CN112362764B - 一种银纳米粒子原位修饰的磁粒及其在分离富集β-受体阻滞剂中的应用 - Google Patents

一种银纳米粒子原位修饰的磁粒及其在分离富集β-受体阻滞剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种银纳米粒子原位修饰的磁粒及其在分离富集β‑受体阻滞剂中的应用。一种银纳米粒子原位修饰的磁粒的制备方法，包括如下步骤：采用溶剂热法制备COOH‑MNPs磁粒，接着COOH‑MNPs磁粒与多巴溶液反应得到聚多巴修饰的polyDOPA‑MNPs磁粒，最后在polyDOPA‑MNPs磁粒表面原位修饰Ag纳米粒子，制备得到polyDOPA@Ag‑MNPs磁粒。本发明所制备的银纳米粒子原位修饰的磁粒(polyDOPA@Ag‑MNPs磁粒)能够很好的吸附和洗脱β‑受体阻滞剂，并使用ESI‑MS技术对洗脱后的上清液进行检测，很大程度的提高了检测灵敏度。

Description

一种银纳米粒子原位修饰的磁粒及其在分离富集β-受体阻滞 剂中的应用
技术领域
本发明涉及超顺磁性功能材料技术领域，尤其涉及一种银纳米粒子原位修饰的磁粒及其在分离富集β-受体阻滞剂中的应用。
背景技术
β-受体阻滞剂被广泛用于治疗各种心血管疾病，例如高血压，缺血性心脏病和心律失常。除了其临床用途和治疗价值外，其中一些药物还可以通过放松肌肉和降低心率来改善心脏功能，这种作用经常被参加专业运动的运动员所滥用，因此被国际奥委会医学委员会禁止使用。另一方面，尽管它们与兴奋剂分析、法医或毒理学方面有内在的关联，但它们的治疗范围狭窄，临床中需要最佳的剂量调整，因此需要精确的分析方法来监测这些药物。但是，生物基质的复杂性使得生物体液中痕量β-受体阻滞剂的分析非常具有挑战性。
目前，测定β-受体阻滞剂的方法主要包括液相色谱-质谱(LC-MS)、液相-紫外(LC-UV)、电化学和二维液相结合荧光检测(FLD)。在这些方法中，LC-MS是使用最广泛的一种，但是，严重的基质干扰作用和体液中目标分析物的低含量妨碍了它们在复杂生物样品中的适用性。为了克服这些限制，采用了不同的样品前处理方法，例如基质固相分散(MSPD)、液-液萃取(LLE)、蛋白质沉淀(PP)、分子印迹固相微萃取(MIP-SPE)和基于磁性吸附剂的固相萃取(MSPE)，都已被用来消除样品基质的干扰并同时预浓缩目标分析物。但上述方法存在预处理过程复杂或者检测灵敏度不高等问题。
发明内容
本发明提供了一种银纳米粒子原位修饰的磁粒及其在分离富集β-受体阻滞剂中的应用，本发明所制备的银纳米粒子原位修饰的磁粒(polyDOPA@Ag-MNPs磁粒)能够很好的吸附和洗脱β-受体阻滞剂，并使用ESI-MS技术对洗脱后的上清液进行检测，很大程度的提高了检测灵敏度。
本发明的目的是提出了一种银纳米粒子原位修饰的磁粒的制备方法，包括如下步骤：采用溶剂热法制备COOH-MNPs磁粒，接着COOH-MNPs磁粒与多巴溶液反应得到聚多巴修饰的polyDOPA-MNPs磁粒，最后在polyDOPA-MNPs磁粒表面原位修饰Ag纳米粒子，制备得到polyDOPA@Ag-MNPs磁粒。
优选地，上述的银纳米粒子原位修饰的磁粒的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)溶剂热法制备COOH-MNPs(四氧化三铁磁粒)：将FeCl3·6H2O溶解在含有二乙二醇(DEG)和乙二醇(EG)的双溶剂中以形成澄清溶液，然后将丙烯酸钠和NaAc加入到所述的澄清溶液中得到混合溶液，并将该混合溶液在室温下搅拌均匀，将搅拌均匀的溶液转移到反应容器中反应，反应后得到的产物经洗涤、干燥后得到COOH-MNPs；
(2)COOH-MNPs磁粒用polyDOPA功能化得到聚多巴修饰的polyDOPA-MNPs磁粒：首先，将DOPA(多巴，又称3,4-二羟基苯丙氨酸)溶解在pH＝8.5的Tris-HCl(三(羟甲基) 氨基甲烷)水溶液中来制备DOPA溶液；然后，将步骤(1)中合成的COOH-MNPs加入DOPA 溶液中分散均匀，得到的产物用磁铁分离并洗涤、干燥后得到聚多巴修饰的polyDOPA-MNPs 磁粒；
(3)polyDOPA-MNPs磁粒表面原位修饰Ag纳米粒子：首先，将步骤(2)得到的聚多巴修饰的polyDOPA-MNPs磁粒分散在pH＝8.5的Tris-HCl水溶液中；然后，在室温超声处理下，缓慢滴加AgNO3溶液，再添加DOPA溶液，并将混合物超声处理，得到polyDOPA@Ag-MNPs磁粒(被聚3-(3,4-二羟苯基)-DL丙氨酸包覆的银纳米粒子修饰的磁粒)。
本发明首先采用一步法制备表面有大量的羧基的COOH-MNPs磁粒，磁粒粒径分布均匀，接着与DOPA溶液反应，利用DOPA在碱性条件下自聚，产生具有大量醌官能团的类黑色素膜，并且当COOH-MNPs磁粒浸入到该溶液中时可以粘附到其表面形成polyDOPA-MNPs磁粒。由于polyDOPA膜中丰富的邻苯二酚链很容易被氧化成醌，并同时引起金属离子的原位还原。同时，polyDOPA膜自发沉积在还原后的Ag粒子结构外部作为保护层，以防止生成的Ag被氧化。利用这些，进一步制备了polyDOPA@Ag-MNPs磁粒。本发明提出的 polyDOPA@Ag-MNPs磁粒制备过程条件温和，工艺简单。
优选地，将FeCl3·6H2O溶解在含有二乙二醇和乙二醇的双溶剂中以形成澄清溶液，澄清溶液中FeCl3的摩尔浓度为0.05-0.2mol/L，二乙二醇和乙二醇的体积比为2-4:1；然后将丙烯酸钠和NaAc加入到所述的澄清溶液中得到混合溶液，FeCl3·6H2O与丙烯酸钠的质量比为 0.3-0.4:1，丙烯酸钠与NaAc的质量比为0.5-1.5:1，并将该混合溶液在室温下搅拌0.5-1.5h形成深黄色溶液，将所述的深黄色溶液转移到反应容器中进行反应，反应温度为180℃-220℃，反应时间为8-12h，反应后得到的黑色产物分别用乙醇和水洗涤，干燥后得到COOH-MNPs 磁粒。
优选地，步骤(2)的具体步骤为：首先，将DOPA溶解在pH＝8.5的Tris-HCl水溶液中来制备DOPA溶液，DOPA溶液的浓度为0.5-1mg/mL；然后，将步骤(1)中合成的 COOH-MNPs加入DOPA溶液中25℃振荡10～12h分散均匀得到黑色产物，COOH-MNPs与 DOPA的质量比为1-3:6，黑色产物用磁铁分离并洗涤、干燥后得到聚多巴修饰的 polyDOPA-MNPs磁粒。
优选地，步骤(3)的具体步骤为：首先，将步骤(2)得到的聚多巴修饰的20～50mgpolyDOPA-MNPs磁粒分散在5～10mL的pH＝8.5的Tris-HCl水溶液中；然后，在室温超声处理下，缓慢滴加100-200mM的AgNO3溶液，AgNO3溶液的体积为100～300μL，再添加20-60 mM的DOPA溶液，DOPA溶液的体积为20～80μL，并将混合物超声处理，得到 polyDOPA@Ag-MNPs磁粒。
本发明还保护根据上述的银纳米粒子原位修饰的磁粒的制备方法制备得到的银纳米粒子原位修饰的磁粒。该磁粒兼具高分子微球的众多特性和磁响应性，并能在外加磁场的作用下方便迅速地分离。
本发明还保护银纳米粒子原位修饰的磁粒在分离富集β-受体阻滞剂中的应用。
优选地，所述的β-受体阻滞剂选自普萘洛尔、醋丁洛尔和美托洛尔中的一种。
优选地，包括如下步骤：待检测血样中加入与待检测血样体积相同的乙腈，离心处理后，收集上清液，将上清液用磷酸盐溶液稀释10倍后得到稀释的脱蛋白样品；在稀释的脱蛋白样品中加入β-受体阻滞剂，接着加入polyDOPA@Ag-MNPs磁粒，超声2～5min使polyDOPA@Ag-MNPs磁粒充分吸附β-受体阻滞剂，再将吸附β-受体阻滞剂的 polyDOPA@Ag-MNPs磁粒磁分离，去除上清液后加入洗脱液，超声洗脱1.5～2.5min，然后使用ESI-MS技术对洗脱液进行检测，实现β-受体阻滞剂的检测分析。血液中β-受体阻滞剂的回收率为80.9％-91.0％。
本发明将来自志愿者的无药物血样加入乙腈来脱蛋白，离心后收集上清，接着用10mM， pH＝7.0的磷酸盐溶液稀释10倍。然后，在稀释的脱蛋白样品中加入一定量的β-受体阻滞剂。不涉及其他预处理程序。使polyDOPA@Ag-MNPs磁粒从样品中提取β-受体阻滞剂，然后使用ESI-MS技术进行检测。
进一步优选，所述的洗脱液为质量分数为0.1％～1％的HAc甲醇溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提出的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒，能够很好的吸附和释放β-受体阻滞剂。
2、本发明提出的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒的制备方法的制备条件温和、操作简便，重现性和稳定性好。
3、本发明提出的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒实现对血液样中β-受体阻滞剂的分离富集。
4、本发明提出的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒为生物体液中药物检测方向等提供新的方法。
5、本发明所制备的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒能够很好的吸附和洗脱β-受体阻滞剂，并使用ESI-MS技术对洗脱后的上清液进行检测，很大程度的提高了检测灵敏度，该方法适用于血液样本。血液中β-受体阻滞剂的回收率为80.9～91.0％。
附图说明
图1为实施例1制备得到COOH-MNPs磁粒和polyDOPA@Ag-MNPs磁粒的TEM图，其中：图a为COOH-MNPs磁粒的TEM图，图b为polyDOPA@Ag-MNPs磁粒的TEM图；
图2为实施例1制备得到COOH-MNPs磁粒和polyDOPA@Ag-MNPs磁粒的粒径分布图；
图3为实施例1制备得到COOH-MNPs磁粒和polyDOPA@Ag-MNPs磁粒的磁饱和曲线；
图4为实施例1制备得到COOH-MNPs磁粒和polyDOPA@Ag-MNPs磁粒在不同pH条件下Zeta电势图；
图5为实施例1制备得到polyDOPA@Ag-MNPs磁粒的EDX光谱图；
图6为实施例1polyDOPA@Ag-MNPs磁粒分离富集血样中的β-受体阻滞剂后的质谱图；
图7为实施例1-3制备银纳米粒子原位修饰的磁粒的流程示意图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除特别说明，本发明使用的设备和试剂为本技术领域常规市购产品。
实施例1
如图7所示，polyDOPA@Ag-MNPs磁粒的制备，包括如下步骤：
(1)通过溶剂热还原法制备COOH-MNPs磁粒：将1.08g的FeCl3·6H2O溶解在含有DEG(30mL)和EG(10mL)的双溶剂中以形成澄清溶液，然后将3g的丙烯酸钠和3g的NaAc 加入到该澄清溶液中得到混合溶液，并将该混合溶液在室温下剧烈搅拌1h以形成深黄色溶液。之后，将深黄色溶液转移到Teflon衬里的高压反应釜(50mL)中，并在200℃加热10h，得到黑色产物COOH-MNPs磁粒，将黑色产物分别用乙醇和水洗涤三次，产物在氮气氛下于 50℃干燥备用。
(2)将步骤(1)中合成的COOH-MNPs磁粒用polyDOPA功能化：首先，将120mg DOPA溶解在160mL 10mM Tris-HCl(pH 8.5)水溶液中来制备DOPA溶液；然后，将步骤(1) 中合成的40mg COOH-MNPs磁粒分散在DOPA溶液中，并在25℃振荡11h，得到黑色产物，黑色产物(polyDOPA-MNPs磁粒)用磁铁分离并用水洗涤，在40℃下在氮气下干燥备用。
(3)在步骤(2)中合成的polyDOPA-MNPs磁粒表面原位修饰Ag纳米粒子：首先，将polyDOPA-MNPs磁粒分散在5mL Tris-HCl水溶液(pH 8.5)中；然后，在室温超声处理下，缓慢滴加200μL AgNO3(40mM)，然后添加50μL DOPA(40mM)，并将混合物超声处理15分钟；随后，将最终产物(polyDOPA@Ag-MNPs)用水洗涤三遍，并分散在2～6mL H2O 中，放置在4℃的环境下存储备用。
对步骤(1)、步骤(3)制备得到的COOH-MNPs、polyDOPA@Ag-MNPs磁粒进行TEM 和粒径分布测定，结果见图1和图2。从图中可以看到修饰过了银纳米粒子的磁粒还是呈球形，且粒径分布发生了变化，主要粒径比未修饰的磁粒大了接近20nm左右。对步骤(1)、步骤(3)制备得到的COOH-MNPs、polyDOPA@Ag-MNPs磁粒进行磁饱和曲线测定，结果见图3。结果显示两种磁粒的饱和磁化值分别为95.5和52.2emu·g-1，充分证明银纳米粒子成功修饰到COOH-MNPs上。对步骤(1)、步骤(3)制备得到的COOH-MNPs、 polyDOPA@Ag-MNPs磁粒进行Zeta电势测定，结果见图4，可以发现，在不同pH条件下，polyDOPA@Ag-MNPs的zeta电位值均小于COOH-MNPs，说明纳米银在COOH-MNPs上的固定是成功的。对步骤(3)制备的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒进行EDX测定，结果见图5，从图中可以看到，银在polyDOPA@Ag-MNPs磁粒中的含量达到4.25％。
实施例2
与实施例1相同，不同之处在于：步骤(1)澄清溶液中FeCl3的摩尔浓度为0.05mol/L，二乙二醇和乙二醇的体积比为2:1；FeCl3·6H2O与丙烯酸钠的质量比为0.3:1，丙烯酸钠与NaAc 的质量比为0.5:1，并将该混合溶液在室温下搅拌0.5h形成深黄色溶液，反应温度为180℃，反应时间为12h；步骤(2)DOPA溶液的浓度为0.5mg/mL，COOH-MNPs与DOPA的质量比为1:6；将步骤(1)中合成的COOH-MNPs加入DOPA溶液中25℃振荡10h分散均匀；步骤(3)AgNO3溶液的体积为100μL，DOPA溶液的体积为20μL。
实施例3
与实施例1相同，不同之处在于：步骤(1)澄清溶液中FeCl3的摩尔浓度为0.2mol/L，二乙二醇和乙二醇的体积比为4:1；FeCl3·6H2O与丙烯酸钠的质量比为0.4:1，丙烯酸钠与NaAc 的质量比为1.5:1，并将该混合溶液在室温下搅拌1.5h形成深黄色溶液，反应温度为220℃，反应时间为8h；步骤(2)DOPA溶液的浓度为1mg/mL，COOH-MNPs与DOPA的质量比为3:6；将步骤(1)中合成的COOH-MNPs加入DOPA溶液中25℃振荡12h分散均匀；步骤(3)AgNO3溶液的体积为300μL，DOPA溶液的体积为80μL。
实施例4
polyDOPA@Ag-MNPs磁粒分离富集β-受体阻滞剂的探讨
将来自志愿者的无药物血样，首先加入与血样样品体积相同的乙腈来脱蛋白，然后5000 rpm离心2min，收集上清，接着用磷酸盐溶液(10mM，pH 7.0)稀释10倍。然后，在稀释的脱蛋白样品中加入10ng mL-1的普萘洛尔。不涉及其他预处理程序，接着加入20mg实施例1制备得到的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒，超声3min使磁粒充分吸附β-受体阻滞剂，再磁分离，去除上清，加入洗脱液，超声洗脱2min，然后使用ESI-MS技术对洗脱液进行检测。ESI-MS 的实验是在Sarix X 7T傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)上完成的，采用阳离子检测模式。电离源采用相应的ESI设备，采用4M记录模式进行精确的质量测量。采用FT-MS 控制软件实现设备控制和数据采集。如图6所示，目标物有很好的响应，可以被检出。该方法与已报道的方法进行了对比，如表1(Table 1)所示，在检测灵敏度及消耗时间上都有很大的优势。
Table 1 Figures of merits of comparable methods for determination ofβ-blockers
Figure RE-GDA0002794799750000091
SPE:solid phase extraction；RAM:restricted-access media；MSPD:matrixsolid-phase dispersion；PP:protein precipitation；MSPE:magnetic solid phaseseparation.
Ref.[1]V.M.F.
Figure RE-GDA0002794799750000092
P.Rodrigues,C.Ribeiro,et al.,Quantification ofalprenolol and propranolol in human plasma using a two-dimensional liquidchromatography(2D-LC),J.Pharm. Biomed.Anal.141(2017)1-8.
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[3]G.Castro,I.Carpinteiro,I.Rodriguez,et al.,Determination ofcardiovascular drugs in sewage sludge by matrix solid-phase dispersion andultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,Anal.Bioanal.Chem.410(2018)6807-6817.
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结果表明所制备的磁粒适用于血液样本。
实施例5
polyDOPA@Ag-MNPs磁粒分离富集β-受体阻滞剂的探讨
将来自志愿者的无药物血样，首先加入与血样样品体积相同的乙腈来脱蛋白，然后5000 rpm离心2min，收集上清，接着用磷酸盐溶液(10mM,pH 7.0)稀释10倍。然后，在稀释的脱蛋白样品中加入10ng mL-1醋丁洛尔。不涉及其他预处理程序，接着加入20mg实施例1制备得到的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒，超声2min使磁粒充分吸附β-受体阻滞剂，再磁分离，去除上清，加入洗脱液，超声洗脱1.5min，然后使用ESI-MS技术对洗脱液进行检测， ESI-MS的检测参数与实施例4相同。
实施例6
polyDOPA@Ag-MNPs磁粒分离富集β-受体阻滞剂的探讨
将来自志愿者的无药物血样，首先加入与血样样品体积相同的乙腈来脱蛋白，然后5000 rpm离心2min，收集上清，接着用磷酸盐溶液(10mM,pH 7.0)稀释10倍。然后，在稀释的脱蛋白样品中加入10ng mL-1美托洛尔。不涉及其他预处理程序，接着加入20mg实施例1制备得到的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒，超声5min使磁粒充分吸附β-受体阻滞剂，再磁分离，去除上清，加入洗脱液，超声洗脱2.5min，然后使用ESI-MS技术对洗脱液进行检测， ESI-MS的检测参数与实施例4相同。
结果表明所制备的磁粒适用于血液样本。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.银纳米粒子原位修饰的磁粒在分离富集β-受体阻滞剂中的应用，其特征在于，包括如下步骤：待检测血样中加入与待检测血样体积相同的乙腈，离心处理后，收集上清液，将上清液用磷酸盐溶液稀释10倍后得到稀释的脱蛋白样品；在稀释的脱蛋白样品中加入10ng mL-1β-受体阻滞剂，接着加入20 mg polyDOPA@Ag-MNPs磁粒，超声2~5 min使polyDOPA@Ag-MNPs磁粒充分吸附β-受体阻滞剂，再将吸附β-受体阻滞剂的polyDOPA@Ag-MNPs磁粒磁分离，去除上清液后加入洗脱液，超声洗脱1.5~2.5 min，然后使用ESI-MS技术对洗脱液进行检测，实现β-受体阻滞剂的检测分析；
所述的银纳米粒子原位修饰的磁粒的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）溶剂热法制备COOH-MNPs：将FeCl3·6H2O溶解在含有二乙二醇和乙二醇的双溶剂中以形成澄清溶液，然后将丙烯酸钠和NaAc加入到所述的澄清溶液中得到混合溶液，并将该混合溶液在室温下搅拌均匀，将搅拌均匀的溶液转移到反应容器中反应，反应后得到的产物经洗涤、干燥后得到COOH-MNPs；
（2）COOH-MNPs磁粒用polyDOPA功能化得到聚多巴修饰的polyDOPA-MNPs磁粒：首先，将DOPA溶解在pH=8.5的Tris-HCl水溶液中来制备DOPA溶液；然后，将步骤（1）中合成的 COOH-MNPs加入DOPA溶液中分散均匀，得到的产物用磁铁分离并洗涤、干燥后得到聚多巴修饰的polyDOPA-MNPs磁粒；
（3）polyDOPA-MNPs磁粒表面原位修饰Ag纳米粒子：首先，将步骤（2）得到的聚多巴修饰的polyDOPA-MNPs磁粒分散在pH=8.5的Tris-HCl水溶液中；然后，在室温超声处理下，缓慢滴加AgNO3溶液，再添加DOPA溶液，并将混合物超声处理，得到polyDOPA@Ag-MNPs磁粒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：将FeCl3·6H2O溶解在含有二乙二醇和乙二醇的双溶剂中以形成澄清溶液，澄清溶液中FeCl3的摩尔浓度为0.05-0.2 mol/L，二乙二醇和乙二醇的体积比为2-4:1；然后将丙烯酸钠和NaAc加入到所述的澄清溶液中得到混合溶液，FeCl3·6H2O与丙烯酸钠的质量比为0.3-0.4:1，丙烯酸钠与NaAc的质量比为0.5-1.5:1，并将该混合溶液在室温下搅拌0.5-1.5 h形成深黄色溶液，将所述的深黄色溶液转移到反应容器中进行反应，反应温度为180℃-220℃，反应时间为8-12h，反应后得到的黑色产物分别用乙醇和水洗涤，干燥后得到COOH-MNPs磁粒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：首先，将 DOPA溶解在pH=8.5的Tris-HCl水溶液中来制备DOPA溶液，DOPA溶液的浓度为0.5-1 mg/mL；然后，将步骤（1）中合成的 COOH-MNPs加入DOPA溶液中25℃振荡10~12 h分散均匀得到黑色产物，COOH-MNPs与DOPA的质量比为1-3:6，黑色产物用磁铁分离并洗涤、干燥后得到聚多巴修饰的polyDOPA-MNPs磁粒。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：首先，将步骤（2）得到的聚多巴修饰的20~50 mg polyDOPA-MNPs磁粒分散在5~10 mL 的pH=8.5的Tris-HCl水溶液中；然后，在室温超声处理下，缓慢滴加100-200 mM的AgNO3溶液，AgNO3溶液的体积为100~300 µL，再添加20-60 mM 的DOPA溶液，DOPA溶液的体积为20~80 µL，并将混合物超声处理，得到polyDOPA@Ag-MNPs磁粒。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的β-受体阻滞剂选自普萘洛尔、醋丁洛尔和美托洛尔中的一种。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的洗脱液为质量分数为0.1%~1%的HAc甲醇溶液。
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