CN115215957B - 一种分子印迹聚合物纳米材料的制备方法及在人血清中β受体阻滞剂检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种分子印迹聚合物的制备方法及其在人血清中β受体阻滞剂检测中的应用。采用RAFT聚合方式，以阿替洛尔为模板制备MIPs，并用于人血清中β受体阻滞剂药物分子的族分离富集检测。基于SERS检测原理，制备了贵金属纳米颗粒负载的MIPs复合材料，成功实现了阿替洛尔的高灵敏度、快速传感分析。

Description

一种分子印迹聚合物纳米材料的制备方法及在人血清中β受 体阻滞剂检测中的应用
技术领域
本发明具体涉及一种分子印迹聚合物的制备方法及其在人血清中β受体阻滞剂检测中的应用。
背景技术
β受体阻滞剂是一种竞争性拮抗剂，可以选择性地与β肾上腺素能受体结合，从而阻断内源性儿茶酚胺-肾上腺素和去甲肾上腺素与β受体的结合，是一类被广泛应用于高血压治疗的药物，同时也可用于控制心律失常、治疗心力衰竭和保护心脏避免再次心肌梗死。β受体阻滞剂按其与受体的识别选择性，可分为两大类：一类可阻断所有类型β肾上腺素能受体的激活，如普萘洛尔、吲哚洛尔等；另外一大类中，则为选择性地激活三种已知类型的β受体之一，即β1、β2和β3受体，如阿替洛尔、醋丁洛尔这两种β受体阻滞剂仅选择性阻断β1受体的激活。
β受体阻滞剂可以降低心率、减少手颤、缓解焦虑，因此在一些射箭、射击等运动中或被运动员服用以提高成绩。此外，如醋丁洛尔、吲哚洛尔、拉贝洛尔等β受体阻滞剂表现出内在的拟交感神经活性，能够在β肾上腺素能受体上作为拮抗剂的同时发挥低水平兴奋剂活性，被国际奥林匹克委员会(the International Olympic Committee，IOC)和国际单项体育联合会禁用。因此防止运动员服用违禁药物，为体育赛事提供公平公正环境，针对于β受体阻滞剂的分析检测是非常必要的。然而人体尿液或血清中的药物残留往往含量较低，且背景干扰十分严重。通用的分析方法中，需对生物样品进行复杂的样品前处理，再通过LC-MS进行定量分析(Minamide Y,Osawa Y,Nishida H,et al.A highly sensitive LC-MS/MS method capable of simultaneously quantitating celiprolol and atenololin human plasma for a cassette cold-microdosing study[J].J.Sep.Sci.:2011,34:1590-1598；Lwin EMP,Gerber C,Song YM,et al.A new LC-MS/MS bioanalytical methodfor atenolol in human plasma and milk[J].Bioanalysis:2017,9:517-530.；KhurooA,Mishra S,Singh O,et al.Simultaneous determination of atenolol andchlorthalidone by LC-MS/MS in human plasma[J].Chromatographia:2008,68:721-729.)。然而，该方法具有步骤多，分析时间长，难以现场分析等不足。因此，发展复杂样品中β受体阻滞剂的快速、高灵敏度传感分析方法具有重要意义。
分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)作为一种人工抗体可以有效模拟抗体的特异性识别能力，排除其他物质干扰，同时富集目标分子，从而对目标分子进行准确测定。近年来，一些针对普萘洛尔、阿替洛尔等β受体阻滞剂的分子印迹相关工作也有发表，可实现单一目标分子的分离与检测，然而针对复杂样品中β受体阻滞剂的族分离检测仍具有挑战。
活性/可控自由基聚合相比于传统聚合，链终止发生概率低，并且反应速率较慢，反应可控性强，制备得到的聚合物分布较窄，因此被广泛使用。其中可逆加成-断裂链转移(Reversible addition-fragmentation chain transfer，RAFT)聚合只需在常规自由基聚合反应中引入合适的链转移试剂，反应即可进行，操作简单，同时具有聚合条件温和、无金属催化剂污染、单体选择范围广等优势，所以常被用于MIPs制备。RAFT聚合反应受热力学控制，有助于模板与单体相互作用的保持，形成亲和力更强的印迹位点，从而提高MIPs的选择识别能力。
表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Ramanscattering,SERS)是指通过贵金属的表面等离子体共振效应增强附近分子的拉曼散射信号的技术，具有快速、无创、准确、高灵敏度等优势。然而，在实际复杂样品检测中，该技术容易受到其他分子的干扰，尤其当被分析物浓度较低，又无法通过物理或化学方式吸附至“热点”附近时，灵敏度会大幅度降低(Wang J,Li JY,Zeng C,et al.Sandwich-like sensor for the highly specific andreproducible detection of rhodamine 6Gon a surface-enhanced Raman scatteringplatform[J].ACS Appl.Mater.Interfaces:2020,12:4699-4706.；Pilo-Pais M,WatsonA,Demers S,et al.Surface-enhanced Raman scattering plasmonic enhancementusing DNA origami-based complex metallic nanostructures[J].Nano Lett.:2014,14:2099-2104)。将MIPs与SERS技术复合，通过MIPs优异的识别选择性，将目标分子集中于传感区域，摒弃杂质干扰，再借助SERS检测手段，即可实现目标分子的快速、高灵敏度传感检测与筛查。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种分子印迹聚合物(MIPs)及其制备方法。
本发明所提供的分子印迹聚合物(MIPs)通过包括如下步骤的方法制备得到：
1)链转移试剂十二烷基-S'-(α,α"-二甲基-α"-乙酸)三硫代碳酸酯(TTCA)的制备；
2)以甲基丙烯酸(MAA)为单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)为交联剂，以β受体阻滞剂为模板，以乙腈为溶剂，在引发剂和链转移试剂存在下，进行RAFT聚合，用洗脱液洗脱至无模板检出，得到分子印迹聚合物(MIPs)。
上述方法步骤1)中，链转移试剂十二烷基-S'-(α,α"-二甲基-α"-乙酸)三硫代碳酸酯(TTCA)的制备包括如下操作：
将丙酮、三辛基甲基氯化铵和1-十二硫醇混匀，N2气氛下反应，滴加NaOH水溶液，反应，加入二硫化碳的丙酮溶液，继续反应，滴加CHCl3，继续反应，滴加NaOH水溶液，反应过夜，反应完成后，加入超纯水和浓盐酸酸化，用N2除去溶液中的丙酮和产生的H2S气体后，抽滤，并用水清洗，将所得固体加入至异丙醇中进行清洗并抽滤，收集滤液旋干，用正己烷进行重结晶，即得；
更具体可为：在圆底烧瓶内加入0.41mol丙酮、0.002mol三辛基甲基氯化铵以及12mL 1-十二硫醇混匀。冰浴下通入N2，搅拌反应10min。于20min内滴加4.19mL 50wt％NaOH水溶液，反应15min。然后将9.75mL丙酮和4.5mL二硫化碳混合，并取9.5mL在20min内滴加完成后，继续反应10min。随后在20min内滴加4.8mL CHCl3，继续反应10min。最后，于1h内滴加完20mL 50wt％NaOH水溶液，反应过夜。反应完成后，加入75mL超纯水和12.5mL浓盐酸酸化。用N2除去溶液中的丙酮和产生的H2S气体后，抽滤，并用水清洗，将所得固体加入至100mL异丙醇中进行清洗并抽滤，收集滤液旋干，用正己烷进行重结晶，即得。
上述方法步骤2)中，所述引发剂具体可为偶氮二异丁腈(AIBN)；
所述链转移试剂具体可为十二烷基-S'-(α,α"-二甲基-α"-乙酸)三硫代碳酸酯(TTCA)；
作为模板的β受体阻滞剂可为阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔和吲哚洛尔中的任意一种，具体可为阿替洛尔；
模板分子、单体MAA、交联剂EGDMA、引发剂AIBN、链转移试剂TTCA的摩尔比依次可为：1:4:20:0.2:0.2-0.6；更具体可为1:4:20:0.2:0.2或1:4:20:0.2:0.6；
所述RAFT聚合的温度可为60℃，时间可为24h；
所述洗脱液具体可为体积比6:4的甲醇与乙酸混合液；
具体地，步骤2)的操作如下：在乙腈中加入模板阿替洛尔、单体MAA、EGDMA、AIBN和链转移试剂TTCA，通N2除氧，并在冷冻抽真空除氧15min后，通入N2密封，升温至60℃反应24h，20000rpm/min离心10min分离聚合物，用乙腈清洗后，真空干燥；加入体积比6：4的甲醇与乙酸混合液作为洗脱液洗脱五次，2h/次，至无模板检出，真空干燥，即得。
上述MIPs在β受体阻滞剂选择性富集分离中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中，所述β受体阻滞剂可为阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔和吲哚洛尔中的至少一种。
本发明的另一目的是提供一种贵金属纳米颗粒-MIPs复合材料及其制备。
本发明所提供的贵金属纳米颗粒-MIPs复合材料，为：MIPs@Au NPs或MIPs@AgNPs，通过原位合成Au NPs或Ag NPs，并将Au NPs或Ag NPs负载于MIPs表面制得。
本发明所提供的贵金属纳米颗粒-MIPs复合材料，通过包括如下步骤的方法制备得到：
将MIPs分散到水中，加入氯金酸或AgNO3，加热煮沸，加入柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，得到贵金属纳米颗粒-MIPs复合材料，即MIPs@Au NPs或MIPs@Ag NPs。
具体地，所述MIPs@Au NPs通过如下方法制备得到：称取制备得到的MIPs 25mg，加入50mL超纯水超声分散，再加入氯金酸使其最终浓度为1mM，加热煮沸后迅速加入5mL38.8mM柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸20min制备得到MIPs@AuNPs，冷却至室温后，4℃保存；
所述MIPs@Ag NPs通过如下方法制备得到：称取制备得到的MIPs 25mg，加入50mL超纯水超声分散，再加入9mg AgNO3，加热煮沸后加入1mL 1％(w/v)柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸1h制备得到MIPs@AgNPs，冷却至室温后，4℃保存。
上述贵金属纳米颗粒-MIPs复合材料在β受体阻滞剂族分离检测中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中，β受体阻滞剂为阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔和吲哚洛尔中的至少一种，
所述检测为通过表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)光谱检测。
本发明的再一目的是提供一种定量检测β受体阻滞剂的方法。
本发明所提供的定量检测β受体阻滞剂的方法，包括如下步骤：
1)绘制β受体阻滞剂信号峰强度对浓度的标准曲线：向MIPs@Ag NPs中加入一系列已知浓度的β受体阻滞剂水溶液，室温吸附后离心，弃上清液，将纳米材料真空干燥后，测定拉曼光谱，绘制β受体阻滞剂信号峰强度对浓度的标准曲线；
2)向MIPs@Ag NPs中加入未知浓度的β受体阻滞剂水溶液，室温吸附后离心，弃上清液，将纳米材料真空干燥后，测定拉曼光谱，将测得的拉曼光谱信号峰强度代入步骤1)中的得到的β受体阻滞剂信号峰强度对浓度的标准曲线，得到待测β受体阻滞剂的含量。
上述方法中，所述β受体阻滞剂为阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔和吲哚洛尔中的至少一种；
所述β受体阻滞剂为阿替洛尔时，一系列已知浓度的β受体阻滞剂水溶液的浓度依次可为：10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3M；
以波数为1326cm-1处的信号作为定量依据绘制标准曲线。
本发明采用RAFT聚合方式，以阿替洛尔为模板进行了MIPs制备，并用于人血清中β受体阻滞剂药物分子的族分离富集检测，对所制备的MIPs进行了形貌和红外表征，探讨了MIPs与模板分子间的识别机理，考察了MIPs的吸附性能，实验结果表明，所制备的MIPs具有优异的吸附动力学及较高的特异性识别能力，最终成功地应用于人血清中五种β受体阻滞剂的选择性富集分离与HPLC检测，进一步，基于SERS检测原理，制备了贵金属纳米颗粒负载的MIPs复合材料，成功实现了阿替洛尔的高灵敏度、快速传感分析。
附图说明
图1(a)为TTCA的液相色谱分析，色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18 column(100×2.1mm,3μm)，洗脱梯度：0-20min,80％B(A:0.1％FA/H2O，B:0.1％FA/CH3CN)，(b)为TTCAESI-IT质谱图(正离子模式)，m/z[M+H]+calculated:365.16；found:364.69。
图2(a)为MIP-1SEM表征图、(b)为NIP-1SEM表征图、(c)为MIP-2SEM表征图和(d)为NIP-2SEM表征图。图中标尺为2μm。
图3(a)为MIP-1TEM表征图、(b)为NIP-1TEM表征图、(c)为MIP-2TEM表征图和(d)为NIP-2TEM表征图。图中标尺为1μm。
图4(a)为MIP洗脱模板后红外表征图及(b)为MIP吸附模板后红外表征图。
图5为不同吸附液体积对MIPs(a)吸附比例和(b)吸附容量的影响。
图6(a)MIP-1/NIP-1和(b)MIP-2/NIP-2对阿替洛尔分子的吸附动力学曲线。
图7为MIP/NIP的吸附量与吸附溶剂含水量的关系图。
图8为不同条件下MIP与模板间相互作用示意图。(a)100％ACN溶液中、(b)100％纯水溶液中以及(c)Gly-NaOH缓冲水溶液(pH 9，10mM)中。
图9MIP/NIP在(a)不同pH缓冲液和(b)不同盐浓度溶液中对阿替洛尔的吸附情况。缓冲液：Na2HPO4-C6H8O7(10mM,pH 3-8),Gly-NaOH(10mM,pH 9,10)。
图10为MIP/NIP对阿替洛尔等温吸附曲线。
图11(a)MIP和(b)NIP与阿替洛尔结合的Scatchard分析拟合曲线图。
图12(a)五种β受体阻滞剂和其他三种对照化合物结构及(b)MIP/NIP吸附结果。
图13为人血清中五种β受体阻滞剂加标回收液相色谱图。(a)五种β受体阻滞剂标准溶液、(b)经由MIP处理后和(c)加标血清经乙腈沉淀后液相色谱图。
图14为贵金属纳米颗粒-MIPs复合材料的制备及SERS检测流程图。
图15(a,b)MIP-1@Au-1、(c,d)MIP-2@Au-1和(e,f)MIP-2@Au-2TEM表征图。图中a、c、e标尺为200nm，b、d、e标尺为1μm。
图16(a,b)MIP-1@Ag和(c,d)MIP-2@AgTEM表征图。图中a、c标尺为200nm，b、d标尺为1μm。
图17(a)阿替洛尔粉末和(b)不同材料吸附阿替洛尔后的拉曼光谱图。其中i为阿替洛尔粉末，ii为MIP-2@Au-1，iii为MIP-2@Au-2，iv为MIP-2@Ag的拉曼光谱图。
图18(a)MIP-2@Ag对不同浓度阿替洛尔吸附后SERS谱图及(b)标准曲线，定量波数为1326cm-1。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的试剂及仪器为：
偶氮二异丁腈(2,2'-Azobis(2-methylpropionitrile)，AIBN)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(Ethylene dimethacrylate，EGDMA)、氯金酸(HAuCl4)、甘氨酸(Glycine，Gly)、1-十二硫醇和二苯甲酮-3(2-Hydroxy-4-methoxybenzophenone，BP-3)购自百灵威(北京，中国)，冰乙酸(HAc)和三乙胺(Triethylamine，TEA)购自阿拉丁公司(上海，中国)，甲基丙烯酸(Methacrylic acid，MAA)，甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)购自赛默飞科技公司(沃尔瑟姆，美国)，氢氧化钠(NaOH)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、硝酸银(AgNO3)、碳酸氢钠、三辛基甲基氯化铵、柠檬酸三钠(Na3Cit)、柠檬酸(C6H8O7)、氯化钠、无水硫酸钠和三氯甲烷(CHCl3)购自北京化工厂(北京，中国)，双酚A(Biophenol A，BPA)购自天津光复精细化工研究所(天津，中国)，甲酸(Formic acid，FA)购自迪马科技(北京，中国)，无水乙醇、丙酮和乙酸乙酯购自天津康科德科技有限公司(天津，中国)，阿替洛尔(Atenolol，ATE)购自上海阿达玛斯试剂有限公司(上海，中国)，盐酸普萘洛尔、磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine，SMZ)购自阿法埃莎化学有限公司(天津，中国)，醋丁洛尔盐酸盐购自Ark Pharm(芝加哥，美国)，拉贝洛尔、吲哚洛尔购自麦克林(上海，中国)，二硫化碳和浓盐酸购自国药集团化学试剂有限公司(北京，中国)，异丙醇和正己烷购自霍尼韦尔(新泽西州，美国)，人血清购自北京博胜经纬科技有限公司(北京，中国)，超纯水产自Milli Q。
纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)形貌通过HT7700(日立，东京，日本)透射电子显微镜(Transmission electron microscopy，TEM)和S-4800(日立，东京，日本)高场发射扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy，SEM)进行表征。使用Tensor-27傅里叶变换红外光谱仪(布鲁克，德国)记录红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR)数据。高效液相色谱系统为岛津UFLC系统，主要包括LC-20AD二元泵、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-20A柱温箱和SIL-20A自动进样器。色谱柱为：Ultimate XB-C18,5μm,4.6×250mm。流动相：A-H2O+0.1％TEA，B-CH3CN+0.1％TEA。梯度：50％B-10min。流速：1.0mL/min。在配备二极管阵列检测器和LCQ质谱仪的UltiMate 3000UHPLC系统(赛默飞，圣何塞，美国)上进行HPLC-ESI-IT-MS分析。表面增强拉曼散射光谱通过LabRAM HR Evolution显微共焦激光拉曼光谱仪记录(HORIBA，法国)，参数设置：激光器波长633nm，ND Filter为25％(约1.0mW)，测定范围为500-1800cm-1，Objective为×100_VIS，N.A.为0.8，激光光斑直径约为1μm，累计时间为10s，累计次数为1，Hole值为100.021，Grating为600(500nm)
实施例1、MIPs的制备及其对β受体阻滞剂选择性富集分离和HPLC检测1.1链转移试剂十二烷基-S'-(α,α"-二甲基-α"-乙酸)三硫代碳酸酯(TTCA)合成
在圆底烧瓶内加入0.41mol丙酮、0.002mol三辛基甲基氯化铵以及12mL 1-十二硫醇混匀。冰浴下通入N2，搅拌反应10min。于20min内滴加4.19mL 50wt％NaOH水溶液，反应15min。然后将9.75mL丙酮和4.5mL二硫化碳混合，并取9.5mL在20min内滴加完成后，继续反应10min。随后在20min内滴加4.8mL CHCl3，继续反应10min。最后，于1h内滴加完20mL50wt％NaOH水溶液，反应过夜。反应完成后，加入75mL超纯水和12.5mL浓盐酸酸化。用N2除去溶液中的丙酮和产生的H2S气体后，抽滤，并用水清洗，将所得固体加入至100mL异丙醇中进行清洗并抽滤，收集滤液旋干，用正己烷进行重结晶。
TTCA表征
在RAFT聚合反应发生时，具有较高链转移常数的TTCA的加入，可以与链增长自由基形成休眠种中间体，限制双基终止副反应的发生，同时降低反应速率。该休眠种可重新裂解释放新的自由基继续反应，TTCA在休眠种与自由基间切换，有效控制反应进行。将所合成的TTCA进行了液相及质谱表征，结果如图1所示，经归一化计算得到TTCA纯度为99.4％，满足实验要求。质谱结果表明，TTCA的m/z[M+H]+理论值为365.16，实测值为364.69，证明成功合成得到TTCA。
1.2MIPs制备条件的优化
在50mL乙腈中加入0.5mmol阿替洛尔(模板)、2mmol单体MAA、10mmol的EGDMA(二甲基丙烯酸乙二醇酯)、0.1mmol的AIBN和0.1mmol或0.3mmol的链转移试剂TTCA，通N2除氧15min，并在冷冻抽真空除氧15min后，通入N2密封，升温至60℃反应24h。20000rpm/min离心10min分离聚合物，用乙腈清洗三次后，50℃真空干燥2h，称重。
在未加模板的前提下进行上述操作，制备NIPs。
加入洗脱液(甲醇/乙酸，6：4，v/v)洗脱MIPs/NIPs五次，2h/次，至无模板检出，50％水洗三次、甲醇清洗三次后，50℃真空干燥2h。
其中AIBN:TTCA＝1:1(n/n)时所制备的MIP命名为MIP-1，NIP命名为NIP-1；AIBN:TTCA＝1:3(n/n)时所制备的MIP命名为MIP-2，NIP命名为NIP-2。
考察了链转移试剂的不同用量对MIPs制备的影响，并对所合成的MIPs/NIPs产率进行了分析。如表1所示，AIBN:TTCA＝1:1(n/n)和AIBN:TTCA＝1:3(n/n)两种条件所制备的MIPs/NIPs产率在83.6％-94.4％，表明聚合反应转化率高。此外，在聚合反应过程中观察到MIP-1/NIP-1反应液中首先出现聚合物，反应一段时间后，MIP-2/NIP-2的聚合溶液中才开始出现聚合物沉淀，并且MIP-1/NIP-1产率高于MIP-2/NIP-2，说明MIP-1/NIP-1反应速率高于MIP-2/NIP-2。这表明当链转移试剂TTCA含量较高时，对聚合反应的调控性增强，因此聚合速率相对较低，反应相同时间后，产率较低。另一方面，两种制备条件下，MIPs的质量都略高于NIPs，推测是模板分子被包裹在MIPs内部所致，这为印迹空穴的产生提供了前提条件。
表1 MIPs/NIPs产率列表
*MIP-1/NIP-1表示AIBN:TTCA＝1:1(n/n)所制备的MIP/NIP；MIP-2/NIP-2表示AIBN:TTCA＝1:3(n/n)所制备的MIP/NIP
通过SEM及TEM对所合成的MIPs/NIPs的形貌和尺寸进行表征，结果如图2和3所示，MIP-1/NIP-1为规整度较差、尺寸分布较广的近球形，MIP-1直径为237±48nm(n＝9)，NIP-1直径为196±48nm(n＝9)。而MIP-2/NIP-2为非常规整的球形，且尺寸均一，MIP-2直径为790±37nm(n＝9)，NIP-2直径为856±29nm(n＝9)。以上结果表明加大链转移试剂的用量使得聚合反应更加可控，所形成的聚合物尺寸分布更加均匀、形貌更加规整。
对所合成的MIP进行了红外光谱表征，结果如图4a所示，2985和2954cm-1处为-CH3或-CH2-伸缩振动峰，1456cm-1处为C-H弯曲振动峰。1731cm-1处的C＝O的伸缩振动峰来源于单体MAA及链转移试剂TTCA的羧基和交联剂EGDMA的酮羰基。1636cm-1处的C＝C伸缩振动峰和1159cm-1处的C-O-C伸缩振动峰表明聚合物中存在EGDMA。1257cm-1处的C＝S伸缩振动峰和757cm-1处的C-S伸缩振动峰表明聚合中存在TTCA。将MIP吸附模板分子阿替洛尔后(图4b)，在1559cm-1和1542cm-1处出现两个尖锐的C＝C伸缩振动峰，此为苯环存在特征峰，证明了阿替洛尔分子的存在。
1.3MIPs吸附性能考察与识别机理研究
1.3.1吸附条件优化
称取制备得到的MIPs及NIPs各1mg，并加入0.5、1.0或2.0mL 50μM阿替洛尔乙腈吸附溶液，室温下孵育2h，离心后取上清进行HPLC测定。
考察制备得到的MIPs对模板分子阿替洛尔的吸附性能，结果如图5所示。固定MIPs用量为1mg，吸附液中阿替洛尔浓度为50μM。当调节吸附溶液体积为0.5，1.0mL时，MIPs吸附了溶液中95％以上的阿替洛尔，说明此时MIPs过量，其印迹位点未被完全利用，因此计算得到MIPs的吸附容量(单位质量MIPs所吸附目标物的物质的量Q，单位μmol/g)较低，其中MIP-1吸附容量分别为22.6μmol/g，48.9μmol/g；MIP-2的吸附容量分别为22.7μmol/g，49.1μmol/g。当进一步增加吸附溶液体积至2.0mL时，MIP-1吸附了溶液中80.9％的阿替洛尔，MIP-2吸附了溶液中83.1％的阿替洛尔，表明此时MIPs印迹位点利用率较高，因此MIPs吸附容量显著提高，其中MIP-1吸附容量提高至85.3μmol/g，MIP-2吸附容量提高至87.6μmol/g。而在NIPs吸附中，当吸附溶液体积为0.5mL时，NIP-1吸附了溶液中75.7％的阿替洛尔，NIP-2吸附了溶液中80.6％的阿替洛尔，吸附比例较低，因此，继续增加吸附溶液体积后，其吸附比例迅速下降，吸附容量增长缓慢，最终IF升高，使特异性识别位点的吸附效果显现出来。
另一方面，通过对比发现，MIP-1/NIP-1与MIP-2/NIP-2吸附情况类似，表明链转移试剂用量改变，虽影响MIPs形貌及尺寸，但对其吸附性能影响不大，两种材料均成功地形成了有效印迹位点，具有较好特异性识别能力。
1.3.2吸附动力学考察
称取制备得到的MIPs及NIPs各1mg，并加入2.0mL 50μM阿替洛尔乙腈吸附溶液，室温下孵育不同时间：10、20、30、60、120、240min，孵育完成后离心，取上清液进行HPLC分析测定。
吸附时间是MIPs实际应用的重要参数，因此首先对MIPs吸附动力学进行了考察。结果如图6所示，两种MIPs在吸附1h后均可达到平衡，具有较快的传质速率，这得益于两种材料尺寸均在纳米尺度范围内，有利于阿替洛尔小分子的传质扩散。另一方面，由于NIPs对阿替洛尔的结合是材料表面的非特异性吸附，因此在10min左右便达到了吸附平衡。同时，无论吸附时间的长短，MIPs的吸附量均高于NIPs，证明了MIPs具有特异性识别位点，对阿替洛尔具有较好的结合能力。
此外，通过图6a和图6b对比可以发现，前30min内，MIP-1吸附量增加更快，这可能与其尺寸相对较小，比表面积更大，因此位于表面的印迹位点更多有关。但两者达到吸附平衡时间及吸附量基本相同，考虑MIP-2/NIP-2具有更规整的形貌及均一的尺寸，有利于提高实验的重现性，因此选择MIP-2/NIP-2进行后续实验。
1.3.3MIP的识别机理研究
(1)配制阿替洛尔浓度为50μM且水含量为0％、5％、10％、15％、20％、40％、50％、60％、80％、100％的乙腈溶液，称取MIP-2及NIP-2各1mg，并分别加入上述吸附溶液4mL，室温下吸附1h，吸附完成后离心，取上清液进行HPLC分析测定。
(2)配制阿替洛尔浓度为50μM且pH为3、4、5、6、7、8的10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲水溶液及pH为9、10的10mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲水溶液，称取MIP-2及NIP-2各1mg，并分别加入上述吸附溶液1mL，室温下吸附1h，吸附完成后离心，取上清液进行HPLC分析测定。另外配制阿替洛尔浓度为50μM且pH为7的25mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲水溶液进行上述吸附。
水能破坏分子间氢键相互作用，而增强分子间疏水相互作用。通过考察MIP的吸附量与吸附溶液中水含量的关系，从而探究氢键与疏水作用在MIP识别中扮演的角色。结果如图7所示，当向乙腈溶液中加入少量水时，MIP吸附量急剧下降，这是由于水作为极性质子溶剂，破坏了MIP与阿替洛尔之间的氢键作用。MIP吸附量的大幅度下降，表明氢键在MIP识别阿替洛尔的过程中扮演着至关重要的作用，如图8a所示，在非极性溶剂中，MIP与模板之间存在多重氢键作用。
当进一步提高水含量时(水含量高于50％)，MIP与阿替洛尔之间的疏水作用显现出来(如图8b所示)，吸附量逐步升高，然而IF值逐渐下降。另一方面，MIP在乙腈中的吸附量远高于纯水中的吸附量，这说明氢键相对疏水作用起到更为主导的作用，也暗示氢键在发挥印迹位点特异性方面起到关键作用，有助于提升MIP识别性能。
溶液的pH值及盐浓度可影响分子间静电相互作用，通过考察MIP的吸附量与溶液pH值及盐浓度的关系，可探究分子间静电作用在MIP识别中扮演的角色。查阅文献可知，单体甲基丙烯酸(MAA)的pKa值为4.65(25℃)，聚合物中羧基由于空间距离靠近，电离受到抑制，其pKa值会进一步提高；阿替洛尔的pKa值为9.6(25℃)。如图9a所示，当吸附溶液pH较低时，MIP中的羧基难以电离，与模板分子间的静电力较弱，导致MIP吸附量低。当进一步升高溶液的pH后，MIP中的羧基逐渐电离，在印迹空穴中，羧基与阿替洛尔的仲胺之间能形成较强的静电引力作用(如图8c所示)，吸附量逐渐升高。而当pH进一步升高至10，接近阿替洛尔的pKa值，使得其带电量下降，MIP与其静电力减弱，MIP吸附量下降。
另一方面，固定溶液pH＝7，增加溶液中缓冲盐的浓度，如图9b所示，盐浓度的升高，导致MIP吸附量下降，该结果表明，MIP与阿替洛尔之间存在静电引力作用，且盐浓度的升高破坏了分子间静电作用。
1.3.4等温吸附线测定
称取制备得到的MIP-2及NIP-2各1mg，并加入2.0mL 10-500μM阿替洛尔乙腈吸附溶液(含20％水)，室温下孵育1h，孵育完成后离心，取上清液进行HPLC分析测定。
为了量化MIP和阿替洛尔间的亲和力，根据公式：Qe/Ce＝Qmax/Kd-Qe/Kd将上述所测等温吸附数据进行拟合分析。其中，Qmax(μmol/g)为MIP对阿替洛尔的理论最大结合量，Qe(μmol/g)是某一浓度下吸附达到平衡时，MIP对阿替洛尔的结合量，Ce(μmol/L)为吸附平衡时阿替洛尔的浓度，Kd(μmol/L)是解离常数。将Qe/Ce对Qe进行线性拟合后，利用拟合所得的线性方程中斜率和截距计算Kd和Qmax。
综合考虑吸附量与IF值，选择水：乙腈＝1:4(v/v)作为溶剂进行等温吸附考察。结果如图10所示，随着阿替洛尔浓度的升高，MIP吸附量逐渐升高，且在500μM时趋于平衡。同时，在不同浓度下，MIP的吸附量均高于NIP的吸附量，表明MIP对阿替洛尔有更好的识别能力。
为了量化MIP/NIP对阿替洛尔的亲和力，对上述所测得等温吸附数据进行Scatchard拟合分析，结果如图11所示。依据拟合所得到线性方程的斜率与截距计算MIP的Kd值为78.8μM，最大吸附量Qmax为126.8μmol/g，NIP的Kd值为380.2μM，最大吸附量Qmax为73.1μmol/g。MIP的Kd远小于NIP，Qmax高于NIP，表明MIP对阿替洛尔具有更高的亲和力和更大的吸附容量。
1.3.5选择性考察
盐酸醋丁洛尔和盐酸普萘洛尔去盐酸化：将一定量盐酸醋丁洛尔或盐酸普萘洛尔溶于水中，并滴加等物质量的碳酸氢钠水溶液，滴加完成后继续搅拌反应2h。使用乙酸乙酯萃取后，加入饱和氯化钠溶液洗涤有机相。加适量无水硫酸钠干燥过夜后，过滤、旋蒸并抽干。分别得到阿替洛尔和普萘洛尔。
称取制备得到的MIP-2及NIP-2各1mg，并加入2.0mL 50μM阿替洛尔(Atenolol，ATE)、醋丁洛尔(Acebutolol，ACE)、普萘洛尔(Propranolol，PRO)、拉贝洛尔(Labetalol，LAB)、吲哚洛尔(Pindolol，PIN)、双酚A(Bisphenol A，BPA)、磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine，SMZ)和二苯甲酮-3(2-Hydroxy-4-methoxybenzophenone，BP-3)乙腈(含20％水)吸附溶液，室温下吸附1h，吸附完成后离心，取上清液进行HPLC分析测定。
如图12a所示，考察了除模板外另外四种β受体阻滞剂醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔、吲哚洛尔及其他三种对照化合物双酚A、磺胺二甲基嘧啶和二苯甲酮-3与MIP/NIP结合情况。结果如图12b所示，MIP对五种β受体阻滞剂均有较高吸附量，显示出较好的特异性，阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔和吲哚洛尔的IF值分别为5.9、4.0、2.4、3.0、3.0，其中由于模板分子阿替洛尔与印迹空穴更为匹配，因此IF值最高。而普萘洛尔结构中萘环相对于苯环更加疏水，与MIP/NIP相比疏水作用更强，因此吸附量略高。通过前述MIP识别机理的研究可知，氢键在形成特异性印迹位点过程中为主要驱动力，而疏水作用除参与特异性印迹外，还在非特异性吸附中发挥重要作用，导致NIP对普萘洛尔吸附量较高，故最终其IF值比阿替洛尔低。此外，MIP对实验中其他三种对照化合物基本没有吸附，证明MIP具有良好的特异性识别能力，可以有效实现β受体阻滞剂的族分离。
1.4MIP用于人血清中β受体阻滞剂的选择性识别与检测
称取10mg MIP加入2mL添加有阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔、吲哚洛尔五种β受体阻滞剂的人血清，β受体阻滞剂添加浓度为2.0、0.5、0.1和0.01μg/mL。25℃孵育1h后用1mL超纯水清洗两次，加入2mL洗脱液(MeOH：HAc＝6：4，v/v)洗脱1h，20000rpm/min离心10min，收集洗脱液，浓缩离心至干后加入0.5mL乙腈复溶并由HPLC进行测定。仪器为配有二极管阵列检测器的HPLC系统。分析所用色谱柱为：Welch Ultimate XB-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)，流速为1.0mL/min，梯度：0-20min，50％B.(A：H2O+0.1％TEA，B：CH3CN+0.1％TEA)。定量分析波长分别设为拉贝洛尔336nm、阿替洛尔275nm、醋丁洛尔235nm、吲哚洛尔264nm、普萘洛尔288nm。
由选择性结果可知MIP对五种β受体阻滞剂均有较高吸附量及良好选择性，表明MIP具备对β受体阻滞剂族分离潜能，因此进一步考察MIP用于人血清中五种β受体阻滞剂的选择性富集检测应用。血清未经任何处理，直接加标五种β受体阻滞剂，考察四个浓度水平：2.0、0.5、0.1和0.02μg/mL。五种β受体阻滞剂标准混合样品色谱图如图13a所示，通过参照该图保留时间对其他溶液中的β受体阻滞剂组分进行定性分析。如图13c所示，加标血清用乙腈沉淀后，上清液进行HPLC分析，结果表明，溶液中杂质成分干扰β受体阻滞剂定量测定。另一方面，在加标血清中直接加入MIP进行处理，经洗脱，离心浓缩并复溶后进行HPLC分析，如图13b所示，人血清中干扰β受体阻滞剂的杂质被有效去除，同时富集了五种β受体阻滞剂。在2.0-0.02μg/mL浓度范围内，五种β受体阻滞剂的回收率均在82.9-100.3％之间，相对标准偏差(RSD)为0.5-6.9％(n＝3)。该结果表明，在复杂生物样品中，MIP对五种β受体阻滞剂仍具有良好的回收率和重现性，实现了人血清中五种β受体阻滞剂的分离富集检测应用。
表2人体血清中五种β受体阻滞剂加标回收率
实施例2、贵金属纳米颗粒-MIPs复合材料的制备及阿替洛尔的SERS定量检测
2.1复合材料的制备
MIPs@Au NPs复合材料的制备：
采取原位合成Au NPs的方法，将Au NPs负载于MIPs表面。合成方法如下：称取制备得到的MIP-1和MIP-2各25mg，加入50mL超纯水超声分散。再加入氯金酸使其最终浓度为1mM，加热煮沸后迅速加入5mL 38.8mM柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸20min制备得到MIP-1@Au-1和MIP-2@Au-1。冷却至室温后，4℃保存。
另外，通过调整柠檬酸三钠的用量优化所负载的Au NPs尺寸。称取MIP-2 25mg，同上述反应一样加入氯金酸煮沸后，分别加入2.5mL 38.8mM柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸20min后制备得到MIP-2@Au-2。冷却至室温后，4℃保存。
MIPs@Ag NPs复合材料的制备：
采取原位合成Ag NPs的方法将Ag NPs负载于MIPs表面。称取制备得到的MIP-1和MIP-2各25mg，加入50mL超纯水超声分散。再加入9mg AgNO3，加热煮沸后加入1mL 1％(w/v)柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸1h制备得到MIP-1@Ag和MIP-2@Ag。冷却至室温后，4℃保存。
采用原位合成法在MIPs表面负载贵金属纳米颗粒，增强阿替洛尔的拉曼信号。采用柠檬酸三钠还原氯金酸或硝酸银的方法，在MIPs表面原位负载Au NPs或Ag NPs，并通过调整柠檬酸三钠的用量调控所得到的Au NPs尺寸，实验流程如图14所示。
对所制备的MIPs@Au及MIP@Ag进行透射电镜表征。如图15所示，MIPs表面成功负载了AuNPs，对不同条件下所负载的AuNPs的尺寸进行测量计算可得(表3)，MIP-1@Au-1中AuNPs的尺寸为20.2±5.4nm，MIP-2@Au-1中AuNPs的尺寸为20.1±5.3nm，由此可知AuNPs的尺寸与载体MIPs的尺寸和形貌无关。同时，MIP-2@Au-2中AuNPs的尺寸为28.2±5.9nm，相比MIP-2@Au-1尺寸更大，表明在原位合成AuNPs过程中，通过调节柠檬酸三钠的用量，可优化AuNPs尺寸。
另一方面，通过图16可知，MIPs表面同样成功负载了Ag NPs，经测量计算可得(表3)，MIP-1@Ag中Ag NPs尺寸为47.0±14.5nm，MIP-2@Ag中Ag NPs尺寸为49.8±11.6nm，两种MIPs所负载的Ag NPs的尺寸同样相差不多。但相比Au NPs而言，Ag NPs负载量更高，且更加均匀。相对于尺寸仅为200nm左右的MIP-1(AIBN：TTCA＝1：1)，尺寸较大的MIP-2(AIBN：TTCA＝1：3)更适合负载50nm左右的Ag NPs，又因二者对阿替洛尔吸附性能相似，因此选择MIP-2负载Au或Ag NPs进行SERS测定。
表3MIPs负载的贵金属纳米颗粒的尺寸(n＝25)
2.2复合材料的优化
分别取1mL MIP-2@Au-1、MIP-2@Au-2和MIP-2@Ag材料溶液(0.5mg/mL)，离心去除上清液后加入1mL水清洗。再分别加入1mL 1mM阿替洛尔水吸附溶液，室温吸附1h后离心，抽干，铺至玻璃片上，使用拉曼光谱仪进行测定。
其中，阿替洛尔粉末作为参照。
首先对阿替洛尔粉末进行了拉曼光谱表征，结果如图17a所示，可以观察到明显的特征拉曼散射峰并列于表4。将原位合成法所制备的MIP-2@Au-1、MIP-2@Au-2和MIP-2@Ag用于阿替洛尔水溶液吸附，并进行拉曼光谱测试，结果如图17b所示，相比于阿替洛尔粉末，MIP-2@Au-2和MIP-2@Ag上阿替洛尔信号得到明显增强，且二者相比较，负载Ag NPs的MIP增强效果更好。
表4阿替洛尔理论拉曼光谱信号及实验光谱信号对比
2.3SERS定量分析
取1mLMIP-2@Ag材料溶液(0.5mg/mL)，离心去除上清液后加入1mL水清洗。再分别加入1mL 10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3M阿替洛尔水溶液，室温吸附1h后离心，抽干，铺至玻璃片上使用拉曼光谱仪进行测定，绘制阿替洛尔信号峰强度对浓度的标准曲线。
MIP@Ag NPs吸附不同浓度阿替洛尔水溶液后，进行拉曼光谱分析，结果如图18a所示，随着吸附溶液浓度的升高，谱图中阿替洛尔拉曼信号随之升高。以波数为1326cm-1处的信号作为定量依据绘制标准曲线，如图18b所示，在浓度为10-8-10-3M范围内，拉曼信号与浓度的对数成线性关系，线性相关系数为0.953。结果表明，通过原位合成法所制备的MIP-2@Ag纳米材料，可以应用于阿替洛尔的快速、高灵敏SERS定量分析。

Claims (9)

1.一种制备分子印迹聚合物方法，包括如下步骤：
1）链转移试剂十二烷基-S'-(α,α"-二甲基-α"-乙酸)三硫代碳酸酯的制备；
步骤1）中，链转移试剂十二烷基-S'-(α,α"-二甲基-α"-乙酸)三硫代碳酸酯的制备包括如下操作：
将丙酮、三辛基甲基氯化铵和1-十二硫醇混匀，N2气氛下反应，滴加NaOH水溶液，反应，加入二硫化碳的丙酮溶液，继续反应，滴加CHCl3，继续反应，滴加NaOH水溶液，反应过夜，反应完成后，加入超纯水和浓盐酸酸化，用N2除去溶液中的丙酮和产生的H2S气体后，抽滤，并用水清洗，将所得固体加入至异丙醇中进行清洗并抽滤，收集滤液旋干，用正己烷进行重结晶，即得；
2）以甲基丙烯酸为单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，以β受体阻滞剂为模板，以乙腈为溶剂，在引发剂和链转移试剂存在下，进行RAFT聚合，用洗脱液洗脱至无模板检出，得到分子印迹聚合物；作为模板的β受体阻滞剂为阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔和吲哚洛尔中的任意一种；
所述引发剂为偶氮二异丁腈；
模板分子、单体MAA、EGDMA、偶氮二异丁腈、链转移试剂的摩尔比依次为：1:4:20:0.2:0.2-0.6。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中，所述RAFT聚合的温度为60℃，时间为24h；
所述洗脱液为体积比6:4的甲醇与乙酸混合液。
3.权利要求1或2所述方法制备得到的分子印迹聚合物。
4.权利要求3所述的分子印迹聚合物在β受体阻滞剂选择性富集分离中的应用；所述β受体阻滞剂为阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔和吲哚洛尔中的至少一种。
5.一种贵金属纳米颗粒-分子印迹聚合物复合材料，为：MIPs@Au NPs或MIPs@Ag NPs，通过原位合成Au NPs或Ag NPs，并将Au NPs或Ag NPs负载于权利要求3所述分子印迹聚合物表面制得。
6.制备权利要求5所述的贵金属纳米颗粒-分子印迹聚合物复合材料的方法，包括如下步骤：将权利要求3所述分子印迹聚合物分散到水中，加入氯金酸或AgNO3，加热煮沸，加入柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，得到贵金属纳米颗粒-分子印迹聚合物复合材料，即MIPs@AuNPs或MIPs@Ag NPs。
7.权利要求5所述的贵金属纳米颗粒-分子印迹聚合物复合材料在β受体阻滞剂族分离检测中的应用；所述应用中，β受体阻滞剂为阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔和吲哚洛尔中的至少一种，
所述检测为通过表面增强拉曼散射光谱检测。
8.一种定量检测β受体阻滞剂的方法，包括如下步骤：
1）绘制β受体阻滞剂信号峰强度对浓度的标准曲线：向权利要求5中所述的MIPs@AgNPs中加入一系列已知浓度的β受体阻滞剂水溶液，室温吸附后离心，弃上清液，将纳米材料真空干燥后，测定拉曼光谱，绘制β受体阻滞剂信号峰强度对浓度的标准曲线；
2）向权利要求5中所述的MIPs@Ag NPs中加入未知浓度的β受体阻滞剂水溶液，室温吸附后离心，弃上清液，将纳米材料真空干燥后，测定拉曼光谱，将测得的拉曼光谱信号峰强度代入步骤1）中的得到的β受体阻滞剂信号峰强度对浓度的标准曲线，得到待测β受体阻滞剂的含量；
所述β受体阻滞剂为阿替洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔、拉贝洛尔和吲哚洛尔中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述β受体阻滞剂为阿替洛尔时，一系列已知浓度的β受体阻滞剂水溶液的浓度依次为：10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3 M；
所述β受体阻滞剂为阿替洛尔时，以波数为1326cm-1处的信号作为定量依据绘制标准曲线。
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