mL溶解有50mg对苯二胺和50mg 1,3,5-三甲醛基苯的二氧六环溶液，并逐滴加入1mL乙酸溶液(6mol/L)，放入120℃烘箱中反应24h；反应结束后，外部磁铁分离产物，用无水乙醇、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺依次清洗数次，最后60℃真空干燥8h，制备得到Fe3O4@COF-LZU1。
Fe3O4@COF-LZU1材料表征：
通过TEM表征Fe3O4@COF-LZU1的形态，如图2A所示，Fe3O4@COF-LZU1纳米粒子呈圆形状，粒径小于10nm。通过HAADF-STEM和EDX元素面扫描图(图2B)，可以看出COF-LZU1所含元素C、N、O与Fe3O4所含元素Fe、O均匀地分布。说明COF-LZU1在Fe3O4表面均匀生长，表明Fe3O4@COF-LZU1成功合成。
通过XRD表征了Fe3O4、Fe3O4@COF-LZU1和COF-LZU1的晶型结构，结果如图3所示。Fe3O4纳米粒子在30.1°、35.5°、43.2°和56.9°处均有特征衍射峰，单独合成的COF-LZU1在5.0°处有特征衍射峰。Fe3O4@COF-LZU1复合材料在30.0°～60.0°范围内显示出了Fe3O4的特征衍射峰，说明在Fe3O4表面生长COF-LZU1没有影响其原本的晶型结构。同时，Fe3O4@COF-LZU1在5.0°处也显示了COF-LZU1的特征峰，表明复合材料成功合成。
通过FT-IR表征Fe3O4@COF-LZU1的化学组成及结构信息，如图4所示，Fe3O4纳米粒子在591cm-1处显现出强的Fe-O红外吸收峰。复合材料Fe3O4@COF-LZU1在1570cm-1处有苯环C＝C键的红外吸收峰，1609cm-1和1618cm-1处分别有C-N键及亚胺键C＝N的红外吸收峰，这与COF-LZU1的化学结构相吻合。此外，Fe3O4@COF-LZU1在591cm-1处也有Fe-O键的红外吸收峰，进一步证实Fe3O4@COF-LZU1成功合成。
Fe3O4和Fe3O4@COF-LZU1的磁响应性能用VSM进行测定(图5)。Fe3O4和Fe3O4@COF-LZU1的饱和磁化强度值分别为67.2emu/g和48.1emu/g，下降了19.1emu/g，表明在Fe3O4表面组装COF-LZU1对其磁响应性能有一定的影响。通过外加磁铁收集进行验证，发现Fe3O4@COF-LZU1复合材料可在短时间内(15s)快速响应，并与溶液分离，表明Fe3O4@COF-LZU1可用于MSPE实验。
材料稳定性分析：复合材料的耐酸碱性以及耐有机溶剂稳定性是萃取实验中必不可少的两个参数，决定了吸附剂的适用环境溶液体系。考察复合材料的耐酸碱性：将Fe3O4@COF-LZU1复合材料分别浸泡于水、酸性和碱性溶液中，通过FT-IR表征(图6)，发现COF-LZU1和Fe3O4的红外吸收特征峰在三种不同性质的溶液环境下均未发生变化，表明复合材料有很高的耐酸碱稳定性。考察复合材料的耐有机溶剂稳定性：将其分别浸泡于各种常用有机溶剂中，发现Fe3O4@COF-LZU1复合材料的红外吸收特征峰保存完整，表明复合材料不溶于这些有机溶剂，且稳定性良好。以上结果说明Fe3O4@COF-LZU1具有良好的稳定性，有潜力作为吸附剂用于萃取分析物。
实施例2膜保护-磁固相萃取处理样品
实验选用直径为2cm的透析膜，使用前，先对透析膜进行处理，其处理过程如下：将直径为2cm的透析膜用2％(w/v)的碳酸氢钠、1mmol/L EDTA(pH 8)溶液和超纯水依次在90℃下处理10min，然后再用超纯水清洗数次，并在室温下干燥。将处理后的透析膜截成6cm长的小段，并将一端密封，制得中空透析膜。制备好的中空透析膜在不使用时，需要在4℃的超纯水中浸泡，以防止其孔隙结构因在空气中过度干燥而造成不可恢复的坍塌。
膜保护-磁固相萃取过程如图7A所示。
准确称取实施例1制得的3mg Fe3O4@COF-LZU1复合材料置于透析膜中，并向膜内装满去离子水，以便产生内外压差，加速传质。将含有复合材料的透析膜置于装有20mL样品液中，在50℃下进行萃取10min，萃取结束后将透析膜中的溶液及吸附剂转移至4mL小瓶中，使用外部磁铁进行分离，并用2mL乙腈分两次(2×1mL)对复合材料进行洗脱，合并洗脱液，最后使用0.22μm的尼龙滤膜过滤用于HPLC-FLD进行分析定量(图7B)。
其中，样品液为：分别称取E1、E2、E3标准品各10.0mg，置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成1.0mg/mL混合标准储备液，存于-20℃的冰箱中，备用。
实施例3膜保护-磁固相萃取-HPLC检测雌激素
将上述实施例2中的样品液由纯净水逐级稀释储备液至所需浓度，现配现用，配制一系列浓度梯度(1～1000μg/L)的E1、E2、E3混合标准工作液。
HPLC分离检测的条件：
选择
Figure BDA0003082851290000071
C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱对3种雌激素进行分离，并用荧光检测器(FLD)进行检测，具体分离检测条件如下：以乙腈:水(80:20，v:v)为流动相，进样体积为10μL，流速为1mL/min，柱温为25℃，激发波长和发射波长分别为280nm和310nm，单个样品检测时长为6min。
获得HPLC图谱后，利用E1、E2和E3的浓度与相应的色谱峰面积构建线性关系，得到检测模型。
结果如图8和表1所示，该方法对E1、E2、E3的线性范围在0.1～800μg/L之间，R2均大于0.9955。LODs(S/N＝3)和LOQs(S/N＝10)的范围分别在0.01～0.15μg/L和0.06～0.80μg/L之间。批内、中间精密度和批间的精密度分别为3.7％～7.3％，4.7％～7.1％和6.5％～9.1％，表明该方法有良好的重复性和再现性。
表1 MSPE-HPLC方法分析三种雌激素的分析特征量
Figure BDA0003082851290000081
实施例4探究步骤(2)过程中不同单体TFB浓度制得的Fe3O4@COF-LZU1的萃取检测效果影响
参照实施例1，改变步骤(2)中的TFB浓度，其他不变，制得相应的Fe3O4@COF-LZU1。然后参照实施例2的过程进行萃取样品处理。
对单体TFB在10～60mmol/L的浓度范围内进行考察，通过FT-IR表征(图9A)，发现随着TFB浓度增大，Fe3O4的特征峰稍有减弱，COF-LZU1的特征峰强度增强，表明材料在Fe3O4表面成功生长。将复合材料用于三种分析物的萃取富集，结果如图9B所示，TFB浓度达到50mmol/L，三种分析物的回收率均达到最大，表明50mmol/L TFB为制备复合材料最佳的单体浓度。但当浓度较底，比如40mmol/L及以下，相应的复合材料的吸附能力较弱，无法用于准确灵敏检测雌激素。猜测是在吸附萃取时材料易发生团聚，影响吸附效率。
经过探究发现，合适的TFB浓度有利于COF-LZU1在磁性Fe3O4纳米粒子表面生长，形成最佳包覆层以提供更大的比表面积和有效的吸附位点。
实施例5不同萃取、洗脱条件的萃取检测效果影响
(一)、萃取条件优化：
参照实施例2，分别单因素考察如下几种萃取条件的影响：
(1)萃取时间
本实施例探索了萃取时间(5、10、15、20和25min)对三种分析物萃取效率的影响，结果如图10A所示，10min之前，E1、E2、E3的峰面积随时间增加而增大，10min之后，峰面积无明显变化，说明Fe3O4@COF-LZU1复合材料在10min内即可完成对目标物的富集。因此，萃取时间选择10min。
(2)吸附剂用量
吸附剂用量是影响萃取效率的重要因素，合适的用量可以对目标分析物提供足够且有效的吸附位点，吸附剂用量过少，提供的吸附位点有限可能会导致萃取不完全等。本实施例探索了不同吸附剂用量(1、2、3、4、5和6mg)对萃取效率的影响。由图10B可看出，3～6mg的吸附剂用量的萃取效率无明显差别，因此，实验选择3mg吸附剂材料进行实验。
(3)萃取温度
实验考察了20、30、40、50、60和70℃的萃取温度对萃取效率的影响。如图1-10C所示，20℃到50℃时萃取效率呈上升趋势，随后随着萃取温度进一步升高至70℃时呈下降趋势。这是因为吸附是放热过程，温度升高会导致吸附剂与分析物之间的作用力降低。根据上述实验结果，实验选择萃取温度为50℃。
(二)、洗脱条件优化：
参照实施例2，分别单因素考察如下几种洗脱条件的影响：
(1)解吸溶剂
合适的解吸溶剂能有效回收目标分析物，因此，实验考察了甲醇、乙腈、乙醇和正己烷对E1、E2、E3的洗脱性能，其中，前三种属于极性溶剂，正己烷是非极性溶剂。结果如图11A所示，甲醇、乙腈、乙醇对三种雌激素具有更好的洗脱效果，正己烷的洗脱效果最差。E1、E2、E3是带两个羟基的双酚类物质，极性较强，因此，在极性溶剂中的溶解度更大。在乙腈中的洗脱效果高于甲醇和乙醇，因此，实验选择乙腈作为解吸溶剂。
(2)解吸溶剂体积
在确保目标分析物完全解吸的情况下，解吸溶剂量越少越能达到富集的目的。因此，在洗脱剂选择乙腈的条件下，对洗脱溶剂体积为1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL的洗脱效果进行考察。如图11B，结果表明在2～3mL的洗脱体积下洗脱效率无明显的差异。因此，选择2mL的洗脱溶剂体积用于后续实验。
(3)解吸次数
通过优化解吸次数，由图11C可知，经过两次解吸即可将大部分目标物解吸下来。因此，选择解吸次数为2次。
实施例6不同液相条件分离检测三种雌激素
参照实施例3，在其他条件不变的情况下(即进样体积为10μL，流速为1mL/min，柱温为25℃，激发波长和发射波长分别为280nm和310n)，调整液相中洗脱模式以及流动相比例，考察HPLC-FLD对浓度为100μg/L的混合标准溶液(E1、E2、E3)的分离检测效果，所得结果如表3所示，图13呈现了不同洗脱模式以及流动相比例所对应的色谱图。由图可知，5种不同洗脱条件均能将三种目标分析物进行有效分离。然而经过对比，条件1、3耗时约7min，4耗时8min，2、5耗时约4min，在保证分离度良好的情况下，分析时长越短越有利于节约时间成本，同时也利于减少流动相的消耗。进一步比较条件2和5，发现条件5的分离度更好，目标峰更加突出，峰形好且无杂峰。因此，实验选择条件5作为最佳的液相色谱条件。
表2色谱条件的优化
Figure BDA0003082851290000101
实施例7Fe3O4@COF-LZU1的循环使用
本实施例考察了Fe3O4@COF-LZU1的吸附-解吸循环使用次数，结果如图12所示。经过10个吸附-解吸后，解吸回收率仍然达到90％以上，与首次解吸附效率相比，E1、E2、E3的解吸附效率分别下降了4.01％、3.41％、2.74％。重复使用10次之后E1、E2、E3的解吸回收率均低于90％，因此，实验表明Fe3O4@COF-LZU1可重复使用10次，具有较好的循环再生能力。
实施例8实际样品检测验证
实际样品制备：牛奶购自本地超市，取15mL牛奶样品于离心管中，纯净水稀释2倍，混匀后，在9000rpm下离心10min，丢弃沉淀以及上层脂肪层，准确称取20mL剩余液进行萃取。
为了进一步评估该方法在实际应用中的可行性，以牛奶作为实际样品，检测其中残留的E1、E2、E3。通过对7种牛奶样品进行空白测定，结果如表4所示，在生牛乳中检测到E3的含量为0.53μg/L，其余样品均未检出。为研究该方法的精密度和准确性，对高、中、低(10、50、100μg/L)3个加标水平的牛奶样品进行加标回收实验分析。结果显示在7种牛奶样品中E1、E2、E3的回收率分别为77.3％～112.1％、78.6％～106.4％和79.3％～111.4％。此外，所有加标回收的RSD均小于9.0，表明该方法在实际应用中的精密度良好。综上所述，所建立的方法适用于分析基质复杂牛奶样品中的痕量雌激素。
表3牛奶中雌酮、雌二醇和雌三醇的测定(n＝3)
Figure BDA0003082851290000102
Figure BDA0003082851290000111
对比例1
将所建立方法与已报道的一些基于SPE并结合HPLC检测牛奶中雌激素的方法进行比较，比较内容包括预处理方法、吸附剂类型及用量、有机溶剂及用量、分析物、检出限、定量限及线性范围，结果如表4所示。与其他方法比较，本文所开发方法吸附剂用量少(3mg)，样品预处理简单且无需有机溶剂，这符合检测分析倡导绿色环保的要求。通过与HPLC-FLD联用，使该方法的检出限和定量限更低，线性范围更宽。结果表明，所建立的方法优于同类型的所报道的方法，此外，操作更简单环境更友好，适用于分析基质复杂牛奶样品中的雌激素。
表4与其他测定雌激素方法的比较
Figure BDA0003082851290000112
Figure BDA0003082851290000121

Claims (6)

1.一种用于吸附雌激素的磁性吸附材料，其特征在于，所述材料的制备方法包括如下步骤：
(1)制备氨基修饰的Fe3O4粒子：将铁盐分散在乙二醇中，然后加入乙酸钠，溶解混匀后，再加入乙二胺进行反应，反应结束后获得透明溶液；将该透明溶液置于反应容器中，在180-220℃下进行溶剂热反应，反应结束后，冷却，并通过外加磁场进行固液分离，收集固体，即得氨基修饰的Fe3O4粒子，记作Fe3O4-NH2；
(2)将所得氨基修饰的Fe3O4粒子分散在二氧六环中，配制得到分散液A；将1,3,5-三甲醛基苯TFB分散在二氧六环中，配制得到分散液B；将分散液B加入到分散液A中，获得混合液C，然后滴加乙酸溶液，滴加结束后，置于100-120℃下进行反应；反应结束后，获得初步反应液；
(3)将对苯二胺、1,3,5-三甲醛基苯分散二氧六环中，配制得到分散液D；然后将分散液D加入到初步反应液中，再滴加乙酸溶液，混匀，在100-120℃下进行反应；反应结束后，通过外加磁场进行固液分离，收集固体，即得磁性吸附材料，记作Fe3O4@COF-LZU1；
步骤(1)中铁盐相对乙二醇的浓度为40-80mg/mL；乙二胺与铁盐的质量比为8-12：1；乙酸钠与铁盐的质量比为2-5：1；
步骤(2)中混合液C中Fe3O4-NH2纳米粒子与TFB的质量比为2：1；乙酸与Fe3O4-NH2纳米粒子的质量比为1-2：1；
步骤(3)中分散液D中的对苯二胺、1,3,5-三甲醛基苯的质量比为(0.8～1.5)：1；乙酸与对苯二胺的质量比为6-8：1。
2.根据权利要求1所述的磁性吸附材料，其特征在于，步骤(2)中分散液A中Fe3O4-NH2纳米粒子的浓度为15-25mg/mL。
3.根据权利要求1所述的磁性吸附材料，其特征在于，步骤(2)中混合液C中TFB的浓度为50-60mmol/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的磁性吸附材料，步骤(3)中分散液D中的对苯二胺的浓度为10-15mg/mL。
5.一种检测牛奶中雌激素的方法，所述方法包括如下过程：
A、样品处理：将权利要求1-4任一项所述的磁性吸附材料置于透析膜内，并向膜内装满去离子水，获得装有磁性吸附材料分散液的透析膜；然后将装有磁性吸附材料分散液的透析膜置于一系列浓度梯度的已知E1、E2、E3含量的混合标准样品液中，对混合标准样品进行吸附萃取，结束后，收集透析膜内的分散液，并通过外加磁场进行分离，获得固体，洗脱，得到相应样品处理液；
B、检测雌激素：利用HPLC检测所得样品处理液，获得相应的高效液相色谱图；将高效液相色谱图中E1、E2、E3对应的色谱峰面积分别和相应的浓度构建线性关系，得到E1、E2、E3的检测模型；
其中，HPLC检测的条件为：
选择
Figure FDA0003614743450000021
C18 4.6×250mm,5μm色谱柱进行分离，并用荧光检测器FLD进行检测；以乙腈:水，80:20，v:v为流动相，进样体积为10μL，流速为1mL/min，柱温为25℃，激发波长和发射波长分别为280nm和310nm，单个样品检测时长为6min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤A中所述吸附萃取的条件为：将每含有3mg磁吸附材料的透析膜置于装有20mL样品液中，在50℃下进行萃取10min。
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